polymerase chain reaction (pcr). tópicos 1. dna 2. pcr –alvos –denaturação –primers...

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Tópicos

1. DNA 2. PCR

– Alvos – Denaturação– Primers– Anelamento

– Ciclos – Requerimentos

DNA

DNA é um ácido nucléico composto de duas cadeias antiparalelas complementares.

Os nucleotídeos são compostos de um grupo fosfato, uma pentose e uma base nitrogenada

DNA

• Acúcar do DNA – Ácido Desoxirribonucleico

• Açúcar do RNA– Ácido Ribonucleico

DNA

O DNA tem quatro bases nitrogenadas.

• Duas são chamadas purinas– Adenina ( A ), Guanina ( G )

• Duas são pirimidinas– Citosina ( C ), Timina ( T )

DNA

Essas quatro bases são ligadas em um padrão repetitivo por pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas

A ligação de duas cadeias complementares é chamada de HIBRIDIZAÇÃO.

DNA

Uma purina sempre se liga a uma pirimidina para manter a estrutura do DNA.

Adenina ( A ) se liga a timina ( T ), através de duas pontes de hidrogênio.

Guanina ( G ) se liga a citosina ( C ), através de três pontes de hidrogênio.

DNA

Examplo de padrão de ligação.• Padrão primário

CCGAATGGGATGCGGCTTACCCTACG

• Padrão complementar

DNA Molecule

AdeninaAdenina

TiminaTimina

GuaninaGuanina

CitosinaCitosina

PCR

PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) é uma técnica que amplifica uma sequência específica de DNA, como objetivo de torná-la abundante e disponível para diversas técnicas de biologia molecular.

OS Alvos do PCR

Os alvos a serem considerados no PCR são as regiões que flanqueiam a sequência específica de DNA a ser amplificada, a qual pode ser um gene inteiro ou somente uma região pequena.

PCR Targets

O número de bases nos alvos pode variar.

TTAAGGCTCGA . . . . AATTGGTTAA

O . . . . Representa o meio da sequência de DNA, e não há problemas em não conhecê-la para poder amplificá-la.

PCR - Desnaturação

A desnaturação é o primeiro passo do PCR, no qual as fitas de DNA são separadas através de aquecimento a 95°C.

PCR Primers

Os primers são sequências de 15 a 30 nucleotídeos, fita única, que são usadas para flanquearem as extremidades da região a ser amplificada. Marcam o início e o fim da seuqência-alvo.

PCR Primers

Um primer para cada extremidade da sua sequência alvo deve ser desenhado, para que as fitas sejam copiadas simultaneamente em ambas as direções.

PCR Primers

TTAACGGCCTTAA . . . TTTAAACCGGTTAATTGCCGGAATT . . . . . . . . . .>e <. . . . . . . . . .

AAATTTGGCCAATTAACGGCCTTAA . . . TTTAAACCGGTT

PCR Primers

OS primers são colocados em excesso na reação de PCR, para que eles se liguem ao DNA alvo, ao invés das duas fitas se ligarem de novo uma a outra.

PCR - Anelamento

O anelamento é o processo através do qual duas sequencias de nucleotídeos são ligadas através da formação de pontes de hidrogênio. Na reação de PCR, o anelamento se dá através da ligação dos primers com o DNA Alvo, a temperatura de 55°C.

PCR Taq DNA Polimerase

O nome Taq vem de Thermus aquaticus, a qual é uma bactéria encontrada sobrevivendo a altas temperaturas em geisers no Yellow Stone National Park.

PCR Taq DNA Polimerase

Essa bactéria produz uma enzima DNA polimerase, a qual amplifica o DNA a partir do anelamento com os primers, na presença de MG, a altas temperaturas.

PCR Ciclos

PCR Ciclos

PCR Ciclos

PCR Ciclos

PCR Cycles

PCR Ciclos

• Desnaturação: 94°- 95°C

• Anelamento: 55°- 65°C

• Extensão: 72°

• Número de ciclos: 25-40

PCR Ciclos

PCR Ciclos

PCR Ciclos

Número de cópias da Região alvo de DNA

A = 2n

n = número de ciclos

PCR Requerimentos

• Cloreto de Magnésio: .5-2.5mM

• Tampão: pH 8.3-8.8

• dNTPs: 20-200µM

• Primers: 0.1-0.5µM

• DNA Polimerase: 1-2.5 units

• DNA Alvo: 1 µg

Extração de DNA de células sanguíneas

Centrifugar, extrair e descartar o plasma, com o cuidado deNão remover a faixa de células brancas.

Extração de DNA de células sanguíneasExtrair cuidadosamente 200ul da região de células brancasE separar em tubos identificados

Extração de DNA de células sanguíneas

AdicionarProtease a Cada tubo

Adicionar Tampão deLise em cadatubo

Extração de DNA de células sanguíneasRealizarHomogeneizaçãoCriteriosa do material

Extração de DNA de células sanguíneas

Incubar os tubosA 56C por peloMenos 10min.

Extração de DNA de células sanguíneas

Centrifugar os tubospara retirar quaisquergrumos

Adicionar etanol para lavageme centrifugar de novo.

Extração de DNA de células sanguíneasAdicionar as maostras em colunas de afinidade e centrifugar .

Extração de DNA de células sanguíneas

Tubo com coluna

A coluna vai ser retiradae adaptada em outro tubono qual será feita a eluição

Coluna.

Esse eluato (flowthrough) seráDescartado.

Extração de DNA de células sanguíneas

A coluna será colocada em um novo tubo, aonde seráLavada mais duas vezes com tampão, para retirar quaisquerMoléculas que não estejam ligadas fortemente a coluna.

Extração de DNA de células sanguíneas

A coluna com o tubo é então centrifugadaMais uma vez, para remover excesso deTampão de Lavagem.O próximo passo é adicionar Tampão de

Eluição• Incuba-se por 30 minutos a 25C• O eluato da coluna é então guardado,

pois agora esse contém o DNA Alvo.

Extração de DNA de células sanguíneasEntão pode-se preparar o mix de PCR.

Mix de PCR

•10x Buffer - 10 µl

•MgCl - 6 µl

•dNTPs- 0.8 µl

•Primer forward - 2 µl

•Primer reverse - 2 µl

•Taq polimerase - 0.5 µl

•H2O estéril - 73.7 µl

Extração de DNA de células sanguíneas

Adicionar ao mix de PCR a amostra de DNA em tubosEspecíficos e colocar em termociclador.

Extração de DNA de células sanguíneas

Análise do produto de PCR.

Bibliografia

• Alberts, Brown,Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter. Use of PCR in Forensic Science. 1998. Online. Internet. 18 Jan. 2001. Available http://www.accessexcellence.org/AB/GG/

forensci_PCR.htm.l• Brown, John C. What The Heck Is PCR? 1995.

Online. Internet. 18 Jan. 2001. Available http://falcon.cc.ukans.edu/~jbrown/pcr.html• Photographs: Courtesy of UMC clinical lab and

Tom Wiggers.

Bibliografia

• Ronald H. Holton, Ph.D.:– Molecular Diagnostics in the Clinical

Laboratory– Molecular Biology in the Clinical

Laboratory– Molecular Pathology: Basic

Methodologies and Clinical Applications– Expanding applications of PCR, by Peter

Gwynne and Guy Page