análisis elemental de muestras clínicas. introducción al ... · (3 tubos concéntricos) rf...

Rubén García

Especialista ICP-MS

Análisis Elemental de

Muestras Clínicas.

Introducción al ICP-MS

Elementos de interés en fluídos biológicos

(orina, sangre, suero, plasma)

ELEMENTOS POTENCIALMENTE TÓXICOS

ELEMENTOS ESENCIALES

METALES PESADOS ALTAMENTE TÓXICOS

• Cd, Pb, Hg (As), etc.

• Al, Sb, Ba, Be, Bi, Li, Ni, Sr, Tl, etc.

• Cr, Co, Cu, Mg, Mn, Se, V, Zn, etc.

ESPECIES QUIMICAS

• MeHg, Metaloproteínas, péptidos y fosfopétidos, metalodrogas, etc

Agilent en Espectroscopía Atómica. Hoy!!.

AA Llama

AA Cámara de Grafito

Espectroscopía Atómica: Técnicas de análisis elemental

MP-AES

ICP-OES

ICP-MS

ICP-MS QQQ

Nuevo!!

Nuevo!!

Necesidades analíticas para la medida de metales

en un laboratorio clínico

Sistema de introducción de muestras robusto

Para todas las matrices manejadas rutinariamente (orina, sangre, etc.)

Medida de muchos elementos en una misma adquisición

Reducción tiempos de análisis

Mejora de la productividad

Reducción de los costes de análisis

Medidas a nivel de trazas y de altas concentraciones en una misma adquisición

Reducción tiempos de análisis

Mejora de la productividad

Reducción de los costes de análisis

Posibilidad de determinación de especies con heteroátomos

Especiación, farmacocinéticas, estudios metabólicos, etc

¿Que es un ICP-MS?

ICP - Inductively Coupled Plasma

• Fuente de iones a alta Tª

• Decompone, atomiza e ioniza la muestra

MS – Espectrómetro de masas

• Diferentes tipos de analizadores de

masas (Qpole, TOF, DF)

• Intervalo de masas de 7 a 250 amu

(Li a U.)

• Detector de modo dual (ppt a ppm)

• Proporciona información isotópica

Técnica de análisis elemental inorgánico

El plasma ICP como fuente de ionización

RF coil

Canal central (Carrier Gas+ muestra)

Gas Plasmógeno

Gas Auxiliar

Antorcha Cuarzo (3 tubos concéntricos)

RF induce la rápida oscilación de Ar+ y e- (>1% Ar+, Tª~10000 K)

Muestra (aerosol) es transportada al centro del plasma (Tª~6500 K

Presión atmosférica Alta eficacia de ionización

d.e. (1015 e cm-3)

Procesos que ocurren en el plasma

Aerosol con la muestra

Desolvatación

H2O(l) H2O(g)

Vaporización

MX(s) MX(g)

Atomización

MX(g) M + X

Ionización M M+

Recombinación M+ + e- M

M+ + O MO+

Analito presente como M+

Analizador de masas

¿Qué elementos pueden ser medidos mediante

ICP-MS?

TODOS a excepción de:

• Presentes en el plasma

• Elementos <5 amu o >260 amu

• No ionizables

Evolución de Agilent en ICP-MS

1987 2000 2009 1994

First computer-controlled ICP-MS

PMS 100

4500 Series

7500 Series

7700 Series

Enabling high

sensitivity

metal analysis

Enabling routine

robust ICP-MS

analysis

Enabling a new level

of interference

management

World's first benchtop system. Hyperbolic profile quad, motorized torch XYZ, cool plasma

Enabling a new level of

ease of use in ICP-MS

9 orders detector range Octopole Reaction System

HMI, ISIS-DS, 3rd Generation ORS Masshunter SW

Enabling a new era in

ICP-MS analysis

8800 ICP-QQQ

World’s first ICP-QQQ for unparalleled interference removal and sensitivity

2012

Agilent 7700x ICP-MS con Octopole Reaction System (ORS3)

Entrada de gas de dilución del kit HMI

Cámara de nebulización refrigerada por Peltier

Lentes iónicas Off-axis

Sistema de introducción de muestra de bajo flujo

Generador de RF de 27MHz de frecuencia variable

Sistema de vacío de alto rendimiento

Entrada del gas de celda

Cuadrupolo hiperbólico de alta frecuencia (3MHz)

Detector simultáneo dual rápido (109 intervalo dinámico lineal)

Interfase de extracción (alta transmisión, tolerancia a matriz)

3º generación Octopole Reaction System (ORS3)

“Autosampler” integrado ultra-inerte

Diseñado especialmente para aplicaciones que requieran alta

pureza donde la prevención de la contaminación es clave

Tapa para proteger las muestras de la contaminación ambiental (e.g. polvo).

Viales PFA ultra-inertes.

Sonda y tubos de muestra ultra-inertes.

Puerto para lavado continuo, más tres viales de lavado adicionales (e.g. lavado alcalino,

lavado ácido, etc.) para máxima flexibilidad.

Bandejas de muestras configurables.

Más pequeño volumen de muestra (<0.5mL).

Diseñado, construido y soportado por Agilent.

Aplicaciones Clínicas/Biomédicas en ICP-MS

Análisis de Orinas

Análisis directo de la muestra tras una dilución 1/5 ó 1/10 (v/v) en 1 %

HNO3/0,5 % HCl y adición de patrones internos

• SIN obturación del nebulizador

• SIN formación de depósitos en el tubo del inyector (10 h análisis)

69 ± 14 68 ± 5 14.3 ± 2.9 13.5±1.1 Pb

198 ± 40 185 ± 17 9.7 ± 2.0 9.6 ± 0.8 Tl

36.9 ± 7 34.8 ± 4.4 9 ± 1.8 6.9 ± 1.1 Sb

15.6 ± 3.1 14.9 ± 1.9 8.6 ± 1.7 8.4 ± 1.1 Cd

163 ± 33 162 ± 15 67 ± 14 65 ± 6 As

187 ± 37 192 ± 17 49 ± 10 56 ± 5.3 Se

50 ± 10 45 ± 5.5 26.7 ± 5.4 24 ± 2.1 Cu

19.1 ± 4.2 18.9 ± 1.4 6.9 ± 1.4 6.6 ± 0.7 Co

20.2 ± 4.1 18.6 ± 2.6 1.2 ± 0.3 1.7 ± 0.3 Cr

certificado medido certificado medido

Lyphochek, level 2 Lyphochek, level 1

Concentración (µg/L) Elemento

Características analíticas para el análisis de orina por ICP-MS

Isótopo LOD (ng/L)

Orina sin diluir

RSD (%)

2 min, n = 10 20 min, n = 20 5 horas, n = 60

7Li 6 0.8 2.7 4.5 9Be 4 1.5 4.2 3.9 52Cr 16 1.7 3.1 4.6 51V 16 2.4 3.4 4.1

55Mn 21 3.0 3.1 3.6 59Co 5 1.8 2.6 4.9 60Ni 9 2.9 3.4 5.1 63Cu 121 0.9 3.1 4.4 66Zn 92 0.8 3.0 5.1 75As 73 2.1 2.8 5.6 78Se 143 2.4 3.7 6.2

LOD= 3 RSDb c/SBR

RSDb: Desviación estandar relativa de la intensidad del fondo (10 medidas), c: concentración el elemento en la disolución;

SBR: relación señal/ruido

Isótopo LOD (ng/L)

Orina sin diluir

RSD (%)

2 min, n = 10 20 min, n = 20 5 hours, n = 60

98Mo 27 1.8 2.8 5.4 103Rh 0.6 1.2 3.3 4.8 111Cd 8 2.4 3.2 3.9 115In 4 0.5 3.0 3.7

118Sn 19 1.6 3.2 5.8 121Sb 6 1.1 2.6 5.3 138Ba 8 1.5 2.8 4.1 184W 7 0.9 2.2 4.6 195Pt 3 0.7 1.9 3.8 205Tl 3 0.6 2.1 2.3

208Pb 2 0.7 2.3 2.5 238U 0.4 1.2 2.2 3.2

Características analíticas para el análisis de orina por ICP-

MS (continuación)

LOD= 3 RSDb c/SBR

RSDb: Desviación estandar relativa de la intensidad del fondo (10 medidas), c: concentración el elemento en la disolución;

SBR: relación señal/ruido

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210220230240250260

5.0E4

1.0E5

[1] Spectrum No.1 [ 181.525 sec]:002SMPL.D# / Tune #1 [CPS] [Linear]

m/z-> 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210220230240250260

5.0E4

1.0E5


m/z->

Pb

Rb

Fe

Br Ba

Ca

Li Mo I

Cs Sr

Zn

Cu

Sb

Sn

C Na

Mg

As

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210220230240250260

5.0E4

1.0E5


m/z-> 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170180190200210220230240250260

2.5E5

5.0E5


m/z->

Pb Fe

Br Ba

Li Mo I

Cs Sr

Zn

Cu

Sb

Sn As

Rb C Na

Mg

Ca

Elemento “desconocido” adicionado

a la muestra de orina

Análisis de elementos tóxicos y nocivos en orina (análisis

semicuantitativo o “Screening” elemental)

Barrido cualitativo de orina diluida 1:10 para identificar envenenamientos

194 196 198 200 202 204 206 208 210 212 214 216

5.0E4

1.0E5

[1] Spectrum No.1 [ 175.118 sec]:003SMPL.D / Tune #1 [CPS] [Linear]

m/z->

Pb

194 196 198 200 202 204 206 208 210 212 214 216

2.5E5

5.0E5


m/z->

Tl

208Pb

205Tl

203Tl

Análisis de elementos tóxicos y nocivos en orina

(análisis semicuantitativo o “Screening” elemental)

Confirmación (por perfil isotópico) de la presencia de Talio (2ppb)

210Po podría ser detectado en esta región de masas

210Po

Caso Alexnder Litvinenko

Espectro de un estándar de

1ppt 237Np

Análisis de elementos radioactivos

Niveles de calibración en ppt

alcanzados con sistema de

introducción de muestra estándar

* Buena ionización en el plasma

* Espectro libre de interferencias

* LOD’s en nivel de pg/L (ppq)

Np

U

Medida de Relaciones Isotópicas

El ICP-MS al proporcionar información

isotópica puede ser utilizado para

estudios con trazadores estables

(metabolismo, marcado isotópico,

análisis por dilución isotópica, etc)

32S16O+

33S16O+

34S16O+

Análisis de muestras alto contenido en sólidos y alta

viscosidad. Clinical Sample Introduction Kit.

Construido en PFA

• Químicamente inerte

• Reduce efectos de memoria (especialmente útil para análisis de yodo)

• Irrompible por golpes e impactos

• Acorta tiempo de limpieza entre muestras

Alta tolerancia a sólidos disueltos

• Permite la introducción directa de sangres y sueros con una mínima preparación de muestra

(dilución). Elimina la necesidad de digestión por microondas.

• Ideal para análisis de orinas

• Alta estabilidad de los estándares internos

Análisis de sangre/suero empleando el ICP-MS 7700x

Muestra y patrones son diluídos con una disolución compuesta por:

Más de 100 muestras pueden ser preparadas en menos de 1 h por una sola persona

0.7 mM NH3

0.01 mM AEDT

0.07 % (v/v) Triton X-100

2 % (v/v) 1-Butanol

10 ppb P.I (No “online”)

Dilución final de la muestra de 1/20

(CSF dil. 1/10)

Características Analíticas del análisis de sangre por ICP-MS

Límites de cuantificación

(LOQs) calculados en sangre sin diluir:

De 0.003 µg/L para 238U hasta

0.1 µg/L para 69Ga

Recuperaciones De 1 µg/L a excepción de:

10 µg/L para B, Mn y Sr y de

200 µg/L para Cu y Rb

obteniendo valores entre 94 -108%

Estabilidad de estándares internos (muestras de sangre

y suero diluidas 1:10 en disolución amoniacal)

Muestras de sangre Muestras de Suero Calibracion

Interfase de muestreo robusta

Imágenes tomadas después del análisis de 90 muestras de sangre

Cono de muestreo o “Sampler “ Cono de extracción o “Skimmer”

Análisis de Selenio en suero con el Agilent 7700x ICP-MS

Análisis de yodo en el Agilent 7700x ICP-MS

o Estabilización en 0.1M NH4OH/ 0.01M AEDT/ 0.07% Triton X

o Limpieza en disolución básica (NH3/AEDT/Triton X)

o Calibraciones a nivel bajo de concentración

o Empleo de Teluro como patrón interno

Acoplamientos con ICP-MS para especiación metálica

Optional

Conventional

(Organic compound)

Detector(s)

GC-ICP-MS

LC-ICP-MS (IC, RP-LC, SEC, FFF)

CE-ICP-MS

Especiación mediante LC-ICP-MS

LC-ICP-MS es la técnica idónea para especies térmicamente inestables siendo el acoplamiento más común

Acoplamiento sencillo mediante un capilar de PFA/PEEK al ICP-MS

Nebulizador y cámara de

nebulización

gas controller

ICP torch

turbo molecular pump

Cuadrupolo

Ar gas

rotary pump

turbo molecular pump

Cromatografo de líquidos

Especiación de Hg mediante UHPLC-ICP-MS

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

0 50 100 150 200

CP

S

time (s)

std 8 ppb

Hg201

Hg2+

MeHg+

EtHg+

PhHg+

4 especies separadas en menos de 3 min

Condiciones HPLC: Columna: Zorbax SB-C18, 4.6 x 50 mm, 1.8 µm Mobile phase: A: 0.5 g/L L-Cys, 0.5 g/L L-Cys,HCl, H20 B: Metanol Gradiente: inicio: 2% MeOH hasta: 90% MeOH en 1 min 90% MeOH durante 3 min cond. iniciales: 2% MeOH Volumen de inyección: 50 µL

Separación isocrática de AsB & Cl del As inorgánico usando una nueva columna

*Surface Aminated Polymer Substrate

Agilent Application Note: Routine Analysis of Toxic Arsenic Species in Urine Using HPLC with ICP-MS, 5989-5505EN, by Tetsushi Sakai and Steven Wilbur, Agilent Technologies

Column G3288-80000 (4.6 x 250 mm) Guard Column G3154-65002 Fase móvil (alcalina): 2 mM phosphate buffer solution (PBS) pH 11.0 ajustado con NaOH 0.2 mM EDTA 10 mM, CH3COONa 3.0 mM NaNO3

1% etanol

Especiación de As en orina por LC-ICP-MS

*Ajustado a pH 11 para separar la AsB. La fuerza iónica de la fase móvil acorta la elución del As V 10ug/L de cada especie de As

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Retention time (min)

Inte

nsit

y (

cp

s) 3

1P

Especies de 31P en Líquido cefalorraquídeo ultrafiltrado

por CapLC-ICP-MS

Daniel Pröfrock, Peter Leonhard

GKSS in Geesthacht, Germany

Aplicaciones clínicas con Agilent ICP-MS

Base de datos con notas de

aplicaciones realizadas por

usuarios ICP-MS Agilent y

especialistas de aplicaciones

disponible via Internet

Conclusiones

El ICP-MS ofrece una combinación única

de propiedades como son:

Gran capacidad multielemental (casi toda la Tabla Periódica)

Bajos límites de detección (muy pocas ppt para la gran mayoría de los elementos)

Amplio intervalo dinámico lineal

Análisis muy rápidos (<5 minutos para un barrido multielemental completo)

Espectros libres de interferencias espectrales (celda de colisión/reacción)

Tolerancia a gran variabilidad de matrices

Robustez

Facilidad de acoplamiento de una técnica de separación cromatográfica al ICP-MS

aumentando las aplicaciones de la técnica

???

[email protected]

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