Polymerase Chain Reaction (PCR)
Tópicos
1. DNA 2. PCR
– Alvos – Denaturação– Primers– Anelamento
– Ciclos – Requerimentos
DNA
DNA é um ácido nucléico composto de duas cadeias antiparalelas complementares.
Os nucleotídeos são compostos de um grupo fosfato, uma pentose e uma base nitrogenada
DNA
• Acúcar do DNA – Ácido Desoxirribonucleico
• Açúcar do RNA– Ácido Ribonucleico
DNA
O DNA tem quatro bases nitrogenadas.
• Duas são chamadas purinas– Adenina ( A ), Guanina ( G )
• Duas são pirimidinas– Citosina ( C ), Timina ( T )
DNA
Essas quatro bases são ligadas em um padrão repetitivo por pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas
A ligação de duas cadeias complementares é chamada de HIBRIDIZAÇÃO.
DNA
Uma purina sempre se liga a uma pirimidina para manter a estrutura do DNA.
Adenina ( A ) se liga a timina ( T ), através de duas pontes de hidrogênio.
Guanina ( G ) se liga a citosina ( C ), através de três pontes de hidrogênio.
DNA
Examplo de padrão de ligação.• Padrão primário
CCGAATGGGATGCGGCTTACCCTACG
• Padrão complementar
DNA Molecule
AdeninaAdenina
TiminaTimina
GuaninaGuanina
CitosinaCitosina
PCR
PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) é uma técnica que amplifica uma sequência específica de DNA, como objetivo de torná-la abundante e disponível para diversas técnicas de biologia molecular.
OS Alvos do PCR
Os alvos a serem considerados no PCR são as regiões que flanqueiam a sequência específica de DNA a ser amplificada, a qual pode ser um gene inteiro ou somente uma região pequena.
PCR Targets
O número de bases nos alvos pode variar.
TTAAGGCTCGA . . . . AATTGGTTAA
O . . . . Representa o meio da sequência de DNA, e não há problemas em não conhecê-la para poder amplificá-la.
PCR - Desnaturação
A desnaturação é o primeiro passo do PCR, no qual as fitas de DNA são separadas através de aquecimento a 95°C.
PCR Primers
Os primers são sequências de 15 a 30 nucleotídeos, fita única, que são usadas para flanquearem as extremidades da região a ser amplificada. Marcam o início e o fim da seuqência-alvo.
PCR Primers
Um primer para cada extremidade da sua sequência alvo deve ser desenhado, para que as fitas sejam copiadas simultaneamente em ambas as direções.
PCR Primers
TTAACGGCCTTAA . . . TTTAAACCGGTTAATTGCCGGAATT . . . . . . . . . .>e <. . . . . . . . . .
AAATTTGGCCAATTAACGGCCTTAA . . . TTTAAACCGGTT
PCR Primers
OS primers são colocados em excesso na reação de PCR, para que eles se liguem ao DNA alvo, ao invés das duas fitas se ligarem de novo uma a outra.
PCR - Anelamento
O anelamento é o processo através do qual duas sequencias de nucleotídeos são ligadas através da formação de pontes de hidrogênio. Na reação de PCR, o anelamento se dá através da ligação dos primers com o DNA Alvo, a temperatura de 55°C.
PCR Taq DNA Polimerase
O nome Taq vem de Thermus aquaticus, a qual é uma bactéria encontrada sobrevivendo a altas temperaturas em geisers no Yellow Stone National Park.
PCR Taq DNA Polimerase
Essa bactéria produz uma enzima DNA polimerase, a qual amplifica o DNA a partir do anelamento com os primers, na presença de MG, a altas temperaturas.
PCR Ciclos
PCR Ciclos
PCR Ciclos
PCR Ciclos
PCR Cycles
PCR Ciclos
• Desnaturação: 94°- 95°C
• Anelamento: 55°- 65°C
• Extensão: 72°
• Número de ciclos: 25-40
PCR Ciclos
PCR Ciclos
PCR Ciclos
Número de cópias da Região alvo de DNA
A = 2n
n = número de ciclos
PCR Requerimentos
• Cloreto de Magnésio: .5-2.5mM
• Tampão: pH 8.3-8.8
• dNTPs: 20-200µM
• Primers: 0.1-0.5µM
• DNA Polimerase: 1-2.5 units
• DNA Alvo: 1 µg
Extração de DNA de células sanguíneas
Centrifugar, extrair e descartar o plasma, com o cuidado deNão remover a faixa de células brancas.
Extração de DNA de células sanguíneasExtrair cuidadosamente 200ul da região de células brancasE separar em tubos identificados
Extração de DNA de células sanguíneas
AdicionarProtease a Cada tubo
Adicionar Tampão deLise em cadatubo
Extração de DNA de células sanguíneasRealizarHomogeneizaçãoCriteriosa do material
Extração de DNA de células sanguíneas
Incubar os tubosA 56C por peloMenos 10min.
Extração de DNA de células sanguíneas
Centrifugar os tubospara retirar quaisquergrumos
Adicionar etanol para lavageme centrifugar de novo.
Extração de DNA de células sanguíneasAdicionar as maostras em colunas de afinidade e centrifugar .
Extração de DNA de células sanguíneas
Tubo com coluna
A coluna vai ser retiradae adaptada em outro tubono qual será feita a eluição
Coluna.
Esse eluato (flowthrough) seráDescartado.
Extração de DNA de células sanguíneas
A coluna será colocada em um novo tubo, aonde seráLavada mais duas vezes com tampão, para retirar quaisquerMoléculas que não estejam ligadas fortemente a coluna.
Extração de DNA de células sanguíneas
A coluna com o tubo é então centrifugadaMais uma vez, para remover excesso deTampão de Lavagem.O próximo passo é adicionar Tampão de
Eluição• Incuba-se por 30 minutos a 25C• O eluato da coluna é então guardado,
pois agora esse contém o DNA Alvo.
Extração de DNA de células sanguíneasEntão pode-se preparar o mix de PCR.
Mix de PCR
•10x Buffer - 10 µl
•MgCl - 6 µl
•dNTPs- 0.8 µl
•Primer forward - 2 µl
•Primer reverse - 2 µl
•Taq polimerase - 0.5 µl
•H2O estéril - 73.7 µl
Extração de DNA de células sanguíneas
Adicionar ao mix de PCR a amostra de DNA em tubosEspecíficos e colocar em termociclador.
Extração de DNA de células sanguíneas
Análise do produto de PCR.
Bibliografia
• Alberts, Brown,Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter. Use of PCR in Forensic Science. 1998. Online. Internet. 18 Jan. 2001. Available http://www.accessexcellence.org/AB/GG/
forensci_PCR.htm.l• Brown, John C. What The Heck Is PCR? 1995.
Online. Internet. 18 Jan. 2001. Available http://falcon.cc.ukans.edu/~jbrown/pcr.html• Photographs: Courtesy of UMC clinical lab and
Tom Wiggers.
Bibliografia
• Ronald H. Holton, Ph.D.:– Molecular Diagnostics in the Clinical
Laboratory– Molecular Biology in the Clinical
Laboratory– Molecular Pathology: Basic
Methodologies and Clinical Applications– Expanding applications of PCR, by Peter
Gwynne and Guy Page