paviršiuje imobilizuoti fosfolipidų bisluoksniai baltymų ir membranų

Dr. Gintaras Valinčius

Vilniaus universitetas, Biochemijos institutas

Seminaras 2012-03-28/29 Kaunas/Vilnius

1

2007–2013 m. Žmogiškųjų išteklių plėtros veiksmų programos 3 prioriteto „Tyrėjų gebėjimų stiprinimas“ VP1-3.1-ŠMM-05-K priemonės „MTTP tematinių tinklų, asociacijų veiklos stiprinimas“ projektas „Lietuvos Biochemikų draugijos

potencialo kurti žinių visuomenę didinimas“ (Nr. VP1-3.1-ŠMM-05-K-01-022)

Biologinių membranų modeliai

2

Paviršiaus biofuncionalizavimas. Molekulinis membranų inkaras: dvi koncepcijos

+ + + + +

I. Pasinaudoti elektrostatine sąveika

II. Pasinaudoti hidrofobine/kovalentine sąveikomis

3

Kokios molekulės galėtų būti molekuliniais inkarėliais?

Hidrofobinė dalis, pavyzdžiui dimiristoilas

Hidrofilinė dalis, pvz. oligoetileno oksidas

Prijungimo prie paviršiaus grupė, pvz., tiolas (-SH)

4

Šiandien turime šiuos sintetinius tiolipidus: Dimiristoil , WC14 (EO6) Dioleoil, HC18 (EO6), DC18 (EO9) Dipalmitoil, FC16 (EO9) Palmiloil/oleoil FayC (EO6)

Naujos kartos tiolipido inkaras turės dvi „kojeles“:

5

ethanol

Step 2: Perkeliamas lipidas (RSE metodas)

Step 1: Formuojamas mišrus monosluoksnis

buffer

Ng 2008 SURF talk

Au Au

Bisluoksnis jungiamas prie paviršiaus

ethanol

6

Inkaro monosluoksnio formavimą galime stebėti:

Kontaktinio kampo pokyčiai

0

20

40

60

80

100

120

140

0 50 100

Co

nta

ct a

ng

le, d

eg

WC14, mol %

McGillivray, D.J.; Valincius, G.; Vanderah, et al. Biointerphases. 2, 21-32 (2007).

7

Inkaro monosluoksnio formavimą galime stebėti elipsometriškai:

0

1

2

3

4

0 50 100Ell

ipso

me

tric

th

icn

ess

, n

m

WC14, mol %

3.3 nm

8

McGillivray, D.J.; Valincius, G.; Vanderah, et al. Biointerphases. 2, 21-32 (2007).

IR spektroskopija rodo spiralinės ir netvarkios struktūros -C-C-O- fragmentus

9 Dimiristoil- Diloleoil-

Realiu laiku molekulinio inkaro formavimąsi galime stebėti paviršiaus plazmonų rezonanso pagalba: daugeliu atveju biofunkcionalizavimas baigiasi < 1 val.

10

Kaip galime įrodyti fosfolipidinės membranos susiformavimą?

11

Laidininkas

Laidininkas

Dielektrikas

Elektrinė dielektriko talpa: 𝐶 =𝜀𝜀0

𝑑

Si/Au

Elektrocheminio impedanso spektroskopija (EIS)

12

-3,50

-3,00

-2,50

-2,00

-1,50

-1,00

-0,50

0,00

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00

Im C

, m

F/c

m2

Re C, mF/cm2

0.1 Hz

0.1 Hz

Inkaras

Membrana

Elektrinės talpos sumažėjimas signalizuoja apie bisluoksnės membranos susidarymą

HC18/DOPC

Periferiniai įrenginiai EIS matavimams

13

Neutronų reflektometrija leidžia nustatyti detalesnę biologiškai funkcionalizuoto paviršiaus architektūra

14

Raudonas – krentantis ir atspindėtas n spinduliai; Oranžinis – prasiskverbęs n spindulys; Žali – išbarstyti nelygumų n atspindžiai.

NR matuojamas atspindėtų (k2) ir krentančių (k1) neutronų skaičiaus santykis

Neutronų atspindžio intensyvumas jautrus sluoksninei paviršiaus struktūrai su maždaug 1 Å rezoliucija

15

Atspindžio intensyvumas

Qz, Å-1

Qz

Sluoksniai sukuria interferenciniuss maksimums/minimumus NR kreivėse, todėl jų analizė leidžia (teoriškai) atkurti sluoksninę struktūrą

16

AND/R at NIST Center for Neutron Research, Gaithersburg, MD

17

ISIS Pulsed Neutron Facility, Rutherford-Appleton Laboratory, Oxfordshire, UK

18

2012-03-09

Biologinės membranos ypač tinka NR. Lengvieji atomai pasižymi intensyvia neutronų sklaida, todėl yra gerai matomi „neutronų šviesoje“, kurios bangos ilgis nuo maždaug 2 iki 10 Å

19

Struktūriniams tyrimams padeda neutronų sklaidos parametrų kontrastas tarp H ir D.

PI- fosfolipidų membranos pasižymi raiškiais spektrais

20

WC14 (dimiristoyl)/diphytanoyl bilayer

21 McGillivray et al. Biointerphases. 2 (2007) 21-33

NR uždavinys yra – nustatyti paviršiaus struktūrą, generuojančią stebimą neutronų atspindžio krievę. Mūsų sukonstruotų pi-FLM atveju pavyksta patikimai identifikuoti prognozuojamą molekulinę architektūrą.

WC14(dimiristoyl)/ Diphytanoyl tBLM

Lateralinis pi-FLM homogeniškumas

22

AFM WC14/DPhyPC

Membranų sudėties pokyčiai: fosfolipidų sudėties variacija

23

Fluorescencinė mikroskopija

24

Vezikulės su FŽ (LR-DOPE ) pažymėtu DOPC

Vezikulės su FŽ (Chol-NDB) pažymėtu Chol

Elektrocheminiai matavaimai rodo, kad Chol pernašą į pi-FLM lydima ryškiu el.talpos sumažėjimu

25

Chol pernaša iš vezikulių turi tokį patį efektą elektrinei talpai

26

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

Ele

ktr

inė

ta

lpa

, m

F/c

m2

Chol pernaša turi poveikį baltymų (toksinų) funkciniam aktyvumui

27

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Me

mb

ran

e c

on

du

cta

nce

, m

S

NR matavimai patvirtina, jog sąveika su vezikulėmis gali generuoti asimetriškas pi-FLM

A – dvisluoksnis suformuotas iš d54DMPC prieš sąveiką su vezikulėmis, B –

dvisluoksnis po sąveikos su hDMPC vezikulėmis.

D2O

H2O

D2O

H2O

Fosfolipidinė membrana

Aukso sluoksnis

Aukso sluoksnis

Tarpinės išvados

29

Sukurta technologija leidžia suformuoti įvairių sudėčių, tame tarpe ir iš biologinių fosfolipidų mišinių, membranų modelius, Atomine skyros fiziniai metodai verifikuoja pi-FLB struktūrą, pi-FLB sudėtį galime varijuoti sąveikos su vezikulėmis keliu. Galimas asimetrinių membranų modelių surfomavimas.

1. Membranas ardančių baltymų tyrimai

2. Poras formuojančių toksinų detekcija ir struktūriniai tyrimai

3. Membranos dielektrinę pažaidą sukeliančių baltymų oligomerų tyrimai.

30

31

Monitoring phospholipase activity with WC14-based tBLMs

PLA2

PL C

PL D

Ca2+ co-factor

Scooting mode

Elektrinė dielektriko talpa: 𝐶 =𝜀𝜀0

𝑑

EIS spektroskopija detektuoja membranos ardymą

32 Valincius, G.; et al. J.Phys. Chem. B.; 110 10213-10216 (2006).

+2 mM PLA2

NR atskleidžia struktūrinius ardomos membranos ypatumus

33

nS

DL

, Å-2

Išorinis membranos sluoksnis, ~33% vandens

-hemolizinas iš S.aureus

34

Song, L., Hobaugh, M., Shustak, C., Cheley, S., Bayley, H., Gouaux, J.E. Structure of staphylococcal alpha-hemolysin, a heptameric transmembrane pore. Science v274 pp.1859-1866 , 1996

Ryškūs EIS pokyčiai iki pat ~10 nM koncentracijos ribos

35

Duncan J. McGillivray, Gintaras Valincius, Frank Heinrich, et al. J, 96 (4) 1547 - 1553, (2009).

NR leidžia identifikuoti baltymo lokalizaciją membranoje

36

Duncan J. McGillivray, Gintaras Valincius, Frank Heinrich, et al. J, 96 (4) 1547 - 1553, (2009).

Įterptas į pi-FLM baltymas - funkcionalus

37

pi-FLM tinkamos nuo cholesterolio priklausomų citolizinų detekcijai. Cholesterolis pastebimai amplifikuoja toksino poveikį membranoms

38

Su Alzheimerio liga siejami -amiloidų oligomerai

39

In vitro galima gauti įvairių dydžių A(1-42) oligomerus

40

Protocol I (1-2 nm) Protocol II (5-10 nm) Protocol III (fibrils)

-amiloidų toksiškumas priklauso nuo oligomerų dydžio

41

Dideli (5-10 nm) A1-42 oligomerai neįtakoja pi-FLM EIS spektrų: nekinta nei pi-FLM talpa, nei laidis

42

0 2.5e-7 5.0e-7 7.5e-7

-7.5e-7

-5.0e-7

-2.5e-7

0

E'

E''

346_DOPC_101.txt346_DOPC_1.6uM Ab_big_102.txt

Maži (1-2) A1-42 oligomerai didina pi-FLM talpą ir laidį, taigi pažeidžią dielektrinį membranų barjerą.

43

WC14/DOPC

Gintaras Valincius, Frank Heinrich, Rima Budvytyte, et al. Biophys. J. 95 4845-4861, (2008).

Papildantys spektroskopiniai (SDG) metodai leistų tiksliau įdentifikuoti toksinius A varianatus

44 44

Fibrils Non-toxic (5-10 nm) oligomers

Toxic (~2 nm) oligomers

pi-FLM taikymas: chromatografiniai detektoriai

45 45

Human sample Primary

purification Separation &

Concentration

Amyloid- fractions

Chromatography UV D1 D2

Detectors

Total amyloid-

Necrotic-active

Apoptotic-active

Išvados

46

• Paviršiuje imobilizuotosios fosfolipidų membranos sudaro biologiškai tikrovišką terpę funkcionalių baltymų įterpimui. • Membranų modeliai yra stabilūs ir leidžia taikyti platų šiuolaikinių fizinių metodų spektrą jų charakterizavimui bei struktūriniams tyrimams. • Vystoma eksperimentinė pi-FLM platforma gali būti pritaikoma membranų integralumą pažeidžiančių baltymų detektavimui, pvz., biosensoriuose, chromatografiniuose detektoriuose, taip pat membranų pažaidos bei membraninių baltymų mechanizmo ir funkcijos tyrimams.

Padėka

47

Rima Budvytytė , Mindaugas Mickevicius, Tadas Ragaliauskas VU BChI Dr. David Vanderah, NIST Gaithersburg, MD, USA Dr. Vilmantė Borutaitė, Ramune Morkūnienė, Paulius Čižas – LSMU, NI. Dr. Aurelija Žvirblienė – VU BTI Habl. dr. Gediminas Niaura Center of Physical Sciences and TechnologyVilnius, Prof. Mathias Losche, Carnegie Mellon Univ. Pittsburgh, PA Frank Heinrich, NIST Gaithersburg, MD. Dalis pristatytų rezultatų yra gauti, vykdant LMT remiamą projektą „Paviršiuje imobilizuoti dirbtiniai fosfolipidų bisluoksniai funkciniam baltymų įterpimu (ImfaBITE)“ (paramos sutartis MIP-096/2011).