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PROTOCOLOS ACTUALES DE CONGELACIÓN: ¿QUÉ Y CÓMO CONGELAR?

María Teresa Cañete ReinaE.S.H.R.E. Senior Clinical EmbryologistEmbryocenter Sevilla

CRIOPRESERVACIÓN

-CONGELACIÓN DE GAMETOS Y EMBRIONES A MUY BAJA TEMPERATURA:-80ºC A -196ºC-DISMINUCIÓN FUNCIONES VITALES-CONDICIONES DE VIDA SUSPENDIDAS-REACCIONES BIOQUÍMICAS DETENIDAS

-CONGELACIÓN Y ALMACENAMIENTO

CONGELACIÓN

•LOS EMBRIONES NO TRANSFERIDOS para uso posterior por:-fallo de embarazo

-segundo hijo

•TODOS LOS EMBRIONES por: -condiciones maternales adversas.

INDICADA PARA:•RETRASO MATERNIDAD por causas laborales ó sociales

•PACIENTES ONCOLÓGICAS (quimioterapia ó radioterapia)

•PACIENTES NO ONCOLÓGICAS ( tratamientos gonadotóxicos)

•CIRUGÍA REPETITIVA EN EL OVARIO COMO ENDOMETRIOSIS

•BANCO DE ÓVULOS

•POSPONER TRANSFERENCIA POR:

-RIESGO DE SHO-APARICIÓN PÓLIPOS ENDOMETRIALES-HIDROSÁLPINX-AUSENCIA DE ESPERMATOZOIDES-DIFICULTAD DE RECOGER LA MUESTRA DÍA DE PUNCIÓN-PACIENTES CON BAJA RESPUESTA PARA ACUMULAR OVOCITOS (DGP)

CONGELACIÓN LENTA

DAÑOS:

-CONGELACIÓN INTRACELULAR Y FORMACIÓN DE CRISTALES

-EFECTOS NOCIVOS DE LA SOLUCIÓN EN MEMBRANA CELULAR Y ORGÁNULOS CELULARES POR CONCENTRACIÓN DE ELECTROLITOS

FASES DEL PROCESO DE CONGELACIÓN:

PRECONGELACIÓN: Exposición y equilibrio a un crioprotector. Los crioprotectores modifican las propiedades físicas de una solución por bajar su punto de congelación.

-PRECONGELACIÓN-CONGELACIÓN-ALMACENAMIENTO

TIPOS DE CRIOPROTECTORES

• PERMEABLES ó INTRACELULARES: Bajo peso molecular

-Glicerol (G)-Dimetilsulfóxido (DMSO)-1,2 propanodiol-Etilenglicol (EG)-Propilenglicol (PG), -Polietilenglicol (PEG)-Etanol y otros alcoholes

FUNCIÓN-Entran en la célula -Reemplazan el agua intracelular-Modifican características fisico-químicas y respuesta frente al descenso de temperatura

MECANISMOS DE ACCIÓN:-Disminución punto de congelación de la suspensión.-Impiden formación de hielo

CRIOPROTECTORES• IMPERMEABLES O EXTRACELULARES: De alto peso molecular

-Polivinilpirrolidona (PVP)-Glucosa-Fructosa-Ficol-Dextrano -Sorbitol-Sucrosa-Lactosa-Trealosa, Rafinosa y otros azúcares

FUNCIÓN-Reducen agua intracelular por efecto osmótico

USO DE CRIOPROTECTORES EN EMBRIONES

• PRONÚCLEOS: Propanodiol y sacarosa

• 4-8 CÉLULAS: Dimetilsulfósido

• BLASTOCISTO: Glicerol

FASES CONGELACIÓN• CONGELACIÓN

• ALMACENAMIENTO

Pasos:

1EQUILIBRIO DE TEMPERATURAS entre la cámara de enfriamiento y el embrión

2ENFRIAMIENTO LENTO hasta llegar al punto de equilibrio de la congelación por debajo de la cual está la NUCLEACIÓN o formación primer cristal de hielo (-5ºC a -15ºC)

3SUPERENFRIAMIENTO:Diferencia entre el punto de equilibrio y nucleación.

-Cristalización espontanea del medio-Aumento de la temperatura debido al

desprendimiento de calor latente- Se puede bajar por “SEEDING” físico inducido cerca

del punto de equilibrio aprox 2ºC por debajo pto congelación

SEEDING :INDUCCIÓN NUCLEACIÓN-CERCA DELPUNTO DE EQUILIBRIO APROX 2ºC POR DEBAJO PTO CONGELACIÓN-TOCAR PARED EXTERIOR TUBO MUESTRA DONDE ESTÁ EMBRIÓN CON PINZAS PREENFRIADAS.-ENFRIAMIENTO DE LA SOLUCIÓN LOCALMENTE A UNA TEMPERATURA POR DEBAJO DE -20ºC NUCLEACIÓN ESPONTANEA-EMBRIÓN COMO OSMÓMETRO Y SE DESHIDRATA.

PLANER KRYO 10 serie II versión 1.7• UNIDAD DE SEEDING AUTOMÁTICA para aprox 16 embriones

• MODULO PELTIER TERMOELÉCTRICO que actúa como bomba de calor

• SUPERENFRIAMIENTO LOCAL

• INDUCCIÓN A LA NUCLEACIÓN

NICOOL MS21 SEEDING MANUAL

VITRIFICACIÓN

CARACTERÍSTICAS- ENFRIAMIENTO MUY RÁPIDO

- SOLUCIÓN ALTAMENTE CONCENTRADA QUE NO CRISTALIZA DURANTE LA CONGELACIÓN

- SU VISCOSIDAD AUMENTA CON EL DESCENSO DE TEMPERATURA HASTA LA FORMACIÓN DE UN ESTADO SÓLIDO AMORFO

- VOLUMEN MÍNIMO DE MEDIO (MENOS DE 0,1 MICROLITROS)

VITRIFICACIÓN ESPERMATOZOIDES

VITRIFICACIÓN:VENTAJAS

• No hay cristalización del embrión.

• Utiliza altas concentraciones de crioprotector que disminuye el período de exposición del embrión a éstos.

• El uso de pequeños volúmenes provee un incremento significativo en la tasa de enfriamiento.

• Tasas de enfriamiento entre 15.000 y 30.000ºC/min(0,3ºC/min en la congelación lenta)

• Se minimizan el daño por cambios osmóticos.

• Se reduce el tiempo del procedimiento (2-10´).

• Protocolo muy sencillo.

• Se eliminan los costos de adquisición de equipos.

• Al haber una mayor posibilidad de que un embrión implante, podemos transferir un menor número de embriones y con ello reducimos el riesgo de embarazo múltiple sin perder efectividad.

USO DE LAS DOS TÉCNICAS EN EMBRYOCENTER

• Congelación lenta: Embriones en estadío de desarrollo de día 1.

•  Vitrificación: desde ovocitos hasta embriones en cualquier estadio de desarrollo (desde día 2 hasta blastocisto).

MI EXPERIENCIA EN CONGELACIÓN LENTA/ VITRIFICACIÓN

PUBLICACIÓN EN AÑO 1990 EN REVISTA para pacientes

PUBLICACIÓN EN BOLETÍN INFORMATIVO

INTRODUCCIÓN: La vitrificación en triploides es un método de congelación en el que, debido a la alta concentración de crioprotectores y ultrarrápida velocidad de enfriamiento, cuando se congela el sistema embrión-medio, las moléculas se disponen de manera similar a las del vidrio (tiene igual disposición molecular e iónica que el líquido), solidificando sin formación de cristales de hielo;ésta tiene ventajas frente a la congelación tradicional, pero el principal problema para la aplicación a gran escala ha sido el control estricto del tiempo de exposición de los embriones al crioprotector, ya que debido a la alta concentración requerida del mismo, existen problemas de disminución de la viabilidad embrionaria. 

Un buen crioprotector debe tener alta solubilidad y baja toxicidad a altas concentraciones y, si es penetrante, bajo peso molecular para entrar fácil y rápidamente a la célula y obtener el máximo efecto protector.Para que los crioprotectores no penetrantes expresen al máximo sus carcterísticas deben ser mezclados con crioprotectores penetrantes.

OBJETIVO: Probar el método de vitrificación en triploides para ver la viabilidad de éstos y poderlos aplicar en la práctica clínica. 

MATERIAL Y MÉTODOS: Se emplearon 15 embriones en día +2 procedentes de zigotos triploides.Estos se expusieron secuencialmente a las soluciones de vitrificación que llevaban etilenglicol como crioprotector intracelular o penetrante, trehalosa como crioprotector extracelular o no penetrante de bajo peso molecular, para la deshidratación de las células, y hialuronato, crioprotector macromolecular para incrementar la viscosidad.Se usaron pajuelas de congelación convencionales de 0.3 ml rellenadas con 30-50 microlitros de la gota de solución de vitrificación con los embriones.Los embriones se almacenaron en nitrógeno líquido durante 30-60 minutos, y se descongelaron rápidamente en un baño a 37 grados centígrados.El contenido de las pajuelas se llevó a un medio tamponado con Hepes suplementado con 0.3 M de sacarosa.RESULTADOS: 13 (86%) de los 15 embriones triploides preservaron una morfología normal en todas las blastómeras y no mostraron signos de daño tras la descongelación; 1 embrión (7%) tuvo una sola blastómera dañada combinada con 3-5 blastómeras supervivientes; 1 embrión (7%) tuvo viabilidad en menos de la mitad de sus células.12 embriones (80%) incluyendo el embrión con una sola blastómera dañada continuaron con la división celular.

VITRIFICACIÓN EN TRIPLOIDES.

M.T. Cañete, M. Esbert, E. Moreno, C. Martinez.C.I.V.T.E. (Centro de Inseminación in Vitro y Transferencia Embrionaria) Sevilla

EMBRIONES NO DAÑADOS EMBRIONES DAÑADOS

EMBRIONES MUY DAÑADOS

86%

7% 7%

CRIOPROTECTORES PENETRANTES NO PENETRANTESALTO PESO MOLECULAR - Ficoll, Polivinilpirrolidona, etc...

BAJO PESO MOLECULAR Glicerol, Etilenglicol, etc.. Sacarosa, trehalosa, etc...

CONCLUSIÓN: El método de vitrificación con hialuronato podría ser un eficiente y simple método de criopreservación en embriones humanos.

VITRIFICACIÓN EN TRIPLOIDES

HIALURONATO

MEDIOS DE VITRIFICACIÓN/DESVITRIFICACIÓN

-Basic Solution (BS): 1 X 1.5ml vial (only for Oocyte Vitrification) -Equilibration Solution (ES): 1 X 1.5ml vial -Vitrification Solution (VS): 2 X 1.5ml vials 1 Cryotop stores up to 5 Oocytes or 4 Embryos as a recommendation.

- Thawing Solution (TS): 2 x 4.0ml -Diluent Solution (DS)- Washing-Solution (WS)

Composition ・ HEPES within Basic Culture Medium ・ Trehalose ・ Hydroxypropyl

Cellulose

DESVITRIVITRI

Composition ・ HEPES within Basic Culture Medium ・ Ethylene Glycol ・ DimethylSulfoxide ・ Trehalose ・ Hydroxypropyl Cellulose

PROTOCOLO VITRIFICACIÓN

ES VS

PROTOCOLO DESVITRIFICACION

VITRIFICACION OVOCITOS

PROTOCOLO VITRIFICACIÓN PARA EMBRIONES

CONCLUSIONESSOBRE VITRIFICACIÓN

• MEJOR CONSERVACIÓN DE LA ULTRAESTRUCTURA Y MENOR LESIÓN DE LA FISIOLOGÍA OVOCITARIA Y EMBRIONARIA. 

• PROPORCIÓN DE EMBARAZO ES SIMILAR A LA COMUNICADA PARA CICLOS EN FRESCO

• NACIDOS PARA LA VITRIFICACIÓN DE OVOCITOS PARECE TENER UNA INCIDENCIA DE ANOMALÍAS CONGÉNITAS (2.5%) NO MAYOR A LA COMUNICADA PARA LOS NACIDOS DE EMBARAZOS ESPONTÁNEOS EN MUJERES FECUNDAS O DE CICLOS FRESCOS DE FECUNDACIÓN IN VITRO.

• PROPORCIONA ELEVADA SUPERVIVENCIA OVOCITARIA, FECUNDACIÓN, DESARROLLO EMBRIONARIO Y EMBARAZO.

• ES UNA TÉCNICA SENCILLA Y ALTAMENTE REPRODUCIBLE QUE PUEDE BENEFICIAR A PAREJAS CON NECESIDAD DE POSTERGAR LA POSIBILIDAD DE EMBARAZO, INCLUIDAS LAS PACIENTES ONCOLÓGICAS.

GRACIAS POR SU

ATENCIÓN