analytické metódy. serológia – súčasť imunológie, zaoberajúca sa reakciami medzi...
TRANSCRIPT
Analytické metódy
Serológia – súčasť imunológie, zaoberajúca sa reakciami medzi antigénom a
protilátkou, základná diagnostická metóda v imunológii
Serologické metódy – zisťujú prítomnosť protilátok zo séra pacienta proti
infekčnému agens
Sérum – tekutá nebunečná zložka krvi, ktorá neobsahuje zrážacie faktory krvi
Plazma – na rozdiel od séra tieto faktory obsahuje.
Sérová skúmavka s gelom Skúmavka s EDTA
Vyšetrenie parametrov humorálnej imunity
Jednoduchá radiálna imunodifuze
Najstaršia imunochemická metóda - stanovenie imunoglobulínov, komplementu
Tvorba komplexu Ag - Ab v prostredí agarózy (0,5 – 2%)
Aplikace antigénu do jamiek v gelu, ktorý obsahuje Ab.
Podľa koncentrácie Ag vznikajú precipitačné prstence
Priemer prstenca precipitátu je úmorný množstvu vyšetrovaného Ag
Dvojitá imunodifuzeDo jamiek sa aplikuje ako Ag tak aj Ab, ktoré difundujú proti sebe.
Stanovenie funkcie a zložiek komplementu
Vyšetrenie C3 a C4 zložky
C3 - najvyšia sérová koncentrace z komplementových proteínov.
Klúčová komponenta komplementovej kaskády
Chová sa ako proteín akútnej fáze, časté zvýšené koncentrace
C4 - sa chová podobne ako C3
PATOLOGIE - PATOLOGIE +
imunokomplexové choroby (zvl. SLE)bakteriální endokarditiskryoglobulinémiehypergamaglobulinémievrozená deficiencehereditární angioedém (HAE)
akutní a chronické záněty
Vyšetrenie CH50
Testuje sa aktivácia komplementu klasickou cestou, ktorý je schopný lyzovať baranie erytrocyty senzibilzované králičou protilátkou
Meria sa hemolýza erytrocytov po aktivácii komplementovej kaskády a vzniku MAC komplexu.
PATOLOGIE - PATOLOGIE +
hemokoagulace (DIC)vrozené deficience různých složekkomplementuhereditární angioedém (HAE)dále viz snížení C3 a C4
nemá diagnostický význam
Vyšetrenie C1 inhibítoru
Dôležitý regulačný proteín, inhibujíci komplementovú kaskádu
Význam stanovenia u chorých s heriditárnym angioneurotickým edénom (HAE)
Nefelometrie a turbidometrie
Bežné analytické metódy používané k stanoveniu veľkej skupiny proteínov
Merajú množstvo imunitných komplexov (špecifická vazba Ab s Ag)
Koncentrácia antigénu je úmerná rýchlosti tvorby zákalu a hustote zákalu
Nefelometria
Meria intenzitu rozptýleného svetla od komplexu Ag s Ab
Svetlo je merané detekčným systémom
Turbidometria
Optická metóda založená na meraní prechádzajúceho svetla
Meria sa stupeň zákalu - turbidita
Elektroforéza bielkovín
Separácie proteínov na základe ich pohyblivosti v elektrickom poli
Sérové proteíny sa rozdelia na 5 hlavných frakcií
Vyšetrenie pre zachytenie monoklonálneho imunoglobulínu – paraproteínu
V prípade pozitívneho nálezu sa robí jeho typizácia imunofixačným vyšetrením
--
++
LEGENDA: vzorek č. 3: susp. paraprotein vzorek č. 7, 8: susp. paraprotein ostatní vzorky: polyklonální imunoglobuliny (norm. nález)
Imunofixácia
Kombinácia elektroforézy s následnou imunoprecipitácoiu za použitia špecifických antisér
Citlivá metóda
Sérum sa rozdelí v gelu v niekoľkých dráhach
Do každej dráhy je nanesené iné antisérum (IgG, IgA, IgM, kappa, lambda)
Imunoglobulíny tvoria s antisérom komplex (precipitát).
Bence Jensonova bielkovina - stanovuje sa v moči
- proteinúria voľných ľahkých reťazcov
--
++
IMUNOFIXACE VZORKU SÉRA ZDRAVÉ OSOBY
LEGENDA: sloupec č. 1: elektroforéza séra
další sloupce: imunochemický průkaz jednotlivých těžkých a lehkých řetězců imunoglobulinů, je zřetelná polyklonální produkce
--
++
IMUNOFIXACE VZORKU SÉRA NEMOCNÉHO S PARAPROTEINEM IgM
LEGENDA: sloupec č. 1: monoklonální pruh na pozici 6
sloupec č. 4 a 6: imunochemický důkaz přítomnosti paraproteinu IgM
Vyšetrenia protilátok proti:
1, baktériám - Borrelia burgdorferi, Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum
2, vírusom - herpetické viry (HSV, EBV, CMV), HIV, hepatitída, klieštová encefalitída,
3, parazitom – Toxoplasma gondii, Toxocara canis
Aglutinace
- Špecifická protilátka naviazaná na nosič (latex, erytrocyt)- V prítomnosti antigénu vo vzorku = aglutinace (viditelná zrazenina)- Reakcia funguje aj pri dôkaze protilátky, v tomto prípade je naviazaný
na nosič antigén- Nevýhodou je nízka citlivosť
- Veľmi častá serologická metóda v imunológii
- Detekcia protilátok aj antigénu
Princíp- vazba antigénu na dno mikrotitračnej
doštičky- pridanie pacientskej vzorky (vazba
protilátky pri pozitivite)- pridaná druhá protilátka s naviazaním
enzýmom- pridanie substrátu, ktorý je štiepený
enzýmom naviazaným na druhej protilátke
- farebná reakcia a fotometrické meranie
ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
Nepriama Elisa
Sendvičová Elisa – na dno doštičky je naviazaná protilátka, detekujeme antigén prítomný vo vzorku
Mikrotitračná 96 – jamková doštička s 8-kanálovou pipetou a s príslušným roztokom konjugátu
Imunoblotting
Kombinácia elektroforézy a vizualizačných metód
Princíp
- Rozdelenie antigénu infekčného agens na gely (agarózový, polyakrilamidový)
podľa molekulovej hmotnosti
- Prenesenie jednotlivých antigénov na nitrocelulózovú membránu (fixovanie)
- Imunodetekcia (rovnaký postup ako pri Elise)
- Vyhodnotenie vzorku
- Často sa používa ako verifikačná metóda po Elise
- vysoká špecifickosť a citlivosť
Výsledok imunoblotu s pacientskými vzorkami
Schéma vírusu Hepatitídy B
Dynamika tvorby protilátok u hepatitídy B
Chlamydia trachomatis IP Referenčná hodnota IP
IgA 1,09 < 1,1
IgM 0,41 < 1,1
IgG 0,81 < 1,1
Chlamydia trachomatis IP Referenčná hodnota IP
IgA 1.64 < 1,1
IgM 0.31 < 1,1
IgG 0.92 < 1,1
Chlamydia trachomatis ELISA: Prítomné pozitívne protilátky triedy IgA proti Chlamydia trachomatis, nárůst hladiny protilátok z hraničnej hodnoty (1.9.2010) na pozitívnu. Hladiny IgG protilátok majú hraničnú hodnotu – může sa jednať o počiatok infekcie. Protilátky IgM nemusia byť tvorené. Při stanovení diagnózy je veľmi dộležitý klinický obraz choroby!
Diagnostika Chlamydia trachomatis - ELISA
1.odber
2. odber