princÍpios gerais do processo de inclusÃo em parafina

PRINCÍPIOS GERAIS DO PROCESSO DE INCLUSÃO EM

PARAFINA

Renata Coelho Freire Batista Queiroz

Escola Técnica Federal de Saúde

2009

Introdução

A maior parte dos tecidos não pode ser

observada in vivo. Devido a esse fato,

eles devem ser submetidos ao

processamento histológico, cujas

operações têm a finalidade de transformar

as células e tecidos em preparações

destinadas ao exame microscópico.

Introdução

As etapas do processamento histológico

desenvolvem-se em fases sucessivas, de

acordo com os princípios fundamentais da

técnica histológica.

Etapas do Processamento Histológico

Colheita do Material - Para se examinar

um tecido, é preciso, antes de tudo, retirá-

lo do organismo, morto ou vivo, isto é, por

meio de uma necrópsia ou de uma

operação cirúrgica;

Fonte: http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0102-

86502000000100001&script=sci_arttext

Etapas do Processamento Histológico

Fixação do Material: Os tecidos, em seu

estado natural, são geralmente opacos,

moles, frágeis e sujeitos à putrefação. Uma

das maneiras de torná-los mais duros e de

retardar os efeitos post mortem do tecido

consiste em mergulhá-los em líquidos

especiais chamados fixadores.

Fonte: www.lupe.com.br

FORMOL BOUIN

Etapas do Processamento Histológico

Redução da Peça – As dimensões da peça

poderão variar de acordo com o tipo do

material a ser analisado, mas a espessura

deve ser constante, devendo variar entre 2

a 6 mm.

Cassete

Fonte: www.anatomohistologia.uns.edu.ar

Processamento Histológico

Apesar do processo de fixação produzir umendurecimento apreciável dos tecidos, ela éinsuficiente para permitir a execução decortes muito finos ao micrótomo (4 - 6 μm).

Há duas maneiras de se endurecer mais ostecidos: através da congelação das peçasou pela inclusão em substânciassuficientemente duras.

Congelação

Micrótomo de Congelação Criostato

Fonte: www.lupe.com.br

Inclusão

Meios Aquosos – não é necessária adesidratação de peças. Esses meios sãomais usados para pesquisas de fisiologiacelular e histoquímica e anatomia vegetal.

Meios Anidros – os produtos de inclusãosão insolúveis em água, sendo, portanto,imprescindível a desidratação. Impregna-se a peça com o solvente do meio deinclusão.

Meios de Inclusão

Gelatina – usada para incluir peças

delicadas. Na técnica histológica é quase

que exclusivamente usada para a técnica

de Impregnações Argênticas de Rio

Hortega, em material escasso ou friável.

Goma Arábica Glicerinada – para

objetos duros e quitinosos, como pêlos de

mamíferos.

Aquosos

Meios de Inclusão

Celoidina – É feita a impregnação a frio

das peças, constituindo o método mais

indicado para tecidos que suportam mal

elevações de temperatura.

Por ser mais elástica que a parafina,

permite obter cortes muito grandes, por

isto ela é muito usada para o estudo

topográfico do sistema nervoso.

Anidros

Meios de Inclusão Anidros

Celoidina

Meios de Inclusão

Parafina – constitui o melhor meio de

inclusão para as colorações com

corantes naturais ou com as anilinas,

permitindo a obtenção de cortes finos,

inclusive seriados.

Anidros

Meios de Inclusão Anidros

Parafina

É bastante utilizada nos laboratórios dehistopatologia, principalmente pelobaixo custo e rapidez no processo deinclusão.

A principal desvantagem da parafinaestá no seu uso quando em tecidos dedifícil penetração (ossos, dentes).

Parafina

É um produto derivado dos resíduos da

destilação do petróleo. Foi descoberta em

1830 pelo alemão Carl Reichenbach.

Como seu nome indica (latim: parum =

pouca + affinis = afim), tem pouca

afinidade química, podendo-se conservar

indefinidamente.

Fonte: www.skpro.pt

Parafina

A parafina usada em histologia é um

corpo sólido cuja temperatura de fusão

varia entre 56°C e 58°C, tornando-se um

líquido incolor nessas temperaturas e de

cor amarelada quando superaquecida.

Parafina

Os solventes de parafina abaixam o seu

ponto de fusão e diminuem sua

consistência. À medida que a parafina

fundida se resfria, vai se solidificando,

processo caracterizado pela sua

cristalização.

Parafina

Ela é insolúvel em água e solúvel em xilol,

toluol e benzol.

Por ser insolúvel em água, não é possível

a inclusão direta dos tecidos em parafina,

logo após a fixação. É preciso realizar

uma série de operações prévias

relacionadas às propriedades da parafina.

Preparo das Peças para Inclusão

Em Parafina

São basicamente quatro etapas para a

inclusão em parafina:

1) Desidratação

2) Diafanização

3) Impregnação pela parafina

4) Inclusão ou formação do bloco de parafina

Preparo das Peças para Inclusão

em Parafina

Manual

Automático

Desidratação

Desidratação pelo Álcool

Sendo a parafina insolúvel em água, é

necessária a desidratação da peça, pois,

mesmo após a fixação, os tecidos retêm

cerca de 85% de líquido, em média.

Desidratação

Durante este processo, observa-se que aspeças diminuem sensivelmente detamanho, devido à saída de água dostecidos (retração).

Para evitar-se uma grande retração nostecidos, faz-se desidratação progressivadas peças.

70°

95° 100° 100°

Fonte: www.anatomohistologia.uns.edu.ar

Desidratação

Um tecido mal desidratado não diafanizabem, não deixa haver penetraçãosuficiente da parafina e,conseqüentemente, não permite bonscortes e colorações.

Para uma boa desidratação...

Respeitar os tempos necessários para

cada peça.

Despejar, no recipiente em que se está

depositada a peça, um álcool do qual se

conheça o número de vezes que foi

usado, e, portanto, sua real graduação.

Para uma boa desidratação...

O recipiente contendo a peça deverá seragitado constantemente.

O álcool deve ser renovado várias vezese os recipientes devem ter fundo largo,para que o volume de água seja o menorpossível nas imediações do local onderepousa a peça.

Álcool 70%60 min.

Desidratação

Álcool 95%60 min.

Álcool 100%60 min.

Álcool 100%60min

Álcool 100%60min

Álcool 70%............................. 1h

Álcool 95%..............................1h

Álcool 100%............................1h

Álcool 100%............................1h

Álcool 100%............................1h

Diafanização

Consiste em trocar por um solvente de

parafina, o álcool que impregna o objeto

desidratado.

Esta etapa é chamada diafanização, por

produzir uma transparência nos tecidos.

São utilizados solventes orgânicos como

xilol, benzol, toluol.

1 HORA

XILOL I XILOL II XILOL III

1 HORA

Para uma boa diafanização...

Não agitar o recipiente;

Usar recipientes estreitos;

Utilizar pelo menos 3 banhos de xilol, com

uma hora cada.

Impregnação pela Parafina

Não pode ser feita a frio, uma vez que a

parafina é sólida à temperatura ambiente.

Durante a impregnação, a parafina deve

ser mantida na estufa, um pouco acima de

sua temperatura de fusão, ou seja, entre

58-60°C.

Impregnação pela Parafina

Para facilitar a impregnação pela parafina,

convém usar o copo parafinizador, que

contêm crivos.

A última parafina a ser usada, que será

usada para a inclusão, deve ser sempre

nova.

Impregnação pela Parafina

Parafina I ..................................1 hora

Parafina II..................................1 hora

Parafina III.................................1 hora

Fonte: www.anatomohistologia.uns.edu.ar

Inclusão em Parafina

A peça é retirada do banho de parafina elevada para uma forma contendo parafinafundida;

Podem ser utilizados moldes de papel oubarras de Leuckhart, que são de metal epermitem o ajuste de acordo com otamanho da peça;

Fonte: www.anatomohistologia.uns.edu.ar

Inclusão em Parafina

Cada bloco deverá conter apenas um

fragmento de tecido. Caso sejam incluídos

vários fragmentos de peça, devem ser

dispostos de acordo com a sua

consistência.

Ao se colocar as Barras de Leuckart

sobre a placa metálica,

forma-se um molde.

Barras de Leuckart -duas peças metálicas

que ao se unirem formam um prisma.

Seqüência de Inclusão

Parafina

III

Fundida

A seguir, realiza-se opreenchimento do molde.

Confecção do Bloco de Parafina

Deixar que o bloco alcance a temperatura ambiente,para que solidifique.Desprender o bloco do molde e deixá-lo em água àtemperatura ambiente por algumas horas. Pode-se colocá-lo sobre o gelo ou no refrigerador.

Pinça aquecida pelo Bico de Bunsen

Peça

Introduzir e orientar a peça

Antes da completa solidificação, coloca-se a identificação da peça em umadas bordas;

Etiquetar o bloco

Seqüência de Inclusão

Inclusão em Parafina

Aparar o bloco com bisturi ou faca: apara-

se a face inferior, que será encaixada no

carro porta-objeto, e as laterais do bloco

(deixa-se em forma de paralelepípedo);

Inclusão em Parafina

Fonte: www.anatomohistologia.uns.edu.ar

ARTEFATOS DEVIDOS A

IMPREGNAÇÃO E INCLUSÃO

1) Impregnação Imperfeita da Parafina –

Morfologicamente, o tecido imperfeitamente

impregnado apresentará aspecto

semelhante ao de “terra queimada ou

seca”.

Os cortes se dispersam além do normal nobanho quente e os banhos de xilolcontraem os cortes em demasia. Estes, aovoltarem às dimensões originais,apresentam as rachaduras.

ARTEFATOS DEVIDOS A

IMPREGNAÇÃO E INCLUSÃO

3) Erro na Técnica de Inclusão – nainclusão múltipla, deve-se incluir cortes detecido em um mesmo bloco segundo suadensidade, para evitar que os cortes fiquemrasgados, quando na realização damicrotomia.

2) Inclusão Imperfeita – se o tecido não é

prontamente transferido do recipiente de

parafina para o molde de inclusão,

aparecerão rachaduras em volta dos

tecidos.

Resumindo...

DESIDRATAÇÃO

DIAFANIZAÇÃO

IMPREGNAÇÃO PELA PARAFINA

INCLUSÃO

Próximos Tópicos...

Microtomia Coloração

Montagem

das Lâminas

Questão para Revisão

Descreva detalhadamente as quatrooperações fundamentais para o processode inclusão em parafina.

Trazer na próxima aula!!!