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Polymerase Chain Reaction (PCR)

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Page 1: Polymerase Chain Reaction (PCR). Tópicos 1. DNA 2. PCR –Alvos –Denaturação –Primers –Anelamento –Ciclos –Requerimentos

Polymerase Chain Reaction (PCR)

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Tópicos

1. DNA 2. PCR

– Alvos – Denaturação– Primers– Anelamento

– Ciclos – Requerimentos

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DNA

DNA é um ácido nucléico composto de duas cadeias antiparalelas complementares.

Os nucleotídeos são compostos de um grupo fosfato, uma pentose e uma base nitrogenada

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DNA

• Acúcar do DNA – Ácido Desoxirribonucleico

• Açúcar do RNA– Ácido Ribonucleico

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DNA

O DNA tem quatro bases nitrogenadas.

• Duas são chamadas purinas– Adenina ( A ), Guanina ( G )

• Duas são pirimidinas– Citosina ( C ), Timina ( T )

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DNA

Essas quatro bases são ligadas em um padrão repetitivo por pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas

A ligação de duas cadeias complementares é chamada de HIBRIDIZAÇÃO.

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DNA

Uma purina sempre se liga a uma pirimidina para manter a estrutura do DNA.

Adenina ( A ) se liga a timina ( T ), através de duas pontes de hidrogênio.

Guanina ( G ) se liga a citosina ( C ), através de três pontes de hidrogênio.

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DNA

Examplo de padrão de ligação.• Padrão primário

CCGAATGGGATGCGGCTTACCCTACG

• Padrão complementar

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DNA Molecule

AdeninaAdenina

TiminaTimina

GuaninaGuanina

CitosinaCitosina

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PCR

PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) é uma técnica que amplifica uma sequência específica de DNA, como objetivo de torná-la abundante e disponível para diversas técnicas de biologia molecular.

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OS Alvos do PCR

Os alvos a serem considerados no PCR são as regiões que flanqueiam a sequência específica de DNA a ser amplificada, a qual pode ser um gene inteiro ou somente uma região pequena.

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PCR Targets

O número de bases nos alvos pode variar.

TTAAGGCTCGA . . . . AATTGGTTAA

O . . . . Representa o meio da sequência de DNA, e não há problemas em não conhecê-la para poder amplificá-la.

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PCR - Desnaturação

A desnaturação é o primeiro passo do PCR, no qual as fitas de DNA são separadas através de aquecimento a 95°C.

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PCR Primers

Os primers são sequências de 15 a 30 nucleotídeos, fita única, que são usadas para flanquearem as extremidades da região a ser amplificada. Marcam o início e o fim da seuqência-alvo.

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PCR Primers

Um primer para cada extremidade da sua sequência alvo deve ser desenhado, para que as fitas sejam copiadas simultaneamente em ambas as direções.

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PCR Primers

TTAACGGCCTTAA . . . TTTAAACCGGTTAATTGCCGGAATT . . . . . . . . . .>e <. . . . . . . . . .

AAATTTGGCCAATTAACGGCCTTAA . . . TTTAAACCGGTT

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PCR Primers

OS primers são colocados em excesso na reação de PCR, para que eles se liguem ao DNA alvo, ao invés das duas fitas se ligarem de novo uma a outra.

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PCR - Anelamento

O anelamento é o processo através do qual duas sequencias de nucleotídeos são ligadas através da formação de pontes de hidrogênio. Na reação de PCR, o anelamento se dá através da ligação dos primers com o DNA Alvo, a temperatura de 55°C.

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PCR Taq DNA Polimerase

O nome Taq vem de Thermus aquaticus, a qual é uma bactéria encontrada sobrevivendo a altas temperaturas em geisers no Yellow Stone National Park.

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PCR Taq DNA Polimerase

Essa bactéria produz uma enzima DNA polimerase, a qual amplifica o DNA a partir do anelamento com os primers, na presença de MG, a altas temperaturas.

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PCR Ciclos

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PCR Ciclos

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PCR Ciclos

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PCR Ciclos

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PCR Cycles

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PCR Ciclos

• Desnaturação: 94°- 95°C

• Anelamento: 55°- 65°C

• Extensão: 72°

• Número de ciclos: 25-40

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PCR Ciclos

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PCR Ciclos

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PCR Ciclos

Número de cópias da Região alvo de DNA

A = 2n

n = número de ciclos

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PCR Requerimentos

• Cloreto de Magnésio: .5-2.5mM

• Tampão: pH 8.3-8.8

• dNTPs: 20-200µM

• Primers: 0.1-0.5µM

• DNA Polimerase: 1-2.5 units

• DNA Alvo: 1 µg

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Extração de DNA de células sanguíneas

Centrifugar, extrair e descartar o plasma, com o cuidado deNão remover a faixa de células brancas.

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Extração de DNA de células sanguíneasExtrair cuidadosamente 200ul da região de células brancasE separar em tubos identificados

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Extração de DNA de células sanguíneas

AdicionarProtease a Cada tubo

Adicionar Tampão deLise em cadatubo

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Extração de DNA de células sanguíneasRealizarHomogeneizaçãoCriteriosa do material

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Extração de DNA de células sanguíneas

Incubar os tubosA 56C por peloMenos 10min.

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Extração de DNA de células sanguíneas

Centrifugar os tubospara retirar quaisquergrumos

Adicionar etanol para lavageme centrifugar de novo.

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Extração de DNA de células sanguíneasAdicionar as maostras em colunas de afinidade e centrifugar .

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Extração de DNA de células sanguíneas

Tubo com coluna

A coluna vai ser retiradae adaptada em outro tubono qual será feita a eluição

Coluna.

Esse eluato (flowthrough) seráDescartado.

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Extração de DNA de células sanguíneas

A coluna será colocada em um novo tubo, aonde seráLavada mais duas vezes com tampão, para retirar quaisquerMoléculas que não estejam ligadas fortemente a coluna.

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Extração de DNA de células sanguíneas

A coluna com o tubo é então centrifugadaMais uma vez, para remover excesso deTampão de Lavagem.O próximo passo é adicionar Tampão de

Eluição• Incuba-se por 30 minutos a 25C• O eluato da coluna é então guardado,

pois agora esse contém o DNA Alvo.

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Extração de DNA de células sanguíneasEntão pode-se preparar o mix de PCR.

Mix de PCR

•10x Buffer - 10 µl

•MgCl - 6 µl

•dNTPs- 0.8 µl

•Primer forward - 2 µl

•Primer reverse - 2 µl

•Taq polimerase - 0.5 µl

•H2O estéril - 73.7 µl

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Extração de DNA de células sanguíneas

Adicionar ao mix de PCR a amostra de DNA em tubosEspecíficos e colocar em termociclador.

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Extração de DNA de células sanguíneas

Análise do produto de PCR.

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Bibliografia

• Alberts, Brown,Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter. Use of PCR in Forensic Science. 1998. Online. Internet. 18 Jan. 2001. Available http://www.accessexcellence.org/AB/GG/

forensci_PCR.htm.l• Brown, John C. What The Heck Is PCR? 1995.

Online. Internet. 18 Jan. 2001. Available http://falcon.cc.ukans.edu/~jbrown/pcr.html• Photographs: Courtesy of UMC clinical lab and

Tom Wiggers.

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Bibliografia

• Ronald H. Holton, Ph.D.:– Molecular Diagnostics in the Clinical

Laboratory– Molecular Biology in the Clinical

Laboratory– Molecular Pathology: Basic

Methodologies and Clinical Applications– Expanding applications of PCR, by Peter

Gwynne and Guy Page


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