laporan mikrobiologi pewarnaan
Post on 12-Dec-2014
179 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Bakteri berasal dari kata latin bacterium, untuk jamaknya bacteria yang artinya adalah
kelompok organisme yang tidak memiliki membran inti sel. Organisme ini termasuk ke
dalam domain prokariota dan berukuran sangat kecil (mikroskopik), serta memiliki
peran besar dalam kehidupan di bumi. Beberapa kelompok bakteri dikenal sebagai agen
penyebab infeksi dan penyakit, sedangkan kelompok lainnya dapat memberikan
manfaat dibidang pangan, pengobatan, dan industri.
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang
berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil
pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada coccus
dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum
hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung (Dwidjoseputro, 2005).
Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri
itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka
dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri yang merupakan salah satu cara yang
paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro, 2005).
Bakteri umumnya tidak memiliki pigmen sehingga tidak berwarna dan hampir tidak
kelihatan karena tidak kontras dengan medium dimana mereka hidup. Oleh karena itu,
perlu dilakukan pewarnaan agar bakteri tampak jelas bila diamati dengan mikroskop.
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion
karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan.
Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa
(Dwidjoseputro, 2005).
Pewarnaan dikelompokkan menjadi pewarnaan langsung dengan pewarnaan basa,
pewarnaan tak langsung atau pewarnaan negatif dan pewarnaan gram. Pewarnaan basa
adalah pewarnaan yang langsung mewarnai bakteri. Pewarnaan negatif adalah
pewarnaan yang tidak langsung mewarnai bakteri, melainkan mewarnai latar belakang
preparat bakteri tersebut. Pewarnaan ini dilakukan dengan menggunakan pewarna yang
bersifat asam seperti tinta cina. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan umum dalam
bidang bakteriologi. Dengan pewarnaan ini, kelompok bakteri dibedakan menjadi dua
yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Hasil akhir dari pewarnaan gram
adalah bakteri gram positif akan berwarna ungu/biru, sementara bakteri gram negatif
akan berwarna merah.
Oleh karena itu dilakukan percobaan untuk mengetahui teknik pewarnaan
mikroorganisme sehingga mempermudah dalam melihat bagian-bagian bakteri.
1.2 Tujuan Percobaan
a. Mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri.
b. Mengetahui fungsi dari pewarnaan bakteri.
c. Mengetahui perbedaan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat
yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan
kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk
mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode
pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat
fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian
pengecatan.
Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi
ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan
untuk mewarnai mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi
dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan.
Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan
infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk
melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang
digunakan untuk memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang
memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif. Pewarnaan
diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi
kelompok-kelompok tahan asam dan tidak tahan asam (Dwidjoseputro.1998).
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884.
Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram
positif dan bakteri gram negatif. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap
cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya
sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak
mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp.
Untuk melihat struktur digunakan pewarnaan flagela, pewarnaan kapsul, pewarnaan
spora, dan pewarnaan nukleus. Pewarnaan Neisser atau Albert digunakan untuk melihat
granula metakromatik (volutin bodies) pada Corynebacterium diphtheriae. Untuk semua
prosedur pewarnaan mikrobiologi dibutuhkan pembuatan apusan lebih dahulu sebelum
melaksanakan beberapa teknik pewarnaan yang spesifik (Pelczar, 1986).
Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan
umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat
warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan
positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan
menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung
warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion
yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna
negatif (Trie, 2012).
Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat warna
basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan
memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan
memberikan zat warna mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih banyak
digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan didinding sel, membran sel dan
sitoplasmasewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan
dengan muatan negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas terlihat
(Dwidjoseputro, 1998).
Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai mikroorganisme,
namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai latar belakang sediaan pewarnaan. Zat
warna asam yang bermuatan negatif ini tidak dapat berkaitan dengan muatan negatif
yang terdapat pada struktur sel. Kadangkala zat warna negatif digunakan untuk
mewarnai bagian sel yang bermuatan positif, perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya
ikat zat warna terhadap struktur sel dapat berubah bergantung pada pH sekitarnya
sewaktu proses pewarnaan (Dwidjoseputro, 1998).
Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang
berumur 24 - 48 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpangan
hasil pewarnaan gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding-
dinding selnya. Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar
sewaktu dicuci dengan lartan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan
dinding sel yang rusak tidak lagi dapat memertahankan crystal violet sehingga terlihat
sebagai bakteri gram negatif.
Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Ulasan ini
kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak
sehingga dapat terlihat bentuk dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan yang sering
kali dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat terutama bila
suspensi tersebut berasal adari bukan media padat. Sebaliknya pada suatu suspensi
bakteri bila terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan sewaktu mencari bakteri pada
preparatnya.
Untuk pewarnaan yang mengamati morfologi sel mikroorganisme maka seringkali
setelah pembuatan preparat ulas dilakukan fiksasi diikuti oleh pewarnaan. Fiksasi dapat
dilakukan dengan cara melewatkan preparat diatas api atau merendamnya dengan
metanol. Fiksasi digunakan untuk:
1. Mengamati bakteri oleh karena sel bakteri lebih jelas terlihat setelah diwarnai
2. Melekatkan bakteri pada glass objek
3. Mematikan bakteri
Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut :
1. Pewarnaan sederhana
Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) tujuan hanya untuk
melihat bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum
digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan
sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu
mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan
bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya
bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk
pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya
bermuatan positif). Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang
dilarutkan dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang
cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna
yang banyak digunakan adalah biru metilen dan ungu kristal.
2. Pewarnaan differensial
a. Pewarnaan gram
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram
negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi
nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram yang
mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara
pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Dengan metode pewarnaan
gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan
gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi
atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena
itu, pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak
mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. Contoh bakteri yang tergolong
bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies
tertentu dari genus Nocardia. Bakteri-bakteri dari kedua genus ini diketahui
memiliki sejumlah besar zat berlemak didalam dinding selnya sehingga
menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna
yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan
biasa, seperti pewarnaan sederhana atau gram.
b. Pewarnaan Tahan Asam
Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam
konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi
zat warna khusus misalnya karbol-fukhsin melalui proses pemanasan, maka akan
menyerap zat warna dan akan tahan diikat tanpa mampu dilunturkan oleh
peluntur yang kuat sekalipun seperti asam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut
bakteri tahan asam (BTA). Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk
mendiagnosa keberadaan bakteri penyebab tuberkulosis yaitu Mycobacterium
tuberculosis .
3. Pewarnaan khusus
a. Pewarnaan Spora
Spora bakteri tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik
pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling
banyak digunakan. Spora bakteri sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk
pewarnaan spora, perlu dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau bisa
masuk ke dalam spora, seperti halnya pada pewarnaan Basil Tahan Asam
dimana cat karbol-fukhsin harus dipanaskan untuk bisa menembus lapisan lilin
asam Mycolic dari Mycobacterium.
b. Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang tidak
stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.
c. Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga
sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena
jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga
memberi warna pada latar belakang yang berwana biru gelap.
4. Pewarnaan negatif
Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar
belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan
transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan
ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan
yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu
bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat.
Metode ini menggunakan tinta cina. Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam
seperti tinta cina. Pewarna asam memiliki negative charge kromogen, tidak akan
menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan
bakteri. Oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang
berwarna.
(Kesuma, 2013).
BAB III
METODOLOGI PERCOBAAN
3.1 Waktu dan Tempat
Praktikum ini dilaksanakan pada hari Senin tanggal 29 April 2013 pukul 16.00 – 18.30
WITA di Laboratorium Rekayasa Lingkungan bertempat di Fakultas Teknik Universitas
Mulawarman Samarinda.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Alat-alat
1. Pipet tetes
2. Jarum ose
3. Lampu bunsen
4. Cawan petri
5. Kaca preparat
6. Mikroskop
7. Tabung reaksi
8. Kertas saring
9. Gelas kimia 1000 ml
10. Botol semprot
11. Tisu
12. Rak tabung reaksi
3.2.2 Bahan-bahan
1. Sabun cuci
2. Larutan zat warna crystal violet
3. Larutan zat warna tinta cina
4. Alkohol
5. Larutan lugol
6. Larutan zat warna safranin
7. Larutan malachite green
8. Aquades
9. Bakteri
3.3 Cara Kerja
3.3.1 Pewarnaan sederhana
1. Dibersihkan kaca preparat dengan menggunakan alkohol sampai bebas lemak, lalu
dibersihkan lagi dengan tisu.
2. Difiksasi diatas nyala lampu bunsen.
3. Diambil secara aseptik satu ose suspensi bakteri dan diratakan diatas kaca preparat.
4. Dikeringkan kaca preparat dengan diangin-anginkan hingga terbentuk noda.
5. Difiksasi dengan dipanaskan diatas nyala lampu bunsen.
6. Didinginkan lalu diteteskan larutan zat warna crystal violet sebanyak 1 atau 2 tetes,
dan dibiarkan selama 1 atau 2 menit.
7. Dicuci dengan aquades sampai sisa-sisa zat warna tercuci seluruhnya.
8. Dikeringkan dengan diangin-anginkan.
9. Diamati dengan menggunakan mikroskop.
10. Digambar bentuk bakteri.
3.3.2 Pewarnaan negatif
1 Dibersihkan object glass dengan menggunakan alkohol sampai bebas lemak, lalu
dibersihkan lagi dengan tisu.
2 Difiksasi diatas nyala lampu bunsen.
3 Diambil secara aseptik satu ose suspensi bakteri dan diratakan diatas object glass.
4 Difiksasi dengan cara dipanaskan diatas nyala lampu bunsen.
5 Diteteskan larutan zat warna tinta cina diatas object glass hingga merata.
6. Dikeringkan dengan diangin-anginkan.
7. Diamati dengan menggunakan mikroskop.
8. Digambar bentuk bakteri.
3.3.3 Pewarnaan gram
1 Dibersihkan object glass dengan menggunakan alkohol sampai bebas lemak, lalu
dibersihkan lagi dengan tisu.
2 Difiksasi diatas nyala lampu bunsen.
3 Diambil secara aseptik satu ose suspensi bakteri dan diratakan diatas object glass.
4 Dikeringkan object glass dengan diangin-anginkan hingga terbentuk noda.
5 Difiksasi dengan dipanaskan diatas lampu bunsen.
6 Didinginkan, lalu diteteskan zat warna crystal violet sebanyak 2 atau 3 tetes dan
dibiarkan selama 1 menit.
7 Dicuci dengan aquades sampai sisa-sisa zat warna tercuci seluruhnya.
8 Dikeringkan dengan cara diangin-anginkan.
9 Diteteskan larutan lugol dan dibiarkan selama 1 menit.
10 Dicuci dengan aquades dan dikeringkan dengan diangin-anginkan.
11 Dicuci dengan alkohol selama 30 detik.
12 Diteteskan larutan zat warna safranin sebanyak 2 atau 3 tetes.
13 Dicuci dengan aquades.
14 Diamati dengan menggunakan mikroskop.
15 Digambar bentuk bakteri.
3.3.4 Perwarnaan spora
1 Dibersihkan object glass dengan menggunakan alkohol sampai bebas lemak, lalu
dibersihkan lagi dengan tisu.
2 Difiksasi diatas nyala lampu bunsen.
3 Diambil secara aseptik satu ose suspensi bakteri dan diratakan diatas object glass.
4 Dikeringkan object glass dengan diangin-anginkan hingga terbentuk noda.
5 Ditutup object glass dengan kertas saring.
6 Diteteskan malachite green sebanyak 2 atau 3 tetes.
7 Dilewatkan diatas api lampu bunsen hingga terlihat uap, jangan sampai zat warna
mendidih dan mengering.
8 Didiamkan 1 menit lalu dibuang kertas saring.
9 Dicuci dengan aquades dan dibiarkan selam 30 detik.
10 Diteteskan safranin dan dibiarkan selama 30 detik.
11 Difiksasi tanpa dipanaskan.
12 Diamati dengan menggunakan mikroskop.
13 Digambar bentuk bakteri.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Pengamatan
Tabel Hasil Pengamatan Bakteri Yang Terbentuk
No Gambar Keterangan1. Pewarnaan Sederhana 1. Bakteri
Bentuk: basil (tongkat)
Warna: ungu
Perbesaran okuler: 10x
Perbesaran objektif: 40x
Perbesaran total: 400
2. Pewarnaan Negatif 1. Bakteri
Bentuk: coccus (bulat)
Warna: transparan
Perbesaran okuler: 10x
Perbesaran objektif: 40x
Perbesaran: 400
3. Pewarnaan Gram 1. Bakteri
Bentuk: spirillum
Warna: merah
Perbesaran okuler: 10x
Perbesaran objektif: 40x
Perbesaran: 400
4. Pewarnaan Spora 1. Spora bakteri
Warna: merah
Perbesaran okuler: 10x
Perbesaran objektif: 40x
Perbesaran: 400
4.2 Pembahasan
Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satu macam zat warna
dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi
dan susunan selnya. Pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pada umumnya
antara lain kristal violet, metylen blue, karbol, fuchsin, dan safranin (Trie, 2012).
Pewarnaan negatif yaitu pewarnaan yang ditujukan terhadap bakteri yang sulit diwarnai,
dimana bakterinya tidak diwarnai melainkan latar belakangnya, metode pewarnaan
negatif merupakan suatu metode perwarnaan umum, dimana digunakan larutan zat
warna yang tidak meresap kedalam sel-sel bakteri melainkan melatarbelakangi sehingga
kelihatan atau nampak sebagai bentuk-bentuk kosong tak berwarna atau negatif (Trie,
2012).
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokan bakteri
gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna
crystal violet dan akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri
gram negatif akan kehilangan zat warna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol,
dan sewaktu diberi zat pewarna air fukhsin atau safranin akan tampak berwarna merah.
Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding
selnya. Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram antara lain crystal violet,
alkohol, safranin, dan iodine (Trie, 2012).
Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malachite green dan
safranin, yang dalam hasil pewarnaannya akan muncul warna hijau pada sporanya (Trie,
2012).
Prinsip pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang digunakan hanya terdiri
dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut yang merupakan suatu cara yang cepat
untuk melihat morfologi bakteri secara umum (Trie, 2012).
Prinsip pewarnaan negatif yaitu suatu metode pewarnaan tidak langsung dimana
digunakan larutan zat warna yang tidak meresap kedalam sel bakteri melainkan ke
dalam latar belakangnya (Trie, 2012).
Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri,
sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna dan
penambahan larutan pencuci (Trie, 2012).
Prinsip pewarnaan spora yaitu suatu metode pewarnaan yang menggunakan malachite
green dan safranin, yang dalam hasilnya pewarnaan akan muncul warna hijau pada
sporanya dan warna merah pada sel vegetatifnya (Trie, 2012).
Crystal violet adalah pewarna triarylmethane. Pewarna ini digunakan sebagai histologis
noda dalam metode gram klasifikasi bakteri. Crystal violet memiliki sifat-sifat anti
bakteri, jamur dan obat cacing. Crystal violet dipakai sebagai zat warna primer
dikarenakan mampu melekatkan bakteri pada kaca dan mencegah autolisis pada
sel, membuat sel-sel lebih kuat atau keras, mencegah mengkerutnya globula-globula
protein sel, mempertinggi sifat reaktif gugusan-gugusan, membunuh bakteri secara
cepat dengan tidak mengubah bentuk dan strukturnya, dan mengubah afinitas cat (Trie,
2012).
Nigrosin (tinta cina) adalah campuran dari pewarna sintesis hitam yang dibuat dengan
memanaskan campuran nitrobenzena, anilin, dan hidroklorida. Industri utamanya adalah
sebagai pewarna untuk pernis, dan tinta penanda pena. Didalam biologi, nigrosin
digunakan untuk pewarnaan negatif bakteri. Bentuk dan organisme yang terlihat
sebagai warna bebas menguraikan terhadap latar belakang gelap. Keuntungan dari
menggunakan metode ini daripada noda positif biasa seperti fuchsin, metilen blue, atau
carbol, ialah bahwa fiksasi sebelumnya oleh panas atau alkohol tidak diperlukan
sehingga organisme terlihat. Selain itu pewarnaan negatif dengan nigrosin dapat
mengungkapkan beberapa mikroorganisme yang tidak dapat diwarnai dengan metode
biasa (Trie, 2012).
Lugol’s iodide, juga dikenal sebagai solusi lugol, merupakan solusi dari iodium dan
iodida dalam air. Larutan yodium lugol digunakan sebagai antiseptik dan desinfektan,
dan untuk desinfikasi darurat air minum, dan pewarnaan dan tes medis. Fungsi larutan
lugol, yaitu meningkatkan aktifitas peningkatan zat warna oleh bakteri, untuk
memperjelas zat warna, dan mempersulit kelarutan zat warna (Trie, 2012).
Safranin adalah pewarna biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi. Safranin
digunakan sebagai counterstain dalam beberapa protokol pewarnaan. Mewarnai seluruh
inti sel darah merah. Hal ini juga dapat digunakan untuk deteksi tulang rawan. Safranin
biasanya memilki struktur kimia, juga trimetil safranin kedua senyawa berperilaku
dasarnya identik dan aplikasi pewarnaan biologi dan kebanyakan prosedur safranin
tidak membedakan diantara keduanya. Persiapan safranin komersial sering mengandung
campuran dari kedua jenis. Safranin juga digunakan sebagai indikator redoks dalam
kimia analitik. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan
pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, memberikan warna
pada mikroorganisme non target (Trie, 2012).
Alkohol yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel
bakteri (mikroorganisme). Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan
terjadinya dua kemungkinan yaitu, mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu,
bakteri menjadi tidak berwarna (Kesuma, 2013).
Pewarnaan malachite green adalah pewarnaan yang biasanya digunakan untuk melihat
bakteri batang pembentuk spora. Untuk membuat larutan malachite green dapat
digunakan bahan kimia dari malachite green oxalate (Kesuma, 2013).
Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna ungu pada
metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna ungu
setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak (Kesuma, 2013).
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding
selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma
organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme
gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram
positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (25 – 50 nm)
sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogannya tipis (1 - 3 nm) (Kesuma, 2013).
Tabel Perbedaan Bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif
Sifat Gram positif Gram Negatif
Komposisi dinding sel Kandungan lipid
rendah
Lipid tinggi
Ketahanan terhadap penisilin Lebih sensitif Lebih tahan
Penghambatan warna basa Lebih dihambat Kurang dihambat
Kebutuhan nutrien Kompleks Relatif sederhana
Ketahanan terhadap perlakuan fisik Lebih tahan Kurang tahan
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:
1. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
2. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11 - 22%), peptidoglikan terdapat
didalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering,
tidak mengandung asam tekoat.
3. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
4. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
5. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
6. Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
7. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
1. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15 - 80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1 - 4%), peptidoglikan ada
yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat
ringan. Mengandung asam tekoat.
3. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
4. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
5. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
6. Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
7. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut.
(Kesuma, 2013).
Mikroskop adalah alat yang di gunakan untuk melihat, atau mengenali benda-benda
renik yang terlihat kecil menjadi lebih besar dari aslinya.
Gambar 4.2 Mikroskop
Berikut adalah bagian-bagian mikroskop beserta fungsinya:
1. Lensa okuler, yaitu lensa yang dekat dengan mata pengamat lensa ini berfungsi
untuk membentuk bayangan maya, tegak, dan diperbesar dari lensa objektif.
2. Lensa objektif, lensa ini berada dekat pada objek yang diamati, lensa ini
membentuk bayangan nyata, terbalik, dan diperbesar. Dimana lensa ini diatur oleh
revolver untuk menentukan perbesaran lensa objektif.
3. Tabung mikroskop, tabung ini berfungsi untuk mengatur fokus dan menghubungan
lensa objektif dengan lensa okuler.
4. Pemutar kasar (Makrometer), makrometer berfungsi untuk menaik turunkan tabung
mikroskop secara cepat.
5. Pemutar halus (Mikrometer), pengatur ini berfungsi untuk menaikkan dan
menurunkan mikroskop secara lambat, dan bentuknya lebih kecil daripada
makrometer.
6. Revolver, revolver berfungsi untuk mengatur perbesaran lensa objektif dengan cara
memutarnya.
7. Reflektor, terdiri dari dua jenis cermin yaitu cermin datar dan cermin cekung.
Reflektor ini berfungsi untuk memantulkan cahaya dari cermin kemeja objek
melalui lubang yang terdapat dimeja objek dan menuju mata pengamat. Cermin
datar digunakan ketika cahaya yang dibutuhkan terpenuhi, sedangkan jika kurang
cahaya maka menggunakan cermin cekung karena berfungsi untuk mengumpulkan
cahaya.
8. Diafragma, berfungsi untuk mengatur banyak sedikitnya cahaya yang masuk.
9. Kondesor, kondensor berfungsi untuk mengumpulkan cahaya yang masuk, alat ini
dapat putar dan di naik turunkan.
10. Meja mikroskop, berfungsi sebagai tempat meletakkan objek yang akan diamati.
11. Penjepit kaca, penjepit ini berfungsi untuk menjepit kaca yang melapisi objek agar
tidak mudah bergeser.
12. Lengan mikroskop, berfungsi sebagai pegangang pada mikroskop.
13. Kaki mikroskop, berfungsi untuk menyangga atau menopang mikroskop.
14. Pengatur sudut, untuk mengatur sudut atau tegaknya mikroskop.
(Indriani, 2010).
Pada percobaan kali ini dilakukan beberapa jenis pewarnaan yaitu, pewarnaan
sederhana, pewarnaan negatif, pewarnaan gram, dan pewarnaan spora. Langkah pertama
adalah membersihkan object glass dengan alkohol agar bebas dari mikroba pengganggu,
lalu dibersihkan dengan aquades agar alkohol tidak menggangu proses pewarnaan
nantinya. Selanjutnya difiksasi, fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk
menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik dengan menggunakan grutaldehid
dengan proses pembakaran. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan
sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya.
Pada pewarnaan sederhana digunakan zat warna crystal violet. Dari percobaan yang
dilakukan pada pewarnaan sederhana didapatkan bakteri dengan bentuk basil dengan
menggunakan perbesaran 400. Pada pewarnaan negatif digunakan zat warna tinta cina.
Dari percobaan yang dilakukan pada pewarnaan negatif didapatkan bakteri dengan
bentuk coccus yang tampak transparan dengan menggunakan perbesaran 400. Pada
pewarnaan gram digunakan dua zat warna yaitu crystal violet dan safranin. Crystal
violet ini merupakan zat warna utama dalam pewarnaan gram, dan safranin merupakan
zat warna kedua karena safranin digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah
kehilangan zat warna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Sedangkan lugol
digunakan untuk mengintensifkan warna utama atau warna dari crystal violet. Dan
alkohol yang merupakan larutan pencuci digunakan untuk melunturkan zat warna
utama. Pada perwarnaan spora digunakan zat warna malachite green karena spora
bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa. Untuk pewarnaan
endospora, perlu dilakukan pemanasan supaya zat warna malachite green bisa masuk
ke dalam spora. Untuk itulah dilakukan pemanasan diatas api bunsen dengan ditutup
dengan kertas saring hingga terlihat uap. Pemanasan ini agar pori-pori bakteri membesar
sehingga zat warna malachite green dapat masuk dan dengan pencucian pori-pori
kembali mengecil menyebabkan zat warna malachite green tidak dapat dilepas
walaupun dilunturkan dengan alkohol, sedangkan pada badan bakteri zat warna
dilepaskan dan mengambil warna merah dari safranin. Pada percobaan ini didapatkan
spora yang seharusnya berwarna hijau, tetapi pada hasil pengamatan yang terlihat hanya
warna merah dari safranin.
Beberapa faktor kesalahan pada praktikum antara lain pemberian zat warna yang
berlebihan sehingga sel bakteri tidak nampak, kurang maksimalnya dalam proses fiksasi
sehingga masih ada bakteri yang belum mati, dan faktor yang lain adalah pada proses
pencucian terlalu deras dalam membilas zat warna dengan air sehingga dapat
menyebabkan bakteri larut terbawa air.
BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
a. Pewarnaan bakteri dipengaruhi faktor-faktor antara lain fiksasi, pelunturan warna,
substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup.
b. Fungsi dari pewarnaan bakteri adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk
bakteri, mengamati struktur dalam dan luar bakteri, dan reaksi terhadap pewarna
yang diberikan sehingga sifat fisik dan kimia bakteri dapat diketahui.
c. Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna ungu
setelah dicuci dengan alkohol pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif
akan mempertahankan zat warna ungu setelah dicuci dengan alkohol, sementara
bakteri gram negatif tidak.
5.2 Saran
Sebaiknya untuk praktikum selanjutnya dilakukan jenis-jenis pewarnaan yang lebih
beragam, misalnya pewarnaan tahan asam dan pewarnaan flagel.
DAFTAR PUSTAKA
1. Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang. Djambatan.
2. Indriani, Sulistya. 2010. Bagian-Bagian Mikroskop dan Fungsinya.
http://sulistyaindriani.wordpress.com/2010/07/12/bagian-bagian-mikroskop-dan-
fungsinya.html, diakses pada tanggal 30 April pukul 20.15 WITA.
3. Kesuma, Widi Indra. 2013. Praktikum Mikrobiologi Pewarnaan Bakteri.
http://widiindrakesuma.blogspot.com/2013/03/praktikum-mikrobiologi-
pewarnaan-bakteri.html, diakses pada tanggal 30 April 2013 pukul 19.23 WITA.
4. Pelczar, Michael. 1986. Dasar – Dasar Mikrobiologi. Jakata. U dan D.
5. Trie, Ita. 2012. Laporan Mikrobiologi Pewarnaan Bakteri.
http://itatrie.blogspot.com/2012/10/laporan-mikrobiologi-pewarnaan.html,
diakses tanggal 24 April 2013 pukul 16.53 WITA.
top related