xmatch metod

PROSES PEMERIKSAAN UJI SILANG SERASI

dr. J Nethasiadr.Irene Ratna. Sdr. Ricky Julian

HAL-HAL PENTING YANG HARUS DIPERHATIKAN SEBELUM MELAKUKAN UJI SILANG SERASI :

1. Periksa identitas pasien dan contoh darah pasien2. Periksa golongan darah ABO dan Rhesus pasien dengan

benar3. Cari darah donor yang sesuai dengan golongan darah

pasien4. Periksa ulang golongan ABO dan Rhesus donor dengan

benar5. Apabila semua golongan ABO dan Rhesus antara pasien

dan donor sama, baru dilakukan uji silang serasi.

• Bertujuan untuk memastikan bahwa darah yang diberikan adalah sesuai/kompatibel, dan tidak akan menimbulkan reaksi serta bermanfaat

• Untuk mengetahui apakah penderita tidak mengandung antibodi yang reaktif terhadap eritrosit donor

• Harus dilakukan 3 fase, mayor, minor dan auto• Untuk permintaan lebih dari satu kantong, tidak boleh

dilakukan metoda pooling, baik pada uji silang serasi mayor maupun minor.

UJI SILANG SERASI

• Uji Silang Serasi - Mayor• Memeriksa ketidak cocokan oleh karena adanya

antibodi dalam serum pasien terhadap antigen sel darah merah donor

• Uji Silang Serasi - Minor• Memeriksa ketidak cocokan oleh karena adanya

antibodi dalam serum donor terhadap antigen sel darah merah pasien

Uji Silang Serasi

T u b e Te s t

Pemeriksaan uji silang serasi :

Minor Test

May

or T

est

DarahDonor

SuspensiSel Donor 5%

SuspensiSel Pasien 5%

Plasma Donor Serum Pasien

DarahPasien

AutoKontrol

7

UJI SILANG SERASI

• phase I putar,1000 rpm 1’ ,baca

• phase II tambah 2 drops bovine albumin 22% ,campur,inkubasi 15’,37oC,putar 1000 rpm 1’,baca,cuci 3X

• phase III tambah 2 drops antihuman globulin serum,putar 1000 rpm 1’ baca,bila neg,+ IgG coated cells(Coombs control sel),putar 1000 rpm ’,positip .

mayor

2 drops patient serum+1 drop 3-5%Suspensi selDonor

2 dropsDonor serum+1 drop3-5%Suspensi selpasien

minor

Pemeriksaan uji silang serasi terdiri atas 3 fase

Fase I : Fase Medium saline Mayor test : 2 tetes serum pasien + 1 tetes

suspensi sel donor 5 %

Minor test : 2 tetes plasma donor + 1 tetes suspensi sel pasien 5%

Auto kontrol : 2 tetes serum pasien + 1 tetes suspensi sel pasien 5% Kocok perlahan-lahan agar homogen

Putar semua tabung pada 3000 rpm selama 15 detik atau 1000 rpm selama 1 menit→ baca reaksi

Fase II : Fase Bovine albumin 22% Pada semua tabung : tambahkan 2 tetes Bovine Albumin 22%

Kocok perlahan-lahan agar homogenInkubasi pada suhu 37C selama 15 menitPutar semua tabung pada 3000 rpm selama

15 detik atau 1000 rpm selama 1 menit→ baca reaksi

Fase III: Fase Anti Globulin Test (Coombs Test)

Pada semua tabung : Cuci semua tabung 3 x dengan Saline (NaCl 0.9%)

Tambahkan pada semua tabung 2 tetes AntiglobulinTest (AHG). Kocok perlahan-lahan agar homogen .Putar semua tabung pada 3000 rpm selama 15 detik atau 1000 rpm selama 1 menit→ baca reaksi

Fase Coombs Control Cells (CCC) : Kontrol semua tabung dengan menambahkan 1 tetes Coombs Control Cells (CCC) bila hasil reaksi fase III negatip. Setelah penambahan CCC reaksi harus positip. Bila hasil reaksi tetap negatip → Pemeriksaan uji silang serasi harus diulang

• Sel darah merah donor diambil dari selang kantong darah• Sel darah merah harus dicuci dan dibuat suspensi 2-5% dalam

saline,apabila terlalu banyak sel , antibodi yang lemah akan tidak terdeteksi karena terlalu sedikit antibodi yang mengadakan ikatan dengan sel darah merah .

• Pencucian sel darah merah donor akan menghilangkan bekuan fibrin yang dapat mengganggu interpretasi pembacaan

• Apabila pemeriksaan memakai metode lain (bukan tube test) harap mengikuti prosedur dari pabriknya.

Prosedur untuk uji silang serasi rutin

Hasil pemeriksaan uji silang serasi diinterpretasikan sbb :

Kompatibel (cocok), bila pada semua fase baik major maupun minor tidak ada reaksi

Inkompatibel (tidak cocok), bila ada reaksi agglutinasi/ hemolisis pada fase manapun baik di mayor test maupun minor test atau pada kedua-duanya.

HASIL POSITIP PADA MAJOR TEST

1. Golongan darah ABO pasien atau donor tidak benar, pemeriksaangolongan darah ABO harus segera diulang.

2. Adanya allo antibodi dalam serum pasien yang bereaksi dengan

antigen yang ada pada sel darah merah donor. Hasil auto kontrol harus negatip, kecuali pada pasien yang baru ditransfusi dengan sel yang inkompatibel.

3. Adanya autoantibodi dalam serum pasien yang juga bereaksi dengan sel darah merah donor.

HASIL POSITIP PADA MAJOR TEST

4. Penyelubungan sel darah donor oleh protein, sehingga antiglobulin test positip. Perlu dilakukan pemeriksaan Direkt Coombs Test (DCT), bila sel donor positip (DCT pos), maka darah donor akan inkompatibel dengan semua serum pasien pada fase antiglobulin, karena SDM telah terselubung dengan immunoglobulin dan atau komplemen.

5. Kelainan dalam serum pasien, misalnya adanya dextran dengan berat molekul yang tinggi atau plasma expander lainnya, sehingga menyebabkan terjadinya false positip (rouleaux formasi). Semua test termasuk auto kontrol akan menunjukkan hasil yang sama.

6. Kontaminasi pada test, misalnya tabung yang kotor, kontaminasi sampel oleh bakteri

HASIL POSITIP PADA MINOR TEST :

1. Golongan darah ABO pasien atau donor tidak benar

2. Adanya antibodi dalam plasma donor yang bereaksi dengan antigen yang sesuai dengan SDM pasien.

3. Penyelubungan SDM pasien oleh protein, sehingga hasil antiglobulin test positip

4. Kontaminasi

WASPADA TERHADAP KEMUNGKINAN HASIL UJI SILANG SERASI FALSE COMPATIBLE :

Adanya allo antibodi yang sangat lemah dalam serum pasien, sehingga tidak terdeteksi (primary response), sehingga hasil uji silang serasi tampak kompatibel. Pada saat transfusi terjadi secondary response, sehingga immun antibodi yang ada akan menimbulkan reaksi transfusi. Bila contoh darah donor dalam selang kantong darah tidak tercampur baik dengan anticoagulant nya, sehingga kemungkinan terjadi kerusakan dari SDM, sehingga antigen yang ada pada SDM menjadi lemah.

Bila prosedur uji silang serasi tidak dilakukan sebagaimana mestinya, misalnya tidak melakukan inkubasi pada suhu dan waktu yang seharusnya.

KARAKTERISTIK DAN JENIS-JENIS ANTIBODI :

Antibodi yang bereaksi pada saline medium : anti-M, anti-P1, anti-I, anti-N, anti-Lea, anti-Leb

Antibodi yang bereaksi pada Bovine albumin medium :antibodi sistem Rhesus, anti-M, anti-Lea, anti-Leb, anti-I

Antibodi yang bereaksi dengan Coombs serum : anti-K, anti-k, anti-Fya, anti-Fyb, anti-Jka, anti-Jkb, anti-S, antibodi sistem Rhesus

UJI SILANG SERASI DENGAN GEL TEST

Sejarah gel test

Pertama kali ditemukan oleh Dr. Yves Lapierre dari Perancis

Pertama kali digunakan secara rutin pada tahun 1988

Prinsip teknologi gel testMaterial gel dari SephadexAglutinasi dengan ukuran besar berada pada

permukaan gelAglutinasi yang lebih kecil ukurannya dapat

melewati pori-pori gel, tergantung ukurannyaSel yang tidak beraglutinasi akan langsung

mengendap kedasar tabung

Prinsip kerja gel test

Uji silang serasi dengan gel test

Masukkan suspensi sel 1% 50 ulTambahkan serum/plasma 25 ulInkubasi 15 menitPutar baca

Reaksi positip kuat

Reaksi positip lemah

Reaksi negatip

Skor kekuatan reaksi

Skor kekuatan reaksi

Bahan yang dibutuhkan

1. DG Dispenser2. Mikropipet 5, 25 dan 50 ul3. Yellow tip4. Tabung reaksi5. Working table6. Digital incubator 37C 7. Card centrifuge8. Spidol

Reagen yang dibutuhkan

Coombs CardLISS Solution

coombs card

working table

Cara mengencerkan sel darah merah

Ambil LISS Solution sebanyak 0,5 ml atau 500 ul

Ambil 5 ul sel darah merah pekat, kemudian masukkan kedalam LISS Solution

Cara mengencerkan sel darah merah

Cara melakukan uji silang serasi

Campur hingga merata, kemudian ambil sebanyak 50 ul suspensi sel dan masukkan kedalam micro tube gel test (Coombs)

Tambahkan 25 ul serum/plasma kedalam card Coombs

digital incubator

Fase inkubasiInkubasi pada 37C selama 15 menit dalam inkubator

fase pemutaran

Setelah fase inkubasi, putar Coombs card dalam card centrifuge selama 10 menit

digital centrifuge

digital centrifuge

Pembacaan hasil uji silang serasi

• 1.lebih mudah• 2.sensitivitas dalam mendeteksi antibodi yg

lemah• 3.stabil• 4.titik akhir aglutinasi jelas• 5.interpretasi hasil objektif• 6.konsisten dan dapat diamati jangka lama• 7.vol sampel sedikit

KEUNTUNGAN:

• 1.banyak alat penunjang• 2.biaya

KELEMAHAN

No Perbedaan Metode salin Metode gel

1 Medium Lar Nacl 0,9% Partikel gel (dextran acrylamid gel

2 Reagensia Bovine albumine AHG

AHG,LISS3

3 Proses pencucian dengan Nacl 0,9%

ada Tidak ada

4 Suspensi sel 2-3% 1%

5 Intepretasi hasil Makroskopik dan mikroskopik

Makroskopik

6 Sel kontrol ada Tidak ada

PERBANDINGAN METODE SALIN DAN GEL:

E.M.® TechnologyErythrocytes Magnetised Technology

Teknologi Magnet

Tahapan sentrifugasi digantikan dengan magnet

Teknologi lamaTeknologi baru

PRINSIP EMT

• Teknologi yang berdasarkan pada magnetisasi terhadap sel darah merah

• EMT menggantikan sistem centrifugasi.• EMT Diagast menggunakan 96 U shaped wells Microplates• Bagaimana partikel magnet melekat pada sel darah merah?

-Panel : sel darah merah termagnesasi selama proses produksi-Sel darah merah : termagnesisasi pada saat tes berlangsung

Erythrocyte

Magnetic Particles

Magnetic particles

Erythrocyte Magnetized Technology

• IgM (reagent) + antigen sel darah merah = aglutinasi• Partikel - partikel magnet menarik sel – sel darah ke

dasar well • Magnetisasi

selama4 menit

Magnetic plate

Sel darah merah

Magnetised solution

Prinsip Teknologi Magnet

Magnetic plate

Prinsip Teknologi Magnet

Magnetic plate

Prinsip Teknologi Magnet

Magnetic plate

Prinsip Teknologi Magnet

Kelebihan Teknologi Magnet

1. Tidak digunakannya protokol sentrifugasi .

2. Cost lebih efektif.

3. Maintenance lebih mudah.

4. Kapasitas sample lebih besar

5. Continues loading of sample

Karakteristik Metode Gel Metode Magnet

Teknologi yang digunakan Gel

EM Teknologi - Teknologi yang berdasarkan pada sel darah merah yang termagnetisasi, menghilangkan tahapan centrifugasi yang masih digunakan pada test tube maupun gel card

Inovasi Inovasi kedua setelah test tube Inovasi terbaru setelah 20 tahun menggunakan gel cardSistem manual Ya Ya

Menghemat tempatTidak ( terdiri dari 2 alat yaitu centrifuge dan Inkubator) Ya (semua alat terintegrasi dalam 1 alat)

PerawatanMemerlukan perawatan lebih karena adanya centrifuge Perawatan minimum karena tidak adanya centrifuge

Maksimum sampel yang dapat ditest untuk Grouping 24 test 32 testMaksimum sampel yang dapat di test untuk Antibody screening (3 well) 48 test 64 test

Maksmimum sampel yang dapat ditest untuk Cross matching (3 well) 48 test 64 test

Waktu yang diperlukan untuk Grouping 15 menit untuk 12 sampel 15 menit untuk 16 sampel

Waktu yang diperlukan untuk Antibody screening 31 menit untuk 24 sampel 30 menit untuk 32 sampel

Waktu yang diperlukan untuk Cross matching 31 menit untuk 24 sampel 45 menit untuk 32 sampel

Masa kadaluarsa Card / microplate setelah dibuka pertama kali 2 jam setelah dibuka pertama kali 20 hari setelah dibuka pertama kaliPembacaan sampel 16 card dibaca terpisah 16 sampel dapat dibaca bersamaan dalam 1 microplateMasa pakai alat 5 tahun (Centrifuge dan Inkubator) 200 tahun ( permanen magnet )

Perbedaan Teknologi Gel dan Magnet

Crossmatching Test dengan

FREELYS® Nano • Alat : FREELYS® Nano• Reagen :CrossLys Kit

1 kit untuk 576 tes, isinya :

– 6 CrossLys plate

– 12 Mag plate (Mikroplate untuk membuat suspensi sel darah merah)

– 1 Screen Diluent (@100ml) LISS buffer

– 7 NanoLys II (@ 8 ml) high density buffer

– 2 MagLys (@ 8 ml) magnetic solution

– 2 DiluentLys (@ 50ml) dilution buffer

PROTOKOL

CROSSMATCH TEST

• Tahap 1: Pencucian dan magnetisasi sel darah merah, baik sel darah merah donor (major) dan sel darah merah OS (minor)

• Tahap 2 : Proses uji silang antara darah donor dengan plasma OS atau sebaliknya

• Tahap 3: Pembacaan hasil

Protokol Cross Match

Protokol :1) Pencucian

Sel darah merah

Physiologicalwater (utk pencucian sel)

Centrifugasi

tube tube

Protokol :1) Magnetisasi

Mag plate Mag plate

90 µl DiluentLys

135 µl DiluentLys 15 µl

suspensi

10 µl sel drh merah

Well n°1 Well n°2Well n°1 Well n°2

Dilution plate15 µl

MagLys

Protokol :1) Magnetisasi

Mag plate

Magnetisasi : 10 menit dlm incubator suhu 37°C

Protocol :2) Proses Uji Silang pada CrossLys plate

AHG (Anti Human Globulin / IgG, IgM)

50 µl Nanolys II

50 µl Screen Diluent

15 µl Plasma / Serum

15 µl Sel darah merah yg sudah dimagnetisasi

1

2

3

4

CrossLys plate

Tahap 1 : Pemipetan

Protokol :2) Proses Uji Silang Pada CrossLys plate

Mag plate CrossLys plate

50 µl Nanolys

50 µl Screen Diluent

15 µl Plasma / Serum

15 µl Sel drh merah yg sdh dimagnetisasi

1

2

3

4

Tahap 2 : Inkubasi

Tutup plate dan letakkan pada incubator suhu 37°CSelama 15 menit

Tahap 3 : Proses

Letakkan magnetik plate (magnet khusus) pada shaker

Letakkan microplate pada magnetic plate

Tekan P3

Protocol :

Positive Reaction

The alloantibodies bound to the red cells are caught by the AHG. The complex “red cells-alloantibodies” form a layer in the well.

Positive reaction

E.M. Technology Indirect Antiglobulin Test

37°C

The alloantibodies bind to the red cells during the incubation at 37°C

Positive Reaction

The alloantibodies bound to the red cells are caught by the AHG. The complex “red cells-alloantibodies” form a layer in the well.

Positive reaction

E.M. Technology Indirect Antiglobulin Test

The magnetic shaking attracts the red cells-alloantibodies to the bottom. The alloantibodies are caught by the AHG

Positive Reaction

The alloantibodies bound to the red cells are caught by the AHG. The complex “red cells-alloantibodies” form a layer in the well.

Positive reaction

E.M. Technology Indirect Antiglobulin Test

Positive reaction: layer in the well

Schematic viewView of

a positive reactionin a microplate well

Negative Reaction

There is no alloantibody in the serum. The red cells do not react with the AHG and create a dot in the center of the well.

Negative reaction

E.M. Technology Indirect Antiglobulin Test

37°C

No alloantibodies bind to the red cells during the incubation at 37°C

Negative Reaction

There is no alloantibody in the serum. The red cells do not react with the AHG and create a dot in the center of the well.

Negative reaction

E.M. Technology Indirect Antiglobulin Test

The magnetic shaking attracts the red cells to the bottom. There is no interaction with the AHG

Negative Reaction

There is no alloantibody in the serum. The red cells do not react with the AHG and create a dot in the center of the well.

Negative reaction

E.M. Technology Indirect Antiglobulin Test

Negative reaction: dot in the center of the well

Schematic viewView of

a negative reactionin a microplate well

Hasil Pembacaan

Positive Negative

COMPATIBLE UNCOMPATIBLE

FREELYS® Nano

Laboratorium mini pertama dibidang Imunohematologi:

Untuk test :

Blood groupingPhenotypingAntibody screening

Cross-matchingIdentificationDetection of weak DDirect Coombs

ReagentsPre-filled reagents

Magnetic plate

Control panelIncubator

Integrated timer

Automatic shaker

1 or 2 automatic shakers

1 incubator of 37 °C

2 magnetic plates

Weight : 9,4 kilos

Length : 578 mm

Depth : 330 mm

Height : 125.5 mm

Rack for reagents Timer integrated Control panel

Microplate support

FREELYS® Nano

FREELYS® Reader

FREELYS® Reader

FREELYS® Reader

Reagents

384 samples

DiluentLys(ref: 69301)

Mag-Plate (ref: 69302)

NanoLys x4 CrossLys x4

x 4

-IAT Kit (IgG/IgM)(ref. 20200)

Preparing donors’ samples

1- Collect the donors blood from the segment in a labelled tube 2- Centrifuge 5 minutes at 2500g3- load on QWALYS

++

IRONMAG

+

DiluentLys

1. On board magnetization of donors red blood cells in the Mag-Plate

2. In the CrossLys microplate: Mixing of magnetized donor’s RBC with patient’s plasma or serum

Microplate reading

Incompatible Compatible

Protocol on Qwalys

Protocol on Qwalys1. On board magnetization of donors red blood cells in a Magplate:

1. 1st well: 7 µL RBC + 153 µL DiluentLys2. 2nd well: 7 µL of diluted RBC + 28 µL DiluentLys + 70 µL IRONMAG

2. In the CrossLys microplate: Mixing of magnetized donor’s RBC with patient’s plasma or serum

1. 50 µL of Nanolys in the CrossLys2. 55 µL of magnetized RBC (prepared on the first step)3. 25 µL of plasma4. Incubation: 5 minutes RT + 15 minutes at 37°C5. Shaking: 3 minutes at 500 rpm + 2 minutes at 600 rpm

Protocol details

THANK YOU