reakční kinetika enzymových reakcí; regulace činnosti enzymů
Post on 30-Dec-2015
71 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
Reakční kinetika enzymových reakcí;
regulace činnosti enzymů
invertasa
sacharosa + H2O glukosa + fruktosa
hexosafosfátisomerasa D-glukosa-6-fosfát D-fruktosa-6-fosfát
Reakční kinetika enzymových reakcí
Časová závislost koncentrace substrátu [S] a produktu [P] monomolekulární přeměny S P.
k1 = 0,01 s-1, k-1 = 0 s-1 pro případ 1 ("nevratná reakce")
k1 = 0,006 s-1 a k -1 = 0,00375 s-1 pro případ 2 (vratná reakce)
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0,18
0,2
0 100 200 300 400 500 600
t [s]
[S]
a [P
] [m
ol/l]
1[P]
2[P]
2[S]
1[S]
Reakční kinetika enzymových reakcí
Základní definice: pro náš případ: = -
Základní model: k1 k2
E + S ES(EP) P + E k -1 k -2
Zanedbat zpětnou reakci?
k1 k2
E + S ES P + E k-1
vdc
dt
i
i =
.
vd P
dt =
[ ] d S
dt
[ ]
Reakční kinetika enzymových reakcí
monomolekulární přeměna S P
Další důležité pojmy: definice limitní rychlosti: Vlim = k2 . [Eo] = číslo přeměny = molekulová (molární) aktivita enzymu
Katalytická aktivita enzymového preparátu ( množství aktivního enzymu) K čemu to? - kupuji enzym (cena za jednotku) - kolik potřebuji enzymu pro reakci - koncentrace katalytické aktivity (kat/ml) - klin. biochemie Katalytickou aktivitu 1 katalu (1 U) vykazuje enzymový preparát, který za definovaných podmínek (pH, pufr, teplota) při nasycení substrátem přemění 1 mol (1 mol) substrátu za 1 sec (1 min).
V
Ek k
ocat
lim
[ ] 2
počet molů substrátu, které je 1 mol enzymu schopen přeměnit při saturacisubstrátem za jednotku času = kolik molekul substrátu je za stejných podmínek
schopna přeměnit 1 molekula enzymu za jednotku času
když [E0] = [ES]
Číslo přeměny = molekulová (molární) aktivita enzymu
Reakční kinetika enzymových reakcí
Jak určit hodnoty KM a Vlim?
metoda počátečních reakčních rychlostí: závislost vo na [S]
Metoda nelineární regrese:Odhad KM = 1,8 mmol.dm-3 a Vlim = 2,5 mmol.dm-3.min-1
"Správné" hodnoty: KM = 2,04 0,43 mmol.dm-3,
Vlim = 2,04 0,16 mmol.dm-3.min-1
Reakční kinetika enzymových reakcí
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
0 1 2 3 4 5 6
[S] [mmol/l]
v o
[mm
ol/l
/min
]
Michaelisovská závislost počáteční reakční rychlosti na koncentraci
substrátu.
Závislost počáteční reakční rychlosti na pH a teplotě
- následný mechanismus (postupný, sekvenční)
- náhodný - uspořádaný - "ping-pongový"
E-P + S1 E-P* + P1
E-P* + S2 E-P + P
S1 + S2 P1 + P2
A
E EAB EPQ E E B Q
P
Q
VÍCESUBSTRÁTOVÁ KINETIKA
"ping-pongový„ mechanismus
- positivní homotropní allosterický efekt (allosterické enzymy)- heterotropní allosterický efekt
vV S
K So
n
n=
.[ ]
+ [ ]
lim
"NEMICHAELISOVSKÉ" ENZYMY
Alosterické enzymy
Regulace enzymové aktivity
•na úrovni transkripce a translace (konstitutivní a induktivní)
•pomocí změn kovalentní struktury (řízeno specifickými enzymy)
- nevratné (aktivace štěpením peptidové vazby - proenzymy)
- vratné (fosforylace, adenylace...)
•efektory (aktivátory a inhibitory)
Regulace enzymové aktivity
Regulace enzymové aktivity
INHIBICE:
- nevratná-vratná: a) substrátem b) kompetitivní (competitive) c) akompetitivní (acompetitive) d) nekompetitivní (noncompetitive)
KE I
EII =
[ ].[ ]
[ ]v
V S
KI
KS
o
MI
=.[ ]
. +[ ]
]
lim
[1
KM´ = , V´lim = VlimK
I
KM
I. +
[ ]1
Kompetitivní inhibice
Kompetitivní inhibice
KES I
ESII =
[ ].[ ]
[ ]
Akompetitivní inhibice
v
V
I
K
S
KI
K
So
I
M
I
=
+[ ]
]
+[ ]
]
lim.[
[
1
1
Akompetitivní inhibice
Nekompetitivní inhibice
KE S
ES
EI S
ESIS =
[ ].[ ]
[ ]
].[ ]
[ ]
[
KE I
EI
ES I
ESII =
[ ].[ ]
[ ]
].[ ]
[ ]
[
v
V S
I
KK S
o
IS
=.[ ]
+[ ]
+ [ ]
lim
.1
VI
KI
lim
([ ]
)1V´lim =
Nekompetitivní inhibice
Regulace enzymové aktivity
Allosterická inhibice (aktivace)
PříkladPříklad
Při studiu enzymové reakce byly pro následující výchozí koncentrace substrátu změřeny počáteční rychlosti reakce:
S [mol/dm3] 6,25 .10-6 7,5 . 10-5 1,0 .10-4 1,0 .10-3 1,0 .10-2
vo [nmol/dm3 . min] 15 56,25 60 74,9 75
a) Odhadněte hodnoty Km a Vlim.
b) Jaká bude počáteční rychlost při koncentracích substrátu
2,5 . 10 –5 a 5 . 10-5 mol/dm3 ?
Imobilizace enzymů
Vazba na nosič Zachycení (entrapment)
sorpcí Kovalentní vazbou V matrici geluOpouzdření
(encapsulation)
Imobilizované enzymy
Definice IUPAC - enzymy, které jsou fyzicky ohraničeny nebo lokalizovány, zachovávají si svoji aktivitu a mohou být použity opakovaně a kontinuálně
BiotechnologieBiotechnologie
Definice?
Aplikace biologických vědních oborů a inženýrských disciplin k přímému nebo nepřímému využití živých organismů nebo jejich součástí v jejich přirozené nebo modifikované podobě.
Přednosti:
surovinová základna, energetická nenáročnost, šetrnost k životnímu prostředí
Nevýhody:
Vysoké náklady na V a V, malá efektivnost?
Biotechnologické směryBiotechnologické směry
1. Průmyslová mikrobiologie
a) Fermentační (ethanol, kyselina citronová)
b) Produkty biosynthes (primární a sekundární metabolity, biopolymery),
c) Biotransformace
d) Biomasa
2. Průmyslové biotechnologie
3. Biotechnologie životního prostředí (bioremediace)
4. Živočišné biotechnologie
5. Biotechnologie užitkových rostlin
6. Veterinární a medicínské biotechnologie
Využití enzymů → aplikovaná enzymologieVyužití enzymů → aplikovaná enzymologie
využití enzymů, resp. enzymových systémů, včetně celých buněk:
průmysl potravinářský a nepotravinářský
klinická biochemie (diagnostika a stanovení analytů)
farmaceutika
Technologicky významné enzymy Hydrolasy (80%) – 50% proteasy, 50% glykosidasy Isomerasy GI (12% !) Oxidoreduktasy – (GOD - analytika) Ostatní (5 - 7%)
Zdroje technických preparátů enzymů: Mikrobiální (bakterie a plísně) - extremofilní MO rekombinantní technologieživočišné a rostlinné
PříkladyPříklady Biodetergenty
(proteasy, amylasy, lipasy, celulasy, peroxidasy)
Hydrolýza škrobu (amylasy, GI, transferasy)
Mlékárenství (chymosin)
Hydrolýza proteinů
……. až po „biostoning“ (celulasy)
top related