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Techniken der

Nukleinsäure- und

Protein-Biochemie

Techniken der Nukleinsäure-Biochemie

Klonierung in einen

Expressions- Vektor

Bestimmung der DNA- Sequenz

Transformation von E.coli oder andere

Zellen

Präparation von synthetischen

Peptiden

Herstellung von spezifischen Antikörpern

Gen oder cDNA

Protein

PCR

PCR

Restriktion, Analyse Ligation Expression

(Primer-) Synthese

Klonierung von DNA

1.) Rekombinante DNA Techniken beruhen auf der Fähigkeit große Mengen an identischen DNA Molekülen (Klone) herzustellen.

2) Durch Einbau von DNA Stücken in Vektoren, die in eine Wirtszelle eingeführt werden, können Klone erzeugt werden.

3) Durch die Replikation des Vektors wird auch das DNA-Stück von Interesse vervielfältigt.

4) Die am häufigsten verwendeten Vektoren sind E.coli Plasmid Vektoren und λ Bakteriophagen Vektoren.

Eine Gen für eine Antibiotika-Resistenz erlaubt einfache Selektion der transformierten Zellen Ampicillin-Resistenz

“Selektionsmarker”

Was benötigt man für eine Klonierung ?

•  Vektor •  Gen

•  Enzyme

•  Vorarbeiten: –  Vektorpräparation –  Gen (Insert)

mittels: PCR Verdau Synthese

Klonierung von DNA mit Plasmid Vektoren

Transformation

DNA-Präparation

Mit Hilfe der PCR kann eine bestimmte DNA Sequenz (z.B. Gen) durch Vervielfältigung aus einer großen Ansammlung von vielen unterschiedlichen DNA Sequenzen isoliert werden.

Allerdings muss zumindest eine kurzes Stück der DNA Sequenz am Anfang und am Ende des gewünschten Gens bekannt sein.

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Zu vervielfältigendes Gen DNA DNA

GGATCC BamHI

Primer 1

XbaI TCTAGA

Primer 2

DNA-Polymerase

DNA-Polymerase

PCR

•  Entwickelt 1985 von Kary Mullis (1993 Nobelpreis) •  In vitro Vervielfältigung von DNA (= Amplifizierung)

–  DNA-Vorlage (= Matrize; Template) –  komplementäre Strangsynthese durch DNA-Polymerasen –  Startpunkt: kurze, komplementäre, einzelsträngige DNA-

Abschnitte (= Primer, können Schnittstellen einführen)

Komponenten im PCR-Ansatz

•  Matrize/Template (DNA oder RNA → cDNA)

•  DNA-Polymerase •  Primer (synthetische Oligonukleotide) •  dNTPs (als Bausteine) •  geeigneter Puffer •  Mg2+ (für die Polymerase)

1. Erste Denaturierung: 5 min/94°C 2.

a) Denaturierung 30 sec/94°C b) Annealing 30 sec/ x °C c) Elongation x sec/72°C

3. Finale Elongation 10 min/72°C 4. Abkühlung 4°C

Die PCR ist ein zyklischer Prozess

20-35x Pol-abhängig

Primer-abhängig Gen-abhängig Pol-abhängig

PCR (polymerase chain reaction)

2 Primer -forward -reverse

PCR (polymerase chain reaction)

PCR (polymerase chain reaction)

DNA-(Primer-)Synthese

Chemische DNA Synthese

Chemische DNA Synthese

Chemische DNA Synthese

Chemische DNA Synthese

Chemische DNA Synthese

Analyse von DNA

-Fragmenten und

-Sequenzen

Kontrolle der PCR durch Gelektrophorese , Trennung von DNA Fragmenten

Visualisierung der DNA-Fragmente erfolgt durch Ethidiumbromid oder

radioaktive Markierung

PCR erfolgreich!

-> Zusammenfügen von Vektor und Gen?

Die Einhaltung der Sequenz und damit verbunden die Triplettabfolge muss

gewährleistet sein

GST

Restriktionsendonucleasen schneiden dsDNA an spezifischen Sequenzen

Schnittstelle

Restriktionsenzyme: DNA-Fragmente

1.  Glatte/stumpfe Enden (blunt end) 2.  3´-überhängende Enden (sticky ends, cohesiv) 3.  5´-überhängende Enden (sticky ends)

1.

2.

3.

Restriktionsenzyme aus verschiedenen Bakterien

schneiden unterschiedliche DNA-Sequenzen.

Diese Sequenzen sind meistens Palindrome.

Methylierte Basen an der Schnittstelle schützen die DNA vor dem Restriktionsenzym

Figure 7-7

Restriktionsfragmente mit komplementären ‘sticky ends’ können leicht verknüpft werden

DNA-Ligase

•  Knüpft Phosphodiesterbindungen –  Schließt Strangbrüche in DNA –  Replikation, Rekombination –  Freie 5´-Phosphat-Gruppe + 3´-OH-Gruppe –  ATP/NAD+-Verbrauch (1 – 5 mM ATP)

•  Molekularbiologie –  Verknüpfung von DNA-Fragmenten –  T4 DNA-Ligase

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5´-3´-Phosphodiesterbindung

Stryer: Biochemie

Schnittstellenproblematik

•  Schnittstellen kommen mit einer gewissen Häufigkeit in jedem Genom vor

•  Was wenn die Schnittstellen nicht passen oder im Genom vorhanden sind?

Modifizierte Vektoren enthalten Polylinker, die

eine Klonierungen mit unterschiedlichen

Restriktionsenzymen ermöglichen.

DNA Analyse

Figure 7-24

Durch Mehrfach-Restriktionsanalyse können DNA Fragmente identifziert werden

DNA-Sequenzierung mit der Dideoxy- Methode

(oder Sanger- oder Kettenabbruch-Methode)

Es werden 4 getrennte DNA- Polymerase Reaktionen durchgefuehrt (jeweils mit einem der 4 Dideoxy-NTPs)

Die Sanger Methode

1 Primer -forward ODER -reverse

Die Sanger Methode (II)

Fluoreszenzfarbstoff-markierte Nucleotide werden für moderne DNA-Sequenziergeräte verwendet

in vitro Mutagenese

•  Deletionen N- oder C-terminale Verkürzung Entfernen von Domänen –  PCR

•  Substitutionen –  Gerichtete Mutagenese

•  Insertionen –  Cassetten Mutagenese

•  Designer Gene

Deletionen

•  Primerdesign auf DNA-Ebene und PCR des gewünschten Bereichs.

Gerichtete Mutagenese (site-directed mutagenesis)

mit Hilfe der PCR

CAC -> GTC => Punktmutation Histidin -> Valin

Site-directed mutagenesis (Quikchange) (Stratagene)

Bild: Caitlin Smith, Nature Methods, 2007 Schema nach Stratagene

Einführung einer Mutation in einem Plasmid mittels PCR

1.  Mutagenese •  Zwei komplementäre Primer mit der Mutation annealen am Template

•  mittels PCR wird das gesamte restliche Plasmid hergestellt

2. Abbau des Templates •  DpnI schneidet methylierte Sequenzen, (nur im Template)

3. Transformation •  Bakterien werden mit dem mutierten Plasmid transformiert

Cassetten Mutagenese

Gezielter Genaustausch Transfervektor

Genom

Transgene Tiere

Spezielle PCR: Reverse Transkription Erzeugung von cDNA (= complementary DNA) aus mRNA

Translation

Protein

splicen

Transkription

Exon Exon Exon Intron Intron Intron Exon DNA

frühe mRNA

späte mRNA

Herstellung einer frühen mRNA, die noch Introns enthält

Herausschneiden der Introns

•  Bei Eukaryoten sind Gene durch Introns unterbrochen •  In vivo werden die Introns aus der RNA herausgeschnitten

Reverse Transkription (RT) cDNA-Erststrangsynthese

AAAAAA 5´ 3´

Oligo-T- Primer

RNA

RNA DNA

Reverse Transkription 1 h/37°C

RNA-Degradation (RNaseH)

cDNA

cDNA: complementary/copy DNA

DNA wird durch ‘Southern blotting’ spezifisch nachgewiesen

mRNAs werden durch ‘Northern blotting’ spezifisch nachgewiesen

Techniken der Protein-Biochemie

Klonierung in einen

Expressions- Vektor

Bestimmung der DNA- Sequenz

Transformation von E.coli oder andere

Zellen

Präparation von synthetischen

Peptiden

Herstellung von spezifischen Antikörpern

Gen oder cDNA

Protein

Protein

Bestimmung der Amino-

säuresequenz

Synthetische Oligonukleotide

als Sonden

Analyse einer cDNA Bank mit

Southern blotting

Herstellung spezifischer Antikörper

Expression einer DNA Library und Analyse

durch Western blotting Gen oder

cDNA

Primärstruktur

N-Terminus Amino-Terminus

C-Terminus Carboxy-Terminus

1. Sequenzierung

und

2. Chemische Synthese

Edman Abbau

PITC Phenyl-isothiocyanate

DABITC 4-[4-(Dimethylamino)phenylazo]phenylisothiocyanate

Edman Abbau, 1. Schritt: Kopplung

1. Kopplung: In diesem ersten Schritt wird an die freie N-terminale Aminogruppe der Peptidkette das „EDMAN-Reagenz“ Phenylisothiocyanat (PITC) gekoppelt. Dabei entsteht in annähernd quantitativer Ausbeute ein Phenylthiocarbamylpeptid (PTC-Peptid).

Edman Abbau, 2. Schritt: saure Spaltung

2. saure Spaltung: Durch den säurekatalysierten nucleophilen Angriff des Schwefels an der ersten Peptidbindung kommt es zur Abspaltung der N-terminalen Aminosäure als Anilinthiazolinon-Aminosäure (ATZ-Aminosäure).

Edman Abbau, 3. Schritt: Konvertierung

3. Konvertierung, saure Hydrolyse: Die instabile ATZ-Aminosäure wird mit wäßriger Säure linearisiert und bei erhöhter Temperatur zur relativ stabilen Phenylthiohydantoin-Aminosäure (PTH-Aminosäure) umgelagert. Die PTH-Aminosäuren werden chromatographisch (HPLC) anhand der Retentionszeiten oder der Rf Werte bei Dünnschichtchromatografie, eines Referenzlaufes identifiziert.

wässrige F3CCOOH

Dünnschichtchromatographie TLC = Thin Layer Chromatography

Rf-Wert= Strecke: Start-Protein Strecke: Start-Laufmittelfront

a b

c

Auftragung nach Lauf

1

2

a Rf1= -------- c

Laufmittel:

Dünnschichtchromatographie TLC = Thin Layer Chromatography

1 2 1 2

Laufmittel 1 Pyridine/H2O

Laufmittel 2 Butanol/Formic acid/H2O

1. Laufrichtung 2. Laufrichtung

Herstellung von Peptiden und Proteinen

Synthetische Peptide werden auch durch eine Festphasen-Methode hergestellt

(Bruce Merrifield)

Kopplung der C-terminalen Aminosäure an das Säulenmaterial

Abspaltung der Schutzgruppe am Aminoende

Kopplung mit der nächsten Aminosäure

Ablösen des fertigen Peptids

Ausbeute der Kopplung in Abhängigkeit der Zyklen

Anzahl der As im Peptid

Ausbeuten an Peptid, wenn die Effizienz pro Zyklus folgende ist

Limitierung in der Länge der Peptide !

Herstellung rekombinanter Proteine

Überexpression eines Gens oder cDNA möglich in

- E. coli - S. cerevisiae - Insektenzellen (Bacculovirus-System)

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Expressionsvektoren

-Dienen der Expression des Zielproteins

-oft ein TAG an N oder C-Terminus

-oft eine Protease Schnittstelle vor der MCS

-unterschiedliche Promotoren

-Organismus spezifisch (Säuger, Hefe, Insekten, Bakterien)

GE-Healthcare, Freiburg

Induktion mit IPTG

Isopropylthio-ß-D-galactopyranosid

Keine Verstoffwechselung durch die Zelle möglich!

Der lac Operator

Bindung des IPTG ändert Konformation und verhindert so DNA-Bindung

Herstellung rekombinanter Proteine

•  direkte Methode •  zelleigene RNA-Polymerase

wird verwendet. Zielgen ist in das Lac-Operon integriert, Expression erst druch Freilegung des Promotors möglich

•  indirekte Methode •  Induktion der Expression der

T7-Polymerase. Zielgen unter Kontrolle des T7 Promotors

Variablen der Expression

•  Zellstamm •  Medium •  Vektortyp

•  Temperatur •  Dichte •  Expressionsdauer

Weitere Induktoren

•  Tryptophan •  Arabinose

•  Temperatur –  Hitze –  Kälte

Expressionskontrolle Auftragung vor und nach Induktion

Übersicht ‘Tags’

•  Poly-Histidin (His)-tag •  Myc-tag •  T7-tag •  Strep-Tag •  Glutathione-S-Transferase (GST)-tag •  Maltose-bindendes Protein (MBP)-tag •  SumoTag •  Calmodulin-bindendes Protein (CBP)-tag

•  Vorteil: hochspezifische Bindung an Säulenmaterial

Glutathion-S-Transferase

12GS

GE-Healthcare

Elutionsmittel

Eigenschaften der Tags

•  N- oder C-terminal •  Länge des Tags •  Protease Schnittstelle erwünscht

Protease cleavage sites

Protease recognition sequence source

Factor Xa Ile Glu/Asp Gly Arg | different distributors

Enterokinase Asp Asp Asp Asp Lys | New England Biolabs

Thrombin Leu Val Pro Arg | Gly Ser different distributors

TEV protease Glu Asn Leu Tyr Phe Gln | Gly Life Technologies

PreScission Leu Glu Val Leu Phe Gln | Gly Pro GE Healthcare

Protease Verdau

PreScission- protease Faktor Xa

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Industrielle Produktion rekombinanter Proteine

Protein Beispiel /Anwendung Insulin Diabetes Gerinnungsfaktoren Faktor VIII (Hämophilie) Intereferone Virusinfektionen, Krebs Interleukine HIV, Krebs, Immunschwäche Monoklonale Antikörper Diagnostik Erythropoietin Anämie (Erythozytenprodukt.) Impfstoffe Virushüllproteine Wachstumshormon Kleinwuchs