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Observación microscópica
Examen Directo:
• Es la base del diagnóstico microbiológico
• Pone en evidencia la presencia de gérmenes, permite evaluar sus características morfológicas y su reacción a las diferentes coloraciones.
1. En fresco
2. Coloraciones
Examen Directo en fresco
• Permite ver las estructuras microscópicas sin alteraciones producto de los colorantes,
• Observar la movilidad de los gérmenes y estudiar la presencia de organismos viables que suelen destruirse con las coloraciones (Ej: trofozoitos).
– Montaje en solución salina
– Montaje en iodo
– Montaje en KOH
– Técnica de la tinta china
– Examen en campo oscuro
Coloraciones
• Distinguen los diferentes tipos de gérmenes gracias a la composición de su pared celular, sirviendo de orientación para el diagnóstico y tratamiento.
Morfología bacteriana
• La forma más sencilla de iniciar una identificación del microorganismo que se desea estudiar es realizar una coloración o tinción de Gram.
• La tinción de Gram es una tinción diferencial porque no todas las células se tiñen de la misma manera y permite discriminar entre dos grandes grupos de eubacterias, las eubacterias Gram (+) y Gram (-).
• El tercer grupo de eubacterias es el de los Bacilos Acido-Alcohol Resistentes (BAAR) que pueden ser diferenciados utilizando la coloración de Ziehl-Neelsen
Estructura de los Gram (+)
El
peptidoglicano
• Este peptidoglicano es una macromolécula gigante formada por cadenas de un dímero compuesto por N-acetilglucosamina y N-acetilmurámico
• Estas cadenas se encuentran unidas entre sí mediante péptidos, que son pequeñas cadenas de aminoácidos que se entrecruzan
• Rigidez: evita que la célula estalle en medios hipotónicos
• Porosidad: permite el paso de nutrientes desde el exterior y el movimiento de enzimas catalíticas y productos de secreción hacia el exterior de la célula
Estructura de los Gram (-)
Las bacterias Gram (+) son células con una gruesa pared celular de peptidoglicano.
Las bacterias Gram (-) son células con una delgada capa de peptidoglicano y una segunda envoltura denominada membrana externa
Preparación de los portaobjetos
• Hervir en detergente 10 minutos
• Enjuagar con agua destilada
• Enjuagar con alcohol
• Secar con un paño limpio que no deje pelusa.
• Almacenar en cajas cerradas
• Para reciclar los portaobjetos se los debe hervir en detergente 20 minutos y continuar con el proceso similar al de los portaobjetos nuevos.
COLORACIÓN DE GRAM
• Fijar la muestra
• Cubrir con cristal violeta durante 3 minutos
• Enjuagar con agua
• Cubrir con lugol durante 2 minutos
• Enjuagar con agua
• Decolorar con alcohol acetona
• Enjuagar con agua
• Cubrir con fucsina diluida 1 minuto
• Enjuagar con agua
Para tener en cuenta:
• Los extendidos de materiales compactos deben ser delgados
• Se debe distribuir el material de manera uniforme por toda la superficie del vidrio.
• No poner dos muestras en un mismo preparado.
• En materiales líquidos dejar secar al aire antes de fijar, no acelerar el proceso de secado.
• Identificar los vidrios del lado opuesto al de la coloración.
• Todas las bacterias, luego de la aplicación del colorante primario cristal de violeta aparecen violetas.
• Todas las células se tiñen con el colorante básico debido a que este interacciona con las cargas negativas del ADN.
• El mordiente lugol prepara a la célula para una coloración diferencial.
• El yodo entra por los poros de la pared celular y forma un complejo con el cristal de violeta.
• Este complejo es muy grande para atravesar los poros de la pared celular luego del lavado.
• El decolorante alcohol acetona, disuelve los lípidos de la pared celular
• La gran cantidad de lípidos que contiene la pared celular conforma grandes poros luego de la aplicación del colorante, por lo que el complejo cristal violeta-yodo es lavado.
• Hasta este punto las células pueden aparecer sin color Gram negativas o violetas Gram positivas.
• El colorante de contraste fucsina es usado para colorear células Gram negativas
Precauciones en Coloración de Gram
• Al fijar los extendidos a la llama se los debe flamear suavemente
• Antes de colorear con cristal violeta el preparado debe de estar frío.
• El cristal violeta y la fucsina deben de ser filtrados antes de usar.
• Respetar los tiempos de coloración en cada una de las etapas.
• Dejar secar los preparados al aire
¿Como mirar una coloración de Gram?
• Se debe realizar una observación macroscópica para determinar el lugar preciso del portaobjetos en el que se encuentra la muestras
• Se debe establecer si se ha decolorado excesivamente o si el extendido es demasiado grueso o delgado.
• Observar a menor aumento
• Un extendido excesivamente grueso es fácilmente reconocido porque resiste la decoloración, mostrando masas oscuras en las que no se pueden reconocer estructuras celulares.
• Ante la presencia de un problema, una forma de controlar la técnica de coloración y la efectividad de los reactivos usados, es hacer coloraciones de la flora bucal (saliva) en donde se encuentra habitualmente gran cantidad de gérmenes Gram (+) y Gram (-) así como también células epiteliales
¡Cuidado con los artefactos!
• Formas cocoides o bacilares de estructuras Gram (+) pueden confundir con gérmenes.
• Los gérmenes pueden tener sus características alteradas.
• Los gérmenes Gram (+) suelen aparecer como Gram variable o Gram (-) si sus paredes están alteradas.
• Examine la matriz de fondo.
• Cuando la muestra tiene muchos restos celulares, no se suelen ver bacilos gram (-) delgados.
• Sucede lo mismo, cuando hay predominancia de gérmenes Gram (+)
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