własności elastyczne komórek i tkanek od fizyki do zastosowań · 2019-01-31 · snap protocol...

Własności elastyczne komórek i tkanek- od fizyki do zastosowań

biomedycznych

Małgorzata Lekka

Zakład Badań Mikroukładów BiofizycznychInstytut Fizyki Jądrowej PAN

Plan prezentacji

Biomechanika komórek

Biomechanika tkanek

Mikroskop sił atomowych (AFM)

Biomechanika komórek

błona komórkowa

włókna aktynowe

mikrotubule

jądro komórkowe

reticulumendoplazmatyczne

mitochondrium

Aparat Golgiego

lizozom

rybosomy

Struktura komórki jest niejednorodna

centrosom

komórki nabłonka pęcherza moczowego(obraz z mikroskopu fluorescencyjnego)

Biomechanika komórek

komórki nabłonka pęcherza moczowego(obraz z mikroskopu fluorescencyjnego)

włókna aktynowe

mikrotubulejądra komórkowe

Biomechanika komórek

Huber et al. Cur. Opin. Cell Biol. (2014)

Levental et al. Soft Matter (2007)

Wiele biologicznych struktur wykazuje nieliniowy charakter

dla dużych odkształceń

Biomechanika komórek

Każdy element strukturalny komórki posiada odmienne własności mechaniczne

Harris, Sem. Cell. Develop. Biol. 2018

cytoplazma

cytoszkielet

jądro komórkowe

• Moduł elastyczności (Young’a)• Moduł ścinania

Biomechanika komórek

Kasza et al. Cur. Opin. Cell Biol. (2007)

Pole powierzchni Sdługość L

ΔL

Siła F𝜎 =

𝐹

𝑆𝛾 =

∆𝐿

𝐿

𝛾 =∆𝛾

∆𝜏

𝜎 = 𝐺′ ∙ 𝛾Elastyczność

Lepkość 𝜎 = |𝐺"(Δ) ∙ Δ| 𝛾

Biomechanika komórek

Voigt model

E η

Kelvin model

E1

E2

η

Maxwell model

E

η

Modele reologiczne dla komórek

+ bardziej zaawansowane modele teoretyczne

Biomechanika komórek

własności mechaniczne pojedynczych komórek mogą być mierzone wieloma metodami

Unal et al. Nanobiomedicine, (2014)

Biomechanika komórek

własności mechaniczne pojedynczych komórek mogą być mierzone wieloma metodami

Prawo Hooke’a:

F = k·x

k – stała sprężystości [N/m]

F

x

L

Lekka BioNanoSciences 6(2016) 65

Biomechanika komórek

AFM -> Tryb modulacji siły (ang. force modulation)

próbka

δ0- początkowe ugięciemateriału (indentacja)

wymuszenie drgań sinusoidalnych o małej

amplitudzie drgań δwokół δ0

𝐹 =3

4

𝐸

1 − 𝜇2𝑡𝑎𝑛𝜃 𝛿2

𝐺∗ =𝐸∗

2 1 + 𝜇

𝐺∗ 𝜔 =1 − 𝜇

3𝛿0𝑡𝑎𝑛𝜃

𝐹∗ 𝜔

𝛿∗ 𝜔

𝐺′ 𝜔 = 𝐺𝑁0 + 𝑘1𝜔

𝑎

𝐺′′ 𝜔 = 𝑘0𝜔−𝑛𝑓 + 𝑏𝑘1𝜔

𝑎

1 10 1001E+02

1E+03

1E+04

HCV29

G'

G''

vis

cous

vis

cous

ela

stic

G0

N

fT

HTB-9

G'

G''

G' [

Pa], G

'' [P

a]

[Hz]

fT

G0

N

ela

stic

Joanna Zemła

dr Joanna Zemła

Biomechanika komórek

http://www.biocurious.com/images

AFM -> Tryb spektroskopii siły (ang. force volume)

0 1 2 3 4 50

2

4

6

cancer prostate cells

PC-3

Du145

LNCaP

normal prostate cells

PZ-HPV-7

Forc

e [

nN

]

Indentation [um]

Moduł Young’a jest wartością względną

Biomechanika komórek

Prostate cancer cells:

LNCaP E = 460 ± 170 PaE = 287 ± 52 Pa

PC-3 E = 1970 ± 410 PaE = 1401 ± 162 Pa

PZHPV-7 E = 3330 ± 650 PaBPH: E = 2790 ± 491 Pa

IFJ PAN, KrakowFaria et al. Analyst 133 (2008) 1498

What was softer – remained softer !

Biomechanika komórek

SNAP Protocol (COST Action TD1002)

Scientific Reports 7 (2017) 5117

0 2000 4000 6000 8000

Inte

nsity [a.u

.]

Frequency [Hz]

𝑘 =𝑘𝐵𝑇

𝑃

P – pole powierzchni

ω = 1.38 kHz

Stała k musi być znana żeby dobrze policzyć czułość detektora

Stał

a sp

ręży

sto

ści [

mN

/m]

numer sprężynki

Schillers et al. Sci. Rep. 7 (2017) 5117

ML, Justyna Bobrowska

Biomechanika komórek

Próbka - żele

Schillers et al. Sci. Rep. 7 (2017) 5117

ML, Justyna Bobrowska

Próbka - komórki MDCK C11

Biomechanika komórek

Model Hertza(1882)

• Idealnie elastyczne kule• Brak adhezji w polu kontaktu• Własności elastyczne są izotropowe

R1

R2

kula naciskająca na elastyczną półprzestrzeń

promień kontaktu

𝑎𝐻 =𝐹 ∙ 𝑅′

𝐸′

aH

1

𝑅′=

1

𝑅1+1

𝑅2

R1

R2 -> ꚙ

aH

𝑅′ = 𝑅1

1

𝐸′=

1

𝐸1+1

𝐸2

Fδ

Biomechanika komórek

Modyfikacja Ufianda - Sneddona

MLCT

OTR4

PNP

MNSL

Long et al. J. Appl. Mech. 84 (2017) 051007

Osiowosymetryczny indenter

Nieskończona półprzestrzeń(izotropowa, idealnie elastyczna)

wprowadzenie funklcji kształtu indentera

Biomechanika komórek

MLCT

OTR4

PNP

MNSL

Long et al. J. Appl. Mech. 84 (2017) 051007

Modyfikacja Ufianda - Sneddona

Biomechanika komórek

adhezja/nacisk/adhezja

Derjaguin-Mueller-Toporov (DMT)

adhezja nacisk

Jonhson-Kendall-Roberts (JKR)

𝑎𝐷𝑀𝑇3 =

𝑅

𝐸′∙ 𝐹 + 2𝜋𝐸𝐴𝑅

F = FHertz - Fadh

F = FHertz - 4𝐸𝑒𝑓𝑓∙𝐹𝑎𝑑ℎ∙𝑎𝐽𝐾𝑅3

3𝑅

𝑎𝐽𝐾𝑅3 =

𝑅

𝐸′∙ 𝐹 + 2𝜋𝐸𝐴𝑅 + [… . ]0.5

… . = 6𝜋𝐸𝐴𝑅𝐹 + 3𝜋𝐸𝐴𝑅2

R

R

F

F

Adhezja

Biomechanika komórek

0

5

10

PA1

450

n= 64 curves

map 6x6 um

Indentation [nm]

E [kP

a]

Żele polyacrylamidowe (PA): jednorodna próbka

Miękki PA 1 (5% PAA & 0.4% bis-A) Sztywny PA 2 (7% PAA & 0.4% bis-A)

0-0.16 mN/m

Model komórki

Spektroskopia siły

Joanna ZemłaJustyna Bobrowska

Biomechanika komórek

Żel PA

100 200 300 400 500 600 7000

10

20

30

100 200 300 400 500 600 7000

10

20

30

100 200 300 400 500 600 7000

10

20

30

100 200 300 400 500 600 7000

10

20

30

100 200 300 400 500 600 7000

10

20

30

PA1

PA2

indentation depth (nm)

indentation depth (nm)

Model komórkiJoanna ZemłaJustyna Bobrowska

E [k

Pa]

E [k

Pa]

E [k

Pa]

E [k

Pa]

E [k

Pa]

Biomechanika komórek

100 200 300 400 500 6000

10

20

30

40

100 200 300 400 500 6000

10

20

30

40

100 200 300 400 500 6000

10

20

30

40

100 200 300 400 500 6000

10

20

30

40

100 200 300 400 500 6000

10

20

30

40 indentation depth (nm)

HCV29 non-malignant

HT1376 cancerous

indentation depth (nm)

Komórki Joanna ZemłaJustyna Bobrowska

Komórki nowotworowe są bardziej deformowalne

E [k

Pa]

E [k

Pa]

E [k

Pa]

E [k

Pa]

E [k

Pa]

αβ αβαβ αβαβ

0

10

20

30

E [kP

a]

Biomechanika komórek

HCV29 T24

HCV29

T24

Indentacja:

• 500 nm• 1000 nm• 1500 nm• brak zakresu

Andrzej Kubiak, Tomasz ZielińskiKomórki

Biomechanika komórek

Andrzej Kubiak, Tomasz Zielińskiorganizacja cytoszkieletu aktynowego

- rozkład elastyczności

Winflunina powoduje wzrost sztywności komórek prostaty

Brak efektu

MTT assay

Biomechanika komórek – rola cytoszkieletu

efektywność działania leków przeciwnowotworowych

0 200 400 600 800 1000 12000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

% k

om

óre

k

cVFL

[nM]

Związek cytotoksyczny

Andrzej Kubiak

CVFL [nM]

E [P

a]

Winflunina powoduje wzrost sztywności komórek prostatypoprzez oddziaływanie z mikrotubulami

CVFL [nM]E

[Pa]

Brak efektu

MTT assay

Biomechanika komórek – rola cytoszkieletu

efektywność działania leków przeciwnowotworowych

0 200 400 600 800 1000 12000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

% k

om

óre

k

cVFL

[nM]

Związek cytotoksyczny

Andrzej Kubiak

Biomechanika komórek

Justyna Bobrowska

Auranofin

0

5

10

15

20

E

[kP

a]

- auranofin +auranofin

1uM Au

- auranofin + auranofin

efektywność działania leków przeciwnowotworowych

mapa własności elastycznych

Biomechanika komórek

Fizyko-chemiczne własności komórek czerniaka

healthy melanocytesskin melanoma from primary tumor sites melanoma metastasis to skinmelanoma metastasis to lung

0

10

20

30

40

50

HEMa-LP

WM115

E [

kP

a]

mean standard deviation

median

WM793WM239

WM266-4

1205Lu

A375-P

Justyna Bobrowska

własności biochemiczne powierzchni komórek(ToF SIMS)

Wzrost deformowalności komórekWzrost różnic we własnościach powierzchniowych

Biomechanika tkanek

Stylianou, Lekka Nanoscale, 2019

Biomechanika tkanek

60 um x 60 um

rdzeń kręgowy

20 um

Biomechanika tkanek

Komórki nowotworowe są bardziej deformowalne

Tkanka nowotworowa jest sztywniejsza

Single cell deformabilitysoft

stiff

softstiff

Tissue deformability

Lekka Bionanoscience, 2016

Stylianou, Lekka Nanoscale, 2019

Biomechanika tkanek

pro

bab

ility

stiffness

pro

bab

ility

stiffness

Single peak

Low and high elasticity peaks

Endometroid carcinoma

Breast cancer

Lekka, Arch. Biochem. Biophys. (2012); Stylianou, Nanoscale, 2018

Biomechanika tkanek

Tian, Nanoscale, 2015

50 um

10 um x 10 um

Podsumowanie

Słaby postęp w leczeniu nowotworów spowodował wzrost zainteresowania własnościami fizyko-chemicznymi na poziomie pojedynczych komórek niosącymi

informację o:

• parametrach fizycznych kontrolujących wzrost i rozprzestrzenianie się komórek nowotworowych,

• O zastosowaniach nowych, dobrze opracowanych metod pomiarowych, w szczególności tych działających w zakresie nanoskali.

Podsumowanie

Zakład Badań Mikroukładów Biofizycznych (NZ55)

1. Justyna Bobrowska

2. Małgorzata Lekka

3. Barbara Orzechowska

4. Joanna Pabijan

5. Joanna Zemła

Doktoranci

1. Joanna Danilkiewicz

2. Andrzej Kubiak

3. Tomasz Zieliński

Aktualnie realizowane projekty

- projekt NCN - Preludium (2014 – 2017)

- projekt NCN OPUS (2015 – 2018)

- Marie-Curie training network ITN (2019 – 2022) –

nowy doktorant

Formalne i nieformalne współprace:

1. Collegium Medicum UJ

2. Uniwersytet w Linzu (Austria)

3. Instytut Fizyki UJ

4. Politechnika w Pradze (Czechy)

5. Politechnika Warszawska

6. Uniwersytet w Mediolanie

7. Universytet w Grenoble

Podsumowanie

Dziękuję