INTRODUCCIÓN

La clasificación de los seres vivos ha sido una actividad fundamental del humano

seguramente desde que tuvo uso de razón. Por ejemplo, el poder identificar un

grupo de hongos venenosos de un grupo de hongos comestibles hubiera sido

una técnica de sobrevivencia muy útil. Sin querer, estos humanos primitivos

estaban usando un sistema de clasificación basado primariamente en

características morfológicas y posiblemente etológicas. Este tipo de clasificación

de seres vivos se conoce ahora como sistemática, o taxonomía (CITA).

Así como a los primeros seres humanos, la sistemática nos permite

almacenar mucha información acerca de lo que nos rodea, y acceder a ella con

facilidad. Pero la sistemática actual no es una sólo método si no que se

compone de varios como la fenética, la cladística y la sistemática filogenética,

con la finalidad de obtener una clasificación más objetiva de los seres vivos. La

fenética se basa en la idea de agrupar taxones por su similitud a nivel global,

comparando todos los caracteres posibles de forma matemática, pero este

método ahora es casi obsoleto a causa de los inconvenientes que presenta su

forma de analizar datos. En cambio, la cladística trabaja con clados, organizando

a los organismos en grupos que comparten caracteres que han sido

determinados objetivamente como evolutivamente significantes. De la cladística

deriva la sistemática filogénica que usa los criterios cladísticos para establecer

grupos de organismos monofiléticos (descendidos de un solo ancestro común)

en base a su genealogía (Brown, 2008 y Morrone, 2001).

Hoy en día se hace uso de la disciplina de la filogenética molecular, que

usa secuencias de proteínas del ADN como marcadores en los análisis. Es

conveniente usar esos marcadores moleculares porque la información contenida

en las secuencias de nucleótidos es sumamente detallada y pueden decirnos

hasta tiempos de divergencia entre especies, basados en la tasa de mutación de

las bases nucleotídicas (Brown, 2008). A la acumulación de estas mutaciones, o

cambios en las frecuencias de las bases, se le conoce como reloj molecular.

Este varía su velocidad de cambio según la importancia de la proteína, y que

parte de la proteína, en cuestión (Curtis et al., 2006).

Se usan distintos marcadores (ribosomales, mitocondriales, etc.) de

acuerdo al propósito del estudio y del nivel taxonómico estudiado. Para estudiar

taxones menores, por ejemplo en el caso de mamíferos, se usarían marcadores

más variables como la región control o displacement loop (D-loop) porque es la

región con la mayor tasa de mutación del genoma mitocondrial con dos regiones

de rápida evolución y una más conservada (Larizzaet al., 2001; Silva et al.,

2011). Otro marcador con la misma utilidad es el Citocromo C oxidasa

subunidad I (COI), se usa principalmente porque los nucleótidos de la tercera

base mutan a una velocidad tan alta que su taza de evolución molecular es casi

tres veces la de ADN ribosomal (Herbert et al., 2003), y es la subunidad más

larga del citocromo oxidasa (Luntet al., 1996) La subunidad II del Citocromo c

oxidasa, es utilizada por razones similares a la primera y, aunque es más corta,

tiene una señal filogenética fuerte proveniente de la segunda posición (más

conservada) cuando se consideran muchos taxones en el estudio, y de la tercera

posición (más variable) cuando se analizan a nivel genérico (Ascunceet al.,

2002). Para una comparación a nivel de género, familia y orden se usan

marcadores con menos variabilidad como el citocromo b (cyt b) (Hernández et

al. 2001).

Hay varios métodos de reconstrucción filogenética que se emplean para

generar resultados gráficos (árboles filogenéticos). Dos de los más son el

método de Máxima Verosimilotud y el método de Neighbor-Joining. El de

primero encuentra árboles filogenéticos que tiene una probabilidad muy alta de

explicar los datos analizados. Es un método relativamente sencillo, como buen

modelo estadístico que sólo se aproxima a la realidad, al que no poder asumir

dependencia de los datos, porque de ser así sería demasiado complicado para

funcionar adecuadamente (Felsenstein, 1981). El método de Neighbor-Joining

es más fácil de emplear por el usuario común gracias a su alta velocidad de

computo y es especialmente acertado cuando se emplean secuencias de

evolución lenta, o en procesos evolutivos cortos, ya que asume que los procesos

evolutivos dentro de los linajes han permanecido constantes a través de la

historia evolutiva (Kumar y Gadagkar, 2000).

Con la información apropiada se pueden generar diagramas en forma de

árboles que muestran la filogenia de un grupo de organismos del ‘punto de vista’

de distintos marcadores. Se pueden comparar diferentes árboles para tener una

imagen más acertada de la historia evolutiva del sujeto de estudio. En este se

analiza la filogenia de los cetáceos misticetos, ballenas barbadas, comparando

los árboles filogenéticos resultantes y, principalmente, evaluar que método y que

gen son los más apropiados en el estudio evolutivo de estos organismos.

OBJETIVOS

General

Verificar el poder del análisis filogenético molecular, usando secuencias de ADN

mitocondrial de misticetos.

Particular

Identificar y ejecutar los pasos de un análisis filogenético molecular, aplicando

algoritmos de optimización robustos como: Neighbor-Joining y Máxima

Verosimmilitud.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se estimaron las relaciones filogenéticas existentes entre las 14 especies de

cetáceos del suborden Mysticetii utilizando cuatro diferentes secuencias del

genoma mitocondrial: Citocromo C Oxidasa I (COI), Citocromo C oxidasa II

(COII), Citocromo B (Cyt b) y la región control (D-loop). También se usaron las

secuencias del Jabalí para utilizarlo como especie fuera. Todas las secuencias

fueron obtenidas de la base de datos en línea National Centerfor Biotechnology

Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Las alineaciones de las secuencias se

realizaron mediante el programa Clustal X versión 2.0 y para las estimaciones

filogenéticas se utilizó MEGA 5. Dentro de éste se obtuvo el modelo de

sustitución nucleotídica que se ajustara mejor a cada secuencia para después

crear los árboles filogenéticos en base a dichos modelos. Para cada región

mitocondrial analizada se creó un árbol mediante el método de Máxima

Verosimilitud (MV) y otro mediante el de Neighbor-Joinig (NJ). En todas las

ocasiones los árboles se sometieron a una prueba bootstrap de 1000

replicaciones. 

RESULTADOS

El modelo de sustitución de ADN que tuvo un mayor ajuste para cada una de las

secuencias fue el de Hasegawa-Kishino-Yano (HKY). En el caso de los modelos

resultantes para los genes mitocondriales COI, COII y CYT B se registró la

presencia de una tasa de sustitución gama (+G) y sitios invariantes (+I) mientras

que para la secuencia de la región control (D- loop) sólo registró una tasa de

sustitución gama sin sitios invariantes. Sin embargo, el modelo HKY no está

disponible en el software MEGA 5 para la creación de árboles filogenéticos

utilizando el método de NJ; su realización sólo es posible mediante el método de

MV. Por tal razón se opto por usar el modelo Tamura-Nei que fue el mejor se

ajustó a las secuencias después del HKY. Los parámetros de sustitución gama y

sitios invariantes fueron similares para ambos tipos de modelos de sustitución de

ADN.

Los dos árboles filogenéticos obtenidos mediante el análisis del gen COI

fueron estructuralmente muy similares entre sí. La diferencia más marcada

radica en el grupo formado por Eubalaena japonica, Eubalaena australis,

Balaenoptera mysticetus y Caperea marginata que está presente en el método

de NJ pero parcialmente ausente en el modelo MV donde C. marginata se

encuentra muy separada del grupo que forman las primeras tres especies (figura

1). En cuanto a tiempos de divergencia se observa que en el segundo árbol las

especies más cercanas son E. australis y E. japónica, seguidas por la mayoría

de las baleonopteras. La divergencia más temprana aparenta haberse dado

entre el grupo de los eubalaenidos (incluyendo B. mysticetus y C. marginata) y el

resto de las especies (figura 1, izq.).

Figura 1. Árbol filogenético realizado a partir de la secuencia del gen mitocondrial Citocromo C oxidasa subunidad I mediante en el modelo de Tamura-Nei y utilizando el método MV (izquierda) y NJ (derecha).El número indicado en cada rama es número de acceso a la secuencia y las especies son Baby, Balaenoptera brydei; Baed, Balaenoptera edeni, Babo, Balaenoptera borealis; Bamu, Balaenoptera musculus; Baom, Balaenoptera omurai; Esro, Escherichtius robustus; Baph Balaenoptera physalus; Meno, Megaptera novaeangliae; Babo Balaenoptera borealis; Baac, Balaenoptera acutorostrata; Cama, Caperea marginata; Bamy Balaena mysticetus; Euau Eubajaena australis; Euaj, Eubalaena japonica; y Susc, el jabalí Sus Scrofa.

Al igual que en el caso de los árboles filogenéticos del gen COI, los

obtenidos mediante el análisis de COII también fueron muy similares entre sí. En

ambos casos C. marginata aparece fuera del grupo formado por E. japonica,

E.australis, B.mysticetus tal y como se muestra en el árbol de COI y MV. Sin

embargo, difieren en la posición del grupo formado por Megaptera novaeangliae

y Balaenoptera physalus (figura 2). En el árbol de NJ se nota que los grupos que

divergieron primero (observado en la longitud de las ramas) fueron los

eubalaenidos (con B. mysticetus) del resto, seguido por C. marginata del resto,

mientras que los más cercanos en tiempo son Balaenoptera edeni con

Balaenoptera brydeiy por otro lado E. australis con E. japonica (figura 2, izq.).

Figura 2. Arboles filogenéticos realizados a partir de la secuencia del gen mitocondrial Citocromo C oxidasa subunidad II mediante el modelo de Tamura-Nei y utilizando el método de MV (izquierda) y NJ (derecha). El número indicado en cada rama es número de acceso a la secuencia y las especies son Baby, Balaenoptera brydei; Baed, Balaenoptera edeni, Babo, Balaenoptera borealis; Bamu, Balaenoptera musculus; Baom, Balaenoptera omurai; Esro, Escherichtius robustus; Baph Balaenoptera physalus; Meno, Megaptera novaeangliae; Babo Balaenoptera borealis; Baac, Balaenoptera acutorostrata; Cama, Caperea marginata; Bamy Balaena mysticetus; Euau Eubajaena australis; Euaj, Eubalaena japonica; y Susc, el jabalí Sus Scrofa.

Por otro lado, los árboles filogenéticos resultantes del análisis del

Citocromo B difieren notoriamente en la estructuras de grupos de tres o más

organismos. Sin embargo, los principales ramas del árbol creado por medio del

método de MV presenta valores bootstrap muy bajos (36, 42 y 19) en sus

primeras ramas, que agrupan a un número grande de especies, por lo que no

pueden tomarse en cuenta. Los valores bootstrap del árbol creado por el método

de NJ también muestra muchos valores bajos en muchas de sus ramas pero en

las primeras presenta valores más grandes que el de MV. Aún así, cercana

relación entre dos ó tres especies está muy clara en algunos casos para ambos

árboles, como E. australis con E. japonica y B. mysticetus, y Balaenoptera

acutorostrata con B. edeni (figura 3). Similar a los dos árboles de NJ anteriores,

los tiempos de divergencia más recientes se observan entre E. australis y E.

japonica por un lado, pero difiere en que entre los balaenopteridos muestra una

cercanía mayor entre B. edeni y Balaenoptera borealis que entre B. edeni y B.

brydei (aunque esto se corrige con un valor relativamente bajo de bootstrap de

56). También excluye a C. marginata como la más diversificada de todas las

demás pero con un bootstrap de solo 56 (figura 3, izq.).

Figura 3. Árbol filogenético realizado a partir de la secuencia del gen mitocondrial Citocromo B mediante en el modelo de Tamura-Nei y utilizando el método de MV (izquierda) NJ (derecha). El número indicado en cada rama es número de acceso a la secuencia y las especies son Baby, Balaenoptera brydei; Baed, Balaenoptera edeni, Babo, Balaenoptera borealis; Bamu, Balaenoptera musculus; Baom, Balaenoptera omurai; Esro, Escherichtius robustus; Baph Balaenoptera physalus; Meno, Megaptera novaeangliae; Babo Balaenoptera borealis; Baac, Balaenoptera acutorostrata; Cama, Caperea marginata; Bamy Balaena mysticetus; Euau Eubajaena australis; Euaj, Eubalaena japonica; y Susc, el jabalí Sus Scrofa.

En un caso más particular, ambos árboles creados mediante la región

control presentan valores bootsrap bajos para la mayoría de sus ramas, en su

gran mayoría menores a 60. Un caso notorio es el de E. australis y E. japonica

que siempre se mantuvieron juntas en los anteriores análisis con un buen calor

bootstrap (76, 89 y 100) sólo se mantienen así en el árbol de MV con un valor

bootstrap más bajo, 72 (figura 4). En este último árbol de NJ no se observa

divergencia génica contundente porque todas las ramas son demasiado cortas a

excepción de la del grupo fuera (figura 4, izq.).

Figura 4. Árbol filogenético realizado a partir de la secuencia de la región control mitocondrial mediante en el modelo de Tamura-Nei y utilizando el método de MV (izquierda) y NJ (derecha). El número indicado en cada rama es número de acceso a la secuencia y las especies son Baby, Balaenoptera brydei; Baed, Balaenoptera edeni, Babo, Balaenoptera borealis; Baom, Balaenoptera omurai; Esro, Escherichtius robustus; Baph Balaenoptera physalus; Meno, Megaptera novaeangliae; Babo Balaenoptera borealis; Baac, Balaenoptera acutorostrata; Cama, Caperea marginata; Bamy Balaena mysticetus; Euau Eubajaena australis; Euaj, Eubalaena japonica; y Susc, el jabalí Sus Scrofa.

DISCUSIÓN

Las relaciones filogenéticas entre las especies de misticetos difirieron en cierto

grado según modelos utilizados, métodos aplicados y genes analizados. El

modelo de sustitución nucleotídica que más cerca estuvo de explicar los

diferentes cambios en las secuencias de todas regiones mitocondriales

analizadas fue Hasegawa-Kishino-Yano pero la imposibilidad de aplicarlo para

construir los árboles filogenéticos mediante los métodos de MV y NJ resultó en

el desuso del mismo. Tamura-Nei fue aplicado en su lugar, obteniendo dos

árboles filogenéticos para cada región mitocondrial.

Se observa que el análisis de la región control mitocondrial presenta

notable una menor confianza de emparentar las especies, pues presenta los

valores bootstrap bastante bajos y una elevada sustitución gama (+G), tanto al

comparar grupos de varios organismos así como parejas de ellos. Esto puede

ser el resultado de que el D-loop presenta una elevada tasa de mutación (Scotto,

2006) y estas mutaciones, al no ser codificantes, son heredadas lo que explica la

gran variedad del segmento y los valores bajos obtenidos en nuestros resultados

(Gardner et al., 2002). También cabe la posibilidad que al tomar la secuencia

completa se hayan establecido relaciones de bloques de secuencias

conservadas o repetidas que relacionan a organismos distancialmente

emparentados en lugar de relacionar organismos cercanamente emparentados,

por lo que se le considera un mal marcador filogenético (Larizzaet al., 2001). Lo

que se ha hecho en otros análisis con el D-loop es tomar fragmentos que no

contienen demasiadas variaciones o demasiadas replicaciones y así se

establecen relaciones más certeras (Árnason y Gullberg, 1994; Larizzaet al.,

2001), pero en el presente estudio se tomó en cuenta la totalidad de la

secuencia de la región control. Sin embargo también se han realizado trabajos

filogenéticos con la región control que emparentan muy bien a las especies de

una familia; quizá la diferencia es sus resultados con los nuestros esté en que

ellos solo se enfocaron a una familia de misticetos mientras que nuestro trabajo

abarcó a todas las especies de misticetos (Wadaet al., 2003).

Los genes mitocondriales, a pesar de mostrar algunos nodos débiles,

tienen muchas ramificaciones muy fuertes y constantes. Por ejemplo, el caso del

grupo formado por B. mysticetus, E. australis y E. japonica es muy notorio pues

está presente en todos los análisis realizados tanto por MV como por NJ

(Arnason y Gullberg, 1994, Arnason y Gullberg, 1996; Milinkovitch,  et al., 1993).

Esta similitud genética se ve reflejada en la morfología de estas especies como

en la cabeza y boca arqueada, el cuerpo robusto, la ausencia de aleta dorsal,

etc. Y en el mismo tema es interesante notar que a pesar de su nombre común,

la ballena franca pigmea (C. marginata) no es incluida en la mayoría de los

análisis dentro del grupo de balaenidos, salvo en el realizado con Cyt b por MV.

Según Sasaki y colaboradores (2005), C. marginata presenta una divergencia

en un tiempo intermedio entre los (eu) balaenidos y los balaenoptéridos,

emparentándolo igualmente con los dos grupos. El análisis mostrado en el

trabajo refleja un emparentado al 95 con los balenoptéridos (similar a los

mostrados por Arnason y Gullberg en 1994 y 1996, con una resolución de 35 y

54, respectivamente) y menciona que sólo caracteres morfológicos

emparentaban antes a la ballena franca pigmea con las demás ballenas francas.

Otro grupo bien diferenciado en el análisis de los tres genes

mitocondriales fue el formado por B. edeni, B. brydei y B. borealis. Estas

especies (y Baleanoptera omurai, que casi siempre se encuentra cerca)

muestran un cierto grado de separación de caracteres y de distancia génica muy

corta. Incluso en años anteriores se pensaba que B. edeni y B. brydei eran la

misma especie, por similitudes morfológicas (Best, 2001) y no fue hasta el

descubrimiento de B. omurai que se separaron definitivamente como dos

especies mediante análisis filogenéticos (Wada et al., 2003).

Así mismo todos los análisis moleculares muestran la relación entre las

dos formas de ballena Minke, la común que vive en el Hemisferio Norte (B.

acutorostrata) y la forma del Antártico (B. bonaerensis), remarcando así su

cercano parentesco. Una asociación muy interesante fue la de M.

novaeangliae y B. physalus pues se observa que están más emparentadas entre

ellas que entre las demás especies de su propio género (en el caso deB.

physalus). Incluso, se sabe de la existencia de híbridos entre ésta y B. musculus,

pero no con M. novaeangliae (Bérubé y Aguilar, 1998). Esto nos lleva a creer

que M. novaeangliae podría estar más relacionada al género Balaenoptera de lo

que se pensaba y una reclasificación podría ser necesaria. Así mismo, E.

robustus apareció más relacionado con los rorcuales que con las ballenas

verdaderas, aunque su forma de alimentación y su falta de numerosos pliegues

gulares sugieren lo contrario, lo que indica que podría ser un espécimen

intermedio entre ambos linajes de misticetos.

En retrospectiva se observa que el gen que aparenta ser más confiable

(múltiples altas resoluciones de bootstrap) es el Cyt b, y también es uno de los

más usados en filogenias para cetáceos. Por otro lado los dos genes del CO

contienen menos resoluciones altas y aunque en este trabajo salieron acertados,

no se usan para hacer filogenias. Esto se puede deber a que, cuando se trata de

separar especies muy cercanas, el Cyt b consistentemente funciona mejor que

las CO y por tanto investigadores prefieren usar lo que se ha probado ser más

seguro (Amaral et al., 2007). A diferencia de los anteriores los árboles del D-loop

salieron con resoluciones muy bajas, muchas por debajo del nivel aceptable

(60). Esto pudiera deberse a que como muta muy rápido es apropiado para

hacer distinciones inter-específicos o inter-génicos pero cuando se trata de

análisis de taxones mayores pierde resolución (Larizza et al., 2001). Finalmente

se observó que los dos árboles de cada gen se asemejaban mucho entre sí,

indicando la validez de los dos métodos de reconstrucción filogenética.

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