angiogenèse et anti-angiogenèse angiogenesis and anti

ISBN 978-2-918172-24-6 10 H

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A

Angiogenèse et anti-angiogenèse

Angiogenesis and anti-angiogenesis

Les coLLoques de L’InstItut servIer



9 7 8 2 9 1 8 172246

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Photocomposition et impression : JouveImprimé en FranceDépôt légal : août 2009ISBN : 978-2-918177-24-6

Les colloques de L’Institut Servier


Angiogenesis and anti-angionenesis

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L’In St Itut SEr VIEr

Président : Docteur Jacques Servier

Comité permanent

Docteur Laurent PerretDocteur Alain Le RidantMadame Béatrice Guardiola-Lemaître

Comité scientifique

Président : Professeur Pierre Godeau

Membres : Professeurs Jacques Barrat, Marie-Germaine Bousser, Jean-Marie Brogard, Janine Chanteur, Bernard Devulder, Camille Francès, Jean-François Giudicelli, Michel Haguenau, Lucien Israel, Henri Lôo, Roger Luccioni †, Charles Joël Menkès, Jean-Pierre Michel, Gérard Milhaud, Yves Pouliquen, Jacques Rochemaure, Michel Safar, Robert Slama

Auteurs Janine Chanteur Professeur Emérite de Philosophie Morale et Politique de l’Université

Paris IV (Sorbonne), Paris, France

Pierre Corvol INSERM U833, Collège de France, Paris, France

Anne Eichmann INSERM U833, Collège de France, Paris, France

Joseph Emmerich INSERM U428 et Hôpital Européen Georges Pompidou, Paris, France

Pierre Godeau Président de l’Institut Servier, Paris, France

Bernard Lévy INSERM U689, Hôpital Lariboisière, Paris, France

Philippe Menasché Hôpital Européen Georges Pompidou, Département de Chirurgie Cardiovasculaire, Université Paris Descartes, Faculté de Médecine, INSERM U633, Paris, France

Jean-Jacques Mourad CHU Avicenne, APHP et Université Paris XIII, Bobigny, France

Michel Pâques UMPC, University College London, Royaume Uni

Jacques Pouysségur Institut de Biologie du Développement et Cancer, CNTS-UME 6543, Université de Nice, Centre Antoine Lacassagne, Nice

Olivier r ixe National Cancer Institute, Medical Oncology Branch, Bethesda, USA ; PNES (Programme National d’Excellence Spécialisée) Rein, Institut National du Cancer, France

José-Alain Sahel CHNO des Quinze-Vingt, Institut de la Vision UMRS-INSERM, Paris, France

Jean-Sébastien Silvestre INSERM U689, Hôpital Lariboisière, Paris, France

Gérard t obelem IVS, Hôpital Lariboisière, Paris, France

Sommaire


IntroductionPierre Godeau ............................................................................................................ 15Hommage à Roger LuccioniPierre Godeau ............................................................................................................. 18Bases moléculaires de l’angiogenèse physiologique et pathologique Pierre Corvol .............................................................................................................. 20Angiogenèse et neurogenèseAnne Eichmann ........................................................................................................... 27Angiogenèse post-ischémique : aspects expérimentaux, perspectives thérapeutiquesBernard Lévy, Jean-Sébastien Silvestre ...................................................................... 34Thérapie génique et cellulaire dans l’artériopathie des membres inférieursJoseph Emmerich ........................................................................................................ 48La thérapie cellulaire en pathologie cardiaquePhilippe Menasché ...................................................................................................... 59Sur la symbolique de l’angiogenèse et de l’anti-angiogenèseJanine Chanteur .......................................................................................................... 66Hypoxie et progression tumorale : nouvelles approches thérapeutiquesJacques Pouysségur .................................................................................................... 70État des lieux des anti-angiogéniques en cancérologieOlivier Rixe ................................................................................................................. 79Anti-angiogenèse et pathologie oculaire, dégénérescence maculaire liée à l’âgeJosé-Alain Sahel, Michel Paques ................................................................................ 86Les vaisseaux tumoraux : une cible thérapeutique majeureGérard Tobelem ........................................................................................................... 94Limites et complications des traitements anti-angiogéniquesJean-Jacques Mourad .................................................................................................. 100

Contents


IntroductionPierre Godeau .............................................................................................................. 109Tribute to Roger LuccioniPierre Godeau ............................................................................................................. 111Molecular bases of physiological and pathological angiogenesisPierre Corvol .............................................................................................................. 113Angiogenesis and neurogenesisAnne Eichmann ........................................................................................................... 119Postischemic angiogenesis: experimental aspects and therapeutic perspectivesBernard Lévy, Jean-Sébastien Silvestre ...................................................................... 125Gene and cell therapy in peripheral arterial disease Joseph Emmerich ........................................................................................................ 138Cell therapy in cardiac diseasePhilippe Menasché ...................................................................................................... 148On the symbolism of angiogenesis and anti-angiogenesisJanine Chanteur .......................................................................................................... 155Hypoxia and tumur progression: new therapeutic approaches Jacques Pouysségur .................................................................................................... 158An appraisal of anti-angiogenics in oncology Olivier Rixe ................................................................................................................. 167Anti-angiogenesis and eye disease; age-related macular degenerationJosé-Alain Sahel, Michel Paques ................................................................................ 173Tumur blood vessels: a major therapeutic targetGérard Tobelem ........................................................................................................... 180Limitations and complications of anti-angiogenic treatmentsJean-Jacques Mourad ................................................................................................. 186

Angiogenèse et anti-angiogenèseAngiogenesis and anti-angiogenesis© 2009 Wolters Kluwer Health. Tous droits réservés

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Introduction

Pierre Godeau

Le concept d’angiogenèse et d’anti-angiogenèse est probablement l’une des avancées majeures de notre évaluation des processus physiopathologiques mais c’est égale-ment un progrès dans nos connaissances du développement physiologique. C’est pourquoi nous avions prévu, il y a bientôt 4 ans, de consacrer à ce thème l’un des colloques de L’Institut Servier, d’autant plus qu’il concerne la plupart des disciplines médicales et entre dans ce qu’il est désormais d’usage de désigner comme un thème transversal.

Si l’intérêt éventuel d’un traitement anti-angiogénique du cancer a été évoqué il y a déjà 37 ans (1971) par Folkman, c’est dans les 5 dernières années que se sont multipliés des essais thérapeutiques dans deux domaines opposés :

usage des médications pro-angiogéniques dans les pathologies ischémiques, essen- –tiellement ischémie critique des membres inférieurs et pathologie coronaire avec, en outre, un espoir jusqu’ici non conἀrmé de bloquer les processus de resténose après angioplastie et/ou mise en place de stents ;

emploi de médicaments anti-angiogéniques dans le traitement du cancer avec déjà –trois médicaments disponibles : bévacizumab (Avastin®), sorafenib, imitinib. Des succès indiscutables ont été obtenus notamment dans le cancer du rein métastatique mais également, bien que moins spectaculaires, dans le cancer colo-rectal, le cancer du poumon non à petites cellules et le carcinome hépatocellulaire. L’activité des agents anti-angiogéniques en monothérapie n’est donc pas nulle mais c’est couplée à la chimiothérapie qu’elle s’avère la plus intéressante.

Le mécanisme de l’angiogenèse est le suivant : elle agit aussi bien en pathologie que chez l’adulte sain en réveillant les cellules endothéliales quiescentes, permettant une néovascularisation. Un exemple est celui de l’exercice musculaire prolongé où l’hypoxie locale, résultant de l’augmentation de la consommation locale d’oxygène, est compensée par une capillarogenèse.

Le VEGF (vascular endothelial growth factor) intervient aussi bien en physio-logie, comme facteur de croissance vasculaire embryonnaire et postnatale, qu’en pathologie, notamment dans le développement de l’angiogenèse tumorale. Cependant, le système VEGF est complexe, comportant plusieurs isoformes et au moins deux récepteurs dont un récepteur soluble qui joue un rôle stabilisant

Pierre Godeau

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frénateur. En outre, le système VEGF est sous la dépendance du facteur transcrip-tionnel induit par l’hypoxie – HIF1 (hypoxia-inducible factor) notamment. Les récepteurs du VEGF ayant une activité tyrosine kinase, cette particularité laisse entrevoir d’autres possibilités de recherche physiopathologique et thérapeutique. Les rapports du VEGF avec les activateurs du plasminogène sont également un point important : l’interaction possible avec des phénomènes thrombotiques ne peut être ignorée.

Par ailleurs, il ne faut pas mettre sur le même pied, dans le domaine de la néovas-cularisation, l’angiogenèse, l’artériogenèse et la vasculogenèse [1]. Enἀn, l’angioge-nèse n’est pas indépendante de la lymphogenèse ni de la neurogenèse.

Si la thérapeutique anti-angiogénique est, dans l’ensemble, bien tolérée, notamment absente de toute myélotoxicité, elle n’en comporte pas moins des effets secondaires cardiovasculaires et rénaux (hypertension artérielle, protéinurie) liés en partie au moins à la baisse de la production de monoxyde d’azote sous anti-VEGF, et on peut craindre des effets fâcheux chez des sujets coronariens ou atteints d’artériopathie des membres inférieurs. À l’inverse, si les agents anti-angiogéniques sont prometteurs et en cours d’évaluation dans la rétinopathie diabétique et la dégénérescence maculaire liée à l’âge, en bloquant la néovascularisation, on pouvait craindre a contrario un effet nocif des pro-angiogéniques utilisés en pathologie vasculaire ischémique chez des patients atteints de l’une de ces pathologies oculaires. Il semble toutefois que la non-perméabilité des milieux oculaires aux traitements administrés à distance ou par voie systémique les mette à l’abri. Le revers de la médaille est que les résultats positifs obtenus par les anti-angiogéniques nécessitent actuellement leur utilisation par voie intravitréenne [2].

Reste un inconvénient majeur du traitement anti-angiogénique : son efἀcacité à court terme sur la croissance tumorale en bloquant les cellules endothéliales activées par le VEGF et en respectant l’endothélium normal dont les cellules sont quiescentes se maintient-elle à long terme ? Rien n’est moins sûr du fait de facteurs multiples : mutation des récepteurs des facteurs de croissance les rendant insensibles aux inhibi-teurs, stratégie de survie des cellules tumorales échappant au traitement, intervention d’autres facteurs de croissance tumorale non identiἀés [3].

C’est pourquoi, dans l’état actuel de nos connaissances, les facteurs anti-angio-géniques ne doivent pas faire « cavalier seul » mais s’inscrivent en association et en complément des traitements classiques, notamment de la chimiothérapie et de la radiothérapie.

Nous espérons qu’au cours de cette journée dont l’organisation a été préférentielle-ment élaborée par Pierre Corvol, nos connaissances encore préliminaires de ce vaste domaine de l’angiogenèse bénéἀcieront d’une mise à jour et d’une réḀexion mieux étayée sur les perspectives d’avancées thérapeutiques prometteuses mais encore insufἀsamment validées.

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Introduction

Bibliographie

1 Simons M. Angiogenesis. Where do we stand now? Circulation 2005 ; 111 : 1556-66.2 Corvol P. VEGF, anti-VEGF et pathologies. Bull Acad Nat Med 2008 ; 192 : 289-302.3 Kerbel RS. Tumor angiogenesis. N Engl J Med 2008 ; 358 : 2039-49.


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Hommage à Roger Luccioni

Le colloque de l’Institut Servier consacré à l’angiogenèse et l’anti-angiogenèse a été préparé depuis 3 ans en collaboration avec Roger Luccioni et je voudrais à cette occasion évoquer la mémoire de celui qui fut mon ami depuis près de 30 ans et qui nous a malheureusement quittés le 9 avril 2008, 1 mois avant son 74e anniversaire. Interniste et cardiologue, chef de service au CHU Nord de Marseille depuis 1979, professeur titulaire depuis 1981 et professeur à la classe exceptionnelle depuis 1997, Roger eut une carrière scientiἀque brillante matérialisée par près de 500 publica-tions, ce qui lui a valu l’estime de ses pairs et le privilège d’exercer les fonctions de Vice-Doyen de la Faculté de Médecine de Marseille depuis 1997.

Mon propos n’est pas de détailler ici sa carrière hospitalo-universitaire mais de partager avec vous quelques aspects de la personnalité si attachante de Roger. J’évoquerai tout d’abord son sens de l’amitié, de la ἀdélité à ses amis et à ses élèves s’inscrivant dans la plus pure tradition corse où la parole donnée n’est jamais remise en question et l’engagement réciproque en amitié est en quelque sorte sacré. Au cours des longues années où j’ai eu l’honneur de présider la 53e section du Conseil Natio-nal des Universités, se sont renforcés les liens qui nous unissaient. J’ai pu apprécier particulièrement l’esprit de synthèse, la qualité de jugement de Roger et son sens de l’équité évaluant avec objectivité et bienveillance sans mesquinerie mais également sans complaisance injustiἀée les candidats aux postes de PUPH se présentant devant notre juridiction.

Le deuxième trait marquant du caractère de Roger est son attachement à sa famille. Sa compagne, Anne-Marie d’Estienne d’Orves, mère de ses deux dernières ἀlles, Marie-Dominique et Julie nées en 1986 et 1987, formait avec Roger un couple exem-plaire et les problèmes de santé qui les éprouvèrent tour à tour et auxquels j’ai parti-cipé comme ami et conseiller médical furent résolus par une attitude courageuse, active, combative et dynamique que seule une profonde entente pouvait engendrer.

Mais il n’est pas possible de ne pas évoquer également d’autres qualités de Roger, sans doute moins connues du milieu scientiἀque.

Roger s’intéressait au football et j’ai souvenir d’une réunion de la Société de cardiologie, plus précisément de la ἀliale Thérapeutique qu’il présidait, et qui se déroulait à Ajaccio le jour de la ἀnale de la coupe d’Europe gagnée par l’OM. Roger, responsable de cette réunion scientiἀque, nous ἀt bénéἀcier de la transmission télé-visée de ce match. Adjoint au maire de Marseille, il se devait de marquer son soutien au club marseillais, mais j’ai appris à cette occasion qu’en 1950, comme junior,

Hommage à Roger Luccioni

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il avait été champion de Provence et était resté ἀdèle à cet engagement sportif de l’adolescence.

En réalité, l’aspect le plus étonnant de la personnalité de Roger est sa profonde culture musicale. Roger fut en effet un contrebassiste renommé, lié à l’histoire du jazz à Marseille depuis son adolescence. Créateur en 1956 de la revue Jazz Hip, concerts, rencontres musicales et tournées, enregistrements de plusieurs albums et musiques de ἀlm ont marqué son activité non seulement de contrebassiste au sein d’un trio mais également de compositeur. En 2006, malgré ses multiples occupations et un état de santé déjà préoccupant, un nouvel album avec ce trio intitulé Douces pluies marquait la pérennité de l’activité de jazzman de Roger.

En 2006, lors d’une séance décentralisée de l’Académie Nationale de Médecine à Marseille, le maire Jean-Claude Gaudin, qui connaissait mes liens amicaux avec Roger, m’avait conἀrmé combien il appréciait l’activité de Roger chargé de la culture à la mairie de Marseille et, parallèlement, son inquiétude concernant son état de santé.

Avec Roger Luccioni, l’Institut Servier perd l’un des membres les plus actifs et les plus prestigieux de son conseil scientiἀque. Chevalier de l’Ordre National du Mérite, chevalier de l’Ordre des Palmes Académiques et de l’Ordre des Arts et Lettres, il nous avait fait bénéἀcier il y a 1 an d’un remarquable exposé lors du colloque sur la dépendance fonctionnelle, exposé particulièrement brillant dont nous ne savions pas que c’était sa dernière participation ofἀcielle aux manifestations de l’Institut Servier.

La minute de silence que je vous propose d’observer nous permettra de nous recueillir en souvenir de notre ami disparu.

Professeur Pierre Godeau


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Bases moléculaires de l’angiogenèse physiologique et pathologique

Pierre Corvol

Fo RmAt Ion des vAIsse Aux s Angu Ins

Le développement du système vasculaire durant l’embryogenèse se déroule en deux phases distinctes, la vasculogenèse et l’angiogenèse. Lors de la vasculogenèse, des cellules progénitrices se différencient en cellules endothéliales à partir de cellules mésenchymateuses puis s’assemblent en un réseau vasculaire primitif. L’angiogenèse, qui fait suite à la vasculogenèse, permet l’extension et le remodelage de ce réseau aἀn d’établir un système circulatoire mature et fonctionnel.

Chez l’adulte sain, l’angiogenèse intervient principalement au cours du cycle ovarien et de la grossesse. Elle participe également au développement d’une circula-tion collatérale lors de l’exercice physique. On parle alors d’artériogenèse. En condi-tions pathologiques, l’angiogenèse est impliquée dans les phénomènes de croissance tumorale, dans des affections oculaires comme la dégénérescence maculaire liée à l’âge et la rétinopathie diabétique, dans la cicatrisation de blessure ou dans des mala-dies inḀammatoires comme la polyarthrite rhumatoïde ou le psoriasis [1].

Const Ru Ct Ion d’un nouve Au vAIsse Au : vAs Cu Logenèse

La vasculogenèse aboutit à la formation d’un plexus capillaire primitif. Sous l’action du VEGF (vascular endothelial growth factor), des cellules progénitrices nommées angioblastes, situées dans le stroma, donnent naissance à des cellules endothélia-les. Celles-ci s’organisent pour former des tubes capillaires primitifs d’une section habituellement constituée de 3 cellules. Le plexus capillaire primitif est, à ce stade, incapable de réagir aux variations de Ḁux sanguin.

Les chercheurs ont longtemps pensé que la phase de vasculogenèse ne concernait pas l’adulte. En réalité, les cellules progénitrices, logées notamment dans la moelle osseuse, peuvent être activées par des facteurs de croissance, des cytokines ou des hormones qui vont relancer la prolifération, la différenciation et la mobilisation de ces cellules pour contribuer à l’élaboration de nouveaux vaisseaux. Ce processus, qui a été récemment décrit, est à la base de nouvelles modalités thérapeutiques, dites


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pro-angiogéniques, employées en thérapie cellulaire. Celles-ci sont actuellement étudiées en cardiologie et pourraient permettre de restaurer l’intégrité des vaisseaux ischémiques au cours de l’infarctus du myocarde et de l’artérite des membres infé-rieurs [1].

Remode LAge vAs Cu LAIRe du Rése Au CApILLAIRe p RImIt IF : Ang Iogenèse et ARté RIogenèse

L’angiogenèse et l’artériogenèse constituent une phase de remodelage vasculaire du réseau capillaire primitif issu de la phase de vasculogenèse.

Le processus est sous le contrôle de différents facteurs abondamment étudiés dans la littérature médicale parce qu’ils constituent autant de pistes pour les thérapeu-tiques pro-angiogéniques ou anti-angiogéniques. C’est ainsi que l’angiopoïétine 1, le PDGF (platelet derived growth factor), le TGF-β (transforming growth factor β) et le PlGF (placenta growth factor) notamment interviennent dans le recrutement, la migration et l’organisation du vaisseau mature qui va ἀnalement être capable de vasodilatation ou de vasoconstriction, de façon à pouvoir réguler les Ḁux sanguins. Il importe de souligner que l’organisation du réseau vasculaire est sous contrôle géné-tique et hémodynamique à la fois. Le Ḁux sanguin participe en effet de façon active à la formation des vaisseaux et à la différenciation en artères et veines. Ainsi, sous l’effet du Ḁux sanguin traversant les vaisseaux, les cellules endothéliales conduisent les cellules mésenchymateuses environnantes à proliférer, migrer et se différencier en cellules périvasculaires pour les capillaires et en cellules musculaires lisses pour les artères et les veines [1].

mé CAn Isme d’ ACt Ion du veg F

On ne peut pas évoquer le VEGF sans rendre hommage à Jean Plouet qui, avec Napoleone Ferrara, a découvert ce facteur de croissance en 1988 à San Francisco. Jean Plouet est malheureusement décédé en 2008. Je tiens à rappeler ici que son rôle dans la découverte du VEGF est resté insufἀsamment reconnu en dehors de la communauté médico-scientiἀque française.

Le VEGF joue un rôle central dans l’angiogenèse. C’est une cytokine à action paracrine, ce qui signiἀe que ce facteur agit sur les cellules endothéliales adjacentes des cellules où a lieu sa synthèse. L’interaction du VEGF avec ses récepteurs expri-més par les cellules endothéliales déclenche une série de réactions qui vont aboutir à la création d’un nouveau vaisseau à partir du vaisseau parental.

Dans un premier temps, le VEGF provoque la perte de contact entre les cellu-les endothéliales et les péricytes, et la perméabilité vasculaire augmente (le VEGF avait été initialement nommé « vascular permeability factor » par Dvorac). Cette perméabilisation libère du sérum et des protéines plasmatiques qui vont contribuer à

Pierre Corvol

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la formation d’une matrice extracellulaire dans laquelle le néovaisseau pourra s’in-tégrer. La membrane basale du vaisseau parental est ensuite détruite sous l’effet de collagénases, de protéases et de l’activateur du plasminogène. Des cellules endothé-liales sont alors libérées et leur prolifération conduit à la formation d’un nouveau vaisseau bourgeonnant à partir du vaisseau parental [1].

veg F et Ré Cepteu Rs du veg F

La famille des VEGF se compose des VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D et du PlGF.

L’effet des VEGF est médié par 3 récepteurs tyrosine kinase nommés VEGFR-1, VEGFR-2 et VEGFR-3. Le proἀl de liaisons des VEGF à ces récepteurs n’est pas spéciἀque :

le VEGFR-1 lie VEGF-A, VEGF-B et PlGF ; –le VEGFR-2 lie VEGF-A, VEGF-C et VEGF-D ; –le VEGFR-3 lie VEGF-C et VEGF-D [2, 3]. –Les récepteurs VEGFR-1 et VEGFR-2 sont essentiellement retrouvés dans le compar-

timent vasculaire au niveau de la membrane plasmique des cellules endothéliales. Nous avons vu que ces facteurs jouent un rôle central dans la physiologie et la pathologie du système vasculaire, en particulier la vasculogenèse et l’angiogenèse, deux mécanismes qui aboutissent à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins orientés dans la direc-tion d’un stimulus angiogénique. Or, le VEGFR-2 interagit avec une protéine, la neuro-piline 1, qui a elle-même la sémaphorine pour ligand. Le terme même de neuropiline indique que cette molécule a été découverte dans le système nerveux. Elle y intervient dans des processus de guidage qui présentent la particularité intéressante d’être parta-gés par les vaisseaux sanguins et par les nerfs. Le terme sémaphorine souligne que ce ligand guide comme un sémaphore le vaisseau dans son trajet.

Le récepteur VEGFR-1 a, quant à lui, une structure proche de celle du récepteur VEGFR-2 mais il se caractérise par sa capacité à être clivé pour donner une partie soluble, circulante, qui se comporte comme un anti-VEGF. Ce récepteur 1 soluble est un VEGF-trap capable d’inactiver le VEGF circulant ou avoisinant les cellules endothéliales. Il interviendrait dans des phénomènes d’angiogenèse-anti-angioge-nèse ἀnement régulés, lors de la grossesse par exemple, pour commander l’arrêt de l’angiogenèse. Des faits cliniques plaident ainsi en faveur d’un excès de VEGFR-1 dans la toxémie gravidique où il entraînerait une ischémie placentaire en inactivant le VEGF et en raréἀant le réseau vasculaire.

Le système vasculaire lymphatique est contrôlé par les VEGF-C et D et leur récep-teur VEGFR-3, soit un autre système de VEGF que dans le compartiment vasculaire. L’organisation générale de ce contrôle est cependant assez parallèle et on peut légiti-mement escompter que des stratégies anti-VEGF spéciἀques pourront être mises en œuvre pour, notamment, éviter la dissémination métastatique par voie lymphatique.


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eFF ets Ce LLu LAIRes et Int RACe LLu LAIRes du veg F

L’activation de son récepteur par le VEGF entraîne toute une série d’événements cellulaires et intracellulaires. Au niveau intracellulaire, le VEGF intervient dans la production du monoxyde d’azote (NO). Son inhibition entraîne ainsi une élévation de la pression artérielle par la diminution de la production endothéliale de NO, qui est un agent vasodilatateur tonique, et, donc, par une élévation du tonus vasoconstricteur.

Les macrophages, les cellules dendritiques et les cellules progénitrices sont égale-ment concernés par le VEGF. Ainsi, ce facteur provoque la prolifération et la migra-tion des cellules endothéliales, sur lesquelles il exerce également un effet antiapop-totique. Il inhibe les cellules dendritiques et mobilise les cellules progénitrices des cellules endothéliales.

s t RAtég Ies Ant I-veg F

Le VEGF peut être inhibé par des anticorps anti-VEGF, le VEGFR-1 soluble, un aptamère ou des inhibiteurs des tyrosines kinases du VEGF (ἀg. 1) [4]. Un aptamère, le pegaptanib, est ainsi d’ores et déjà employé dans le traitement de la dégénéres-cence maculaire liée à l’âge. Les inhibiteurs des tyrosines kinases du VEGF, qui ont l’avantage de pouvoir être administrés par voie orale, sont déjà utilisés dans le traite-ment anticancéreux et probablement promis à un bel avenir.

Aptamère

Domaine lgG-like

DomaineTyrosine-kinase

Signalisation cellulaire

InnibiteursTKdu VEGFR

TKI

TKII

VEGF-R2

VEGF-R1soluble

Ac anti-VEGFVEGF

Figure 1. Stratégies anti-VEGF (Reproduit avec l’autorisation de Corvol et Postel-Vinay [4]).

Pierre Corvol

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Cet éventail de stratégies anti-VEGF soulève la question du choix thérapeutique et, plus particulièrement, de sa spéciἀcité. Un anticorps permet d’être extrême-ment spéciἀque et pourra permettre d’agir précisément sur le VEGF-A et non sur les VEGF-B, C ou D. En revanche, un inhibiteur des tyrosines kinases pourra agir sur plusieurs récepteurs à activité tyrosine kinase. Avantage ou inconvénient ? Ces tyrosines kinases pouvant être impliquées dans la prolifération cellulaire, il peut être intéressant de disposer d’un inhibiteur poly-tyrosines kinases, poly-récepteurs de croissance. La question reste donc ouverte.

eFF ets du veg F : pLé Io t Rop Iq ues

Les fonctions du VEGF sont extrêmement variées et son rôle en physiologie et en patho-logie humaine est considérable. Il intervient en pathologie tumorale, inḀammatoire et sur la plaque athéromateuse. Ainsi, celle-ci est microvascularisée et, expérimentalement du moins, une thérapeutique anti-VEGF exerce un effet de stabilisation de la plaque.

Si le VEGF intervient dans la croissance vasculaire, il agit également au niveau du système nerveux à la façon d’un facteur neurotrophique. En outre, il est impliqué dans la croissance du cartilage, dans l’angiogenèse ovarienne, dans l’organisation et la fonction glomérulaire [5].

Rô Le de L’Hypo x Ie d Ans L’Ang Iogenèse

La vie dépend de l’oxygène. Au Permien, il y a 250 millions d’années environ, la pression partielle d’oxygène dans l’atmosphère était environ deux fois plus impor-tante qu’actuellement. Alors qu’aujourd’hui seuls de petits organismes comme les insectes peuvent se permettre d’être dépourvus de système vasculaire et d’assurer leurs besoins par la simple diffusion de l’oxygène, l’élévation de la pression d’oxy-gène qui régnait au Permien a favorisé l’existence de libellules géantes sans réseau vasculaire de près de 1 mètre d’envergure.

L’oxygène est bien la clé de l’existence. Véhiculé par le système vasculaire, il diffuse à partir des vaisseaux dans les tissus environnants. Cependant, la pression partielle d’oxy-gène s’effondre rapidement à distance du vaisseau. Cette situation d’hypoxie nécessitait la mise en place de réponses cellulaires adaptées et coordonnées. Celles-ci reposent sur un facteur essentiel, le facteur induit par l’hypoxie (HIF, hypoxia-inducible factor) qui en est le chef d’orchestre et qui coordonne les réponses à l’hypoxie au niveau cellulaire et à celui de l’organisme entier. En situation hypoxique, il fait passer la cellule d’un métabo-lisme aérobie à un métabolisme anaérobie beaucoup moins efἀcace en termes de rende-ment énergétique mais essentiel pour la survie cellulaire. L’HIF va également déclencher la formation de nouveaux vaisseaux qui vont pouvoir apporter l’oxygène dans des terri-toires hypoxiques. Enἀn, ce même HIF va entraîner une vasodilatation des vaisseaux pour véhiculer de plus grandes quantités d’hémoglobine, accroître l’érythropoïèse… [6].


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À ce jour, on dénombre une centaine de gènes environ qui sont activés et une autre centaine qui sont réprimés sous l’effet de HIF.

Réve IL Ang Iogén Iq ue en p At Ho Log Ie tumo RALe

La croissance tumorale dépend de la néoformation de vaisseaux pour assurer l’ap-provisionnement en oxygène et en nutriments et l’évacuation des déchets du méta-bolisme. La néovascularisation pathologique se développe sous l’effet de conditions hypoxiques et notamment sous le contrôle du VEGF et de son récepteur VEGFR-2.

C’est en 1971 que Judah Folkman a énoncé l’idée de bloquer l’angiogenèse pour priver la tumeur d’oxygène. Ce raisonnement lumineux a eu l’énorme mérite de faire travailler des chercheurs d’horizons très différents sur ce thème. Après les premiers succès vient à présent le temps, comme d’usage, des remises en question. Ainsi, des chercheurs ont émis l’hypothèse que les anti-angiogéniques provoqueraient en réalité la régression des vaisseaux tumoraux dont on sait qu’ils sont caractérisés par un réseau vasculaire désor-ganisé, instable, une perméabilité accrue, des shunts artérioveineux… En revanche, ils permettraient une « normalisation » de la vascularisation. Les anti-angiogéniques feraient régresser les vaisseaux tumoraux anarchiques et peu efἀcaces pour favoriser sa réorganisation et permettraient ainsi une meilleure pénétration des médicaments cyto-toxiques et une meilleure sensibilité à la radiothérapie qui est très dépendante d’une bonne oxygénation. Ce phénomène expliquerait pourquoi chez l’homme, contrairement à la souris, un anti-VEGF seul n’a jamais montré d’effet antitumoral (ἀg. 2).

Vaisseaux cancéreux

Tissu normal Tissu cancéreux

Traitementanti-angiogénique

Régressiondes vaisseauxtumoraux

Réseau vasculaire désorganisé, instablePerméabilité accrueÉlévation de la pression interstitielleShunts artério-véneuxInsuffisance de péricytesFlux sanguin non régulé

Réseau vasculaire organisé, stablePerméabilité contrôléePrésence de péricytes quiescentsFlux sanguin régulé

"Normalisation"de la vascularisation(meilleur apportdes anti-cancéreux,sensibilité accrueà la radiothérapie)Vascularisation normale Vaisseaux tumoraux

Figure 2. Vascularisation tumorale et traitement anti-angiogénique (Reproduit avec l’autorisation de Corvol et Postel-Vinay [4]).

Pierre Corvol

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Bibliographie

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Angiogenèse et neurogenèse

Anne Eichmann

Le réseau vasculaire est le premier des grands systèmes à se mettre en place durant l’on-togenèse. Au cours de son développement, les vaisseaux sanguins se dirigent avec préci-sion vers leur cible pour réaliser un arbre vasculaire extrêmement stéréotypé. Comment l’embryon parvient-il à former un système aussi complexe et aussi structuré alors qu’il atteint une longueur totale de 80 000 km chez l’homme adulte ? Nous espérons qu’en approfondissant notre connaissance des mécanismes à l’œuvre, nous pourrons parvenir à une meilleure maîtrise des nombreuses maladies qui affectent le réseau vasculaire.

Les Rése Aux vAs Cu LAIRe et ne Rveux sont ét Ro Itement LIés

Il y a 500 ans, Vesalius dessinait, à la lueur des chandelles, l’arbre vasculaire humain. L’anatomiste belge avait déjà remarqué que celui-ci était totalement superposable à ce deuxième arbre que forme le système nerveux (ἀg. 1). Ces deux systèmes, qui pour l’un irrigue tout le corps et pour l’autre contrôle sa motricité et son système senso-riel, doivent interagir de façon étroite. Ainsi, les nerfs ont des besoins en oxygène et en nutriments et ils sont, pour cette raison, recouverts d’un dense réseau vasculaire. De la même façon, la motricité et le maintien du tonus vasculaire nécessitent une innervation et les artères sont par conséquent entourées d’un ἀn réseau de nerfs post-ganglionnaires sympathiques.

Les deux systèmes ont par ailleurs en commun de se ramiἀer dans tout l’organisme pour transmettre une information directionnelle, le Ḁux artériel et veineux dans le système vasculaire et les voies motrices et sensorielles dans le système nerveux. De plus, ils sont tous deux composés de deux types de cellules intimement associés, les cellules endothéliales et les cellules de la paroi vasculaire dans le système vasculaire, les neurones et les cellules gliales dans le système nerveux.

FACteu Rs de CRo Iss An Ce vAs Cu LAIRe et déve Loppement du système ne Rveux

Si les systèmes vasculaire et nerveux présentent des interactions anatomiques et fonctionnelles, ils ont également en commun des voies moléculaires de signalisation qui permettent leur développement harmonieux. L’intervention des facteurs de crois-

Anne Eichmann

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sance vasculaire dans le développement du système nerveux a été observée chez une souris dans laquelle l’élément de réponse à l’hypoxie dans le promoteur du VEGF avait été délété : les chercheurs avaient eu la surprise de voir l’animal développer une sclérose très proche de la sclérose latérale amyotrophique humaine. De nombreuses études ont par la suite montré que le VEGF exerce une action neurotrophique. Notre contribution à ce domaine, en collaboration avec Jean-Léon Thomas de l’U 711 de l’INSERM, a été d’étudier un facteur de croissance apparenté au VEGF, le VEGF-C, qui intervient dans le développement neural.

veg F-C et déve Loppement des systèmes vAs Cu LAIRe et ne Rveux

Le VEGF-C et son récepteur, le VEGFR-3, interviennent dans le développement des vaisseaux lymphatiques. Le rapporteur LacZ inséré dans le gène VEGFR-3 colore en bleu tous les vaisseaux qui expriment ce récepteur. Il a permis de montrer sa

Figure 1. Ces représentations, datant de 1543, montrent que l’anatomiste belge Vesalius avait déjà remarqué que les arbres vasculaire (à gauche) et nerveux (à droite) humains sont superposables.


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présence au niveau du réseau vasculaire lymphatique, alors qu’il n’est pas exprimé dans les veines. Le récepteur VEGFR-3 est ainsi spéciἀque des vaisseaux lympha-tiques. L’emploi du rapporteur LacZ a également permis de montrer que ce récep-teur est présent au niveau du cerveau de souris adultes. Le cerveau étant dépourvu de système lymphatique, le récepteur est donc également exprimé par des popula-tions de neurones, et ce constat rendait très probable une action du VEGF-C sur le système nerveux. De fait, nous avons montré in vitro que des progéniteurs de neuro-nes d’embryon exprimant le récepteur VEGFR-3 se divisent et prolifèrent lorsqu’ils sont soumis à une stimulation par le VEGF-C [1]. Ce dernier, qui est exprimé dans les deux systèmes, régule vraisemblablement des voies parallèles du développement neural et du développement vasculaire. Cette observation soulève la question d’un éventuel impact neurologique des traitements anti-angiogéniques.

LA CRo Iss An Ce des CApILLAIRes est gu Idée p AR L’Hypo x Ie

Comment le guidage des capillaires est-il assuré ? La rétine de la souris est un modèle extrêmement précieux pour l’étude de la vascularisation. Elle a notamment permis de montrer que l’angiogenèse est conditionnée par l’hypoxie. Celle-ci attire les vaisseaux par une expression accrue du VEGF, alors que l’apport d’oxygène la diminue en une boucle de rétrocontrôle qui dirige la couverture vasculaire et donc l’oxygénation des tissus.

Si nous nous intéressons plus particulièrement à l’extrémité des capillaires qui pénètrent dans les territoires hypoxiques, nous constatons qu’elle est constituée d’une cellule endothéliale spécialisée, la tip-cell, qui se distingue par sa capacité à étendre de très nombreux ἀlopodes, c’est-à-dire de petites structures riches en actine pouvant se polymériser et se dépolymériser. La tip-cell présente également la caractéristique d’exprimer les plus forts taux du récepteur VEGFR-2. Elle va par conséquent avoir la plus forte réponse au VEGF et, pour cette raison, elle constitue probablement une cible préférentielle des traitements anti-angiogéniques.

LA tip-cell gu Ide LA pRog Ress Ion des CApILLAIRes

Au niveau de la rétine, la formation du capillaire s’effectue selon un gradient de VEGF allant du plus élevé dans la région hypoxique au plus faible dans la région normoxi-que. Lorsqu’elle est située à proximité de la région hypoxique, la tip-cell forme des ἀlopodes alors que les cellules situées derrière forment la lumière du capillaire et assurent l’apport en sang, en oxygène et en nutriments. Pourquoi ces deux types de cellules se comportent-ils de manières différentes ? Il a été montré qu’une mutation d’un gène ligand de Notch, nommé Dll4 (delta-like ligand 4), perturbe la sélection des tip-cells. Chez les animaux Dll4 hétérozygotes, chaque cellule endothéliale va se comporter en tip-cell et étendre des ἀlopodes. Cela signiἀe que chacune des cellules

Anne Eichmann

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endothéliales a la possibilité d’évoluer en tip-cell mais que, en conditions normales, cette potentialité est abolie par l’action de Dll4 sur son récepteur Notch exprimé par la cellule adjacente.

LA s Ign ALIs At Ion de Lt A-n o t CH Cont Rô Le LA Fo RmAt Ion de tip-cells

Schématiquement, le VEGF produit par les cellules hypoxiques se lie à son récepteur VEGFR-2 sur la tip-cell. Il a été montré que cette liaison induit l’expression de Dll4 par la tip-cell. Dll4 va se lier à son ligand Notch exprimé par les cellules situées à l’arrière de la tip-cell. L’action de Notch va ensuite moduler l’expression du VEGF récepteur dans cette cellule de façon à abaisser sa sensibilité au VEGF. Sept articles publiés à la ἀn des années 2006 et 2007, dont un par notre équipe, arrivent à la même conclusion : la signalisation delta-Notch supprime la formation des tip-cells [2-8]. Ce qui est tout à fait remarquable, c’est que cette voie de signalisation opérationnelle chez l’embryon l’est également au niveau des vaisseaux tumoraux. De cette obser-vation découle l’idée de bloquer la vascularisation tumorale en générant un nombre excessif de tip-cells pour empêcher la formation d’un réseau vasculaire structuré.

sI mILARItés ent Re tip-cell et Cône de CRo Iss An Ce Axon AL

La tip-cell présente de remarquables similarités avec une structure terminale de l’axone nommée cône de croissance (ἀg. 2). Tout comme le vaisseau, l’axone possède à son extrémité une structure motrice étendant des ἀlopodes qui vont polymériser et dépo-lymériser pour guider l’axone vers une cible distante dans l’organisme. On connaît actuellement quatre familles de ligands et de récepteurs qui guident les axones vers leur cible. Ces ligands sont les éphrines, les sémaphorines, les slits et les nétrines qui vont se lier à des familles de récepteurs exprimés par les ἀlopodes de l’axone et provoquer ainsi l’attraction ou la répulsion du cône de croissance. Il est tout à fait remarquable que parmi les quatre familles de récepteurs aux facteurs de guidage des axones, plusieurs s’expriment également au niveau des cellules endothéliales, y compris au niveau des tip-cells. C’est notamment le cas du récepteur Eph4 et de son ligand l’éphrine B2, des récepteurs plexine-D1 et neuropiline qui lient les sémaphorines, de robo4, un membre des récepteurs aux slits et d’UNC5B pour la nétrine [9-14] (ἀg. 3).

Imp LICAt Ion de mo Lé Cu Les de gu IdAge Axon AL de type nét RIne et de Leu R Ré Cepteu R un C5B dAns LA mo RpHogenèse du système vAs Cu LAIRe

Nous nous sommes particulièrement intéressés à un récepteur de la nétrine, l’UNC5B.La nétrine est un facteur de guidage de la croissance neuronale bifonctionnel, ce

qui signiἀe qu’elle est aussi bien capable d’attirer que de repousser les neurones. Elle


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Figure 2. La tip-cell endothéliale de la rétine de souris (à gauche) comme le cône de croissance axonal (à droite) étendent des ἀlopodes qui vont guider le néovaisseau ou l’axone vers une cible distante dans l’organisme.

Uninjected Netrin-1

Figure 3. La nétrine-1 promeut la rétraction des ἀlopodes et inhibe la croissance des vaisseaux expri-mant UNC5B [12, 13].

Anne Eichmann

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se lie en effet à deux types de récepteurs différents, les récepteurs DCC, qui sont de type attractif, et les récepteurs UNC5, qui sont de type répulsif.

Au niveau du système vasculaire, nous avons montré que le récepteur UNC5B est exprimé par les cellules endothéliales. Des embryons knockout qui ont une délétion du récepteur UNC5B présentent une arborisation accrue du réseau vasculaire, ce qui est compatible avec le caractère répulsif ou inhibiteur de ce récepteur [12]. Lorsque les tip-cells endothéliales d’embryon normal sont traitées par le ligand du récepteur, la nétrine, l’extension des ἀlopodes est inhibée. En revanche, lorsque l’UNC5B est délété, le capillaire n’est plus repoussé ni même attiré par la nétrine. Par conséquent, la nétrine, qui est une molécule de guidage axonal, et son récepteur UNC5B inter-viennent dans la morphogenèse du système vasculaire. L’UNC5B agit en tant que récepteur répulsif au niveau du réseau vasculaire et empêche la formation d’un excès de bourgeonnements angiogéniques et de branchements. La littérature scientiἀque fait par ailleurs état d’actions de type attractif pour la nétrine. Ce ligand serait donc bifonctionnel au niveau du système vasculaire, tout comme il l’est au niveau du système nerveux.

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12 Lu X, Le Noble F, Yuan L, et al. The netrin receptor UNC5B mediates guidance events controlling morphogenesis of the vascular system. Nature 2004 ; 432 : 179-86.


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13 Larrivée B, Freitas C, Trombe M, et al. Activation of the UNC5B receptor by netrin-1 inhibits sprouting angiogenesis. Genes Dev 2007 ; 21 : 2433-47.

14 Bouvrée K, Larrivée B, Lv X, et al. Netrin-1 inhibits sprouting angiogenesis in developing avian embryos. Dev Biol 2008 ; 318 : 172-83.


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Angiogenèse post-ischémique : aspects expérimentaux, perspectives thérapeutiques

Bernard Lévy, Jean-Sébastien Silvestre

Les organismes unicellulaires et ceux dont la taille ne dépasse pas les capacités de diffusion des gaz et des substances solubles n’ont pas de système cardio-vasculaire. La vie cellulaire est alors uniquement dépendante des concentrations de gaz et de solutés dans le liquide environnant la cellule ou le micro-organisme. L’embryon du mammifère ne se compose, au tout début de son évolution, que d’un amas de cellules avasculaires. Cependant, le développement d’un réseau vasculaire capable de trans-porter Ḁuides et gaz nécessaires à la vie cellulaire apparaît rapidement pendant la croissance de l’embryon. On appelle « vasculogenèse » les événements embryologi-ques initiaux commençant par la migration de précurseurs endothéliaux (angioblastes) qui se différencient et forment, localement, des tubules de cellules endothéliales qui se réunissent eux-mêmes en plexus vasculaires peu ou pas organisés. La croissance, la différenciation et l’organisation de ces plexus en réseaux vasculaires fonctionnels constituent l’« angiogenèse ». Ce processus est caractérisé par le bourgeonnement de cellules endothéliales à partir des extrémités et des parois latérales des vaisseaux préexistants. On observe également une division longitudinale de vaisseaux formant deux tubes parallèles qui évoluent ensuite indépendamment. Ces étapes initiales de vasculogenèse puis d’angiogenèse aboutissent à la formation d’un réseau essentiel-lement de type capillaire. Ce n’est qu’ensuite que les éléments de plus gros calibre (artérioles, veinules, et anastomoses artérioveineuses) sont constitués par l’appari-tion de cellules musculaires lisses (myogenèse) puis de la matrice extracellulaire qui consolide les structures vasculaires. On observe en même temps l’apparition de péricytes autour des capillaires. Les artères de résistance puis de conductance sont formées en dernier lieu par le développement de la média puis de l’adventice. Les propriétés contractiles des cellules musculaires vasculaires apparaissent en dernier lieu, l’ensemble de ces événements étant regroupé sous le terme d’artériogenèse.

Ces processus complexes nécessitent une coordination et des régulations précises de multiples facteurs activateurs et inhibiteurs qui interagissent avec de nombreux types cellulaires, vasculaires et extravasculaires. Ces mécanismes de régulation sont probablement très différents d’un organe à l’autre et constituent des réseaux qui sont eux-mêmes très différenciés. Il y a, par exemple, de nombreuses distinctions anato-


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miques, histologiques et fonctionnelles entre les réseaux vasculaires hépatiques, cutanés et cérébraux.

Nous nous limiterons, dans ce chapitre, à présenter les éléments fondamentaux de la néogenèse vasculaire déclenchée par un contexte pathologique tel que l’ischémie tissulaire.

pRIn CIpAux mé CAn Ismes de LA néo vAs Cu LARIs At Ion post -Is CHém Iq ue

L’importance relative des différents processus, vasculogenèse, angiogenèse et arté-riogenèse, dans le déclenchement de la néovascularisation associée à l’ischémie reste à déἀnir [1]. Néanmoins, les trois processus agissent sans doute de concert pour établir un réseau vasculaire fonctionnel. Ainsi, il est probable que l’artériogenèse permet une augmentation importante du Ḁux dans la zone lésée mais que le déve-loppement de nouveaux capillaires (angiogenèse) évite une destruction tissulaire massive du territoire ischémié. Enἀn, même si les stimuli initiaux diffèrent probable-ment, vasculogenèse, angiogenèse et artériogenèse partagent les mêmes facteurs de croissance, chimiokines et protéases, qui peuvent activer et moduler différemment ces trois mécanismes.

Angiogenèse post-ischémiqueLe principal inducteur de l’angiogenèse est l’hypoxie qui implique notamment une activation d’HIF-1 (hypoxia-inducible factor 1).

HIF et veg F-AL’HIF-1 est un facteur de transcription nucléaire qui se lie à des éléments de réponse à l’hypoxie situés dans la région régulatrice de nombreux gènes. L’injection intramus-culaire d’un plasmide codant pour HIF-1α réduit la taille de l’infarctus et augmente la néovascularisation du myocarde ischémique [2]. L’administration d’HIF-1α accroît également le Ḁux sanguin régional, le score angiographique et la densité capillaire dans un modèle d’ischémie du membre inférieur chez le lapin [3]. L’HIF-1 régule notamment l’expression du gène codant pour le VEGF-A [4] qui, une fois sécrété, va se lier à ses récepteurs à activité tyrosine kinase, VEGFR-1 et VEGFR-2, situés à la surface des cellules endothéliales et musculaires lisses vasculaires. L’activation de ses récepteurs déclenche de multiples voies de signalisation à l’origine de la stimula-tion de l’angiogenèse. Le VEGF-A peut activer la prolifération et la survie cellulaire par des mécanismes dépendants de la phosphatidylinositol 3’-kinase/Akt [5-7]. Akt pourrait contribuer à la réaction angiogénique en inhibant le processus apoptotique ou en phosphorylant l’enzyme de synthèse du monoxyde d’azote (NOS) de type endothélial (NOSe) à l’origine d’une activation soutenue, indépendante du calcium,


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de l’enzyme. La NOSe joue également un rôle clé dans la néovascularisation post-ischémique. Les souris déἀcientes pour la NOSe présentent une altération de la néogenèse vasculaire dans la zone ischémiée [8]. Le NO contribue également direc-tement à l’effet du VEGF. Dans le modèle d’ischémie périphérique chez la souris, la réponse angiogénique au VEGF requiert la présence de la NOSe [8]. De même, dans le cœur infarci, l’induction de l’angiogenèse est dépendante de la production de NO [9]. Finalement, l’administration par thérapie génique de la NOSe promeut la néovascularisation dans la patte ischémique de rat, soulignant ainsi l’importance du NO dans le processus de néogenèse vasculaire [10].

e spèces radicalaires de l’oxygèneLes espèces radicalaires de l’oxygène (RLO, radicaux libres de l’oxygène), dont l’anion superoxyde, le peroxyde d’hydrogène, le radical hydroxyle et les dérivés nitrés comme le NO et le peroxynitrite, sont des espèces biologiquement actives qui stimulent de multiples voies de signalisation par leur potentiel d’oxydoréduction [11-13]. Chacune de ces espèces provient de réactions chimiques ou enzymatiques spéciἀques. Les NADPH oxydases représentent une source prédominante de RLO dans le vaisseau [11, 12, 14]. Dans les cellules endothéliales, les NADPH oxydases sont constituées de 2 sous-unités membranaires, gp91phox (ou Nox 2) et p22phox, et de 2 composants cytosoliques, p47phox et p67phox. La petite protéine G Rac-1 est égale-ment nécessaire pour une activité totale de l’enzyme. Rac-1 et gp91phox jouent un rôle majeur dans l’effet du VEGF-A sur la prolifération des cellules endothéliales [15]. De même, des souris invalidées pour la gp91phox présentent une altération de la néovascularisation post-ischémique soulignant également l’implication des RLO dans l’effet pro-angiogénique du VEGF-A dans le territoire ischémié [16, 17].

Autres veg FL’expression d’autres membres de la famille des VEGF est également induite par l’hypoxie. Par exemple, le PlGF (placenta growth factor), qui se lie au récepteur VEGFR-1, active la néovascularisation dans le tissue ischémique [18]. L’expression du VEGF-B est également augmentée dans la zone ischémiée et un traitement par un plasmide codant pour l’une des deux isoformes du VEGF-B, le VEGF-B167 ou le VEGF-B186, déclenche une revascularisation thérapeutique chez des souris avec une ischémie du membre inférieur [19]. Dans un modèle d’explants aortiques, les explants provenant de souris surexprimant le VEGF-B167 ou le VEGF-B186 dans les cellules endothéliales se développent fortement, suggérant un rôle direct du VEGF-B dans le processus angiogénique [20]. Le VEGF-C (ou VEGF-2) a été décrit comme un ligand spéciἀque pour les récepteurs endothéliaux de type tyro-sine kinase, VEGFR-2 et VEGFR-3. In vitro, le VEGF-C a un effet mitogénique et chimiotactique dose dépendant sur les cellules endothéliales, plus particulièrement


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sur les cellules endothéliales microvasculaires. Le VEGF-C stimule la libération de NO par les cellules endothéliales et augmente la perméabilité vasculaire. Enἀn, l’ex-pression constitutive de VEGF-C chez l’animal adulte facilite l’angiogenèse dans un modèle d’ischémie périphérique [21].

protéines « angiomatrices »De nombreux autres facteurs (facteurs de croissance, facteurs de transcription, hormones, protéines kinases) ont le potentiel de moduler l’angiogenèse. De plus, le nombre de facteurs affectant la néogenèse vasculaire augmente de jour en jour ; certains d’entre eux présentent pourtant un intérêt particulier. Ainsi, plusieurs protéines de la matrice extracellulaire sont associées à l’endothélium vasculaire et activent l’angiogenèse par un mécanisme dépendant des intégrines mais en l’ab-sence d’addition exogène de facteurs de croissance. Parmi ces protéines « angio-matrices », il a été démontré que la protéine Del-1 (developmental endothelial locus-1) active l’angiogenèse et la néovascularisation post-ischémique en se ἀxant à l’intégrine αvβ5 sur l’endothélium quiescent, et par ce biais, augmente l’expres-sion du facteur de transcription Hox D3 et l’intégrine αvβ3 [22, 23]. De même, l’analogue de Del-1, la lactadhérine, est exprimé dans les cellules vasculaires et, en interagissant avec l’intégrine αvβ3, module la voie de signalisation dépendante de VEGF/VEGFR-2. Enἀn, la lactadhérine interagit avec les intégrines αvβ3 et αvβ5, et, par un mécanisme dépendant d’Akt, est capable d’activer le développement de nouveaux vaisseaux dans un contexte ischémique en l’absence d’addition exogène de VEGF-A [24].

Artériogenèse post-ischémiqueL’artériogenèse représente la croissance des artères collatérales à partir des anas-tomoses artério-artériolaires préexistantes. Certains groupes ont assimilé l’arté-riogenèse postnatale dans le contexte ischémique au développement de vaisseaux collatéraux (ou collatéralisation) et les deux termes peuvent être utilisés indifférem-ment. L’artériogenèse est induite par un mécanisme indépendant de l’hypoxie qui semble reposer sur les modiἀcations des forces hémodynamiques qui apparaissent dans les vaisseaux collatéraux consécutivement à une augmentation du Ḁux. Cette augmentation du débit vasculaire provient de la différence de pression entre les artérioles préexistantes connectées en amont du point d’occlusion et celles en aval. L’artériogenèse se traduit par une activation et une migration des cellules pariétales et un remodelage de la paroi vasculaire.

Rôle des forces de cisaillementL’augmentation chronique des forces de cisaillement dépasse les restrictions anato-miques des vaisseaux collatéraux et restaure complètement la conductance des colla-


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térales. Les forces de cisaillement activent les voies de signalisation dépendantes de Ras-ERK, Rho et du NO [25, 26]. La réponse primaire physiologique aux forces de cisaillement est une activation des cellules endothéliales et un grand nombre de gènes sont connus pour être contrôlés par des éléments de réponse aux forces de cisaillement localisés dans leur promoteur [27]. Parmi ceux-ci, les forces de cisaille-ment augmentent l’expression des gènes codant pour des cytokines activatrices ou chimioattractantes. Le MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1) est augmenté au niveau des sites artériogéniques et la collatéralisation est accrue par un traitement avec du MCP-1 [28]. De même, l’atrophie musculaire est aggravée dans le membre inférieur ischémié de souris invalidées pour le récepteur CCR-2 de MCP-1. L’analyse morphométrique montre également une réduction du diamètre des vaisseaux collaté-raux dans ces conditions [29]. De plus, l’ischémie induite par une ligature de l’artère fémorale augmente le nombre de cellules inἀltrées exprimant le récepteur CXCR-3 et le niveau d’expression de ses ligands CXCL-9 et 10. Enἀn, le score angiographi-que et la perfusion tissulaire sont diminués dans le membre inférieur ischémique de souris invalidées pour CXCR-3 [30].

Rôle des cellules inἀammatoiresL’augmentation de l’expression des cytokines chimioattractantes active l’inἀltration des cellules inḀammatoires dans le territoire ischémié.

Ainsi, la migration des macrophages est sous le contrôle de la ἀxation de MCP-1 sur son récepteur CCR-2. Le niveau de monocytes est directement corrélé avec l’in-tensité de la néovascularisation [31]. CXCL-9 et CXCL-10, de par leur interaction avec leur récepteur CXCR-3, attirent les lymphocytes T qui modulent également la néogenèse vasculaire post-ischémique. Des souris nude déἀcientes en lympho-cytes T ou des souris déἀcientes en lymphocytes CD4+ présentent une altération de la néovascularisation post-ischémique [32, 33]. De plus, l’absence de lympho-cyte CD8 diminue l’expression de l’interleukine 16 (IL-16) et réduit le recrutement des lymphocytes T CD4+ au niveau des zones d’artériogenèse. L’administration exogène de lymphocyte T CD8 restaure un taux d’IL-16 important, un nombre adéquat de lymphocytes T CD4+ et, de fait, active le développement de vaisseaux collatéraux [34]. On peut donc proposer le schéma suivant : en réponse à une occlu-sion vasculaire, les lymphocytes T CD8 s’inἀltrent au niveau des zones d’artérioge-nèse et recrutent les lymphocytes T CD4 par la production d’IL-16. Les lymphocy-tes T CD4 contrôlent alors le développement de vaisseaux collatéraux en partie en activant le recrutement de macrophages qui libèrent des facteurs artériogéniques. En effet, la présence des cellules inḀammatoires est associée à la libération locale de nombreuses molécules pro-artériogéniques comme des cytokines, l’interleukine 2 et le TNF-α (tumor necrosis factor alpha), des facteurs de croissance comme le VEGF et des métalloprotéases (MMP) [28, 35].


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Des cytokines comme l’interleukine 1β augmentent également l’activité d’HIF-1α, dénotant ainsi un rôle transactivateur d’HIF-1α dans le processus inḀammatoire [36]. Au cours de la réaction inḀammatoire, des cytokines anti-inḀammatoires sont produi-tes et modulent l’intensité de l’inḀammation. La néovascularisation est augmentée dans le membre inférieur ischémié de souris déἀcientes pour la cytokine anti-inḀam-matoire IL-10 [37]. Cet effet est bloqué par un traitement avec un inhibiteur des métalloprotéases, malgré une activation persistante du VEGF-A [38]. L’inἀltration des leucocytes dans le cœur infarci et la collatéralisation sont diminuées chez des souris invalidées pour l’activateur du plasminogène de type urokinase ou pour la métalloprotéase de type 9 [39]. De même, des souris déἀcientes en MMP-9 présen-tent une réduction de la collatéralisation dans un modèle d’ischémie du membre inférieur, soulignant le lien étroit entre cellules inḀammatoires, métalloprotéases et artériogenèse [40].

vasculogenèse post-ischémiqueLa néovascularisation post-ischémique ne dépend pas uniquement des processus angiogénique et artériogénique mais implique également les progéniteurs circulants de cellules vasculaires provenant de la moelle osseuse. En réponse à une ischémie tissulaire, les précurseurs des cellules endothéliales sont mobilisés de la moelle osseuse vers la circulation périphérique et migrent vers le tissu ischémique. Le recru-tement des cellules progénitrices endothéliales (EPC, endothelial progenitor cells) exprimant CXCR-4 est médié par l’hypoxie et le facteur de transcription HIF-1α qui active l’expression de SDF-1 (stroma-derived factor 1) [41]. Les cellules mononu-cléées ou les EPC provenant d’animaux hétérozygotes pour CXCR-4 présentent une diminution de l’expression de CXCR-4 et de leur capacité à stimuler la reperfusion tissulaire chez des souris nude [42]. L’hypoxie locale libère également des facteurs solubles chimioattractants pour les EPC circulantes. Un candidat potentiel est le VEGF dont le niveau est accru par l’hypoxie et qui induit SDF-1 dans les structu-res vasculaires et périvasculaires [43]. Les chimiokines et les plaquettes permettent également la capture des EPC au niveau des zones de lésions vasculaires [30, 44, 45]. Une fois qu’elles sont recrutées, l’arrêt des EPC sur l’endothélium activé par l’ischémie découle de l’activité des molécules d’adhésion présentes à la surface des cellules vasculaires comme l’intégrine β2 et la sélectine de type L [46-48]. Après leur recrutement et leur adhésion au niveau de l’endothélium activé par l’ischémie, les EPC exercent leurs effets bénéἀques sur la néogenèse vasculaire par des méca-nismes différents (ἀg. 1).

Il a d’abord été suggéré que les progéniteurs s’incorporaient dans le site de néovas-cularisation où la différenciation en cellules endothéliales se terminait [49-51]. Cependant, la relative contribution des EPC à la vasculature est très variable et semble dépendre du modèle expérimental, du type et du sous-type de progéniteurs ou


40

encore de la méthode d’isolement des EPC [52-55]. Certains travaux expérimentaux suggèrent même que ces progéniteurs ne s’incorporent pas dans les néocapillaires mais agissent en tant que cellules de soutien. Ainsi, les progéniteurs médullaires s’accumulent autour des vaisseaux collatéraux et se différencient en ἀbroblastes, leucocytes et péricytes qui produisent plusieurs facteurs de croissance et chimio-kines [53]. La libération de SDF-1 par les plaquettes favorise la mobilisation et le recrutement des progéniteurs CXCR-4+/VEGFR-1+ autour des structures vasculaires qui dès lors promeuvent le développement de vaisseaux collatéraux [56]. De même, le VEGF induit la nostocytose (homing) des cellules mononucléées myéloïdes et permet leur positionnement périvasculaire et leur rétention par l’activation de SDF-1 [43]. Enἀn, les progéniteurs dérivés de sang de cordon humain peuvent se différencier en progéniteurs endothéliaux précoces et tardifs. Les EPC précoces expriment des marqueurs de la lignée monocytaire et présentent un fort potentiel paracrine de libération de facteurs pro-angiogéniques alors que les EPC tardifs expriment des marqueurs endothéliaux et possèdent de vraies capacités vasculogéniques [57].

Ischémie

Lumièrevasculaire

Progéniteur

Nécrose/Apoptose

Moléculeschimiottractantes

Membranebasale

Potentiel dedifférenciation

Potentiel paracrineVEGFMCP-1HGFPIGFNO

CXCR4

SDF-1

PSGL-1

ICAM-1Sélectine

C.endothéliales

Signal de homingVEFG-A, PIGF

4

2

β23

1

Figure 1. Après leur adhésion à l’endothélium activé, les cellules progénitrices vasculaires pourraient déclencher la néogenèse vasculaire par deux mécanismes principaux : leur capacité à se différencier en cellules endothéliales et leur potentiel paracrine de libération de facteurs pro-angiogéniques et pro-artériogéniques.


41

Ainsi, le rôle premier des progéniteurs pourrait être de libérer des facteurs angiogé-niques et artériogéniques et de contribuer à la genèse vasculaire par des effets para-crines. Enἀn, les cellules progénitrices possèdent également un potentiel vasoactif susceptible de participer à l’amélioration de la perfusion tissulaire dans le territoire ischémié [58].

pe Rspe Ct Ives t Hé RApeut Iq ues

Les trois principaux processus, vasculogenèse, angiogenèse et artériogenèse, carac-térisent le remodelage tissulaire consécutif à des pathologies vasculaires ischémiques chroniques ou aiguës. Ils constituent la cible des stratégies d’angiogenèse thérapeu-tique proposées pour élaborer un traitement alternatif chez des patients présentant des artériopathies des membres inférieurs ou des maladies coronaires. De nombreu-ses stratégies d’angiogenèse thérapeutique fondées sur l’administration de facteurs de croissance, de cellules souches, de molécules pharmacologiques ou de protéi-nes de la matrice extracellulaire ont été proposées et présentent des potentialités plus ou moins intéressantes. Cependant, celles actuellement testées dans des essais cliniques sont fondées sur l’administration de facteurs de croissance ou de cellules progénitrices.

Facteurs de croissanceLes essais cliniques sont essentiellement fondés sur l’administration de VEGF-A et du facteur de croissance des ἀbroblastes 1 ou 2 (FGF, ἀbroblast growth factor). L’échec des études VIVA, FIRST et TRAFFIC suggèrent que l’administration intra- vasculaire de protéines est insufἀsante pour induire une néovascularisation thérapeu-tique [59-61]. Cela est sans doute lié au mode d’administration (intraveineux ou intra-coronaire) et au choix d’injecter des protéines dont la demi-vie tissulaire est courte. Au contraire, les essais REVASC et Euroinject-1, fondés sur des stratégies de trans-fert de gènes codant pour différentes isoformes de VEGF-A directement dans la zone ischémique, montrent des résultats intéressants sur la fonction cardiaque [62, 63]. Les essais précliniques ont prouvé l’efἀcacité de différents facteurs de croissance pour stimuler la néogenèse vasculaire dans des modèles d’ischémie cardiaque ou du membre inférieur mais en utilisant des animaux jeunes, sans facteurs de risque cardio-vasculaire associés. L’induction d’une réponse pro-angiogénique similaire chez des patients âgés, sans autres alternatives thérapeutiques avec des lésions athéromateu-ses marquées, constitue un déἀ thérapeutique clairement plus marqué. La sélection des patients candidats à un stent ou à un pontage pourrait permettre d’augmenter l’efἀcacité et la faisabilité des thérapies pro-angiogéniques et de considérer l’an-giogenèse thérapeutique comme une thérapie complémentaire à la revascularisation chirurgicale conventionnelle. De même, le choix des patients présentant des signes


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d’angor ou de claudication pourrait signer la présence de tissus ischémiques mais encore viables et donc potentiellement capables de répondre à la revascularisation thérapeutique [64]. Enἀn, l’administration de plusieurs facteurs de croissance avec des cibles cellulaires distinctes serait susceptible d’activer simultanément plusieurs processus impliqués dans la néogenèse vasculaire. Ainsi, il a été démontré que la co-administration de FGF et de PDGF-BB (platelet derived growth factor BB) ou de VEGF-A et de PlGF était beaucoup plus efἀcace que l’injection d’un seul facteur de croissance dans des modèles d’angiogenèse dans la cornée ou d’ischémie cardiaque et périphérique [65, 66].

Cellules progénitricesMême si de nombreux travaux expérimentaux suggèrent la présence de progéniteurs vasculaires dans d’autres tissus comme le cœur, le tissu adipeux ou dans le sang, l’administration de précurseurs d’origine médullaire constitue la base des thérapies cellulaires pro-angiogéniques [67, 68]. Ainsi, l’injection de progéniteurs endothé-liaux provenant de la moelle osseuse restaure le Ḁux cutané et la densité capillaire dans des modèles expérimentaux d’ischémie cardiaque ou de membre inférieur chez le rongeur [69, 70]. L’injection d’EPC humaines augmente également la formation de nouveaux vaisseaux sanguins dans le territoire infarci [71]. Enἀn, des études récen-tes ont suggéré que les cellules mononucléées provenant de la moelle osseuse sans différenciation ni puriἀcation en EPC étaient capables de favoriser le développement vasculaire dans le territoire ischémié [71, 72]. L’administration de cellules mononu-cléées médullaires provenant d’animaux contrôles est également efἀcace dans des modèles expérimentaux de diabète et d’hypercholestérolémie [73, 74]. Ces thérapies cellulaires sont actuellement testées au niveau clinique dans de petites cohortes de patients. Une implantation autologue de cellules mononucléées médullaires dans le membre ischémié de patients souffrant d’une maladie artérielle périphérique ou de thrombo-angiopathie oblitérante améliore la vascularisation et le processus cicatri-ciel [75, 76]. Cependant, un certain nombre de ces patients présentent des effets secondaires ou transitoires [76]. De même, la transplantation intracoronaire de cellu-les mononucléées médullaires dans le myocarde de patients ayant une ischémie aiguë augmente la perfusion et la fonction du tissu ischémié [77-79]. Dans ce contexte également, certaines études montrent des effets transitoires, voire pas d’effets, souli-gnant ainsi la nécessité de poursuivre l’analyse de l’efἀcacité thérapeutique de ces stratégies fondées sur l’administration de cellules souches [80, 81]. En particulier, la plupart des facteurs de risque cardiovasculaires comme le diabète, l’hypertension artérielle ou l’hypercholestérolémie réduisent le potentiel thérapeutique des cellules progénitrices adultes, notamment d’origine médullaire [17, 73, 82]. Ainsi, il apparaît crucial de mettre au point des stratégies restaurant la fonction des cellules progénitri-ces. Par exemple, un prétraitement des EPC par l’éphrine B2 aboutit à l’augmentation


43

de l’expression de PSGL-1, un ligand des sélectines, et ainsi à une amélioration de la capacité des EPC à migrer vers le territoire ischémique et à activer le développement vasculaire dans un modèle d’ischémie du membre inférieur chez la souris [83]. De même, une bithérapie fondée sur l’administration conjointe de deux types de cellu-les progénitrices, les EPC et les cellules progénitrices musculaires lisses (SMPC, smooth muscle progenitor cells), présente une meilleure efἀcacité thérapeutique que chacun des types cellulaires injecté séparément. Les SMPC libèrent en effet de l’an-giopoïétine-1 qui va se ἀxer sur son récepteur Tie-2 localisé à la surface des EPC et améliorer leur survie et leur propension à former des structures vasculaires [84].

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48

t hérapie génique et cellulaire dans l’artériopathie des membres inférieurs

Joseph Emmerich

L’ischémie critique des membres inférieurs (ICMI), qui est la forme la plus sévère de l’artériopathie oblitérante des membres inférieures (AOMI), se manifeste par des douleurs au repos résistantes aux antalgiques et évoluant depuis plus de 15 jours ou par des troubles trophiques. La viabilité du membre est toujours menacée et le pronostic général des patients est également compromis avec une mortalité autour de 50 % à 5 ans [1, 2]. La Transatlantic Inter-Society Consensus (TASC), qui a récem-ment déἀni l’ICMI, souligne que « la notion d’ICMI implique la notion de chronicité et doit être distinguée de l’ischémie aiguë des membres » [3, 4]. L’évaluation hémo-dynamique par la mesure de l’indice de pression systolique (IPS) est fondamentale pour quantiἀer de façon objective la perfusion des membres inférieurs. Il est recom-mandé d’utiliser la mesure de la pression absolue à la cheville qui, pour déἀnir une ICMI, doit être inférieure à 70 mmHg et/ou une pression du gros orteil inférieure à 30 mmHg et/ou une pression d’oxygène transcutanée (TcPO2) comprise entre 30 et 50 mmHg. Dans ces conditions, le sauvetage chirurgical ou endoluminal du membre s’impose mais il n’est pas toujours réalisable, faute d’axe receveur utilisable ou au décours d’interventions chirurgicales multiples. L’ICMI est souvent associée à des occlusions diffuses du lit artériel avec absence de vascularisation distale. Dans cette dernière situation, qui représente de 20 à 30 % des cas, le traitement médical reste la seule ressource thérapeutique avant l’amputation [5]. Le consensus de la TASC estime que de 10 à 30 % des patients avec ICMI seront décédés dans les 6 mois et que de 25 à 35 % devront subir une amputation majeure [6]. La mortalité péri-opératoire d’une amputation est de 5 à 10 % pour les amputations de la jambe et de 15 à 20 % pour les amputations au-dessus du genou. Cette situation, assez fréquente, constitue un échec thérapeutique car aucun autre traitement n’a fait la preuve de son efἀcacité.

Les traitements comme la stimulation cordonale postérieure ou l’implantation d’un stimulateur sous-cutané ne sont plus actuellement recommandés par le consensus de la TASC dans le traitement de l’ICMI. Ce consensus considère également qu’il n’y a pas sufἀsamment de preuves en faveur de la sympathectomie lombaire [3].

La prostacycline et ses dérivés ont été utilisés initialement par perfusion intra-artérielle puis intraveineuse dans plusieurs essais thérapeutiques. L’étude randomi-

Thérapie génique et cellulaire dans l’artériopathie des membres inférieurs

49

sée la plus importante avec un dérivé de la prostacycline, l’étude ICAI, a conduit à proposer un traitement par perfusion de dérivés de la prostacycline chez les patients avec ICMI et un membre viable chez lesquels une revascularisation est impossible, particulièrement quand l’alternative est une amputation [6]. Malheureusement, si une efἀcacité transitoire apparaît au bout de 1 mois elle ne persiste plus au bout de 6 mois.

En prenant en compte les données précédentes sur le traitement médical de l’ICMI sans possibilité de revascularisation, on peut raisonnablement énoncer qu’aucune des possibilités thérapeutiques actuelles ne permet d’améliorer les patients et d’as-surer le sauvetage de leur jambe en ischémie critique, lorsque les possibilités de revascularisation ne sont pas possibles [7].

t Hé RApIe gén Iq ue

L’angiogenèse thérapeutique ou la possibilité pour le patient de développer un réseau vasculaire suppléant est une solution possible, actuellement évaluée pour éviter l’amputation en cas d’ischémie critique chronique. L’angiogenèse physiologique est induite par des facteurs de croissance tels que le VEGF (vascular endothelium growth factor) ou le FGF (ἀbroblast growth factor). L’administration de ces facteurs sous forme de protéines recombinantes est difἀcile. En effet, en raison de leur demi-vie très courte, ils doivent être utilisés à fortes doses et leur efἀcacité est alors limitée par une mauvaise tolérance et un risque d’effets secondaires systémiques. La théra-pie génique permet l’introduction et le transfert de gènes codant pour les facteurs de croissance angiogéniques dans les cellules musculaires d’un patient atteint d’AOMI. Les cellules transfectées vont alors produire de faibles taux de ces protéines angio-géniques, mais de façon soutenue et pendant une période variant de 1 à 2 semaines. Deux types de vecteurs sont utilisés en clinique : les vecteurs viraux (adénovirus) et les vecteurs non viraux (utilisation de plasmides nus ou de plasmides encapsulés dans des liposomes).

À la suite des travaux d’Élisabeth Nabel qui ont démontré la faisabilité de la théra-pie génique à visée vasculaire au début des années 1980, la thérapie génique s’est développée depuis 1996 en utilisant plusieurs approches différentes [8]. Les recher-ches ont mis en évidence des facteurs de croissance vasculaire comme le VEGF qui ont été utilisés dans des essais de phase I pour promouvoir une angiogenèse en cas d’ischémie critique des membres inférieurs [9, 10]. Ces essais ont utilisé la théra-pie génique à l’aide d’adénovirus ou de plasmides nus codant pour le VEGF ou le FGF-1.

L’approche intra-artérielle a été initialement utilisée mais la dilution systémique des produits de thérapie génique et la présence d’une athérosclérose diffuse en a limité l’efἀcacité. Pour cette raison, l’injection intramusculaire est actuellement préférée. Il a été démontré que l’injection intramusculaire d’un plasmide nu est réalisable et que

Joseph Emmerich

50

celui-ci restait sous forme non réplicative et ne s’intégrait pas au génome, limitant le risque de mutagènes [11].

Les résultats décrits montrent une efἀcacité clinique qui est difἀcile à appré-cier du fait de l’absence d’essais randomisés en aveugle disponibles à ce jour. Le consensus de la Transatlantic Conference on Clinical Trial Guidelines in Peripheral Arterial Disease recommande que les événements à analyser dans des essais rando-misés soient la disparition complète de la douleur sans antalgiques, la cicatrisation complète et la fréquence des amputations [12].

Jusqu’ici, aucune étude publiée ne répond à ces critères et si une augmentation de la collatéralité semble obtenue, cela ne signiἀe pas qu’elle soit sufἀsante pour l’obtention d’une guérison de l’ICMI. De plus, l’arrêt prématuré de l’expression de facteurs de croissance pourrait conduire à une régression de la néovascularisation initialement obtenue [13]. Les résultats des principaux essais de thérapie génique dans l’ischémie critique sont résumés dans le tableau 1. Au total, un peu plus de 300 patients ont été inclus dans des essais de phase I et II. Aucun effet délétère grave n’a été rapporté à ce jour sur des suivis cliniques qui restent cependant faibles.

t ableau 1. Revue des essais de thérapie génique dans l’ischémie critique des membres inférieurs.

Auteur (année) t raitement

n ombre de patientss uivi Résultats

Traités Témoins

Isner (1996)

Plasmide VEGF165 intra-artériel (hydrogel de polymères)

1 – 12 semaines Augmentation des collatérales (angiographie)Œdème transitoire.

Baumgartner (1998)

Plasmide VEGF165 intramusculaire

9 – 6 mois Augmentation des collatérales (angiographie) et de l’IPS.

Isner (1998)

Plasmide phVEGF165 6 – ? Augmentation des collatérales (angiographie), amélioration de l’IPS.

Makinen (2002)

Adénovirus VEGF intra-artériel

18 19 2 ans Adénovirus VEGF intra-artériel.

Plasmide/liposome VEGF intra-artériel (en association avec angioplastie)

17 19 Augmentation des collatérales (angiographie), pas de différence de l’IPS.Pas de différence dans les événements cliniques.

(à suivre)


51

Auteur (année) t raitement

n ombre de patientss uivi Résultats

Traités Témoins

Comerota (2002)

Plasmide FGF-1 intramusculaire

51 – 6 mois Réduction des ulcères, augmentation de l’IPS et de la TcPO2.

Shyu (2003)

Adénovirus VEGF165 intramusculaire

24 – 6 mois Augmentation des collatérales (angiographie) et de l’IPS.Réduction des douleurs de repos et cicatrisation des ulcères.

Rajagopalan (2003)

Adénovirus VEGF121 intramusculaire

33 72 6 mois Patients sans ICMI mais avec claudication intermittente.Pas d’amélioration de la distance de marche ou de l’IPS.

Shyu (2003)

Plasmide VEGF165 intramusculaire, 2 séries d’injection à 1 mois d’intervalle

21 – 6 mois Amélioration des douleurs et de l’IPS.Cicatrisation des ulcères et augmentation des collatérales (angio IRM).

Motyas (2005)

Adénovirus 5FGF-4 intramusculaire

10 3 12 semaines Augmentation des collatérales (angiographie). Impossible de donner de conclusion sur l’efἀcacité car étude de petit taille et dosage trop bas.

Kusumanto (2006)

VEGF165 intramusculaire

27 27 100 jours Pas de réduction signiἀcative de la fréquence d’amputation, mais amélioration de la douleur, du soin des ulcères.

Marui (2007)

bFGF (biodegradable gelatin hydrogel)

7 – 4-24 semaines

Amélioration du périmètre de marche, de l’IPS à 4 pas à 24 semaines.

Rajagopalan (2007)

Adénovirus HIF-1α intramusculaire

34 7 12 mois Faisabilité du traitement, pas de corrélation entre IPS et pronostic.

IPS : indice de pression systolique ; TcPO2 : pression transcutanée d’oxygène.

(suite)

Joseph Emmerich

52

La seule étude randomisée est l’étude TALISMAN qui est en cours de publica-tion [14]. Elle a comparé l’injection de NV1FGF en 4 séances thérapeutiques à 15 jours d’intervalle à une injection de placebo chez des sujets ayant une ICMI asso-ciée à des ulcères ou une gangrène. Le résultat est positif avec une réduction du risque d’amputation chez les patients ayant reçu la thérapie génique. Cent vingt-cinq patients ont été randomisés pour recevoir soit 4 mg de plasmides codant pour du FGF-1 pendant 4 semaines, injections espacées de 2 semaines, soit un placebo (sérum salé). L’injection de plasmide codant pour le FGF-1 a réduit de 50 % le risque d’amputation et de 37 % le risque d’amputation majeure. Ce bénéἀce s’est associé à une tendance à une diminution de la mortalité. Ces résultats intéressants devraient être conἀrmés par une nouvelle étude en cours de réalisation, l’étude TAMARIS, compte tenu du fait que les événements qui sont sortis positivement dans l’étude TALISMAN étaient déἀnis comme secondaires dans le schéma de l’étude.

t Hé RApIe Ce LLu LAIRe

La découverte en 1997, par Asahara, des précurseurs circulants des cellules endothé-liales chez l’homme adulte a révolutionné le concept d’angiogenèse postnatale [15]. De nombreux travaux ont conἀrmé l’existence de ces précurseurs, leur origine médul-laire et leur aptitude à s’intégrer dans des structures vasculaires dans deux types de modèles : l’angiogenèse tumorale et la revascularisation d’un tissu ischémique. Les cellules souches endothéliales adultes sont une source potentielle pour la régénéra-tion de l’endothélium dans le système cardiovasculaire et seraient un produit idéal de thérapie cellulaire autologue. On parle dans ce cas de vasculogenèse.

Des nombreux essais sur des modèles précliniques d’ischémie ont utilisé la thérapie cellulaire pour induire une angiogenèse thérapeutique par intégration à un nouveau réseau vasculaire et/ou par sécrétion de facteurs de croissance [1 6]. La thérapie cellu-laire présente plusieurs avantages par rapport à la thérapie génique décrite précédem-ment. Tout d’abord, elle a recours à l’utilisation de cellules autologues, prévenant ainsi tout risque de rejet. Elle prévient également le risque théorique de pathologies induites par la thérapie génique, liées soit directement à l’action du facteur de crois-sance codé par le plasmide injecté, soit à une insertion du plasmide, malgré toutes les précautions prises. Les cellules utilisées ont une origine médullaire et correspon-dent à des « cellules souches » dont les conditions de différenciation sont encore mal connues. Deux types de cellules ont été utilisés dans des essais précliniques : les cellules endothéliales circulantes (PEC, progéniteurs endothéliaux circulants) dites précoces, ou encore appelées CFU-Hill, d’origine monocytaire (CD14+), et les PEC dites tardives ou « outgrowth endothelial cells » (CD14–) [17]. Si ces cellu-les peuvent induire une angiogenèse in vivo sur des modèles animaux, seules les cellules mononucléées de la moelle osseuse (BMMNC, bone marrow mononuclear cells) ou les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMNC, peripheral blood


53

mononuclear cells), après stimulation par le G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor), ont été utilisées chez l’homme dans des essais cliniques de phase I et II. Après des travaux encourageants chez l’animal, la première étude a été réalisée chez l’homme en 2002 par injection intramusculaire de cellules mononucléées médullai-res autologues chez des patients en ischémie critique chronique des membres infé-rieurs [18]. Un premier groupe de 25 patients avec ischémie unilatérale avait reçu des cellules médullaires dans le membre malade et du sérum physiologique dans le membre inférieur controlatéral. Les résultats étant très positifs, un second groupe de 22 patients avec ischémie bilatérale a été randomisé entre cellules médullaires et cellules mononucléées d’origine sanguine, ces dernières servant de témoin. Au bout de 24 semaines, une amélioration signiἀcative de tous les paramètres cliniques a été notée chez les patients traités par cellules médullaires et une néoangiogenèse a été objectivée sur les artériographies des membres inférieurs. La tolérance a été parfaite. Depuis, d’autres séries utilisant ce même procédé ont été publiées avec des résultats similaires. Ces études sont résumées dans le tableau 2. À l’heure actuelle, plus de 600 thérapies cellulaires ont été effectuées chez l’homme, plus de la moitié des cas étant rapportés dans des publications provenant d’Asie. Actuellement en France, 3 essais ouverts sont en cours dans cette indication à partir de cellules autologues mononucléées médullaires (Amiens, Nantes, Reims, Grenoble, Paris-Hôpital Euro-péen Georges-Pompidou, Marseille). Un essai national randomisé en double aveugle (étude BALI) a débuté aἀn de démontrer si cette approche thérapeutique est réelle-ment efἀcace sur les événements cliniques majeurs : amputations et mortalité.

Huang et al. [19] ont publié une autre approche qui repose sur l’utilisation de PBMNC après leur mobilisation par l’injection sous-cutanée de 600 µg/j de G-CSF pendant 5 jours. Au cinquième jour de stimulation, environ 300 ml de PBMNC ont été recueillis et concentrés, puis injectés dans la jambe ischémique dans 40 sites pour un total de 3 × 109 PBMNC. Les auteurs ont randomisé 28 patients avec un diabète et ICMI pour recevoir des PBMNC ou un traitement conventionnel avec suivi de 3 mois. Les principaux symptômes (douleurs et ulcères) ont été signiἀcativement améliorés chez les 14 patients traités. Aucune amputation n’a dû être effectuée dans le groupe traité contre 5 chez les témoins (p = 0,007). Cette étude suggère que la transplantation autologue de PBMNC, après stimulation par le G-CSF, pourrait aussi être une procédure sûre et efἀcace de l’ICMI. Elle a l’avantage de ne pas nécessiter d’anesthésie générale ni de ponction de moelle osseuse.

Dans une étude anatomopathologique à partir des patients traites par thérapie cellulaire dans notre centre, nous avons récemment démontré in vivo chez l’homme le développement d’une néovascularisation importante par cette approche thérapeu-tique. L’analyse immunohistochimique des échantillons d’amputation des patients ayant reçu une thérapie cellulaire est comparée avec celle des témoins, amputés pendant la même période et appariés selon l’âge et le sexe. Chez 3 patients, on a

Joseph Emmerich

54

t ableau 2. Revue des essais de thérapie cellulaire dans l’ischémie critique des membres inférieurs.

Auteur (année)

t raitement (nombre

de cellules)Injection n ombre

de patients s uivi Résultats

Tateishi-Yuyama (2003)

BMMNC(0,7-2,9 × 109)

IM, mollet40 × 0,75 ml

45 24 semaines Augmentation des collatérales (angiographie), de l’IPS et de la TcPO2.

Higashi (2004)

BMMNC(1,6 ± 0,3 × 109)


7 24 semaines Augmentation des collatérales (angiographie), de l’IPS et de la TcPO2 et vasomotricité.

Huang (2004)

PBMNC(3 × 109)

IM, cuisse, mollet et pied

5 12 semaines Augmentation de l’IPS et de la perfusion (laser-Doppler).

Saigawa (2004)

BMMNC(6,04 ± 1,58 × 107/kg)

IM 8 4 semaines Corrélation entre amélioration de l’IPS et le nombre de cellules CD34+ dans le produit de thérapie cellulaire.

Huang (2005)

PBMNC(3 × 109)


14 traités, 14 témoins (essai randomisé)

3 mois Augmentation de l’IPS et de la perfusion.78 % de cicatrisation dans le groupe actif contre 39 %.

Yang (2005)

PBMNC IM pied et mollet

62 6 mois Amélioration des douleurs dans 87 % des cas.Cicatrisation des ulcères. TcPO2 et IPS améliorés.

Kim (2006)

BMMNC stimulées

6 injections intraosseuses tibiales

27 20 mois Amélioration modérée des douleurs.Cicatrisation de 13/17 ulcères.Collatérales augmentées.

Gu (2006)

BMMNC stimulées

IM, intra-artérielle ou les deux

35 5 mois Amélioration des douleurs dans 90 % des cas.Cicatrisation de 10 % des ulcères.Amélioration IPS, TcPO2.

Durdu (2006)

BMMNC IM pied, mollet, avant-bras

28 20 mois Cicatrisation dans 83 % des cas.Amélioration douleurs.Collatérales visibles sur artériographie.

Miyamoto (2006)

BMMNC(3,5 × 109)

IM mollet, pied

8 12 mois 1 décès inexpliqué, 4 issues défavorables.

Saito (2007)

BMMNC IM 14 24 semaines Réduction de la douleur au repos, amélioration des ulcères.

BMMNC : cellules mononucléées médullaires ; PBMNC : cellules mononucléées du sang périphérique après stimulation par du G-CSF ; IM : intramusculaire ; IPS : indice de pression systolique.


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observé une angiogenèse active au niveau de la partie distale de la jambe ischémique mais pas dans le muscle de la jambe. Tous les nouveaux vaisseaux sont positifs aux marqueurs endothéliaux (CD31, CD34, facteur de von Willebrand) et négatifs aux marqueurs lymphatiques (podoplanin). Les marquages immunohistochimiques pour Ki 67 et c-kit ont montré une prolifération endothéliale élevée dans les vaisseaux néoformés [20].

mALAd Ie de Bue Rge R

La thérapie cellulaire ainsi que la thérapie génique ont aussi été utilisées chez les sujets présentant la maladie de Buerger. Cette dernière est une inḀammation occlu-sive et segmentaire des artères et des veines, caractérisée par une thrombose et une recanalisation des vaisseaux atteints. Cette maladie inḀammatoire non athéromateuse touche les artères de petit et moyen calibres ; le diagnostic est posé en s’appuyant sur des critères cliniques, ceux publiés par Olin en 2000 [21] : un âge inférieur à 45 ans, une consommation présente ou passé de tabac, la présence d’ischémie aux extrémités distales (membres inférieurs et/ou supérieurs). Chez les patients avec une maladie de Buerger, il est difἀcile d’obtenir une revascularisation chirurgicale car l’atteinte est toujours très distale. Ainsi, en dehors de l’arrêt du tabac, les thérapies dont nous disposons à ce jour sont peu efἀcaces et ne garantissent pas une réponse prolongée ou une guérison complète.

Isner et al. [22] ont conduit une étude clinique de phase I pour démontrer l’efἀ-cacité et la tolérance de l’injection intramusculaire de VEGF165 chez 6 patients avec une maladie de Buerger. Les résultats ont montré que si la thérapie est mise en place avant le développement d’une gangrène, alors les patients peuvent obtenir une cica-trisation complète des ulcères et éviter l’amputation. Toutefois, cette étude n’avait pas de groupe témoin.

La thérapie cellulaire a été réalisée au cours d’une étude pilote chez 8 patients avec maladie de Buerger, diagnostiqués selon les critères d’Olin [23]. Le traitement a eu recours à des cellules mononucléées prélevées à partir de la moelle osseuse avec un suivi de 4 ans : les résultats ont montré une amélioration prolongée des symptômes d’ischémie.

Cependant, l’intérêt principal de cet essai est d’avoir mis en évidence la possibilité de développement de réseaux vasculaires secondaires dans cette population particu-lière de malades. En effet, un patient est décédé 20 mois après l’administration de la thérapie ; il n’avait pas de facteurs de risque cardiovasculaires et avait arrêté de fumer avant d’être inclus dans l’essai. On ne peut donc exclure que ce décès soit lié à la thérapie cellulaire pratiquée, la mortalité coronaire étant rare dans la maladie de Buerger des sujets jeunes.

Ainsi, l’injection de BMMNC chez des souris invalidées pour le gène de l’apoli-poprotéine E peut faciliter le développement des lésions d’athérosclérose, l’angioge-

Joseph Emmerich

56

nèse étant nécessaire au développement de la plaque intimale [24]. D’autres études seront nécessaires pour évaluer l’innocuité du traitement chez ce type de patients.

Con CLus Ion

À ce jour, aucune des études publiées sur la thérapie génique ou cellulaire ne permet de conclure de façon déἀnitive sur l’efἀcacité et la tolérance de cette thérapeutique innovante. La réponse à cette question nécessitera la réalisation d’études de plus grande envergure, randomisées et prenant comme événement primaire la diminution de la fréquence des amputations majeures.

Si ces approches concernant de nouvelles possibilités thérapeutiques de l’AOMI ouvrent des perspectives passionnantes, elles soulèvent également de nombreuses questions.

Quelles cellules doit-on utiliser ? Plusieurs autres travaux s’intéressent aux cellules mésenchymateuses, adipocytaires et aux cellules souches embryonnaires.

Quel doit être le rythme des injections ? Par quelle voie ?Faut-il combiner la thérapie génique à la thérapie cellulaire (transfection des cellu-

les utilisées par un gène d’intérêt) ?L’innocuité est-elle vraiment garantie sur le court terme mais aussi sur le long

terme avec le risque théorique de stimuler le développement de cancers latents ou d’aggraver l’athérosclérose ?

Par ailleurs, l’ischémie critique avec troubles trophiques étant le stade ultime de l’AOMI, qui est grevée d’une morbi-mortalité élevée, on peut se demander s’il s’agit du meilleur moyen de valider ces thérapies visant à stimuler l’angiogenèse. Peut-être serait-il plus pertinent de s’intéresser aux patients ayant seulement des douleurs de repos ou de combiner la thérapie génique ou cellulaire à la réalisation de pontages distaux ou d’angioplasties chez des sujets ayant un meilleur pronostic. Une autre approche plus récente concerne la réalisation de vaisseaux artiἀciels. Cette approche innovante représente également une voie de recherche pour les patients opérables mais n’ayant plus de matériel autologue pour que ce geste soit réalisé ce geste [25].

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Joseph Emmerich

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24 Silvestre JS, Gojova A, Brun V, et al. Transplantation of bone marrow-derived mononuclear cells in ischemic apoliprotein-E knockout mice accelerates atherosclerosis without altering plaque composition. Circulation 2003 ; 108 : 2839-42.

25 L’Heureux N, McAllister TN, de la Fuente LM. Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization. N Engl J Med 2007 ; 357 : 1451-3.


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La thérapie cellulaire en pathologie cardiaque

Philippe Menasché

Les possibilités de greffes de cellules dans le cœur suscitent de grands espoirs. Visant à redonner une fonctionnalité à des territoires myocardiques devenus akinétiques à la suite d’un infarctus, la thérapie cellulaire en cardiologie est déjà une réalité clinique attestée par le grand nombre d’essais cliniques actuellement en cours.

tH é RApIe Ce LLu LAIRe de L’In FARCtus du my o CARde

La dilatation excessive du ventricule gauche après un infarctus est l’un des plus puis-sants facteurs prédictifs du risque de décès [1]. L’un des objectifs majeurs des théra-pies cellulaires est donc de parvenir à une réduction du remodelage du ventricule gauche, plus efἀcace que les traitements actuels de l’infarctus comme la revasculari-sation au stade aigu par angioplastie, la thrombolyse, les stents… Les performances de ces traitements étant particulièrement élevées, le déἀ est à l’évidence ambitieux.

é valuation de la thérapie cellulaireLa procédure de thérapie cellulaire est aujourd’hui parfaitement standardisée. Un cathéter est introduit dans l’artère qui a été reperméabilisée quelques heures ou quelques jours plus tôt et des cellules mononucléées de la moelle osseuse du patient y sont injectées. Le choix de ces cellules est déterminé par leur disponibi-lité immédiate et par leur petite taille qui garantit la sécurité de l’injection intra-coronaire [2].

L’intervention a été récemment évaluée par une méta-analyse portant sur 13 essais contrôlés incluant 811 patients. La fraction d’éjection ventriculaire gauche était améliorée de façon statistiquement signiἀcative de 3 % (p = 0,0007). S’il est modeste, le bénéἀce de la thérapie cellulaire n’est donc pas nul. En revanche, aucun effet nota-ble sur le remodelage ventriculaire n’a été observé [3].

Certains en ont conclu que la thérapie cellulaire est et restera inefἀcace. En réalité, ces résultats apparemment négatifs sont extraordinairement positifs par la masse d’informations qu’ils nous ont apportée. Ils ont en particulier permis d’identiἀer les facteurs responsables de ces mauvais résultats. Il est dès lors possible de commencer à travailler de façon plus pertinente.

Philippe Menasché

60

Facteurs d’échec ou de réussite liés à la procédure d’administrationQuels sont les facteurs qui peuvent expliquer les bénéἀces limités de la thérapie cellulaire ? Certains d’entre eux tiennent à la procédure utilisée. Par exemple, il a été montré que le minutage (timing) de l’administration des cellules entre en ligne de compte. L’adressage (homing) des cellules varie beaucoup selon que l’injection a été effectuée 1 heure ou 24 heures après l’épisode aigu de l’infarctus. Des études clini-ques tentent actuellement de préciser le moment optimal d’administration et cette question devrait donc être clariἀée. La dose de cellules administrées est sans doute également un élément de réussite signiἀcatif. La méta-analyse montre ainsi que la fraction d’éjection ventriculaire est d’autant plus améliorée que le nombre de cellu-les injectées est élevé. Il existe donc un effet dose et la posologie peut certainement être optimisée (ἀg. 1) [3].

Fonctionnalité cellulaire altéréeL’altération de la fonctionnalité cellulaire est probablement un écueil beaucoup plus ardu. Il a été montré, sur un modèle animal de patte ischémique, que l’administration de cellules de moelle osseuse prélevées sur un sujet sain améliore l’ischémie alors que des cellules provenant d’un sujet avec cardiopathie ischémique sont sans effet. Nous sommes dans une situation similaire lorsque nous tentons d’améliorer des coronariens par l’in-jection de cellules de moelle non fonctionnelles en raison de leur maladie coronaire.

Étudeou sous-catégorie

01 < 10(7) cellules

02 < 10(8) cellules

03 < 10(9) cellules

04 < 10(10) cellulesMeyer (2006)

Huang (2006)Janssens (2004)Kang (2006)Schachinger (2006)Suarez de Lezo (2007)

Ge (2006)Lunde (2006)

Li (2007)Penicka (2007)

Meluzin LD (2006)

Meluzin HD (2006)

Meluzin HD (2006)

Sous-total (IC à 95 %)




Test d'hétérogénéité : non applicable,

Test d'hétérogénéité : x2 = 15,69. df = 4 (p = 0,003). I2 = 74,5 %

Test d'hétérogénéité : x2 = 9,51 df = 4 (p = 0,05) I2 = 57,9 %

Test d'hétérogénéité : x2 = 31,46. df = 11 (p = 0,0009). p = 65,0 %

Test d'effet global : Z = 0,71 (p = 0,48)



Test d'hétérogénéité : non applicableTest d'effet global : Z = –3,16 (p = 0,002)

Test d'effet global : Z = –3,00 (p = 0,002)

Total (IC à 95 %)

CSMO Moyenne (ET)

Sans CSMO Moyenne (ET)

EMPIC à 95 %

EMPIC à 95 %

Poids%n n

22107

108

109

1010

222222

10

2030259510

180

3030

357

3030

350

2030259210

177

44223514

1044223510

125 121

3,00 (4,69) 2,00 (4,69) 10,50 1,00 (–1,77, 3,77)1,00 (–1,77, 3,77)10,50

4,839,95

10,509,664,93

39,86

9,608,926,75

12,033,65

40,95

8,698,69

100,00

–10 –5 0 5 10En faveur d'un traitement sans CSMO En faveur d'un traitement par CSMO

5,30–3,103,004,50

–2,001,51

2,501,205,302,50

14,003,60

6,006,00

2,74

(–1,21, 11,81)(–6,15, –0,05)(0,23, 5,77)(1,30, 7,70)(–8,41, 4,41)(–1,96, 4,98)

(–0,73, 5,73)(–2,39, 4,79)(0,39, 10,21)(0,52, 4,48)(6,06, 21,94)(1,04, 6,16)

(2,28, 9,72)(2,28, 9,72)

(0,98, 4,50)

2,00 (4,69)

53,30 (3,50)58,60 (9,90)

57,10 (7,80)45,00 (9,00)

7,00 (6,20)3,40 (6,90)5,10 (9,10)5,50 (7,30)

20,00 (8,00)

6,70 (6,50) 0,70 (8,10)

4,50 (3,99)2,20 (7,30)

–0,20 (8,60)3,00 (6,50)

6,00 (10,00)

1,20 (7,50)5,00 (4,69)

4,30 (7,10)

52,60 (5,70)47,00 (7,00)

CSMO : cellules souches provenant de la moelle osseuse ; EMP : écart moyen pondéré.

Figure 1. Amélioration de la fraction d’éjection ventriculaire gauche en fonction de la quantité de cellules administrées. (Reproduit avec autorisation de Martin-Rendon, et al. [3]).


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Il serait possible de tester les cellules avant injection, mais la procédure serait alors trop longue, lourde et coûteuse pour pouvoir être utilisée en routine. Une deuxième stratégie serait de disposer de stocks de cellules, nécessairement allogéniques mais préalablement testées et fonctionnelles. Nous disposerions alors d’un produit prêt à l’emploi se rapprochant d’un médicament classique. Le problème du rejet subsiste, mais il pourrait être contourné par l’emploi de cellules souches mésenchymateuses (CSM) si le « privilège immunologique » qui leur est attribué est conἀrmé.

q uel mode d’administration des cellules ?Comment administrer les CSM allogéniques ? La voie intraveineuse est a priori la plus séduisante : l’accès est simple, dénué de risque, mais les cellules sont captées par la moelle, la rate et le poumon avant de parvenir au cœur. Le cathétérisme endo-ventriculaire gauche serait à cet égard plus efἀcace, mais son utilisation quelques heures après un infarctus du myocarde peut comporter des risques. Reste la voie intracoronaire : des études récentes chez l’animal menées en vue d’évaluer l’impact de la dose administrée et du traitement antithrombotique associé ont montré que des CSM du tissu adipeux ou de la moelle administrées par injection intracoronaire ont bien un effet thérapeutique sur la fonction cardiaque. Ces études ont en outre levé certaines craintes quant au risque d’occlusion des capillaires par les CSM dont la taille est deux fois plus importante que celle des cellules mononucléées [4-6].

Si ces résultats sont conἀrmés et validés, nous aurons fait un grand pas sur la voie de la mise au point d’un produit de thérapie cellulaire fonctionnellement efἀcace, pouvant être aisément conservé et utilisable en urgence.

L’adressage des cellules injectées reste très insufḀsantAprès injection par voie intracoronaire, environ 3 % seulement des cellules admi-nistrées sont retrouvées dans le cœur. Différentes techniques ont été élaborées pour tenter d’améliorer cet adressage insufἀsant. Certaines de ces approches sont fondées sur la biologie comme la manipulation des tissus hôtes en vue de provoquer l’am-pliἀcation des signaux d’adressage. Des améliorations techniques simples sont également imaginées, comme un cathéter qui, au lieu de libérer les cellules dans la lumière du vaisseau, les distribue autour, ce qui semble un moyen efἀcace d’amé-liorer le nombre de cellules qui vont véritablement pénétrer dans le parenchyme myocardique.

u ne amélioration trop modeste de la fraction d’éjection ventriculaireLa méta-analyse des essais randomisés évaluant le bénéἀce de l’administration de cellules de moelle osseuse dans les suites d’infarctus du myocarde a montré qu’elle ne procurait qu’une amélioration très modeste de la fraction d’éjection ventriculaire. Ce résultat a été interprété par certains comme la preuve déἀnitive de l’échec de

Philippe Menasché

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cette technique. Il serait utile à ce propos de se souvenir que les études évaluant des médicaments comme les bêtabloquants ou les inhibiteurs de l’enzyme de conver-sion (IEC) ont eu des résultats comparables alors que personne ne conteste plus que ces produits sauvent des vies. Ainsi, en 2004, l’étude CAPRICORN (Carvedilol post-infarct survival control in left ventricular dysfunction) évaluant les effets d’un bêtabloquant, le carvedilol, sur le remodelage ventriculaire gauche après un infarctus du myocarde aigu avait conclu à une amélioration de 4 % seulement de la fraction d’éjection ventriculaire gauche [7]. En 2007, une méta-analyse des effets des IEC a également abouti à des résultats du même ordre de grandeur [8].

Il est donc encore tout à fait prématuré d’afἀrmer que la thérapie cellulaire en pathologie cardiaque n’a pas d’avenir.

tH é RApIe Ce LLu LAIRe de L’Insu FFIs An Ce CARd IAq ue

Avec 5 millions de malades, l’insufἀsance cardiaque est la première cause d’hospi-talisation aux États-Unis. En France, on dénombre chaque année 150 000 nouveaux cas dont 10 000 formes graves, la prise en charge de la maladie comptant pour 3 % du budget de la santé. Malgré les nombreux progrès thérapeutiques, les décès d’ori-gine cardiovasculaire restent fréquents chez ces patients. La thérapie cellulaire de l’insufἀsance cardiaque vise à régénérer les cicatrices post-infarctus akinétiques. Trois essais contrôlés randomisés ont été menés en vue d’évaluer l’intérêt de l’ad-ministration de myoblastes squelettiques dans cette indication. Les cellules étaient injectées via un cathéter endoventriculaire dans deux études. Les résultats ont été positifs pour l’une et négatifs pour l’autre. Dans la troisième étude, la transplan-tation cellulaire chirurgicale effectuée en complément d’un pontage coronaire n’a pas davantage réussi à atteindre son objectif principal. Cet essai – intitulé MAGIC (Myoblast Autologous Grafting in Ischemic Cardiomyopathy) – a été mené sur des effectifs de patients relativement importants (120 malades randomisés dans 5 pays). Il a été lancé en vue d’étudier l’effet de l’injection de myoblastes dans les cicatrices d’infarctus sur la fonction cardiaque. Celle-ci a été effectivement améliorée chez les patients traités mais pas davantage que dans le groupe placebo.

Il faut toutefois relever que le groupe traité avec la plus forte dose de myoblastes a présenté une diminution signiἀcative des volumes télédiastolique et télésystolique du ventricule gauche (p < 0,05). La thérapie cellulaire a donc eu un effet sur le remo-delage ventriculaire, mais celui-ci est resté trop faible pour permettre l’amélioration de la fonction cardiaque (ἀg. 2) [9].

Les essais menés avec des cellules de moelle osseuse n’ont pas donné de meilleurs résultats qu’avec les myoblastes. Le proἀl de sécurité de la thérapie cellulaire cardia-que paraît satisfaisant hormis quelques inquiétudes quant à une augmentation possi-ble du risque d’arythmies ventriculaires dont l’interprétation reste complexe en raison de la multiplicité des facteurs en cause. Tous les malades de l’essai MAGIC ont été


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implantés avec un déἀbrillateur. Il a donc été possible d’effectuer une surveillance objective des arythmies ventriculaires laquelle n’a pas fait apparaître de différence signiἀcative entre les groupes traités et le groupe placebo.

d omaines d’amélioration : les cellulesDeux voies d’amélioration sont possibles, la première pouvant être qualiἀée de conservatrice et la seconde d’agressive. L’option conservatrice admet l’impossibilité de régénérer les lésions d’infarctus pour exploiter au mieux les effets paracrines des cellules greffées en sélectionnant les plus efἀcaces. Ces effets paracrines potentiels sont la stimulation de l’angiogenèse, un effet anti-apoptose, un remodelage de la matrice extracellulaire conduisant à une augmentation de l’élasticité des tissus cica-triciels et à une réduction de la ἀbrose, et un sauvetage des cardiomyocytes dont les dégâts sont réversibles.

Quelles sont les populations de cellules admissibles ? Les fractions CD34+ et CD133+ des cellules souches hématopoïétiques ou les cellules souches mésenchy-mateuses sont dotées d’un effet paracrine. Une étude récente a ainsi montré que le milieu sécrété par ces cellules sufἀsait pour diminuer l’apoptose ainsi que la taille de

VT

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usi

on

20

10

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-10

-20

*p < 0,05

n = 25–12,6 (–19,4 ; 0)

n = 295,9 (–11,8 ; 15,2)

n = 27– 3,9 (–17,0 ; 12,6)

Faible dose Dose élevée Placebo

NS

VTD : volume télédiastolique ; SC : surface corporelle.Les données sont exprimées sous forme de médianes et d’intervalles interquartiles.

Figure 2. Évolution des volumes télédiastoliques ventriculaires gauches. (Reproduit avec autorisation de Menasché, et al. [9]).

Philippe Menasché

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l’infarctus et améliorer la fonction ventriculaire gauche. C’est probablement cet effet paracrine qui explique le bénéἀce obtenu par la thérapie cellulaire sur le remodelage ventriculaire dans l’étude MAGIC.

La deuxième option, dite agressive, garde l’ambition de générer de nouveaux cardiomyocytes à partir de cellules souches. Les plus attractives parmi les cellu-les candidates seraient les cellules souches cardiaques, mais elles ne semblent être présentes que chez les nourrissons, durant les premiers mois de la vie. Les cellules souches embryonnaires, pluripotentes, semblent en revanche être des candidates de choix. Dans notre groupe, l’équipe de Michel Pucéat a élaboré un procédé de préo-rientation de ces cellules vers un phénotype cardiaque, puis de sélection des seuls progéniteurs cardiaques. Des essais menés dans un modèle animal d’infarctus ont ensuite montré que ces cellules deviennent des cardiomyocytes fonctionnels. Les cellules souches induites pluripotentes, ou iPS, sont les derniers progéniteurs poten-tiels [10].

Leur principal avantage est qu’elles proviennent du malade lui-même, mais il faut garder à l’esprit que l’utilisation de produits autologues pose en réalité de réels problèmes logistiques, notamment lorsque l’objectif est de pouvoir traiter un grand nombre de patients.

Amélioration du transfert et de la pérennité des cellulesLe transfert par injection à l’aide d’une seringue est associé à la perte de 80 % des cellules administrées. L’utilisation de systèmes d’injection contrôlés par ordina-teur améliorant la précision des cibles pourrait permettre des progrès substantiels. L’incorporation de cellules dans un biomatériau favoriserait également une meilleure rétention. Dans notre expérience, des techniques alternatives, faisant appel à des patchs en collagène cellularisé ou à des feuilles de cellules restant jointives entre elles grâce à la matrice extracellulaire, se sont avérées plus efἀcaces que l’injection conventionnelle.

Par ailleurs, les populations de cellules administrées subissent une mortalité consi-dérable dans les jours suivant l’injection [11, 12]. Les raisons de cette mort cellulaire sont à présent mieux connues. Elles sont dues à l’inḀammation, à l’ischémie et à l’apoptose provoquée par le détachement de la matrice extracellulaire, et ces consta-tations fournissent autant de voies de recherche pour tenter d’optimiser la survie du greffon cellulaire.

Con CLus Ion

Le choix des cellules devrait être déterminé par l’indication clinique. Les différents types de cellules, qu’elles soient adultes ou embryonnaires, sont efἀcaces dans certains cas et le sont moins dans d’autres. Il faut donc partir des malades et des maladies pour effectuer le choix le plus adapté.


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L’amélioration des techniques de transfert/survie est aussi importante que l’identi-ἀcation de la « meilleure » cellule. Cela n’a en effet aucun sens d’avoir une cellule, aussi efἀcace soit-elle, si l’on reste incapable de la placer là où on le souhaite et de l’y maintenir en vie. Cette survie implique que les cellules soient apportées avec leur support vasculaire et leur matrice extracellulaire.

Bibliographie

1 St John Sutton M, Pfeffer MA, Plappert T, et al. Quantitative two-dimensional echocardiographic measurements are major predictors of adverse cardiovascular events after acute myocardial infarc-tion. The protective effects of captopril. Circulation 1994 ; 89 : 68-75.

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11 Fukushima S, Varela-Carver A, Coppen SR, et al. Direct intramyocardial but not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model. Circulation 2007 ; 115 : 2254-61.

12 Fukushima S, Coppen SR, Lee J, et al. Choice of cell-delivery route for skeletal myoblast trans-plantation for treating post-infarction chronic heart failure in rat. PLoS One 2008 ; 3 : e3071.


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s ur la symbolique de l’angiogenèse et de l’anti-angiogenèse

Janine Chanteur

En marge des recherches scientiἀques qui ont permis de connaître l’angiogenèse et l’anti-angiogenèse et de tenter d’en acquérir la maîtrise, nous allons nous pencher quelques instants sur la symbolique que l’on peut dégager de ces processus. Cette réḀexion va nous conduire à condamner deux erreurs qui menacent le travail des chercheurs car elles imprègnent l’état d’esprit contemporain.

Il s’agit, d’une part, du respect inconditionnel de la nature sacralisée et, d’autre part, de l’alignement absurde de l’animal sur l’homme. Ces convictions et la propa-gande outrée qui en font la promotion sont redoutables : elles tentent d’arrêter les recherches en cours, en se servant de justiἀcations morales fallacieuses, pseudo-philosophiques ou prétendues scientiἀques. Le recours à la réalité de l’angiogenèse et de l’anti-angiogenèse montre combien les afἀrmations passionnelles ne reposent ni sur la raison ni, d’ailleurs, sur le sentiment ; elles mobilisent au contraire l’arbi-traire et la sensiblerie.

L’Ang Iogenèse et LA s ACRALIs At Ion de LA nAtu Re

On sait que l’angiogenèse, phénomène « naturel », assure la croissance de l’em-bryon et le développement normal de l’individu jusqu’à l’âge adulte. Elle intervient aussi, entre autres, dans la cicatrisation des blessures, phénomène également « natu-rel ». Ainsi, sa fonction est-elle indispensable et ne pose pas problème quand elle se déroule normalement. Dans cette perspective, elle participe à l’aspect, que certains ont dit « lumineux », de la nature au service de l’harmonie de la vie.

À l’opposé, l’angiogenèse, quand elle se développe de façon anarchique mais tout aussi « naturelle », produit encore de la vie, mais une vie dont on peut dire qu’elle progresse « contre la vie ». En assurant la multiplication des cellules cancéreuses, elle leur permet de dévorer les cellules saines et de se répandre dans l’organisme grâce aux vaisseaux sanguins qu’elle fabrique ou qu’elle détourne à leur proἀt. Ce phénomène est également naturel mais, en tant que tel, il est mortel si l’on n’inter-vient pas. La voracité des cellules cancéreuses est comparable à l’attitude des vain-queurs qui tuaient les vaincus en leur imposant une inanition totale.

Sur la symbolique de l’angiogenèse et de l’anti-angiogenèse

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Que penser alors de la « nature » qui témoigne à la fois d’un élan de vie dont on s’émerveille à juste titre et qui est capable, dans le même élan, d’apporter la mort par prolifération d’une vie envahissante et déréglée ? Ce phénomène « naturel » peut non seulement causer la mort de ce dont il se nourrit mais encore se suicider par la même occasion. Il faut d’ailleurs souligner que le qualitatif « naturel » n’est pas synonyme de « normal », bien qu’il arrive, à tort, de prendre l’un pour l’autre : « naturel » exprime le fait brut tel qu’il se présente sans intervention humaine, « normal » est un jugement qui a une connotation juridique ou scientiἀque, voire morale. Les deux mots, d’ailleurs, n’ont pas du tout la même étymologie.

Faut-il donc continuer à fantasmer sur la perfection de ce qui est naturel, quelles qu’en soient les manifestations, ou accepter de revenir à l’ambiguïté, voire l’ambi-valence, de la nature, dont les hommes ne portent pas la responsabilité, bien qu’ils puissent, par des conduites fâcheuses, accélérer et même provoquer des dégâts ? L’écologie est une idée louable qu’il est important de respecter et de mettre en prati-que, sauf lorsque, d’« idée », elle devient « idéologie » et que ses ardents défenseurs ne s’aperçoivent pas qu’il ne s’agit plus d’écologie bienfaisante mais d’un véritable jeu avec la mort. Rappelons un jugement porté par Alfred de Vigny sur la nature, à la fois trop sévère et cependant réaliste : dans son poème, La maison du berger, il personniἀe la nature et la fait se déἀnir elle-même : « On me dit une mère et je suis une tombe. » Elle est plutôt, comme l’angiogenèse et beaucoup d’autres phénomènes « naturels », les deux à la fois…

S’il est indiscutablement nuisible et condamnable d’empoisonner l’air des villes, la terre ou l’eau des océans, des Ḁeuves et des rivières avec certains produits toxi-ques, il l’est tout autant de faire de la nature une « idole », décidant de la vie ou de la mort des hommes. L’essence de l’idole est de se nourrir de ceux qui l’encensent. Mais le pire, c’est que l’idolâtre est souvent à lui-même sa propre idole : il est sûr de connaître la vérité qu’il s’acharne à propager en cherchant à éliminer toutes les objections. Rappelons-nous Greenpeace et ses émules qui ressusciteraient volontiers l’obscurantisme. Mutatis mutandis, on peut dire d’un cancer qu’il a cet orgueil et cette ténacité.

L’Ang Iogenèse et LA s ACRALIs At Ion des An ImAux

L’étude du phénomène de l’angiogenèse avait permis de décrypter un processus contre lequel la thérapie dont on disposait alors n’était pas toujours sufἀsante. Après avoir compris la façon dont la nature procédait pour développer les cellules cancé-reuses, l’« idée » vient, dans les années 1970, d’empêcher ces dernières de se multi-plier en les privant d’apport sanguin. La découverte des médicaments nécessaires à l’anti-angiogenèse fut rendue possible par l’expérimentation sur l’animal, en l’oc-currence sur des souris.

Janine Chanteur

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Or, sans se préoccuper le moins du monde de la guérison de malades condamnés, avant les succès de la recherche, des associations de défense des animaux crient au massacre des souris ou d’autres animaux indispensables à la recherche, sous le prétexte et sans doute, hélas, avec la conviction que l’animal a autant le droit de vivre que l’homme. On sait que certaines thérapies (médicamenteuse ou autres) ne peuvent être découvertes et mises au point sans la recherche sur l’animal et, en conséquence, être utilisées légalement sur l’homme sans avoir été expérimentées sur les animaux. Des mesures très strictes encadrent toute expérimentation de cette nature et préviennent les abus. Cependant, les associations irréductibles ne se gênent pas pour interrompre les expérimentations dans les laboratoires, en commettant des délits graves et même des crimes contre la personne des chercheurs, pour défendre les animaux. La zoolâtrie contemporaine constitue une nouvelle forme d’idolâtrie, celle de l’animal, au détriment de l’homme.

L’affection pour l’animal, l’intérêt qu’on lui porte sont des attitudes normales et même morales. En revanche, la préférence hystérique de l’animal par rapport à l’homme relève de la pathologie. Ce n’est pas, d’ailleurs, parce que l’homme est un « animal raisonnable », comme nous le déἀnissons depuis Aristote, qu’il faut le préférer à l’animal mais bien parce qu’il est seul capable de distinguer entre le bien et le mal et de reconnaître l’existence d’un « prochain » qu’il faut aider à guérir s’il en a besoin. L’animal, même s’il a des germes de raison, ce que personne ne nie, ne se fait jamais un « devoir » de lutter contre les atteintes biologiques de ses congénè-res ou de relever un ennemi blessé. Notons, de plus, que ces germes de raison ne lui permettent ni d’inventer ni de progresser.

Con CLus Ion

En conclusion, il reste que sacriἀer l’être vivant et sensible qu’est l’animal est un acte grave et difἀcile à admettre. Cependant, si l’homme est le vivant le plus accom-pli, en dépit de sa trop fréquente méchanceté il est également le seul à éprouver à la fois l’obligation de dépasser ses limites, de reconnaître la précarité de ses succès toujours provisoires et d’accepter la certitude de sa propre mort.

Et c’est bien cette « ἀnitude » de la condition humaine qui, en nous faisant un devoir de soigner l’homme « avant » de considérer la vie de l’animal, nous empêche de sortir tout à fait de la contradiction entre l’expérimentation sur l’animal et l’in-térêt qu’on lui porte. C’est pourquoi il nous faut tout mettre en œuvre pour sauver notre prochain, en faisant à l’animal aussi peu de mal qu’il est possible. C’est dire que nous devons tendre au bien, de tout notre être, en sachant que nous ne pourrons jamais y parvenir absolument. C’est donc avec courage et modestie, en dehors d’un quelconque dogmatisme, qu’il faut agir en faveur des hommes, sans nous cacher la contradiction qui subsiste entre soigner l’animal et se servir de lui. La perfection morale est un « horizon » vers lequel nous devons tendre, sans jamais pouvoir l’at-

Sur la symbolique de l’angiogenèse et de l’anti-angiogenèse

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teindre – au moins en cette vie. Telle est la rudesse de la condition humaine, c’est sa faiblesse, c’est sa misère, mais c’est aussi son indiscutable valeur.

Ces deux aberrations – sacralisation de la nature et sacralisation de l’animal – sont, me semble-t-il, remarquablement dénoncées par la considération de l’angiogenèse, phénomène naturel qui fait vivre mais peut tuer, et de l’anti-angiogenèse, qui est une espérance magniἀque due au génie de l’homme pour sauver l’homme.


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Hypoxie et progression tumorale : nouvelles approches thérapeutiques

Jacques Pouysségur

Ang Iopoïét Ines et veg F-A : deux ACteu Rs CLés de LA néo vAs Cu LARIs At Ion

Parmi le large éventail de facteurs angiogéniques, le VEGF-A et les angiopoïétines représentent deux acteurs majeurs de la néovascularisation. Pour rappel, la signalisa-tion du récepteur Tie-2 tyrosine kinase par l’angiopoïétine 1 stimule le recrutement des péricytes. La voie Notch activée au sein des cellules endothéliales maintient celles-ci en quiescence par le blocage de la voie cycline D-Cdk4. Lorsque la formation de néovaisseaux est rendue nécessaire, par exemple lors d’une réparation tissulaire ou du développement d’une tumeur, l’angiopoïétine 2, un antagoniste naturel de l’angio-poïétine 1, va « éteindre » la signalisation du récepteur Tie-2 en déplaçant l’angiopoïé-tine 1. Cette action va induire la déstructuration des capillaires en place permettant aux cellules vasculaires endothéliales de devenir réactives au VEGF-A et, donc, d’assurer les étapes de base : migration et division assurant la néovascularisation [1].

LA BAIsse de tens Ion d’o xygène ( Hypo x Ie) est Le s Ign AL de LA néo vAs Cu LARIs At Ion

En effet, le couple angiopoïétine 2 et VEGF-A est induit par l’hypoxie et la néovas-cularisation se produit donc là où il y a déἀcit d’oxygène. Le régulateur clé de la réponse cellulaire à l’hypoxie est le facteur HIF (hypoxia inducible factor), décou-vert il y a une quinzaine d’années par le groupe de Semenza [2]. L’application d’un stress hypoxique à des cultures de cellules (de Caenorhabditis elegans à l’homme) provoque l’induction rapide d’une sous-unité HIF-1α. Celle-ci migre dans le noyau pour s’associer à son partenaire HIF-1β constituant le facteur de transcription HIF-1 assurant, par l’induction de gènes variés, la survie des cellules. Ce processus est extrêmement rapide et peut être observé dans les 10 minutes qui suivent le stress hypoxique. De la même façon, la levée de l’hypoxie arrête le processus par la dispa-rition de la protéine HIF-1α qui possède une demi-vie inférieure à 5 minutes en normoxie.


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d es senseu Rs d’o xygène Cont RIBuent à LA dest Ru Ct Ion et à L’InACt IvAt Ion d’HIF-1 α

L’étude des mécanismes de régulation d’HIF-1α, notamment de la part du groupe de P. Ratcliffe à Oxford, a révélé le rôle clé joué par un ensemble d’hydroxylases. L’inactivation d’HIF-1α implique 3 enzymes HIF prolyl-hydrolase (PHD1, 2 et 3), PHD2 étant l’enzyme responsable du faible niveau d’HIF-1α en normoxie. Ces PHD sont de véritables senseurs d’oxygène, c’est-à-dire des enzymes capables de détec-ter et de lire la pression d’oxygène au sein d’une cellule, dans son noyau et dans son cytoplasme. Ces enzymes ont 2 cofacteurs, l’oxygène et le 2-oxoglutarate. En situation de normoxie, la PHD2 va hydroxyler 2 résidus proline situés au niveau du domaine de transactivation N-TAD. Les résidus proline hydroxylés sont alors recon-nus par la protéine pVHL (von Hippel-Lindau), sous-unité d’un complexe multipro-téique possédant une activité ubiquitine ligase, qui transfère plusieurs ubiquitines sur son substrat. La chaîne de polyubiquitine est reconnue par le système catalytique du protéasome qui dégrade alors rapidement HIF-1α.

Le Km pour l’oxygène de ces enzymes est assez élevé, donc toute baisse d’oxygène à partir de 20 % se traduit par une baisse de l’activité des PHD induisant une stabili-sation concomitante d’HIF-1α. L’HIF-1α est stabilisé et la protéine peut donc induire les gènes qui vont participer au programme génétique d’adaptation à l’hypoxie.

En outre, la fraction de l’HIF-1α qui pourrait échapper au protéasome est inhibée par un autre senseur d’oxygène, l’HIF asparaginyl-hydroxylase (FIH), qui hydroxyle l’asparagine située au niveau du domaine de transactivation C-TAD, empêche ainsi la ἀxation d’un coactivateur général de transcription (p300) et interdit l’induction des gènes qui en dépendent.

L’activité de l’HIF-1α est ainsi régulée par 2 senseurs de l’oxygène cellulaire, PHD et FIH, qui sont dépendants non seulement de la pO2 cellulaire mais également des niveaux de 2-oxoglutarate.

LA BIFon Ct Ion ALIté d’HIF-1 α Con Fè Re une p Lus g RAnde soup Lesse d’ AdApt At Ion FACe à L’Hypo x Ie

Nous nous sommes interrogés sur la signiἀcation physiologique de la présence de 2 domaines de transactivation sur HIF-1α et nous avons pu montrer que N-TAD et C-TAD induisent des groupes de gènes différents. Cette observation ne relève pas de la seule curiosité académique ; elle présente un réel intérêt physiologique. Les cellules situées à proximité d’un capillaire sont, dans des conditions de pression d’oxygène élevée, les 2 senseurs d’oxygène, PHD2 et FIH sont l’un et l’autre actifs et HIF-1α est donc dégradé et/ou inhibé. Le gradient d’oxygène intracellulaire s’abaissant à mesure que l’on considère des populations de cellules plus éloignées du capillaire, PHD2 et FIH tendent à être inactivées et HIF-1α à être stabilisé. Cependant, la PHD2 est la première des deux hydrolases à être inactivée lorsque la baisse de la pO2 intracellu-

Jacques Pouysségur

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laire reste modérée. Seul le domaine de transactivation C-TAD reste bloqué par une activité FIH très afἀne pour l’oxygène. Dans ces conditions, seuls les gènes induits par le C-TAD s’exprimeront, par exemple le gène dit proapoptotique BNIP-3. Lorsque la cellule se trouve dans un état plus hypoxique, les domaines N-TAD et C-TAD sont tous deux « libérés » et l’ensemble du répertoire des gènes contrôlés par HIF-1 sera induit.

Nous sommes donc en présence de 2 senseurs d’oxygène dotés d’afἀnités différen-tes pour l’oxygène, qui agissent sur 2 domaines de transactivation distincts et appor-tant des réponses différenciées à des conditions d’oxygénation différentes (ἀg. 1).

Sur le plan physiologique, ce double mode de contrôle confère à la cellule une plus grande souplesse d’adaptation aux valeurs de la pO2 cellulaire [3, 4].

dégradation

Senseursd'oxygène

protéasome

inactivation

Figure 1. Senseurs d’oxygène et régulation de HIF-1α.

HIF-1, un FACteu R de LA su Rv Ie Ce LLu LAIRe

L’inactivation de la PHD2 induite par la baisse de la pO2 se traduit par l’induction du gène bnip-3. La protéine BNIP-3 a d’abord été décrite comme induisant la mort cellulaire. Sachant que le gène bnip-3 est induit dans des conditions de baisse modé-rée de la pression d’oxygène n’entraînant pas de mort cellulaire, il nous était difἀcile d’adhérer pleinement à cette notion. Pourquoi HIF-1, qui est un facteur de survie, induirait-il un gène de mort cellulaire ? En réalité, nous avons établi que les produits des gènes bnip-3 et de leur cousin bnip-3L, tous deux induits par HIF-1 et exprimés au niveau mitochondrial, induisent l’autophagie [5]. Lorsque les conditions nutri-tionnelles baissent, la cellule peut survivre en engageant un processus d’autolyse contrôlé assurant des nutriments, en attendant que les conditions nutritives revien-


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nent. Nous sommes donc ici en présence d’un processus de survie et, fait remarqua-ble, la baisse de la pO2 qui constitue le signal de déclenchement de la néovasculari-sation va également déclencher le processus d’autophagie. La baisse de pression de l’oxygène intracellulaire signale une diminution générale des apports en nutriments à laquelle la cellule répond par l’induction d’un processus autophagique lui permet-tant de pallier, jusqu’à un certain point, une carence nutritionnelle (ἀg. 2).

Vaisseau

Figure 2. HIF-1 : une molécule de survie pour les cellules subissant un stress hypoxique. Tumeur d’un adénocarcinome colique humain (LS174) implanté chez la souris Nude. On détecte ici l’anhydrase carbonique CAIX, un marqueur induit par HIF (l’anticorps anti-CAIX apparaît en clair). Ce marquage coïncide avec l’expression de HIF-1α. Il est d’autant plus détecté que l’on s’éloigne du vaisseau situé au centre de la ἀgure.

HIF-1 est Imp LIq ué d Ans LA Régu LAt Ion du pH Int RACe LLu LAIRe tumo RAL

Depuis les travaux pionniers du siècle dernier par Otto Warburg, on sait que la majo-rité des cellules cancéreuses utilisent la glycolyse même en présence d’oxygène. Il s’agit d’un processus de transformation du glucose en pyruvate, le sous-produit ἀnal étant l’acide lactique. Ce système, qui ne produit que 2 molécules d’adénosine triphosphate (ATP) par molécule de glucose, est peu efἀcace. De plus, l’accumu-lation d’acide lactique diminue localement le pH, ce qui peut se révéler toxique et

Jacques Pouysségur

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impose la mise en œuvre de mécanismes de régulation du pH. On sait depuis peu que l’expression d’HIF-1 est capitale dans ce « switch » métabolique et qu’HIF-1 est directement impliqué dans la régulation du pH intracellulaire [3].

Bien que l’hypoxie soit le principal facteur d’induction d’HIF-1α, d’autres stimuli sont capables d’augmenter le niveau de ce facteur de transcription dans certains types cellulaires. Ainsi, même en présence d’oxygène, des conditions oncogéniques comme une délétion de PTEN, une activation constitutive de la phospho-inositide 3 kinase (PI3K) activant la voie Akt se traduisent par l’augmentation de l’activité HIF-1. De plus, des mutations du processus de déstabilisation d’HIF-1α ont été iden-tiἀées dans plusieurs types de tumeurs humaines (vhl, sdh, idh1…), conduisant à l’activation d’HIF en conditions de normoxie. HIF-1, par l’induction de la kinase PDK1, supprime l’activité pyruvate déshydrogénase et, par l’induction de LDH-A, va en quelque sorte « forcer » le métabolisme glycolytique, un processus généra-teur d’ATP nécessitant une consommation exagérée de glucose [7]. Ce métabolisme aberrant est largement utilisé actuellement dans le diagnostic en FDG-PET (F-18 Ḁuorodeoxyglucose positron emission tomography) qui permet de visualiser l’accu-mulation de l’analogue non métabolisé du glucose. Au-delà, nous sommes convain-cus qu’une meilleure connaissance de ce métabolisme aberrant du glucose conduira à des exploitations en thérapeutique anticancéreuse (ἀg. 3).

Figure 3. Métabolisme aberrant du glucose des cellules cancéreuses. Accumulation de Ḁuoro-déoxy-glucose dans un cancer du poumon métastasé visualisé par FDG-PET. (Reproduit avec l’aimable auto-risation de Beer, et al. [6]).


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Comment Les Ce LLu Les des m Amm IFè Res Cont Rô Lent -e LLes Le pH Int RACe LLu LAIRe ?

Si la régulation du pH intracellulaire est bloquée, la glycolyse et sa production d’ATP seront également stoppées par un rétrocontrôle. Si la cellule est strictement dépen-dante de la glycolyse pour sa fourniture énergétique, cette action provoquera une mort par nécrose.

Quels sont les systèmes de régulation du pH intracellulaire identiἀés ? L’échangeur sodium-protons est le régulateur de pH universel. Il utilise le gradient « entrant » de sodium pour extraire les protons du milieu intracellulaire. Cet échangeur, activé à pH acide, est une cible de tous les facteurs de croissance. Tous les mitogènes sont capables d’augmenter l’afἀnité pour le site H+ régulateur permettant à la cellule en prolifération d’imposer un pH intracellulaire plus alcalin. L’acide lactique, qui est également un facteur d’acidiἀcation du milieu intracellulaire, est extrait de la cellule par les cotransporteurs lactate-protons MCT1 et MCT4. Les anhydrases carboni-ques, surtout celles induites en condition hypoxique, comme on le verra plus loin, sont également des enzymes pouvant jouer un rôle clé dans l’adaptation des cellules à un micro-environnement acide.

Pour appréhender l’impact de l’acidose sur l’incidence tumorale, nous avons, à partir de ἀbroblastes, isolé et étudié un ensemble de mutants affectés dans certaines des étapes du métabolisme : des mutants déἀcients en phospho-glucose isomérase (pgi–) et donc ne produisant plus d’acide lactique, des mutants déἀcients en respira-tion (res–) et donc totalement dépendants de la glycolyse et générant, de ce fait, beau-coup d’acide lactique, enἀn des mutants déἀcients en échangeur Na+/H+ (nhe1–).

Pour résumer, il apparaît clair que la perte de l’échangeur Na+/H+ (nhe1–) affecte surtout la tumorigénicité des cellules produisant beaucoup d’acide lactique. Les cellules pgi– forment des tumeurs normalement même en l’absence d’échangeur Na+/H+ (nhe1–). Ce résultat très important apportait la « preuve de concept » validant les régulateurs de pH des tumeurs à haute glycolyse comme cibles potentielles anticancers [3].

Cont Rô Le du pH Int RACe LLu LAIRe : q ue LLe t RAdu Ct Ion CLIn Iq ue ?

Les cellules tumorales en conditions hypoxiques sont condamnées à tirer leur éner-gie de la glycolyse et, en conséquence, produisent de grosses quantités d’acide lacti-que. Si la régulation du pH intracellulaire est inactivée, il se produit un effondrement rapide du développement tumoral.

Cette observation peut-elle avoir une traduction clinique et nous offrir de nouvelles thérapeutiques ?

À côté de l’échangeur Na+/H+ (nhe1–), l’anhydrase carbonique (carbonic anhy-drase, CA) pourrait être l’une de ces nouvelles cibles. Nous connaissons environ

Jacques Pouysségur

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13 isoformes d’anhydrases carboniques, mais nous nous intéressons plus particuliè-rement aux anhydrases carboniques IX (CAIX) et XII (CAXII) qui sont fortement induites par HIF-1 et que l’on retrouve dans la plupart des tumeurs d’origine épithé-liale humaine.

Ces anhydrases carboniques sont localisées au niveau de la membrane plasmique. Leur domaine catalytique, situé hors de la cellule, catalyse l’hydratation du CO2, cette réaction aboutissant à la libération de bicarbonate et d’un proton (H2O + CO2 = HCO3

– + H+). Le bicarbonate est rapidement repris par la cellule tandis que le proton reste dans le domaine extracellulaire. La présence de CAIX ou de CAXII va donc contribuer à l’acidose que l’on retrouve dans la plupart des tumeurs solides, tandis que la recapture du bicarbonate devrait permettre le maintien d’un pH intracellulaire plus alcalin autorisant le fonctionnement de la glycolyse et de la synthèse protéique dans un environnement acide très hostile (ἀg. 4).

LA CAIx Indu Ite p AR L’Hypo x Ie p Romeut LA su Rv Ie des Ce LLu Les tumo RALes

Nous avons essayé de comprendre quel bénéἀce les cellules tumorales tirent de l’expression de CAIX et si cette dernière peut constituer une cible thérapeutique. En normoxie, ni HIF-1α ni CAIX ne sont exprimés, alors qu’ils le sont fortement en conditions hypoxiques. Nous avons fait une expérience très simple. Nous avons

1800

1600

1400

1200

1000

800

600

400

200

0

Vo

lum

e tu

mo

ral (

mm

3 )

Nombre de jours après l'injection de cellules

LS174Adénocarcinome du côlon

LS-shCA9 - DOX

+ DOX

- DOX

+ DOX

LS-shCA9

LS-shCA9/CA12-

LS-shCA9/CA12-45 %

85 %

7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29

Figure 4. CAIX et CAXII sont des cibles potentielles pour des thérapeutiques anticancéreuses.


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apporté du gaz carbonique à une suspension de ἀbroblastes et la mesure de pH extra-cellulaire a montré une acidiἀcation progressive du milieu de culture. La même expérience menée avec les ἀbroblastes exprimant la CAIX a induit une acidiἀcation très brutale, dans les 5 secondes suivant l’apport de CO2, du milieu de culture. De manière plus intéressante, les cellules exprimant CAIX et incubées à des pH acide (6,5-7,0) présentaient un pH intracellulaire de 0,4 à 0,2 unité pH plus alcalin que celui des cellules contrôle. Une telle différence a des implications considérables sur le taux de glycolyse et le métabolisme de l’ATP et nous avons montré in vitro que les cellules sans CAIX perdent leur viabilité dans des conditions très acides qui repro-duisent l’environnement acide des tumeurs.

L’expression de CAIX et de CAXII procure-t-elle un avantage aux cellules tumo-rales in vivo ? Dans un modèle murin de carcinome du côlon humain, nous avons inactivé la CAIX au moyen d’une petite molécule, d’ARN interférence, dont l’ex-pression peut être contrôlée par la doxycycline. La suppression de l’expression de la CAIX par l’ajout de doxycycline dans l’eau de boisson entraînait une diminution de 45 % du développement tumoral. Cette diminution restait donc modeste, mais il est apparu que la réduction de l’expression de la CAIX entraînait une forte surex-pression de l’anhydrase carbonique cousine, la CAXII. Nous avons créé des cellu-les dépourvues de CAXII mais conservant CAIX. Le développement tumoral de ces cellules était comparable à celui de la lignée témoin. L’utilisation de la doxycy-cline, qui permet d’abolir l’expression de CAIX, a entraîné une réduction tumorale de 85 %. Par conséquent, il apparaît bien que les anhydrases carboniques CAIX et CAXII induites dans les zones hypoxiques de nombreuses tumeurs constituent des cibles thérapeutiques pertinentes [8].

Les t RAnspo Rteu Rs mono CARBo xy LIq ues, CIBLes t Hé RApeut Iq ues po tent Ie LLes ?

Nous avons vu que les anhydrases carboniques ne sont pas les seuls agents impliqués dans la régulation du pH intracellulaire. Ce processus met en jeu notamment les transporteurs d’acide lactique MCT1 et MCT4. Les cellules ἀbroblastiques n’ex-priment que MCT1. Son inhibition, par un inhibiteur spéciἀque mis au point par AstraZeneca, dans des cultures ἀbroblastiques placées en conditions hypoxiques abolit leur viabilité et, in vivo, chez la souris nude, réduit d’un facteur 10 le volume tumoral. Cependant, de nombreuses cellules cancéreuses, comme les cellules tumo-rales épithéliales, possèdent simultanément MCT1 et MCT4. Nous avons donc mimé cette situation en introduisant dans les ἀbroblastes la forme MCT4 humaine. Lorsque ces cellules sont placées en conditions hypoxiques, le blocage de MCT1 n’a plus aucun effet sur la viabilité, démontrant le rôle déterminant de MCT4 dans le fonctionnement de la glycolyse et donc de la survie des cellules. Il paraît donc que le MCT4 constitue une cible potentielle pour de nouvelles thérapeutiques anticancé-

Jacques Pouysségur

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reuses car ce transporteur est absolument indispensable au maintien de la glycolyse dans un grand nombre de tumeurs sous hypoxie. L’approche future envisagée est une double inactivation MCT1/MCT4 en ciblant la chaperonne commune à ces deux transporteurs : la basigine ou CD147.

Con CLus Ion

Nous sommes convaincus qu’une stratégie visant le métabolisme glycolytique exacerbé des tumeurs est une approche nouvelle offrant des potentiels thérapeutiques peu explorés. Nous avons analysé ici le ciblage de la régulation du pH intracellulaire des tumeurs. Nous avons vu que plusieurs systèmes de contrôle du pH sont utilisés par les cellules. Leur contribution respective pour chaque type de tumeur devra être analysée en étude préclinique chez la souris. Ces modèles permettront de propo-ser les meilleures associations possibles de drogues ciblant le pH intracellulaire de manière à effondrer l’ATP intracellulaire dans des conditions ayant peu d’impact sur les tissus sains. Le métabolisme cellulaire a eu ces lettres de noblesse au siècle dernier ; nous entrons aujourd’hui dans une nouvelle phase où la physiologie cellu-laire et la génétique moléculaire apportent une nouvelle lumière sur le métabolisme des tumeurs. De nouvelles pistes thérapeutiques sont en pleine exploration.

Bibliographie

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tumour regression. Nature 2006 ; 441 : 437-43.4 Dayan F, Roux D, Brahimi-Horn MC, et al. The oxygen sensor factor-inhibiting hypoxia-inducible

factor-1 controls expression of distinct genes through the bifunctional transcriptional character of hypoxia-inducible factor-1 alpha. Cancer Res 2006 ; 66 : 3688-98.

5 Bellot G, Garcia-Medina R, Gounon P, et al. Hypoxia-induced autophagy is mediated through HIF-induction of BNIP3 and BNIP3L via their BH3-domains. Mol Cell Biol 2009 ; 29 : 2570-81.

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7 Kroemer G, Pouysségur J. Tumor cell metabolism: cancer’s Achilles’ heel. Cancer Cell 2008 ; 13 : 472-82.

8 Chiche J, Ilc K, Laferrière J, et al. Hypoxia-inducible carbonic anhydrase IX and XII promote tumor cell growth by counteracting acidosis through the regulation of the intracellular pH. Cancer Res 2009 ; 69 : 358-68.


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é tat des lieux des anti-angiogéniques en cancérologie

Olivier Rixe

Les anti-angiogéniques ont véritablement modiἀé le métier de cancérologue en le rapprochant de celui des internistes et des spécialistes d’organes qui traitent des pathologies du rein, de la peau, du vaisseau ou du tube digestif. Les effets secondai-res des anti-VEGF, comme les toxicités hématologiques, dermatologiques ou rénales, nous ont fait entrer dans une cancérologie transversale. Ils nous ont amenés à élargir notre champ d’action et à faire en permanence de la médecine comparée, comme en témoignent les communications de cet ouvrage.

n éo- Ang Iogenèse tumo RALe : LA CIBLe p HARmACo Log Iq ue ne se LImIte p As Au veg F

Les thérapeutiques ciblant le VEGF devaient représenter une cible unique « idéale ». En réalité, plus nos connaissances progressent, plus nous devons admettre que les choses sont bien plus complexes que nous ne l’avions imaginé. Certes, le VEGF est une voie essentielle qu’utilisent les cellules tumorales pour stimuler la prolifération vasculaire. Cependant, il existe d’autres facteurs pro-angiogéniques, identiἀés ou restant encore à découvrir, qui interviennent soit directement de la cellule tumorale à la cellule endothéliale, soit indirectement via l’environnement péritumoral et la cellule stromale [1].

Avec un certain retard vis-à-vis de nos collègues cardiologues, nous commençons à nous intéresser aux précurseurs médullaires et à leur importance dans le système vasculaire tumoral et péritumoral. Réduire la cible pharmacologique au VEGF est une erreur. Nous disposons aujourd’hui de médicaments soit très « purs », ciblant le VEGF, soit très « impurs », des drogues « sales », qui vont s’adresser à plusieurs des facteurs clés du réseau angiogénique [2]. Les outils ciblant le VEGF et son récepteur dont nous disposons sont des anticorps monoclonaux anti-VEGF, comme le béva-cizumab, des récepteurs solubles comme le VEGF Trap, ou encore des molécules qui vont inhiber la partie fonctionnelle des récepteurs au VEGF (ἀg. 1). Des essais thérapeutiques portant sur ces petites molécules, plus ou moins spéciἀques et ayant un spectre plus ou moins large, sont quotidiennement publiés.

Olivier Rixe

80

Le réel avantage de molécules ciblant spéciἀquement le VEGF par rapport à des molécules qui auront des actions collatérales beaucoup plus larges (dont tous les « ib » : sunitinib, sorafénib, axitinib, pazopanib…) reste encore aujourd’hui à préciser.

SorafénibSunitinib

VEGF

VEGFR-2

VEGFR-1VEGFR-3

PDGF

PDGFR

PDGFR kit

Cascade de transduction du signalPerméabilité vasculaire, survie,

prolifération et migration cellulaire

SunitinibSorafénib

VasculogenèsesAngiogenèse

Lymphangiogenèse

Angiogenèse

Péricyte

SunitinibSorafénib

Sorafénib

Sunitinib

Raf

Ek

MEK

Cellule endothéliale

Celluletumorale

TumeurStimulation autocrine

AngiogenèsePression interstitielle tumorale

proliférationSurvie

Figure 1. Sites d’action des anti-angiogéniques.

État des lieux des anti-angiogéniques en cancérologie

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Les ACt Ions des Ant I-veg F Restent m AL Connues

En réalité, nous ignorons à peu près tout de ce que nous faisons lorsque nous donnons un anti-VEGF. Certes, la raréfaction du système vasculaire est clairement reliée à la régression du volume tumoral. Il a été montré, chez la souris, que l’utilisation d’un antirécepteur au VEGF de type 2 permet une réduction volumétrique tumorale tout à fait superposable à la raréfaction vasculaire [3]. Cependant, le champ d’action des anti-VEGF paraît bien plus large. Un effet antitumoral direct est très probable. Le sunitinib a ainsi une action antitumorale in vitro sur des cultures cellulaires, donc en l’absence de tout système vasculaire. Récemment, il a également été montré que les cellules de la tumeur peuvent mobiliser des cellules normales de la moelle osseuse et provoquer leur migration jusqu’aux régions prémétastatiques et, ainsi, préparer ce nouvel environnement à la greffe tumorale [4]. La tumeur émettrait un signal par l’intermédiaire des VEGFR-1 et VEGFR-2 et préparerait des « niches » aux éven-tuelles tumeurs secondaires en les rendant adhérentes. Ces cellules médullaires vont se loger sur des poumons, des foies et de l’os sains et vont, secondairement, attirer les cellules tumorales pour permettre leur prolifération et le développement secondaire de métastases. Ce phénomène médié par VEGFR-1 et VEGFR-2 peut constituer un autre point d’impact pharmacologique important, ce qui expliquerait la réduction des nouvelles métastases en présence des inhibiteurs de ces récepteurs.

Les VEGF seraient aussi impliqués dans des phénomènes d’immunosuppression observés dans l’environnement tumoral. Le VEGF produit par les cellules tumora-les inhibe la maturation des cellules dendritiques dans l’environnement tumoral et celles-ci seraient ainsi incapables d’induire les réponses lymphocytaires T effectrices antitumorales.

LA démonst RAt Ion de LA vALId Ité du Con Cept Ant I-veg F A été é CLAt Ante

Les outils thérapeutiques anti-VEGF efἀcaces sont apparus dans les années 2000 avec, parmi les plus puissants, le sunitinib. L’étude de phase 1 de cet agent a été menée en France [5]. L’un des premiers patients traités était atteint d’un cancer métastatique du rein. Les métastases pulmonaires de ce malade ont régressé quasi complètement. La preuve du concept anti-VEGF était faite ! Une telle efἀcacité antitumorale dès la phase 1 reste assez exceptionnelle en cancérologie.

La phase 2 a été menée de l’autre côté de l’Atlantique avec le schéma mis au point à l’Institut Gustave-Roussy : 4 semaines de traitement donné par voie orale, suivies de 2 semaines d’arrêt [6]. La présentation des résultats au congrès de l’American Society of Clinical Oncology (ASCO) en 2005 a été saluée par une ovation debout (standing ovation). Les lésions avaient régressé chez 42 % des 60 patients traités. Alors que leur tumeur rénale était considérée comme résistante à tout médicament,

Olivier Rixe

82

elle se révélait sensible dans presque 1 cas sur 2, avec une durée de réponse d’environ 14 mois et une médiane de survie d’environ 2 ans. Le médicament a été approuvé, sur la base de cette étude menée chez seulement 60 patients, aux États-Unis par la Food and Drug Administration (FDA) d’abord, puis par les autorités européennes, ce qui a été ensuite conἀrmé par une large étude de phase 3 [7]. Ainsi, le sunitinib a été comparé à l’un des traitements standard de la maladie métastatique. Son adminis-tration a permis un doublement de la survie sans progression. La médiane de survie est passée de 21 mois dans le groupe standard interféron à 26 mois dans le groupe sunitinib. La faiblesse de l’écart entre les deux groupes de traitement s’explique notamment par le passage au sunitinib de patients initialement sous interféron, ce qui tend à rapprocher les deux courbes de survie.

u n Fo Rt ImpACt su R LA su Rv Ie s Ans p Rog Ress Ion

Parallèlement, nous avons mis au point, à l’hôpital de la Pitié-Salpêtrière, un autre anti-VEGF, l’axitinib [8, 9]. Avec cet agent également, des résultats signiἀcatifs ont été observés dès la phase 1 dans plusieurs types tumoraux et, notamment, dans le cancer du rein métastatique. L’axitinib est une molécule qui présente l’intérêt d’in-hiber très spéciἀquement les récepteurs au VEGF des types 2 et 3 et elle a donc très peu d’activité sur les autres récepteurs impliqués dans l’angiogenèse ou sur d’autres tyrosines kinases. Nous avons traité 50 patients et obtenu 44 % de réponses objecti-ves et des rémissions complètes qui ont pu persister au-delà de 4 ans de traitement.

Les études ont é CHoué à démont Re R un Béné FICe su R LA pRo Long At Ion de LA su Rv Ie

La stratégie thérapeutique dans le cancer du rein a été totalement bouleversée par ces quelques essais, incluant des études clés également menées avec le bévacizumab et le sorafénib. En 1980, les recommandations pour la prise en charge d’un cancer du rein préconisaient l’utilisation de la progestérone, de cytotoxiques (vinblastine) et, surtout, d’immunothérapie par interféron et interleukine 2. Les résultats théra-peutiques restaient cependant plus que modestes. L’arrivée des anti-angiogéniques a complètement modiἀé les recommandations et, aujourd’hui, 80 % des patients ayant un cancer du rein sont, ou seront, traités par un traitement dirigé contre les facteurs de croissance vasculaire.

Cela étant, quel est réellement l’impact des traitements anti-VEGF en termes de prolongation de la survie ? Sur l’ensemble des études de phase 3 publiées sur le cancer du rein utilisant les traitements anti-angiogéniques, une seule a montré un bénéἀce sur la survie d’environ 6 mois avec le sunitinib par rapport au traitement de référence (interféron). Les autres études sont positives en termes de survie sans récidive.


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éLAB o RAt Ion de nouve LLes st RAtég Ies t Hé RApeut Iq ues

Les cancérologues ont mis au point deux stratégies différentes. L’une d’elles fait appel à des monothérapies utilisant des inhibiteurs du récepteur au VEGF dans le cancer du rein et dans l’hépatocarcinome. Les études randomisées sont positives avec un impact sur la survie sans progression assez modeste (de 1 à 3 mois) dans l’hépatocar-cinome et plus important dans le cancer du rein. Dans les autres tumeurs (les cancers du sein, du poumon ou du côlon), les anti-VEGF ont été employés en association avec les traitements conventionnels et en particulier la chimiothérapie. Ces essais ont montré une synergie entre la chimiothérapie et le bévacizumab, phénomène qui reste aujourd’hui assez mal expliqué. Cette action sur la plupart des tumeurs, comme celles du côlon, du poumon ou du sein, a été démontrée, les taux de réponses étant plus élevés qu’avec la chimiothérapie seule, mais l’impact reste assez modeste en termes de survie sans progression et de survie globale. D’autres indications dans les tumeurs plus ou moins orphelines sont en cours d’élaboration. Des études de phase 2 concernant les tumeurs thyroïdiennes et les tumeurs neuro-endocrines carcinoïdes du pancréas ont été publiées récemment. Des taux de réponses signiἀcatifs ont été obtenus et des essais de phase 3 sont donc en cours. Le bévacizumab est actuelle-ment évalué dans le glioblastome.

LA q uest Ion des p Hénomènes de Rés Ist An Ce Aux Agents Ant I-Ang Iogén Iq ues

Ces thérapeutiques anti-angiogéniques permettent-elles des survies à long terme ? Clairement, la réponse est : très peu ! L’essai de phase 2 sur l’axitinib est l’un des seuls dans lequel des patients sont toujours vivants au bout de plus de 4 ans. L’amélioration des taux de réponses obtenus avec les thérapeutiques anti-angio-géniques ne s’est pas réellement traduite par des réponses complètes et de réelles améliorations des pourcentages de survie à long terme. Quelle en est la raison ? Les mécanismes de résistance aux anti-angiogéniques font aujourd’hui l’objet de nombreuses publications.

Il existe deux types de résistances aux traitements anti-VEGF [10] : les résistances intrinsèques, dans lesquelles le malade ne va pas répondre au traitement anti-angio-génique, et les résistances acquises où, après une phase de raréfaction vasculaire, ce réseau va se remettre à proliférer et à s’étendre. Les mécanismes en cause paraissent extrêmement hétérogènes. Ainsi, le phénomène d’évasion vasculaire à un traitement anti-VEGF correspond à une réactivation de l’angiogenèse tumorale indépendante du VEGF, associée à une induction médiée par l’hypoxie d’autres facteurs pro-angio-géniques incluant des membres de la famille des facteurs de croissance des ἀbro-blastes (FGF, ἀbroblast growth factor). Le traitement par des inhibiteurs du FGF entraîne, de nouveau, la raréfaction vasculaire. En conséquence, cibler la voie VEGF

Olivier Rixe

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va déréprimer d’autres voies comme la voie FGF, qui va constituer un mécanisme d’échappement signiἀcatif.

Un autre mécanisme de résistance met en jeu une sous-population de cellules souches de la lignée myéloïde. Ces cellules vont inἀltrer la tumeur et la rendre résis-tante aux anti-VEGF. Il faut souligner que ces cellules sont très sensibles à la chimio-thérapie, ce qui pourrait expliquer la synergie d’action obtenue avec l’association d’un anti-VEGF et d’un cytotoxique.

v e Rs une Ident IFICAt Ion des p At Ients pouv Ant Béné FICIe R d’un t RAItement Ant I-Ang Iogén Iq ue

Nous n’avons toujours pas la capacité d’identiἀer les patients qui vont répondre au traitement anti-angiogénique. L’ampliἀcation de l’EGFR et les mutations de KRAS permettent d’identiἀer les malades répondeurs à l’erlotinib. L’herceptine est efἀcace dans 40 % des cas chez les patientes montrant une ampliἀcation du gène HER2. L’imatinib n’est actif que chez des malades atteints d’une tumeur stromale surex-primant c-kit associée à certaines mutations parfaitement identiἀées. Pourtant, nous sommes aujourd’hui incapables d’identiἀer les anomalies du récepteur au VEGF qui permettraient de prédire l’activité des anti-VEGF.

Certains facteurs, essentiellement cliniques, peuvent toutefois être associés à la réponse au traitement. Ainsi, les patients faisant une hypertension artérielle au décours d’un traitement par l’axitinib tendent à avoir une meilleure survie que les autres patients. L’apparition de l’hypertension artérielle (élévation de la diastolique) est ainsi un facteur associé à l’efἀcacité du traitement anti-angiogénique, sans doute indirectement associé à une meilleure biodisponibilité du médicament chez ces patients [8, 11].

Quelles sont les perspectives des traitements anti-angiogéniques ? Devront-ils être associés ? Leur spectre devrait-il être élargi ? Devraient-ils être utilisés plus précoce-ment, notamment en adjuvant ? Est-il possible d’identiἀer des sous-groupes de patients répondeurs ? Faudrait-il également cibler les voies VEGF indépendantes ? Les méde-cins de différentes disciplines médicales comme la cardiologie et la cancérologie ont des interrogations communes comme le démontrent les présentations de ce colloque.

L’avenir de l’utilisation clinique de ces molécules réside dans l’identiἀcation de facteurs prédictifs de la réponse à ce traitement ciblé qui permettra d’améliorer l’in-dice thérapeutique de ces molécules.

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Anti-angiogenèse et pathologie oculaire, dégénérescence maculaire liée à l’âge

José-Alain Sahel, Michel Paques

n éo vAs Cu LARIs At Ion o Cu LAIRe

La néovascularisation rétinienne est connue de longue date. Dès 1948, Michaelson, un ophtalmologiste de l’Université de Jérusalem, a postulé l’existence d’un facteur x, libéré par le tissu hypoxique et stimulant la formation de néovaisseaux dans des pathologies ischémiques comme le diabète et les occlusions veineuses. Michaelson avait également évoqué la possibilité, dans l’avenir, de bloquer ce facteur x dès lors qu’il serait identiἀé [1].

méd IAteu Rs de LA néo vAs Cu LARIs At Ion o Cu LAIRe

L’hypothèse de Michaelson a été conἀrmée plus de 40 ans après avec l’identiἀcation du VEGF (vascular endothelial growth factor) dans la pathologie oculaire. Le VEGF n’est toutefois pas le seul facteur à intervenir dans les phénomènes de néovasculari-sation et dans l’orchestration de ce processus. Par exemple, l’équipe de Chemtob, à Montréal, a tout récemment montré que l’accumulation de succinate dans la rétine hypoxique agit comme un puissant médiateur de l’angiogenèse et que cet agent est notamment impliqué dans la rétinopathie diabétique ischémique. Le succinate agit par l’intermédiaire de son récepteur, le GPR-91 (G protein-coupled receptor-91), les effets de ce dernier étant eux-mêmes médiés par les cellules ganglionnaires de la rétine qui, en réponse à l’augmentation des niveaux de succinate, régulent la produc-tion de nombreux facteurs de croissance et, en particulier, du VEGF [2].

Plus généralement, on considère aujourd’hui qu’il existe un équilibre entre des facteurs pro-angiogéniques, au premier rang desquels le VEGF, le PDGF (platelet-derived growth factor), le FGF-2 (ἀbroblast growth factor-2) et des facteurs anti-angiogéniques naturels, en particulier le PEDF (pigment epithelial-derived factor), qui est notamment synthétisé par l’épithélium pigmentaire.


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d égéné Res Cen Ce m ACu LAIRe LIée à L’âge : mé CAn Ismes de LA néo vAs Cu LARIs At Ion

Nous nous intéresserons ici plus particulièrement à la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). Cette pathologie fréquente touche 1,5 million de personnes en France, un dixième d’entre elles étant considérées comme aveugles. Jusqu’au début des années 2000, l’arsenal thérapeutique restait très restreint dans cette indication et se limitait, pour l’essentiel, au laser utilisé dans des formes très particulières de la maladie, concernant moins de 8 % des patients, dans lesquelles des néovaisseaux apparaissent en dehors de la macula.

Le mécanisme conduisant à la formation des néovaisseaux dans la DMLA est moins bien élucidé que dans l’ischémie diabétique ou dans les occlusions veineuses. Le rôle d’une inḀammation locale semble de plus en plus évident à la lumière des nombreuses études génétiques mettant en évidence le rôle du polymorphisme de facteurs du complément dans la prédisposition à la maladie. Plusieurs mécanismes coexisteraient, parmi lesquels l’ischémie joue un rôle assez obscur. Une hypothèse aujourd’hui admise, mais restant à conἀrmer, postule qu’un niveau donné de VEGF permettrait de maintenir la structure et la fonction de la circulation choriocapillaire dans la rétine normale puis, avec le vieillissement, l’accumulation de débris dans la rétine viendrait faire obstacle à la diffusion de l’oxygène vers les photorécepteurs, ce qui entraînerait une hypoxie, une augmentation de la synthèse de VEGF contribuant à la néo-angiogenèse.

n éo vAs Cu LARIs At Ion CHo Roïd Ienne d Ans LA dm LA

La DMLA débute par un soulèvement de la macula. L’angiographie en Ḁuores-céine ou au vert d’indocyanine permet de révéler la présence de néovaisseaux dont l’exsudation alimente l’œdème maculaire. La maladie a ainsi deux composantes, la prolifération néovasculaire et l’hyperperméabilité vasculaire qui lui est consécu-tive, les néovaisseaux étant à l’origine d’exsudations et d’hémorragies dans la région maculaire.

Il semble que l’efἀcacité des thérapeutiques utilisées dans la DMLA soit davantage liée à leur action sur la perméabilité vasculaire qu’à leur effet anti-angiogénique proprement dit. Il faut à ce propos se souvenir que le VEGF est également dénommé vascular permeability factor. L’expérience clinique indique qu’en termes d’amélio-ration de la fonction maculaire, il est très probable que la cible principale des anti-VEGF soit la perméabilité vasculaire.

La forme exsudative de la maladie nous intéresse plus particulièrement. Les formes atrophiques de la maladie sont également fréquentes, mais elles sont caractérisées par l’involution des vaisseaux et, donc, par un processus pathologique à l’opposé de ce qui est observé dans la forme exsudative [3].


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AvAn Cées t Hé RApeut Iq ues FACe à LA néo vAs Cu LARIs At Ion o Cu LAIRe

Les néovaisseaux n’apportent pas une réponse adaptée à l’ischémie. En raison de leur situation ectopique, ils n’ont pas d’effet signiἀcatif sur l’oxygénation du tissu ischémique. En revanche, ils sont responsables de complications sévères, cécitantes, essentiellement par ἀbrose et rétractation secondaire.

Il était donc logique de cibler ces néovaisseaux dans une perspective thérapeuti-que. Historiquement, le laser a surtout été employé dans la rétinopathie diabétique pour obtenir l’ablation du tissu ischémique (panphotocoagulation rétinienne). Cette intervention est une forme d’amputation, elle procède au sacriἀce du tissu en vue de limiter la synthèse de VEGF et des facteurs pro-angiogéniques, mais elle est réalisée au détriment des neurones qui sont détruits.

Ce traitement est donc très peu satisfaisant, mais les anti-VEGF constituent-ils pour autant une alternative optimale ? Si le VEGF intervient dans le développe-ment des néovaisseaux, il joue également un rôle déterminant dans les processus physiologiques de vascularisation. Ainsi, dans l’œil adulte, les récepteurs au VEGF sont exprimés sur l’endothélium, mais également dans les cellules de la rétine, qu’il s’agisse de l’épithélium pigmentaire ou des photorécepteurs. Le VEGF y a un effet pro-inḀammatoire et il est probable qu’il intervienne dans le maintien de la trophi-cité de la choriocapillaire. Enἀn, il a été montré que le VEGF a un rôle neuropro-tecteur [4, 5]. Les anti-VEGF pourraient en conséquence avoir un effet toxique sur les neurones de la rétine avec une altération de l’électrorétinogramme, et donc de la fonction visuelle, ce qui pourrait, sans que cela soit établi de manière irréfutable, poser problème dans le cas de traitements itératifs et à long terme.

e xp Lo RAt Ion des e FFets du veg F Au n Ive Au de L’œ IL

Le rôle du VEGF au niveau de la rétine a notamment été exploré par l’étude des conséquences de son injection intra-oculaire. Les effets de cette intervention sont variables selon les espèces. Chez le rat, elle ne se traduit pas tant par la formation de néovaisseaux que par une dilatation du calibre vasculaire et par une très importante diffusion. Le principal effet du VEGF est donc ici une augmentation de la perméabi-lité des vaisseaux qui pourrait être liée à un effet pro-inḀammatoire. Chez le singe, en revanche, le VEGF entraîne la formation de néovaisseaux [6, 7].

Le rôle du VEGF en pathologie a notamment été exploré en France par les équipes de Malecaze et de Plouet, et, aux États-Unis, par l’équipe d’Aiello qui ont montré l’augmentation des taux de VEGF dans différentes pathologies, et plus particulière-ment dans la rétinopathie diabétique (ἀg. 1), ce phénomène étant moins évident dans la DMLA [8, 9]. Les nombreux travaux qui ont montré que le blocage du VEGF entraînait une inhibition de la néovascularisation sont à l’origine de l’élaboration des stratégies anti-VEGF en ophtalmologie au cours des dernières années [10-12].


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s t RAtég Ies Ant I-veg F

La DMLA, l’œdème maculaire et la néovascularisation prérétinienne sont les prin-cipales indications des anti-VEGF. L’administration par voie intraveineuse est possi-ble, mais la voie intravitréenne est le plus souvent employée. Cette dernière est aujourd’hui effectuée en routine en injections mensuelles. Les thérapeutiques ayant déjà obtenu leur AMM ou encore à l’étude ciblent les ARN qui vont coder pour le VEGF, le VEGF lui-même, ses récepteurs ou la voie d’activation de la tyrosine kinase [13].

Les médicaments actuellement approuvés en ophtalmologie sont le pegaptanib sodique et le ranibizumab. Ce dernier est un fragment du bévacizumab qui serait doté d’une pénétration oculaire et d’une afἀnité améliorée. Les essais cliniques ont principalement montré une diminution de la diffusion et, donc, une réduction de l’œdème maculaire. Surtout, le traitement par le ranibizumab stabilise l’acuité visuelle et permet même une amélioration chez à peu près un tiers des malades. Incontestablement, ce traitement a représenté une évolution thérapeutique majeure

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OAVCR : occlusion active de la veine centrale de la rétine ; RDP : rétinopathie diabétique périphérique.

Figure 1. Augmentation des taux de VEGF intravitréen au cours de la rétinopathie diabétique humaine. (Reproduit avec l’aimable autorisation d’Aiello, et al. [9]).


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veg F tRA p : BLo CAge sé Le Ct IF ou non sé Le Ct IF ?

Le VEGF Trap est un récepteur soluble du VEGF actuellement en phase 3 de son développement. Non spéciἀque, il lie toutes les formes du VEGF et serait, in vitro, 140 fois plus efἀcace que le ranibizumab. Son principal intérêt est de permettre un espacement considérable des doses.

La question du choix du blocage sélectif versus non sélectif du VEGF a été large-ment débattue, notamment en regard des fonctions physiologiques importantes du facteur angiogénique. Les études expérimentales ont montré que si le blocage du seul

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Injection simulée, 1 injection/mois (n = 238)Ranibizumab 0,5 mg, 1 injection/mois (n = 240)

PDT. 1 injection tous les 3 mois si nécessaire (n = 143)

Ranibizumab 0,5 mg, 1 injection/mois (n = 139)

*p < 0,01

*p < 0,01

12

Figure 2. Stabilisation et amélioration de l’acuité visuelle avec le ranibizumab dans la DMLA. (Repro-duit avec l’aimable autorisation de Rosenfeld, et al. [14]).

en permettant une stabilisation ou une amélioration de l’acuité visuelle chez 90 % des patients dans une indication où les ophtalmologistes étaient jusqu’alors relative-ment impuissants (ἀg. 2) [14].

La tolérance du ranibizumab paraît bonne, même si le risque d’accident vasculaire cérébral n’est pas totalement nul.


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VEGF-165 reste sans effet sur la vascularisation physiologique, le blocage global par le ranibizumab en pourrait revanche être associé à des effets indésirables sur la vascularisation [15, 16]. Le pegaptanib est un aptamère spéciἀque à haute afἀnité pour le VEGF-165 qui a été approuvé en ophtalmologie. Son efἀcacité a été démon-trée vis-à-vis de l’absence de traitement avec un bénéἀce en termes d’acuité visuelle. Cependant, ce traitement ne permet qu’un ralentissement de la perte visuelle alors que le blocage pan-VEGF stoppe la perte visuelle, voire améliore l’acuité visuelle. Le pegaptanib n’a, par conséquent, pas eu le succès de l’approche pan-VEGF en ophtal-mologie. Cela pourrait s’expliquer par l’effet anti-œdémateux du ranibizumab.

Un article très récent, paru dans Cancer Research, fait état d’une forme de VEGF-165, le 165 b, qui serait anti-angiogénique. Le blocage du VEGF-165 pourrait donc avoir un double effet, pro-angiogénique et anti-angiogénique simultanément, et son ciblage souffrirait ἀnalement d’un manque de spéciἀcité [17, 18].

Aut Res st RAtég Ies Ant I-Ang Iogén Iq ues

Différentes stratégies anti-angiogéniques sont en cours d’élaboration. Des essais cliniques évaluent les inhibiteurs de la tyrosine kinase. Une forme topique d’un anta-goniste du VEGF, un Src kinase, a fait l’objet d’investigations, mais il s’est avéré être à l’origine de lésions de la cornée qui semblent en limiter beaucoup l’intérêt, sauf à améliorer la pharmacocinétique.

L’ophtalmologie a été l’une des premières disciplines à utiliser les ARN interfé-rents. Des essais ont montré un bénéἀce par rapport à l’absence de traitement, mais celui-ci restait modéré en regard de ce qui est obtenu avec les anti-VEGF.

Une phase 3 actuellement en cours évalue leur intérêt dans une approche de stabili-sation, en relais des anti-angiogéniques. Les ARN interférents sont toutefois contro-versés. Il semble qu’ils entraînent une inhibition non spéciἀque de la néovascularisa-tion par l’intermédiaire de la voie Toll R3. Les récepteurs Toll R3 sont présents dans les cellules de l’épithélium pigmentaire et leur activation par les ARN interférents pourrait être associée à une mort cellulaire. Les ARN interférents pourraient ainsi avoir des effets non spéciἀques sur l’épithélium pigmentaire.

Aut Res v o Ies t Hé RApeut Iq ues et Aut Res mod ALItés de t RAItement

Des approches alternatives sont actuellement envisagées comme, par exemple, la thérapie génique par l’AdPEDF (adénovecteur porteur du gène du PEDF). Des études chez l’animal ont montré que l’expression accrue de PEDF dans l’œil pourrait empêcher l’angiogenèse.

Il a également été envisagé d’utiliser des traitements combinés. Ainsi Friedlander, du Scripps Research Institute, a proposé d’attaquer le processus angiogénique sur


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trois niveaux simultanément. Il préconise d’intervenir sur le déclenchement du processus de néo-angiogenèse à l’aide d’un aptamère anti-VEGF, de faire appel aux intégrines αvß3 et αvß5 pour s’opposer à la prolifération des néovaisseaux et, enἀn, d’utiliser un facteur soluble, le T2-TrpRS, inhibant la maturation des néovaisseaux.

Con CLus Ion

L’utilisation des anti-angiogéniques est aujourd’hui entrée en pratique courante en ophtalmologie, ce qui représente une avancée majeure. Chaque jour, des centaines de patients reçoivent une injection d’anti-VEGF. Il demeure que ces traitements sont coûteux, longs et que nous en ignorons les conséquences à long terme. De plus, les formes atrophiques restent incurables et nous plaçons de grands espoirs dans les essais cliniques actuellement en cours et dans la mise au point de la prévention des complications de la maladie.

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Les vaisseaux tumoraux : une cible thérapeutique majeure

Gérard Tobelem

u n v Is Ionn AIRe, un Con Cept

L’angiogenèse, c’est-à-dire la croissance des vaisseaux, est un processus essentiel du développement embryonnaire et de la réparation tissulaire. Un déséquilibre de ce processus est observé dans de nombreuses pathologies, dans les cancers tout d’abord mais aussi au cours de pathologies inḀammatoires, ischémiques, infectieuses et immunologiques.

L’angiogenèse moderne commence en 1971 avec Judah Folkman qui va consacrer toute sa vie, jusqu’à sa mort récente le 14 janvier 2008, aux recherches sur l’angio-genèse. Ce chirurgien de formation, professeur à Harvard et directeur du Programme de biologie vasculaire au Children’s Hospital de Boston, va affronter pendant de très nombreuses années le scepticisme de la communauté médicale et scientiἀque tant son hypothèse de 1971 est avant-gardiste [1]. Il faut reconnaître qu’il s’agissait alors d’une simple hypothèse résultant davantage d’une vision que de travaux solidement étayés. La vision de Folkman : un rêve pour l’époque !

Un tissu cancéreux est un tissu comme un autre qui a besoin de nutriments et d’oxygène véhiculés par les vaisseaux sanguins pour croître, se multiplier et essai-mer. C’est sur ce constat qu’a émergé la notion d’« angiogenèse dépendance » des tumeurs. Accompagnant la progression tumorale d’un stade dormant vers un stade invasif de croissance et de dissémination métastatique, les vaisseaux subiraient un changement phénotypique, le fameux « switch angiogénique ». Dès lors, inhi-ber l’angiogenèse apparaît très naturellement, en tout cas pour Folkman le vision-naire, comme une nouvelle stratégie thérapeutique anticancéreuse qui consiste tout simplement à affamer le cancer en le privant de sa vascularisation. Ainsi naît, avec ce pionnier, le premier concept de thérapeutiques ciblées dans le cancer, une straté-gie qui aujourd’hui se développe formidablement. Si, pendant près de deux décen-nies, l’angiogenèse n’intéresse qu’un petit nombre d’initiés, il n’en est plus de même aujourd’hui avec l’approche anti-angiogénique des cancers qui est entrée dans la pratique thérapeutique quotidienne des cancérologues, des ophtalmologistes et bien-tôt d’autres spécialistes.


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Quatre ans avant sa mort brutale (très probable un accident coronaire ischémique), Folkman a pu voir avec satisfaction que son rêve était devenu réalité. Les vaisseaux tumoraux sont aujourd’hui une cible majeure dans le traitement des cancers. Les indications se multiplient dans les cancers colorectaux, du sein, du poumon et du rein. De même, les molécules enregistrées se multiplient et de très nombreuses autres sont en phase de développement préclinique et clinique. Ce domaine est devenu un domaine clé pour l’industrie pharmaceutique et biotechnologique. Le nombre d’équipes académiques travaillant sur les mécanismes moléculaires et cellulaires de l’angiogenèse est aujourd’hui légion. Cette mobilisation est à la hauteur des enjeux, tant de questions persistent sur le plan de la recherche fondamentale comme sur le plan thérapeutique. Les cibles s’afἀnent et les approches anti-angiogéniques sont de plus en plus complexes. Une meilleure compréhension des caractéristiques des vaisseaux tumoraux est aujourd’hui à l’origine d’une recherche translationnelle très prometteuse.

q ue LLes sont Les CARACté RIst Iq ues des néo vAIsse Aux tumo RAux ?

Désorganisés, de distribution anarchique, perméables et fragiles, les néovaisseaux tumoraux sont profondément anormaux. Leur survie est sous la dépendance d’une présence continue de VEGF (facteur de croissance angiogénique) qui est à l’origine de leur prolifération et de l’augmentation de perméabilité. Leur couverture péricy-taire est plus faible. Il en résulte une augmentation de pression interstitielle intratu-morale ce qui, d’une part, favorise l’essaimage de cellules tumorales vers le courant sanguin ou lymphatique, c’est-à-dire les métastases, et, d’autre part, défavorise l’ac-cès des chimiothérapies vers les cellules tumorales. L’hypoxie, qui est présente au sein de la tumeur, induit davantage d’instabilité génétique et sélectionne les cellu-les tumorales les plus malignes. Ainsi, les vaisseaux tumoraux sont profondément anormaux en termes de phénotype, de marqueurs et d’hémodynamique. Ils sont le siège d’un remodelage important. Ils sont certes augmentés en nombre, la densité capillaire est effectivement accrue dans la plupart des cancers, mais ils sont surtout qualitativement différents des vaisseaux normaux. Nous l’avons montré [2, 3] dans un modèle d’hépatocarcinome murin, d’autres équipes également [4]. En résumé, on peut dire que les vaisseaux tumoraux expriment de façon très importante une spéci-ἀcation artérielle, les cellules endothéliales angiogéniques sont en effet Notch 4, Dll4 et éphrine B2 positives, autant de marqueurs normalement présents (et à un moindre degré) seulement sur les cellules endothéliales artérielles. Le remodelage vasculaire est ἀnalement la résultante de l’hyperstimulation par le VEGF, facteur d’autant plus exprimé que l’hypoxie au sein de la tumeur est forte. Il y a donc une cascade que nous avons pu préciser sur notre modèle d’hépatocarcinome murin mais

Gérard Tobelem

96

aussi in vitro sur des cultures de cellules endothéliales : VEGF → Notch 4 → Dll4 → éphrine B2. Ce remodelage induit des modiἀcations du Ḁux sanguin. Nous avons pu ainsi montrer par écho-Doppler, dans ce modèle, qu’une augmentation de la vitesse du Ḁux de l’artère hépatique précédait la diffusion du carcinome [5]. Au total, ces modiἀcations phénotypiques, ces changements d’expression de marqueurs molécu-laires et ces perturbations hémodynamiques traduisent le profond remodelage vascu-laire survenant dans la vasculature tumorale.

q ue Ls sont Les AppRo CHes t Hé RApeut Iq ues Ant I-Ang Iogén Iq ues ?

Ces approches sont aujourd’hui de trois types. On peut inhiber la croissance des néovaisseaux tumoraux, les détruire ou, et c’est une troisième approche émergente, les rendre encore plus anormaux. La première stratégie fait appel aux anti-angiogéni-ques proprement dits [6, 7] et la deuxième à une classe de produits appelés vascular disrupting agents (VDA) [8]. Ces deux groupes diffèrent par leur cible, leur méca-nisme d’action et peut-être par leurs indications et leurs schémas d’administration. La troisième approche, la plus récente, consiste à bloquer Dll4 [9-12].

Les anti-angiogéniques auront pour cible principale le VEGF et/ou ses récepteurs compte tenu du rôle majeur de ce facteur de croissance dans le remodelage vascu-laire. Ils sont maintenant mieux connus, certains d’entre eux sont de plus en plus présents dans la pratique quotidienne des cancérologues. Il est vrai qu’en accord avec la théorie initiale de Folkman, on attendait des anti-angiogéniques qu’ils inhibent la croissance des néovaisseaux tumoraux, voire qu’ils détruisent les néovaisseaux exis-tants. La dépendance des cellules endothéliales vis-à-vis du VEGF pour leur survie renforçait cette attente. D’un autre côté, l’augmentation d’hypoxie qui en devait en résulter aurait pu rendre encore plus difἀcile l’accès des chimiothérapies au sein de la tumeur. Or, il n’en a rien été. D’une part, les anti-VEGF stricts, le bévacuzimab par exemple, ne semblent pas efἀcaces en monothérapie vis-à-vis de la tumeur et, d’autre part, leur association avec les chimiothérapies potentialise l’efἀcacité de ces dernières. En fait, l’effet de ces anti-angiogéniques et notamment des anti-VEGF est certes d’inhiber la croissance des néovaisseaux tumoraux mais aussi, et ceci était plus inattendu, de normaliser la vasculature tumorale. Il s’agit d’un concept mis au point par Jain [13, 14] et conἀrmé par d’autres équipes, dont la nôtre. La privation de VEGF induite par un anticorps, un composé piège ou un inhibiteur de ses récepteurs induit une réversion du phénotype artériel anormal des cellules endothéliales angio-géniques. Il en résulte une normalisation hémodynamique, une meilleure oxygéna-tion des cellules tumorales et, donc, de plus grandes accessibilité et sensibilité aux traitements anticancéreux classiques (chimiothérapie ou radiothérapie). Si le produit anti-angiogénique n’a pour cible exclusive que le VEGF (c’est le cas par exemple du bévacizumab), son utilisation en monothérapie sera peu efἀcace car seule la combi-


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naison avec une chimiothérapie et/ou une autre thérapeutique ciblée pourra avoir une activité antitumorale signiἀcative. Par ailleurs, tant que persistent des cellules tumorales, il paraît logique de poursuivre cette stratégie thérapeutique pour enrayer toute nouvelle reprise d’activité angiogénique.

Les VDA, deuxième classe d’anti-angiogéniques, sont encore en cours de mise au point. Ils sont donc moins bien connus. Ce groupe comprend deux types de molécules :

d’une part les agents de liaison à la tubuline (sur le site de ἀxation de la colchicine –à la sous-unité β de la tubuline), qui dépolymérisent les microtubules et désorgani-sent ainsi le cytosquelette de la cellule endothéliale ; ils agissent également sur la VE-cadhérine en interférant avec les contacts cellule endothéliale-cellule endothé-liale, la molécule type de cette catégorie étant la combrestatine phosphate A4 ;

d’autre part les analogues de Ḁavonoïdes, qui induisent des lésions apoptotiques de –la cellule endothéliale, la molécule type étant le DMXAA (5,6-dimethylxanthenone-4-acetic acid).

Les VDA détruisent donc les vaisseaux tumoraux établis en ciblant les cellules endothéliales immatures et les péricytes de ces vaisseaux. En effet, les cellules endo-théliales sont hautement dépendantes de leur cytosquelette de tubuline pour leurs mobilité, invasion, attachement, alignement et prolifération. Les VDA vont donc induire une rupture du cytosquelette et des liaisons cellule-cellule. Il en résulte une désorganisation destructrice, un véritable collapsus des néovaisseaux, plus d’hypoxie et donc de nécrose tissulaire en aval des vaisseaux détruits. Mais si cette cytotoxicité se manifeste au centre de la tumeur, il semble persister en périphérie une vérita-ble couronne de cellules tumorales viables dont le support nutritionnel est assuré par diffusion passive à partir des vaisseaux normaux adjacents. Cette couronne peut représenter un contingent important de cellules cancéreuses susceptibles de repartir en croissance. En principe, les cellules endothéliales activées sont plus sensibles aux VDA mais les premières études cliniques semblent montrer qu’un endothélium vasculaire normal peut également être affecté. Il en résulte des effets secondaires cardiaques et neurologiques signiἀcatifs. Il faut donc attendre les résultats des études de phase 2 en cours pour savoir si le rapport bénéἀce/risque est favorable.

La troisième approche est encore plus récente. Le Dll4 induit par le VEGF se ἀxe à Notch et est en retour un régulateur négatif du VEGF limitant ainsi l’hyper- angiogenèse anormale qui résulte de l’hyperexpression de VEGF. Son inhibition produit un effet paradoxal d’augmentation de la néoangiogenèse et de réduction de la masse tumorale. En fait, bloquer Dll4 revient à laisser s’emballer la voie du VEGF, ce qui augmente le nombre de néovaisseaux mais aussi leurs anomalies. Le résultat est donc plus de néovaisseaux non fonctionnels sans Ḁux sanguin directionnel et, en conséquence, plus d’hypoxie tumorale. L’inhibition de Dll4 crée plus d’« anorma-lisation » vasculaire au sein de la tumeur et l’angiogenèse imparfaite ainsi induite

Gérard Tobelem

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s’accompagne d’une régression tumorale. Cette approche in vitro et in vivo chez l’animal semble très prometteuse et complémentaire des autres stratégies, notam-ment en cas de résistance au blocage de VEGF. Ainsi, l’utilisation d’anticorps anti-Dll4 ou de Dll4 soluble (le Dll4 soluble encombre le récepteur Notch sans déclencher la cascade de signalisation et empêche le Dll4 endogène d’y accéder) a montré une activité antitumorale solide sur de nombreux modèles.

FAut -IL ALo Rs no RmALIse R, dét Ru IRe ou « Ano RmALIse R » Les vAIsse Aux tumo RAux ?

Actuellement, seuls les anti-angiogéniques (et notamment l’inhibition du VEGF) ont fait la preuve de leur efἀcacité dans plusieurs indications. La mise au point clinique des VDA n’est pas encore achevée et on ne peut donc pas sans risque parier sur leur avenir en tant que médicaments. Quant aux bloqueurs de Dll4, la question se pose de savoir quel sera leur proἀl de tolérance avant de vériἀer si la preuve du concept physiopathologique se conἀrme chez des malades cancéreux.

La stratégie anti-angiogénique aujourd’hui s’impose, même si de nombreuses questions demeurent sans réponses sur les produits de cette classe thérapeutique : quelle dose, quelles combinaisons, quel régime d’administration, quelle durée de traitement, quels marqueurs d’efἀcacité ou de résistance primaire ou acquise, quels effets au long cours ? Il reste encore beaucoup à établir ou à démontrer. Parmi ces questions, celle sur le régime d’administration est cruciale. Si l’on suit le concept élaboré par Jain sur la fenêtre de normalisation, une autre séquence d’administra-tion que celle qui consiste à donner anti-angiogénique et chimiothérapie en même temps serait-elle plus efἀcace ? Ne faudrait-il pas, en effet, d’abord normaliser les vaisseaux tumoraux par une administration première de l’anti-VEGF puis, dans un délai à déterminer (12 heures, 24 heures, 48 heures ?), administrer dans un deuxième temps la chimiothérapie de référence ? Une autre question cruciale est celle de l’im-portance du bénéἀce réel apporté aux malades. L’impact est encore faible mais le palliatif d’aujourd’hui n’est-il pas un investissement pour le curatif de demain ?

En fait, des interrogations de même nature se posent pour les VDA. D’après les études précliniques et les premières phases cliniques, il paraît peu probable que les VDA soient actifs en monothérapie. La persistance de la couronne tumorale viable en est vraisemblablement responsable. Dès à présent, l’option d’une combinaison avec la chimiothérapie (peut-être d’ailleurs à faible dose, de type métronomique) est donc prise. Des premiers résultats de phase 2 sont encourageants. Mais, là encore, se pose la question du régime : les deux traitements en même temps ou décalés ? Une autre option pourrait associer VDA et anti-angiogéniques. En effet, l’introduc-tion d’un anti-angiogénique après un VDA a du sens pour compléter l’inhibition de croissance et pour maintenir les cellules tumorales viables restantes en phase de dormance puisque privées de néo-angiogenèse.


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Et ἀnalement, à la question : « Normaliser, détruire ou “anormaliser” ? », c’est peut-être la réponse : « Les trois ! », mais pas forcément en même temps, qui sera la bonne combinaison de stratégies pour franchir un pas supplémentaire vers plus de survies. Et pour donner plus de vie au rêve de Folkman !

Bibliographie

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ration of immature vessels and results in poor perfusion. Blood 2007 ; 109 : 4753-60.12 Sainson RCA, Harris AL. Anti-Dll4 therapy: can we block tumour growth by increasing angio-

genesis? Trends Mol Med 2007 ; 13 : 390-5.13 Duda D, Jain RK, Willett CG. Anti-angiogenics: the potential role of integrating this novel treat-

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Limites et complications des traitements anti-angiogéniques

Jean-Jacques Mourad

Les médicaments anti-angiogéniques (bévacizumab, sunitinib, sorafénib) sont de plus en plus utilisés dans le traitement des cancers avancés du côlon, du sein, du poumon, du foie et du rein. Leur mécanisme d’action passe par l’inhibition d’un facteur pro-angiogénique, le VEGF (vascular endothelial growth factor). Les effets secondaires de cette inhibition sont assez mal connus des médecins.

u n Rô Le Impo Rt Ant d Ans Le m AInt Ien de L’Homéost As Ie mICRo CIRCu LAt o IRe

L’absence de VEGF est létale ou provoque des anomalies majeures durant l’embryo-genèse et le développement. Chez l’adulte, en revanche, ce facteur était réputé n’in-tervenir que dans le cycle menstruel, la cicatrisation et la croissance des cheveux. On pouvait donc penser qu’un anti-VEGF agirait essentiellement sur les circulations à gros renouvellement (turnover), la circulation tumorale notamment (ἀg. 1) [1].

ÂgeEmbryogenèse/

développement postnatal Âge adulte Pathogenèse à l’âge adulte

Vasculogenèse

Angiogenèse Formationdu système

hyaloïde

Formationdu plexuschoroïde

Absencede VEGF

Inhibitionpartielledu VEGF

Inhibitionpartielle du VEGF

Létale Inhibitiondela formation

du plexuschoroïde(in vitro)

Absence decouchechorio-

capillaire

Maintien de l’homéostasie vasculaire

CœurTrachée Cerveau Poumons

Reins

Yeux

Inhibitiondu VEGF

Inhibitiondu VEGF

Diminuele réseaucapillairemuqueux

Perte de cellules

alvéolaires

Élargissementde l’espace

aérienpulmonaire

Angiogenèse

Cycle de lareproduction Croissance

descheveux

Cicatrisation

Angiogenèse

Tumeurs Œdèmemaculaire

DMLAnéovasculaire

Rétinopathiesprolifératives

Inhibitiondu VEGF

Prolongationde la survie

Inhibitiondu VEGF

Inhibitiondu VEGF

Stabi-lisation

de lavision

Réduitl’épaissis-

sementmaculaire

Réductionde la NVC

Stabiliseou

améliorela vision

VEGF+

VEGF–

Dévelop-pementanormal

des poumons et des vaisseaux

pulmonaires

DMLA : dégénérescence maculaire liée à l’âge ; NVC : néovascularisation choroïdienne

Figure 1. VEGF : un rôle clé dans l’homéostasie vasculaire. (Reproduit avec l’autorisation de Bhisitkul [1]).


101

Pourtant, les essais cliniques et la pharmacovigilance ont permis de mettre rapide-ment en évidence des complications spéciἀques à ces traitements. Le VEGF joue un rôle important dans le maintien de l’homéostasie circulatoire, en particulier à l’éche-lon microcirculatoire, et son inhibition entraîne une diminution de la densité capil-laire plus ou moins importante selon le tissu auquel on s’intéresse [2]. La régression capillaire est ainsi signiἀcative au niveau du pancréas, de la thyroïde, des surrénales, de l’hypophyse, du plexus choroïde et des villosités intestinales. L’importance de la régression est dose dépendante et atteint 68 % au niveau de la thyroïde [2].

In HIBIt Ion du veg F et p Ro té Inu RIe

Produit par les podocytes, le VEGF est un puissant modulateur de la perméabilité capillaire agissant par l’induction de la fenestration des capillaires glomérulaires. Son inhibition est associée à une perte des fenestrations faisant le lit de dysfonc-tions glomérulaires avec, en particulier, l’apparition de protéinuries [2] (ἀg. 2). Cette complication, fréquemment associée à la prise d’un anti-VEGF, est dose dépendante et habituellement réversible à l’arrêt du traitement.

A BTémoin Ad-sVEGFR-1 14d

Capillaires glomérulaires

sVEGR : récepteur soluble du VEGF.

Figure 2. Perte des fenestrations capillaires associée à l’inhibition du VEGF. (Reproduit avec l’autori-sation de Kamba, et al. [2]).

In HIBIt Ion du veg F et RIsq ue Hype Rtens IF

La complication la plus fréquemment associée au traitement anti-angiogénique est l’hypertension artérielle (HTA). Selon une revue récente de la littérature médicale, elle est présente chez un quart des patients recevant du bévacizumab avec un risque relatif variant entre 4 et 7 vis-à-vis des témoins [3]. Il faut toutefois préciser que les essais thérapeutiques utilisent les critères usuels de la classiἀcation NCI-CTCAE (common terminology criteria for adverse events of the National Cancer Institute) qui ne reprennent aucune des recommandations internationales de diagnostic et de prise en charge de l’HTA.

Jean-Jacques Mourad

102

Les premiers essais qui ont étudié le risque hypertensif associé au bévacizumab ont montré un effet dose-effet toxique. Il est présent quelles que soient les modalités de l’in-hibition du VEGF et il a également été démontré avec le sorafénib [3]. Des tableaux clini-ques associés à l’HTA, comme la leuco-encéphalopathie postérieure réversible associée à une HTA sévère, ont été rapportés, mais ils restent heureusement exceptionnels [4-8].

mé CAn Ismes de L’AppARIt Ion d’une H t A se Cond AIRe Au t RAItement Ant I-Ang Iogén Iq ue

Les mécanismes physiopathologiques explicatifs ont été peu étudiés. Ce n’est qu’en 2006 qu’a été publié un premier article s’interrogeant sur les raisons de la surve-nue d’une hypertension chez les patients qui reçoivent des anti-angiogéniques. Ses auteurs émettaient l’hypothèse que des modiἀcations hormonales étaient en cause, mais ne sont pas parvenus à le démontrer [9].

En réalité, on sait que les résistances périphériques jouent un rôle central dans le mécanisme de l’hypertension et que celles-ci sont pour l’essentiel localisées dans la microcirculation. Il a ainsi été démontré que des phénomènes de raréfaction artério-capillaire interviennent de façon décisive dans l’installation d’une HTA et qu’ils appa-raissent à des stades extrêmement précoces de l’histoire naturelle des hypertendus.

Avec le Pr Bernard Lévy du Laboratoire d’imagerie de Lariboisière, nous avons lancé une étude en vue de déceler une éventuelle association entre la survenue d’une HTA et un phénomène de raréfaction capillaire chez les patients qui reçoivent un traitement anti-angiogénique. Après 6 mois de traitement par le bévacizumab, une élévation des chiffres tensionnels a été observée chez tous les patients inclus (n = 18). Surtout, leur exploration à l’aide d’une technique de vidéocapillaroscopie pleine peau au niveau du doigt a montré une diminution dose-dépendante de la densité capillaire (tableau 1 et ἀg. 3) [10, 11]. Nos observations ont été confortées par une étude abou-tissant aux mêmes résultats avec un inhibiteur de la tyrosine kinase, le télatinib [12].

Dans cette même étude, l’utilisation du laser-Doppler nous a également permis d’établir l’existence d’une dysfonction endothéliale majeure avec inhibition totale de la vasodilatation induite par la pilocarpine associée à la prise de bévacizumab [11].

t ableau 1. Évolution de la densité capillaire de la peau du dos des doigts avec le bévacizumab (d’après Mourad, et al. [11]).

n = 18 Ligne de base 6 mois p (test de s tudent)

PAS (mmHg) 129 ± 13 145 ± 17 0,0001

PAD (mmHg) 75 ± 7 82 ± 7 0,0001

Densité capillaire initiale 84 ± 13 75 ± 12 0,0001

Densité capillaire maximale 90 ± 13 81 ± 11 0,0001

PAS : pression artérielle systolique ; PAD : pression artérielle diastolique.


103

Hype Rtens Ion : FACteu R pRéd ICt IF de L’ACt Iv Ité du t RAItement Ant I-Ang Iogén Iq ue

Un travail présenté à l’American Society of Clinical Oncology (ASCO) de 2005 a cependant apporté de nouveaux éléments susceptibles d’attirer l’attention des cancérologues sur la question de l’hypertension associée à la prise d’anti-angio- géniques : il montrait que la survie de patients recevant du bévacizumab et de la gemcitabine en traitement d’un cancer du pancréas était corrélée de manière signiἀ-cative à l’élévation précoce des chiffres tensionnels (p = 0,007) [13]. L’HTA apparaît ainsi comme un marqueur précoce d’activité et d’efἀcacité antitumorale du bévaci-zumab (tableau 2).

25

20

15

10

5

0

R2 = 0,43 p = 0,008

0 1000

Dose cumulée de bévacizumab

Réd

uct

ion

de

la d

ensi

té c

apill

aire

ob

serv

ée à

6 m

ois

(n

bre

de

cap

/mm

2 )

2000 3000 4000 5000

Figure 3. Effet dose-dépendant du bévacizumab sur la réduction de la densité capillaire cutanée. (Reproduit avec l’aimable autorisation de Mourad, et al. [11]).

t ableau 2. Taux de survie en fonction de la survenue d’une HTA précoce (d’après Friberg, et al. [13]).

Cohortes n s urvie (mois) IC à 95 %

Sans HTA 40 8,7 7,3-9,7

HTA précoce 6 13,7 9,6-inἀni

Tous patients admissibles 46 9,0 7,7-10,5

Jean-Jacques Mourad

104

Le Pr Olivier Rixe a également publié, en 2007, une étude montrant que l’appari-tion d’une HTA était signiἀcativement associée à une meilleure réponse au sunitinib chez des patients atteints d’un cancer du rein métastatique. L’apparition d’une HTA de grade 3 selon la classiἀcation NCI-CTCAE chez 22 % des patients était associée à une meilleure réponse au traitement anti-angiogénique [14]. Enἀn, ces résultats viennent d’être conἀrmés par une étude incluant des patients traités par le béva-cizumab, souffrant de cancer du côlon métastatique. Un tiers des patients environ présentait une HTA. Or, des taux de réponses de 75 % et une médiane de survie de 13,7 mois ont été obtenus chez les patients hypertendus contre respectivement 32 % et 8,7 mois chez les normotendus [15].

v e Rs des Re Comm And At Ions

La question d’un risque accru d’hypertension iatrogène est-elle réellement cruciale quand le traitement en cause permet un gain d’espérance de vie ? Dans les faits, les cancérologues ne s’en sont vraiment préoccupés qu’à partir du moment où la Food and Drug Administration (FDA) a interdit l’utilisation du bévacizumab en cas d’HTA ou de protéinurie importante.

Cette décision a cependant pu avoir des répercussions signiἀcatives sur la mise en œuvre des traitements, une hypertension artérielle et/ou une protéinurie pouvant retarder l’administration du traitement anti-angiogénique.

Pour cette raison, des recommandations pour la prise en charge de l’hyperten-sion artérielle et de la protéinurie chez les patients devant recevoir des anti-VEGF viennent d’être élaborées par différentes sociétés savantes (Société de Néphrologie, Société Française d’Hypertension Artérielle, Association Pédagogique Nationale des Enseignants de Thérapeutique et Fédération Francophone de Cancérologie Diges-tive). L’essentiel de ces recommandations peut être résumé en quatre points [16] :

il n’y a pas lieu de retarder l’administration d’une première dose d’un traitement –anti-angiogénique en raison de l’existence d’une HTA observée en ambulatoire ou de chiffres de pression artérielle élevés constatés en hôpital de jour (hors urgence hypertensive, exceptionnelle) ou d’une protéinurie (hors protéinurie massive, exceptionnelle) ;

un patient devant recevoir une première administration d’un traitement anti-angio- –génique doit en bénéἀcier dans l’immense majorité des cas, quelle que soit sa pres-sion artérielle le jour où il est admis pour recevoir ce traitement ;

il n’y a pas lieu d’administrer un traitement antihypertenseur oral ou par voie –veineuse avant administration d’un traitement anti-angiogénique, même si les chif-fres de pression artérielle mesurés à cette occasion sont élevés ;

le patient devant recevoir une première administration d’un traitement anti-angio- –génique n’a pas de raison particulière de présenter une urgence hypertensive, excep-tionnelle. Celle-ci, si elle existe, doit être prise en charge par une équipe spécialisée.


105

Fondamentalement, l’objectif est d’éviter qu’une chimiothérapie planiἀée soit reportée au prétexte qu’une pression artérielle systolique est jugée trop élevée alors que ces patients seront probablement de bons répondeurs. La mesure de la pression artérielle est fréquemment effectuée sur le site de la chimiothérapie, c’est-à-dire dans des conditions non satisfaisantes, et il est préférable que les patients puissent bénéἀ-cier d’une mesure au domicile. Nous tentons actuellement de promouvoir l’autome-sure tensionnelle au domicile, sans le stress de l’hôpital de jour en cancérologie.

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Angiogenesis and anti-angiogenesisAngiogenèse et anti-angiogenèse© 2009 Wolters Kluwer Health. All rights reserved

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Introduction

Pierre Godeau

The concept of angiogenesis and anti-angiogenesis is probably one of the most important advances in our assessment of physiopathological processes and also an example of progress in our understanding of physiological development. It is for this reason that the decision was made nearly 4 years ago to devote one of the Institut Servier meetings to this topic, particularly as it covers the majority of medical disci-plines and can be considered as what is nowadays known as a transversal theme.

Although the potential use of an anti-angiogenic treatment for cancer was ἀrst mentioned by Folkman nearly 37 years ago (1971), it is in the last 5 years that thera-peutic trials in two opposing domains have multiplied:

use of pro-angiogenic medications in ischemic disease, mainly critical lower-limb –ischemia and coronary disease, with the as yet unconἀrmed hope of blocking the process of restenosis after angioplasty and/or stent implantation;

use of anti-angiogenic therapies in the treatment of cancer, with three drugs –currently available: bevacizumab (Avastin ®), sorafenib, imitinib). Particularly in metastatic renal cancer, the achievements are unquestionable, with successful albeit less spectacular results in colorectal cancer, non-small cell lung cancer, and hepato-cellular carcinoma. Although the activity of anti-angiogenic agents in monotherapy is not to be discounted, it proves most interesting when coupled with chemotherapy.

The mechanism of angiogenesis is as follows: it functions just as well in disease situations as in healthy adults by awakening quiescent endothelial cells, thus promo-ting neovascularisation. An example is that of extended muscular exercise where local hypoxia, resulting from an increase in local oxygen consumption, is compen-sated by capillarogenesis.

VEGF (vascular endothelial growth factor) performs as well in physiology, as an embryonic and postnatal vascular growth factor, as it does in different pathologies, especially in the development of tumor angiogenesis. The VEGF system is how ever complex, and comprises several isoforms and at least two receptors, including a soluble receptor which plays an inhibitory stabilising role. In addition, the VEGF system is dependent on a transcriptional hypoxia-inducible factor, HIF1. The VEGF receptors have a tyrosine kinase activity, a feature which foresees additional possibi-lities for pathophysiological and therapeutic research. The link between VEGF and

Pierre Godeau

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plasminogen activators is also an important feature: the possible interaction with thrombotic phenomena must not be ignored.

Within the ἀeld of neovascularisation, the processes of angiogenesis, arteriogene-sis, and vasculogenesis should not be put on the same level [1]. Lastly, angiogenesis is not independent of lymphogenesis or neurogenesis.

Although anti-angiogenic therapy is generally well tolerated, and notably devoid of myelotoxicity, it is nevertheless associated with cardiovascular and renal side effects (arterial hypertension, proteinuria), related at least in part to the reduced nitrogen monoxide production observed during anti-VEGF treatment, and potentially serious side effects are known to occur in coronary patients or those with peripheral arterial disease. On the other hand, even though the neovascularisation inhibitor effects of anti-angiogenic agents appear promising and are currently being studied in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration, the potential risk of a counter effect from pro-angiogenic agents used in vascular ischemic disease in patients with one of these ocular diseases cannot be ignored. The non-permeability of the ocular environment in remotely or systemically administered treatments would however appear to provide protection from such effects although the downside of the positive results observed with anti-angiogenic agents is that they currently require intravitreal injection [2].

One major disadvantage of anti-angiogenic treatment remains: by inhibiting endo-thelial cells activated by VEGF and by respecting the normal endothelium, including quiescent cells, these agents are known to provide short-term efἀcacy against tumor growth, but can this effect be maintained over the long term? Numerous factors indi-cate that nothing is less certain: mutation of growth factor receptors rendering them insensitive to inhibitors, the survival strategy of tumor cells that escape treatment, and the intervention of other unidentiἀed tumor growth factors [3].

It is for this reason that, with our present level of knowledge, anti-angiogenic factors must not be left to “go it alone”, but rather be used in combination with and as a supplement to traditional treatments, namely chemotherapy and radiotherapy.

We hope that during the course of the day, which has largely been organised by Pierre Corvol, our still basic understanding of the vast domain of angiogenesis will beneἀt from an update and from reḀexion built on the perspectives of promising, though still insufἀciently validated, therapeutic advances.

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Tribute to Roger Luccioni

For the last 3 years Roger Luccioni had been helping to organise the Institut Servier Symposium on Angiogenesis and Anti-angiogenesis, and I would like to take this oppor-tunity to pay tribute to my friend of nearly 30 years who sadly passed away on 9th April 2008, a month before his 74th birthday. Cardiologist, Specialist and Head Physician at the CHU Nord in Marseille since 1979 and full Professor since 1981, he taught the classe exceptionnelle from 1997. Roger had a brilliant scientiἀc career, backed by almost 500 publications, earning the respect of his peers. He had the honour of holding the position of Vice Dean of the Faculty of Medicine in Marseille from 1997.

I will not dwell on his hospital and university career here, but would like to share with you some facets of Roger’s engaging personality. First, his sense of friendship and loyalty to his friends and alumni were in the purest Corsican tradition, where the spoken word is above suspicion and friendship is considered a sacred bond. During the many years I was privileged to chair the 53rd Section of the National University Board, our friendship deepened. I particularly appreciated Roger’s Ḁair for synthesis, his sound judgment and sense of fairness. He assessed our PU-PH applications [for University Professor & Hospital Consultant posts] with objectivity and benevolence, never subservient or petty-minded.

Roger’s second marked attribute was his devotion to his family. He and Anne-Marie d’Estienne d’Orves, mother of his two youngest daughters, Marie-Dominique and Julie (born in 1986 and 1987) formed an exemplary couple. The health problems they both suffered in turn, and which I witnessed as friend and medical adviser, were overcome with courage, optimism and determination which only a genuine bond can achieve.

But it is impossible for me not to mention Roger’s other sides which are likely to be less familiar to scientiἀc circles.

Roger was very keen on football. I remember one meeting of the Cardiology Society (or rather of the therapeutic subsidiary he chaired) which was held in Ajaccio on the day that Olympique de Marseille won the European Cup. Roger, who was in charge of this scientiἀc meeting, arranged for us to watch the match on TV. As Deputy Mayor of Marseille, he was duty bound to show support for the Marseille FC, but I found out while I was there that as a Junior player in 1950, he became champion of Provence and had remained a football fan ever since.

Actually, the most surprising aspect of Roger’s personality is his impressive musi-cal culture. Since his teens he was a well-known double-bass player on the Marseille

Pierre Godeau

112

jazz scene. In 1956 he founded the Jazz Hip review, and not only as a double-bass player but also as a composer, was involved in concerts, music circles and tours, producing several albums and composing ἀlm music. In 2006, despite his hectic lifestyle and already worrying state of health, Roger’s trio brought out a new album entitled Douces pluies, reḀecting his enduring passion for jazz.

In 2006, at a meeting of Marseille’s National Academy of Medicine, Mayor Jean-Claude Gaudin, who knew of our friendship, told me how much he admired what Roger was doing as Head of Culture for the city of Marseille, but also expressed concern about his state of health.

With the death of Roger Luccioni, the Institut Servier has lost one of its Scientiἀc Board’s most energetic and prestigious members. He was made Knight of the National Order of Merit for France, and was awarded several academic distinctions (Chevalier de l’ordre des Palmes académiques and Chevalier de l’ordre des Arts et Lettres). At last year’s meeting, he presented an outstandingly brilliant paper at the Functional Dependence Symposium, although sadly we were unaware that it was to be his last ofἀcial contribution to an Institut Servier event.

I would like to request a minute’s silence to mark our respect for our departed friend.

Professor Pierre Godeau


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Molecular bases of physiological and pathological angiogenesis

Pierre Corvol

BLOOD VESSEL FORMATION

Development of the vascular system during embryogenesis occurs in two distinct stages: vasculogenesis and angiogenesis. During vasculogenesis, progenitor cells differentiate into endothelial cells from mesenchymal cells, then assemble and form a primitive vascular network. Angiogenesis, which follows vasculogenesis, extends and reshapes the primitive network in order to establish a mature and functional circulatory system.

In healthy adults, angiogenesis occurs mainly during the ovarian cycle and preg-nancy. It also contributes to the development of collateral circulation during physical exercise, in which case it is referred to as arteriogenesis. In pathological conditions, angiogenesis is involved in tumor growth, in ocular disorders, such as age-related macular degeneration and diabetic retinopathy, in wound healing, and in inḀamma-tory diseases, such as rheumatoid arthritis or psoriasis [1].

NEW VESSEL CONSTRUCTION: VASCULOGENESIS

Vasculogenesis results in the formation of a primitive capillary plexus. Due to the action of VEGF (vascular endothelial growth factor), progenitor cells, called angiob-lasts, which are located in the stroma, give birth to endothelial cells. These endothe-lial cells organise to form primitive capillary tubes of a section usually made up of 3 cells. At this stage, the primitive capillary plexus is unable to react to variations in blood Ḁow.

For a long time researchers thought that the phase of vasculogenesis did not occur in the adult organism. In reality, progenitor cells, particularly those housed in bone marrow, can be activated by growth factors, cytokines or hormones which promote the proliferation, differentiation and mobilisation of cells in order to develop new vessels. This recently described process is at the root of new therapeutic regimens, known as pro-angiogenic regimens, which are used in cell-based therapies. They

Pierre Corvol

114

are currently being studied in the context of cardiology and could be used to restore ischemic vessels during myocardial infarction and lower limb arthritis [1].

VASCULAR REMODELLING OF THE PRIMITIVE CAPILLARY NETWORK: ANGIOGENESIS AND ARTERIOGENESIS

Angiogenesis and arteriogenesis together make up the phase of vascular remodelling of the primitive capillary network emerging from vasculogenesis.

This process is controlled by different factors which have been widely studied in medical literature; as such, they comprise different directions for the development of pro-angiogenic or anti-angiogenic treatments. Angiopoietine 1, PDGF (platelet derived growth factor), TGF-β (transforming growth factor β), and P1GF (placenta growth factor) are involved in the recruitment, migration, and organisation of mature vessels that will ultimately be capable of vasodilation or vasoconstriction in such a way as to regulate blood Ḁow. It is important to point out that the organisation of the vascular network is controlled by both genetic and hemodynamic parameters. Blood Ḁow participates actively in vessel formation and in the differentiation into arter-ies and veins. In this way, inḀuenced by the blood Ḁow traversing the vessels, the endothelial cells lead the surrounding mesenchymal cells to proliferate, migrate, and differentiate into perivascular cells, for capillaries, and into smooth muscular cells, for arteries and veins [1].

MECHANISM OF ACTION OF VEGF

It is impossible to mention VEGF without paying tribute to Jean Plouet who, with Napoleone Ferrara, discovered this growth factor in San Francisco in 1988. Sadly, Jean Plouet died in 2008 and his role in the discovery of VEGF is still poorly recog-nised outside the French medico-scientiἀc community.

VEGF plays a central role in angiogenesis. It is a cytokine with paracrine action, which means that the factor acts on endothelial cells adjacent to cells where synthe-sis takes place. The interaction of VEGF with its receptors, expressed by endothelial cells, triggers a series of reactions which lead to the creation of a new vessel from the parent vessel.

Initially, VEGF causes a loss of contact between endothelial cells and pericytes, and vascular permeability increases (VEGF was initially named vascular perme-ability factor by Dvorac). This permeabilisation releases serum and plasma proteins which contribute to the formation of an extracellular matrix into which the new vessel is integrated. The basal membrane of the parent vessel is then destroyed by the effects of collagenases, proteases, and plasminogenic activators. Endothelial cells are released and their proliferation leads to the formation of a new vessel sprouting from the parent vessel [1].


115

VEGF AND VEGF RECEPTORS

The VEGF family is made up of VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D and P1GF.The effect of VEGF is mediated by 3 tyrosine kinase receptors named VEGFR-1,

VEGFR-2 and VEGFR-3. The binding proἀle of VEGF to these receptors is not speciἀc:

VEGFR-1 binds VEGF-A, VEGF-B and P1GF; –VEGFR-2 binds VEGF-A, VEGF-C and VEGF-D; –VEGFR-3 binds VEGF-C and VEGF-D [2, 3]. –VEGFR-1 and VEGFR-2 receptors are mainly found in the vascular compartment

of the plasma membrane in endothelial cells. We have seen that these factors play a central role in the physiology and pathology of the vascular system, in particular vasculogenesis and angiogenesis, two mechanisms which result in the formation of new blood vessels directed toward an angiogenic stimulus. VEGFR-2 interacts with neuropilin 1, a protein that itself has semaphorin as a ligand. The very term neuropi-lin indicates that the molecule was discovered in the nervous system. There it takes part in guidance processes which have the interesting characteristic of being shared by both blood vessels and nerves. The term semaphorin emphasizes that this ligand guides the vessel on its journey, like a semaphore.

The structure of the VEGFR-1 receptor is similar to that of the VEGFR-2 receptor, but is characterised by its capacity to split and yield a circulating, soluble part, which acts as an anti-VEGF. This soluble receptor 1 is a VEGF-trap capable of inactivating neighbouring or circulating VEGF endothelial cells. It would appear to have a role in the ἀnely regulated angiogenesis—anti-angiogenesis processes, during pregnancy for example, to order angiogenesis to come to a halt. Clinical evidence supports the hypothesis of an excess of VEGFR-1 in gravidic toxaemia where it would appear to bring about placenta ischemia by inactivating VEGF and rarefying the vascular network.

The lymphatic vascular system is controlled by VEGF-C and D and their receptor VEGFR-3, which is a separate VEGF system from that found within the vascular compartment. The general organisation of this control is nonetheless relatively simi-lar and it is legitimate to presume that speciἀc anti-VEGF strategies could be imple-mented, especially to prevent metastases spreading via the lymphatic system.

CELLULAR AND INTRACELLULAR EFFECTS OF VEGF

Activation by VEGF of its receptor leads to a whole series of cellular and intracellu-lar events. At the intracellular level, VEGF plays a part in the production of nitrogen monoxide (NO). VEGF inhibition leads to an elevation in arterial pressure by reduc-ing the endothelial production of NO, a tonic vasodilator agent, and thus, increasing vasoconstrictor tonus.

Pierre Corvol

116

Macrophages, dendritic cells, and progenitor cells are also affected by VEGF, which causes the proliferation and migration of endothelial cells, upon which it also has an antiapoptotic effect. It inhibits dendritic cells and mobilises progenitor endothelial cells.

ANTI-VEGF STRATEGIES

VEGF can be inhibited by anti-VEGF antibodies, soluble VEGFR-1, an aptamer, or VEGF tyrosine kinase inhibitors (ἀg. 1) [4]. Pegaptanib, an aptamer, is already used in the treatment of age-related macular degeneration. The VEGF tyrosine kinase inhibitors, which have the advantage of being administered orally, are already used in anticancer treatments and, in all probability, have a promising future.

The range of anti-VEGF strategies raises the question of therapeutic choice and, more particularly, of its speciἀcity. An antibody is extremely speciἀc and will act speciἀcally on VEGF-A, but not on VEGF-B, C or D. On the other hand, a tyrosine kinase inhibitor will act on several receptors with tyrosine kinase activity. Is this an advantage or a disadvantage? Tyrosine kinases may be involved in cell proliferation and it may prove interesting to have an inhibitor capable of targeting poly-tyrosine kinases and poly-growth receptors. The question remains open.

Aptamer

lgG-like domain

Tyrosine-kinasedomain

Cell signalling

VEGFRTKinhibitors

TKI

TKII

VEGF-R2

VEGF-R1soluble

Ac anti-VEGFVEGF

Figure 1. Anti-VEGF strategies (reproduced with permission from Corvol and Postel-Vinay [4]).


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PLEIOTROPIC VEGF EFFECTS

VEGF has extremely varied functions including an important role in physiology and human disease states; its involvement in tumor development, inḀammation and athero-sclerosis has been demonstrated. In experimental conditions, anti-VEGF treatment has been shown to have a stabilising effect on the microcirculation of the plaque.

VEGF contributes to vascular growth and also acts on the nervous system as a neurotrophic factor. It is involved in cartilage growth, ovarian angiogenesis, and glomerular organisation and function [5].

ROLE OF HYPOXIA IN ANGIOGENESIS

Life relies on oxygen. In the Permian age, approximately 250 million years ago, the partial pressure of oxygen in the atmosphere was approximately twice as high as it is today. Nowadays, only small organisms such as insects can survive without a vascular system, ensuring their requirements by the simple diffusion of oxygen. However, because of the elevated oxygen pressure during the Permian age, there were giant dragonḀies with wingspans of approximately 1 metre, but that had no vascular network.

Oxygen is the key to our existence. It is transported by the vascular system and disseminated via the vessels into the surrounding tissues, and yet the partial oxygen pressure rapidly decreases as it moves away from the vessel. This hypoxic state requires the intervention of adapted and co-ordinated cellular responses that are guided by one essential factor, HIF (hypoxia-inducible factor), which conducts and co-ordinates the responses to hypoxia within the cells and throughout the entire organ-ism. In a hypoxic situation, HIF passes cells from aerobic metabolism to anaerobic metabolism; this is far less efἀcient in terms of energy production but essential for cell survival. HIF also activates the formation of new vessels which supply oxygen to hypoxic territories. Finally, the same HIF causes vasodilation of the vessels thus improving distribution of haemoglobin and increasing erythropoiesis, etc [6].

At the present time, approximately one hundred genes are known to be activated by the effect of HIF and a similar number repressed.

ANGIOGENIC AWAKENING IN TUMOR PATHOLOGY

Tumor growth depends on the formation of new vessels to ensure oxygen and nutri-ment supply, and also the evacuation of metabolic waste. Pathological neovasculari-sation develops in hypoxic conditions and particularly under the control of VEGF and its receptor VEGFR-2.

It was in 1971 that Judah Folkman presented the idea of blocking angiogenesis to deprive tumors of oxygen. The enormous advantage of this inspired hypothesis was that researchers from very varied horizons began studying this ἀeld. Following the

Pierre Corvol

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Cancerous vessels

Normal tissue Cancerous tissue

Regression of tumor vessels

Disorganised unstable vascular network Increased permeabilityElevated interstitial pressureArterio-venous shuntsPericyte insufficiencyNon-regulated blood flow

Organised stable vascular network Controlled permeabilityPresence of quiescent pericytesRegulated blood flow

“Normalisation” of vascularisation (Improved distribution of anti-cancer treatments, increased sensitivity to radiotherapy)Normal vascularisation Tumor vessels

Anti-angiogenic treatment

Figure 2. Tumor vascularisation and anti-angiogenic treatment (reproduced with permission from Corvol and Postel-Vinay [4]).

initial success, the usual doubts and questions have arisen. Scientists have suggested that in reality, anti-angiogenic agents probably cause tumor vessels, which are known to be characterised by a disorganised, unstable vascular network, increased permeability, and arterioveinous shunts, to regress. On the other hand, they would appear to “normalise” vascularisation. It has been suggested that anti-angiogenic agents cause anarchic and inefἀcient tumor vessels to regress, thus promoting their reorganisation, which in turn improves not only penetration of cytotoxic drugs but also sensitivity to radiotherapy, which is highly dependent on good oxygenation. This would explain why, in contrast to mice, anti-VEGF therapy alone has never demonstrated an antitumor effect in man (ἀg. 2).

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119

Angiogenesis and neurogenesis

Anne Eichmann

The vascular system is the ἀrst of the major systems to develop during ontogenesis. During its development, the blood vessels extend to precisely speciἀed targets, result-ing in a highly stereotyped vascular tree. How does the embryo form such a complex and structured system that reaches a total length of 80 000 km in adult humans? We hope that by increasing our knowledge of the mechanisms at work, we can achieve a better understanding of the numerous diseases affecting the vascular system.

THE VASCULAR AND NERVOUS NETWORKS ARE CLOSELY RELATED

Five hundred years ago, Vesalius drew the human vascular tree by candlelight. The Belgian anatomist had already observed that it was totally superimposable on a second tree forming the nervous system (ἀg. 1). These two systems, one which irri-gates the entire organism and the other which controls its sensory-motor systems, must interact closely. Nerves need oxygen and nutrients and are therefore covered by a dense vascular network. Similarly, motility and the maintenance of vascular tonicity require innervation. Thus, the arteries are surrounded by a ἀne network of post-ganglionic sympathetic nerves.

Both systems also branch throughout the body to convey directional information: the arterial and venous Ḁow of the vascular system and the motor and sensory path-ways of the nervous system. In addition, they are both composed of two types of intimately associated cells: endothelial cells and vascular wall cells in the vascular system, and neurons and glial cells in the nervous system.

VASCULAR GROWTH FACTORS AND DEVELOPMENT OF THE NERVOUS SYSTEM

The vascular and nervous systems not only interact anatomically and functionally, they also have molecular signaling pathways in common that enable their coordi-nated development. The intervention of vascular growth factors in nervous system development has been observed in mice in which the response element to hypoxia in the VEGF promoter was deleted. Researchers were surprised to observe that the sclerosis that the animal developed was very similar to human amyotrophic lateral

Anne Eichmann

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sclerosis. Numerous subsequent studies have shown that VEGF has a neurotrophic action. Our contribution to this area, in collaboration with Jean-Léon Thomas of INSERM U711, concerns the study of a growth factor called VEGF-C, which is related to VEGF, and is involved in neural development.

VEGF-C AND THE DEVELOPMENT OF NERVOUS AND VASCULAR SYSTEMS

VEGF-C and its receptor, VEGFR-3, are involved in the development of lymphatic vessels. The LacZ reporter inserted in the VEGFR-3 gene colours all the vessels that express this receptor blue. This reporter showed that the VEGFR-3 receptor is present in the lymphatic vascular system, but is not expressed in the veins. The VEGFR-3 receptor is, therefore, speciἀc to the lymph vessels. The use of the LacZ reporter has also shown that this receptor is present in the brain of adult mice. As the brain has no lymphatic system, the receptor is expressed by neuron populations. This ἀnding

Figure 1. These drawings, dating from 1543, show that the Belgian anatomist Vesalius had already observed that the vascular (left) and nervous (right) trees are superimposable.


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probably explains the action of VEGF-C on the nervous system. In fact, we have shown in vitro that the progenitors of embryonic neurons expressing the VEGFR-3 receptor divide and proliferate when subjected to VEGF-C stimulation [1]. VEGF-C is expressed in both neural and vascular systems and most likely regulates the paral-lel paths of neural and vascular development. This observation raises the possibility that anti-angiogenic treatments could have a neurological impact.

CAPILLARY GROWTH IS GUIDED BY HYPOXIA

How is capillary guidance assured? The mouse retina is an extremely valuable model for studying the vascular system. It has helped to demonstrate that angiogen-esis is dependent on hypoxia. Hypoxia attracts vessels by increasing the expression of VEGF, whereas oxygen decreases VEGF in a feedback loop that directs vascu-lar coverage and oxygenation of the tissue. If we look speciἀcally at the capillary extremity which penetrates the hypoxic areas, we observe that it is composed of specialized endothelial cells, tip-cells, which are distinguished by their ability to extend several specialized ἀlopodia, i.e. small actin-rich structures that can polymer-ize and depolymerize. The tip-cell also expresses the highest levels of the VEGFR-2 receptor. It will therefore have the greatest response to VEGF, and for this reason, it is probably a preferential target for anti-angiogenic treatment.

THE TIP-CELL GUIDES CAPILLARY PROGRESSION

In the retina, capillary formation occurs according to a VEGF gradient, which is highest in the hypoxic region and lowest in the normoxic region. When close to the hypoxic region, the tip-cell forms ἀlopodia while the cells located at the rear form the capillary lumen and provide the blood, oxygen and nutrient supply. Why do these two types of cells behave in different ways? It has been shown that a mutation of a Notch gene ligand, Dll4 (delta-like ligand 4), disrupts the selection of tip-cells. In Dll4 heterozygous animals, each endothelial cell behaves like a tip-cell and extends ἀlopodia. This means that each of the endothelial cells has the potential to evolve into a tip-cell but, under normal conditions, this potential is inactivated by the action of Dll4 on the Notch receptor expressed by the adjacent cell.

DELTA-NOTCH SIGNALING CONTROLS THE FORMATION OF TIP-CELLS

Schematically, VEGF produced by hypoxic cells binds to its VEGFR-2 receptor on the tip-cell. It has been shown that this binding induces expression of Dll4 by the tip-cell. Dll4 will then bind to the Notch ligand expressed by cells located at the rear of the tip-cell. The action of the Notch ligand will then modulate the expression of the

Anne Eichmann

122

VEGF receptor in the cell to reduce its sensitivity to VEGF. Seven articles published in late 2006 and 2007, including one by our team, reached the same conclusion: delta-Notch signaling suppresses the formation of tip-cells [2-8]. Remarkably, this signal-ing pathway, which is operational in the embryo, is also operational in tumor vessels. This observation suggests the possibility of blocking tumor vasculature by generating an excessive number of tip-cells to prevent the formation of a vascular structure.

SIMILARITIES BETWEEN THE TIP-CELL AND THE AXONAL GROWTH CONE

The tip-cell shows remarkable similarities with a terminal structure of axons called the axonal growth cone (ἀg. 2). Like the vessel, the axon has a motility structure at its extremity that extends ἀlopodia, which polymerize and depolymerize to guide the axon to a remote target in the body. We currently know of four families of ligands and receptors that guide axons to their target. These ligands are the ephrins, the semaphorins, the slits and the netrins and they bind to families of receptors expressed by the axon ἀlopodia and attract or repulse the growth cone. It is remarkable that

Figure 2. The endothelial tip-cell in the mouse retina (left) and the axonal growth cone extending ἀlo-podia (right) will guide the neo-vessel or axon to a remote target in the organism.


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amongst the four receptor families that guide axons, several are also expressed in endothelial cells and in tip-cells. In particular, this is the case for the Eph4 receptor and its ligand B2 ephrin, for the plexine-D1 receptors and neuropilin which bind the semaphorins, for robo4, a member of the slit receptors, and for the netrin receptor, UNC5B [9-14 ] (ἀg. 3).

Uninjected Netrin-1

Figure 3. Netrin-1 promotes the retraction of ἀlopodia and inhibits the growth of blood vessels expressing UNC5B [12, 13].

INVOLVEMENT OF NETRIN AXONAL GUIDANCE MOLECULES AND THEIR UNC5B RECEPTOR IN VASCULAR SYSTEM MORPHOGENSIS

We are particularly interested in the netrin receptor UNC5B. Netrin is a guidance factor in bifunctional neuronal growth, meaning that it can both attract and repel neurons. It binds to two different types of receptors, the attractive DCC receptors and the repulsive UNC5 receptors. In the vascular system, we have shown that the UNC5B receptor is expressed by endothelial cells. Knockout embryos that have a deletion of the UNC5B receptor show increased arborization of the vascular network, which is compatible with the dual repulsive/inhibitive nature of this receptor [12]. When the endothelial tip-cells of normal embryos are treated with the ligand receptor netrin, ἀlopodia extension is inhibited. However, when UNC5B is deleted, the capillary is no longer repelled or even attracted by netrin. Netrin is therefore an axon guidance molecule and its UNC5B receptor is involved in the morphogenesis of the vascular system. UNC5B acts as a repulsive receptor in the vascular network and prevents the formation of an excess of angiogenic sprouting and branching. Scientiἀc literature supports attractive-type actions for netrin. This ligand is therefore bifunctional in both the vascular and the nervous systems.

Anne Eichmann

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125

Postischemic angiogenesis: experimental aspects and therapeutic perspectives


Unicellular organisms and organisms small enough to rely on the diffusion of gases and soluble substances do not possess a cardiovascular system. Cell life in such organ-isms depends solely on the concentration of gases and solutes in the liquid surround-ing the cell or microorganism. At the very start of its development, the mammalian embryo consists of only a cluster of nonvascular cells. However, the development of a vascular network capable of transporting the Ḁuids and gases necessary for cell life develops rapidly during embryonic growth. “Vasculogenesis” is the term that deἀnes the initial embryonic events starting with the migration of endothelial precursors (angioblasts), which then differentiate and develop locally into tubules of endothelial cells that form the loosely organized or nonorganized vascular plexus. “Angiogenesis” is the growth, differentiation and organization of the vascular plexus into a functional network. This process is characterized by endothelial cells budding from the extremities and the lateral walls of the existing vessels. Longitudinal divi-sion of vessels forms two parallel tubes that then develop independently. These initial stages of vasculogenesis and angiogenesis lead to the formation of a network mainly composed of capillaries. It is not until after this stage that the larger-sized elements (arterioles, venules and arteriovenous anastomosis) are formed by smooth muscle cells (myogenesis) and the extracellular matrix that strengthens the vascular struc-tures. At the same time, pericytes appear around the capillaries. Finally resistance arteries and conductance arteries are formed by the development of the media and then the adventitia. The contractile properties of vascular muscle cells develop last. All of these events are grouped under the term “arteriogenesis”.

These complex processes require coordination and speciἀc regulation of multiple activation and inhibition factors which interact with many vascular and extravascular cell types. These regulatory mechanisms are probably very different from one organ to another and form very different networks. For example, several anatomical, histo-logical and functional distinctions exist between the vascular networks of the liver, skin and brain.

This chapter focuses on introducing the basic elements of vascular neogenesis as triggered in a pathological context, such as ischemia.


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PRINCIPAL MECHANISMS OF POSTISCHEMIC NEOVASCULARIZATION

The relative importance of the different processes of vasculogenesis, angiogenesis and arteriogenesis in the onset of neovascularization associated with ischemia has yet to be deἀned [1]. However, the three processes undoubtedly act together to estab-lish a functional vascular network. It is likely that arteriogenesis allows a signiἀcant increase in Ḁow in the injured area and the development of new capillaries (angio-genesis) avoids massive tissue destruction in the ischemic area. Finally, although the initial stimuli probably differ, vasculogenesis, angiogenesis and arteriogenesis are activated and modulated, albeit differently, by the same growth factors, chemokines and proteases.

Postischemic angiogenesisHypoxia is the main cause of angiogenesis, which involves HIF-1 (hypoxia-inducible factor 1) activation.

HIF and VEGF-AHIF-1 is a nuclear transcription factor that binds to elements of the hypoxia response in the regulatory region of several genes. Intramuscular injection of a plasmid encoding HIF-1α reduces infarct size and increases neovascularization of the ischemic myocardium [2]. Administration of HIF-1α also increases the regional blood Ḁow, the angiographic score and the capillary density in a hindlimb ischemia model in rabbits [3]. HIF-1 regulates, in particular, the expression of the gene coding for VEGF-A [4], which, once secreted, binds to the tyrosine kinase receptors VEGFR-1 and VEGFR-2 located on the surface of endothelial cells and vascular smooth muscle cells. Activation of these receptors triggers multiple sign-aling pathways which are responsible for stimulating angiogenesis. VEGF-A can activate cell proliferation and survival by mechanisms dependent on phosphati-dylinositol 3’-kinase/Akt [5-7]. Akt may contribute to the angiogenic response by inhibiting the apoptotic process or by phosphorylating endothelial nitric oxide synthase (eNOS) so that its activity is sustained independent of calcium. eNOS also plays a key role in postischemic neovascularization. Mice lacking eNOS show altered vascular neogenesis in the ischemic area [8]. NO also contributes directly to the VEGF effect. In the peripheral ischemia model in mice, the angiogenic response to VEGF requires the presence of eNOS [8]. Similarly, in the infarcted heart, induction of angiogenesis is dependent on the production of NO [9]. Finally, the administration of eNOS-+ by gene therapy promotes neovascularization in the ischemic rat paw, highlighting the importance of NO in the vascular neogenesis process [10].


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Oxygen radical speciesOxygen radical species (OFRs, oxygen free radicals), including superoxide anion, hydrogen peroxide, hydroxyl radical and nitrates, such as NO and peroxynitrite, are biologically active species stimulating multiple signaling pathways by their redox potential [11-13]. Each of these species is derived from speciἀc chemical or enzyme reactions. NADPH oxidases are a predominant source of OFRs in blood vessels [11, 12, 14]. In endothelial cells, NADPH oxidases are composed of two membrane subunits, gp91phox (or Nox 2) and p22phox, and two cytosolic components, p47phox and p67phox. The small G protein, Rac-1, is also necessary for complete enzyme activity. Rac-1 and gp91phox play a major role in the effect of VEGF-A on endothelial cell proliferation [15]. Mice lacking gp91phox display an altered post-ischemic neovas-cularization, further emphasizing the involvement of OFRs in the VEGF-A pro-angiogenic effect in the ischemic area [16, 17].

Other VEGFsHypoxia also induces the expression of other members of the VEGF family. For example, PlGF (placenta growth factor), which binds to the VEGFR-1 receptor, acti-vates neovascularization in ischemic tissue [18]. The expression of VEGF-B also increases in the ischemic area and treatment with a plasmid encoding one of the two VEGF-B isoforms, VEGF-B167 or VEGF-B186, triggers therapeutic revascu-larization in mice with hindlimb ischemia [19]. In an aortic explants model, the explants from mice overexpressing VEGF-B167 or VEGF-B186 in the endothe-lial cells develop strongly, suggesting a direct role for VEGF-B in the angiogenic process [20]. VEGF-C (or VEGF-2) has been described as a speciἀc ligand for the endothelial tyrosine kinase receptors, VEGFR-2 and VEGFR-3. In vitro, VEGF-C has a dose-dependent mitogenic and chemotactic effect on the endothelial cells, particularly the microvascular endothelial cells. VEGF-C stimulates the release of NO by the endothelial cells and increases vascular permeability. Finally, the constitu-tive expression of VEGF-C in the adult animal facilitates angiogenesis in a periph-eral ischemia model [21].

“Angiomatrix” proteinsMany other factors (growth factors, transcription factors, hormones and protein kinases) have the potential to modulate angiogenesis. Furthermore, the number of factors known to affect vascular neogenesis is increasing daily and some of these factors are particularly interesting. Several extracellular matrix proteins are associated with the vascular endothelium and activate angiogenesis by an integrin-dependent mechanism, but in the absence of the exogenous addition of growth factors. Among these “angiomatrix” proteins it has been demonstrated that the Del-1 (developmental endothelial locus-1) protein activates post-ischemic angiogenesis and neovasculari-


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zation by binding integrin αvβ5 to the quiescent endothelium, which subsequently increases the expression of the transcription factor Hox D3 and integrin αvβ3 [22, 23]. Similarly, the Del-1 analogue, lactadherin, is expressed in vascular cells and, by interacting with integrin αvβ3, modulates the VEGF/VEGFR-2-dependent signal-ing pathway. Finally, lactadherin interacts with integrins αvβ3 and αvβ5, and, by a mechanism dependent on Akt, is able to activate the development of new vessels in an ischemic area in the absence of the exogenous addition of VEGF-A [24].

Postischemic arteriogenesisArteriogenesis is the growth of collateral arteries from preexisting arterioarteriolar anastomoses. Some research groups have compared ischemic postnatal arteriogen-esis and the development of collateral vessels (or collateralization); both terms can be used synonymously. Arteriogenesis is induced by a hypoxia-independent mecha-nism, which appears to be based on changes in hemodynamic forces that occur in the collateral vessels following an increase in Ḁow. This increase in the vascular Ḁow arises from the pressure difference between the preexisting arterioles upstream from the point of occlusion and those downstream. Arteriogenesis results from the activa-tion and migration of parietal cells and a remodeling of the vascular wall.

The role of shear stressChronic increases in shear stress exceed the anatomical restrictions of the collateral vessels and restore full collateral conductance. Shear stress activates the signaling pathways that are dependent on Ras-ERK, Rho and NO [25, 26]. The primary physio-logical response to shear stress is endothelial cell activation and a large number of genes are known to be controlled by shear stress response elements located in their promoters [27]. Among these are genes coding for enhancer cytokines or chemoat-tractants which have their expression increased by shear stress. Shear stress increases MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1) at arteriogenic sites and collater-alization is increased by treatment with MCP-1 [28]. Similarly, mice lacking the CCR-2 receptor for MCP-1 have increased muscle atrophy in hindlimb ischemia. Morphometric analysis shows a reduction in the diameter of collateral vessels under these conditions [29]. Furthermore, ischemia induced by ligation of the femoral artery increases the number of inἀltrated cells expressing the CXCR-3 receptor and the level of expression of its ligands, CXCL-9 and 10. Finally, mice lacking CXCR-3 with hindlimb ischemia have lower angiographic scores and less tissue perfusion [30].

The role of inἀammatory cellsThe increased expression of chemoattractant cytokines activates the inἀltration of inḀammatory cells into the ischemic area.


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The migration of macrophages is controlled by the binding of MCP-1 to its CCR-2 receptor. The monocyte level correlates directly with the rate of neovascu-larization [31]. CXCL-9 and CXCL-10 attract T cells through interaction with their CXCR-3 receptor. These T cells also modulate post-ischemic vascular neogenesis. Post-ischemic néovascularisation is less effective in nude mice lacking T cells or mice lacking CD4+ cells [32, 33]. Moreover, the absence of CD8 cells decreases the expression of interleukin 16 (IL-16) and reduces the recruitment of CD4+ T cells in arteriogenic areas. Exogenous administration of CD8 T cells restores a signiἀcant IL-16 titer, an adequate number of CD4+ T cells thus activating the development of collateral vessels [34]. These data suggest the following mechanism: in response to a vascular occlusion, CD8 T cells inἀltrate arteriogenic areas and recruit CD4 T cells by producing IL-16. CD4 T cells then partially control the development of collateral vessels by activating the recruitment of macrophages that release arterio-genic factors. Indeed, the presence of inḀammatory cells is associated with the local release of several proarteriogenic molecules, such as cytokines, interleukin-2, TNF-α (tumor necrosis factor alpha), growth factors such as VEGF and metalloproteinases (MMP) [28, 35].

Cytokines such as interleukin-1β also increase HIF-1α activity, indicating a tran-scriptional role for HIF-1α in the inḀammatory process [36]. During the inḀamma-tory reaction, anti-inḀammatory cytokines are produced and modulate the inḀam-mation intensity. Neovascularization increases in hindlimb ischemia in mice lacking the anti-inḀammatory cytokine IL-10 [37]. This effect is blocked by treatment with a metalloproteinase inhibitor, despite the continued activation of VEGF-A [38]. Leukocyte inἀltration of the infarcted heart and collateralization are reduced in mice lacking the urokinase-type plasminogen activator or MMP-9 [39]. Similarly, mice lacking MMP-9 show reduced collateralization in a hindlimb ischemia model, emphasizing the close relationship between inḀammatory cells, arteriogenesis and metalloproteinases [40].

Postischemic vasculogenesisPostischemic neovascularization not only depends on angiogenic and arteriogenic processes, but also on circulating vascular progenitor cells from the bone marrow. In response to tissue ischemia, endothelial precursor cells are mobilized from bone marrow into peripheral circulation and migrate to the ischemic tissue. Hypoxia and the transcription factor HIF-1α, which activates the expression of SDF-1 (stromal-derived factor 1), mediate the recruitment of endothelial progenitor cells (EPCs) expressing CXCR-4 [41]. Mononuclear cells or EPCs from animals heterozygous for CXCR-4 show a decreased expression of CXCR-4 and a decreased ability to stimulate tissue reperfusion in nude mice [42]. Local hypoxia also releases chemoat-tractant soluble factors for circulating EPCs. A potential chemoattractant candidate


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is VEGF. The VEGF level is increased by hypoxia and it induces SDF-1 in vascular and perivascular structures [43]. Chemokines and platelets can also capture EPCs in areas of vascular lesions [30, 44, 45]. Once recruited, the adhesion of EPCs on the ischemia-activated endothelium is a result of the activity of adhesion molecules on the surface of endothelial cells, such as integrin β2 and L-selectin [46-48]. After their recruitment and adhesion to the ischemia-activated endothelium, EPCs promote vascular neogenesis through various mechanisms (ἀg. 1).

Initially, it was suggested that the progenitors were incorporated into the neovas-cularization site where the differentiation into endothelial cells ended [49-51]. However, the relative contribution of EPCs to the vasculature is highly variable and seems to depend on the experimental model, the type and subtype of the progenitors, and the method of EPC isolation [52-55]. Some experiments even suggest that these progenitors are not incorporated into the neocapillaries, but instead act as support cells. Therefore, bone marrow progenitors accumulate around collateral vessels and differentiate into ἀbroblasts, leukocytes and pericytes, which produce several growth factors and chemokines [53]. The release of SDF-1 by platelets promotes the mobi-

Ischemia

Vascularlumen

Progenitor

Necrosis/apoptosis

Chemoattractantmolecules

Basalmembrane

Differentiationpotential

Paracrine potentialVEGFMCP-1HGFPIGFNO

CXCR4

SDF-1

PSGL-1

ICAM-1Selectin

Endothelial cells

VEGF-A, PIGFhoming signal

4

2

3

1

Adhesion

β2

Figure 1. After their adhesion to the activated endothelium, vascular progenitor cells can trigger vas-cular neogenesis by two main mechanisms: through differentiating into endothelial cells and through a paracrine potential to release proangiogenic and proarteriogenic factors.


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lization and recruitment of CXCR-4+/VEGFR-1+ around the vascular structures, which leads to the development of collateral vessels [56]. Similarly, VEGF induces mononuclear myeloid cell nostocytosis (homing) and allows their perivascular posi-tioning and retention by the activation of SDF-1 [43]. Finally, progenitors derived from human umbilical cord blood can differentiate into early and late endothelial progenitors. Early EPCs express monocytic lineage markers and have a strong poten-tial paracrine role in the release of proangiogenic factors, whereas late EPCs express endothelial markers and have vasculogenic capabilities [57].

Therefore, the primary role of progenitors could be to release angiogenic and arteriogenic factors and to contribute to vascular genesis through paracrine effects. Finally, progenitor cells also have a vasoactive potential, which is likely to play a role in the improvement of tissue perfusion in the ischemic area [58].

THERAPEUTIC PERSPECTIVES

The three main processes (i.e. vasculogenesis, angiogenesis and arteriogenesis) char-acterize tissue remodeling in response to chronic or acute ischemic vascular disease. These processes are the target of alternative angiogenic therapeutic strategies for patients with peripheral arterial disease or coronary disease. Many angiogenic thera-peutic strategies based on the administration of growth factors, stem cells, pharma-cological molecules or extracellular matrix proteins have been proposed. Although these strategies have varying potential, those currently being tested in clinical trials are based on the administration of growth factors or progenitor cells.

Growth factorsClinical trials involving growth factors are primarily based on the administration of VEGF-A and ἀbroblast growth factor (FGF) 1 or 2. The failure of the VIVA, FIRST and TRAFFIC studies suggests that intravascular administration of proteins is insuf-ἀcient to induce therapeutic neovascularization [59-61]. This is undoubtedly related to the route of administration (intravenous or intracoronary) and choosing to inject proteins with short tissue half lives. REVASC and Euroinject-1 studies, however, are based on strategies that transfer genes coding for different VEGF-A isoforms directly into the ischemic zone. These studies have shown promising results in cardiac func-tion [62, 63]. Preclinical trials have proven the efἀcacy of different growth factors on vascular neogenesis stimulation in hindlimb or cardiac ischemia models using young animals without any associated cardiovascular disease risk factors. Inducing a similar proangiogenic response in elderly patients with pronounced atherosclerotic lesions and who have no therapeutic alternatives, is a more signiἀcant therapeutic challenge. The selection of patients who are candidates for a stent or a bypass could increase the efἀ-cacy and feasibility of proangiogenic therapies and therapeutic angiogenesis could be


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developed as a complementary therapy to conventional surgical revascularization. For similar reasons, patients could be selected with symptoms of angina or claudication as these could signal the presence of ischemic, but still viable tissue that is potentially capable of responding to revascularization therapy [64]. Finally, the administration of several growth factors with distinct cellular targets could simultaneously activate the multiple processes involved in vascular neogenesis. Studies have demonstrated that coadministration of FGF and PDGF-BB (platelet derived growth factor BB) or VEGF-A and P1GF is far more effective than the injection of a single growth factor in cornea or cardiac and peripheral ischemia angiogenesis models [65, 66].

Progenitor cellsAlthough many experiments suggest the presence of vascular progenitors in other tissues, such as the heart, adipose tissue or blood, the administration of precursors of bone marrow origin is the basis for proangiogenic cell therapies [67, 68]. Injection of endothelial progenitor cells from bone marrow restores the Ḁow and the capillary density of the skin in hindlimb and cardiac ischemia experimental models in rodents [69, 70]. Likewise, injection of human EPCs increases the formation of new blood vessels in the infarcted area [71]. Recent studies have suggested that mononuclear cells from bone marrow without EPC differentiation or puriἀcation were able to promote vascular development in the ischemic area [71, 72]. The administration of bone marrow mononuclear cells from control animals is also effective in experimen-tal models of diabetes and hypercholesterolemia [73, 74]. These cellular therapies are currently being tested clinically in small cohorts of patients. Autologous implantation of bone marrow mononuclear cells in the ischemic limb of patients with peripheral arterial disease or thromboangiitis obliterans improves vascularization and the scar-ring process [75, 76]. However, a number of these patients have shown side effects or transient effects [76]. Similarly, intracoronary transplantation of bone marrow mono-nuclear cells into the myocardium of patients with acute ischemia increases perfusion and the function of the ischemic tissue [77-79]. Some studies of intracoronary trans-plantation have also shown transient effects or no effect, underscoring the need for further analysis of the therapeutic efἀcacy of these stem cell strategies [80, 81]. One particular issue is that most cardiovascular risk factors, such as diabetes, hyperten-sion or hypercholesterolaemia, reduce the therapeutic potential of adult progenitor cells, particularly those from bone marrow [17, 73, 82]. Therefore, the development of strategies for restoring progenitor cell function is essential. For example, pretreat-ment of EPCs by ephrin B2 results in increased expression of PSGL-1, a selectin ligand, which improves the ability of EPCs to migrate to the ischemic area and acti-vate vascular development, as shown in a hindlimb ischemia model in mice [83]. Similarly, dual therapy based on the joint administration of two types of progenitor cells, CBS and smooth muscle progenitor cells (SMPCs), has a better therapeutic


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effect than when each cell type is injected separately. SMPCs release angiopoietin-1, which binds to its Tie-2 receptor located on the surface of EPCs, improving EPC survival and their propensity to form vascular structures [84].

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138

Gene and cell therapy in peripheral arterial disease

Joseph Emmerich

Critical lower-limb ischemia (CLLI), the most severe form of peripheral arterial occlusive disease (PAOD), includes symptoms of rest pain resistant to analgesics lasting more than 15 days, or trophic disorders. The viability of the limb is threatened and the general prognosis for patients is also compromised with a mortality rate of around 50% at 5 years [1, 2]. The TransAtlantic InterSociety Consensus (TASC), which recently deἀned CLLI, highlighted that “CLLI implies the notion of a chronic condition and must be differentiated from acute limb ischemia” [3, 4]. Assessment of hemodynamic parameters, by measuring systolic blood pressure index (SBPI), is fundamental in order to objectively quantify lower limb perfusion. Measurement of absolute ankle pressure is recommended; to conἀrm CLLI it must be <70 mmHg and/or big toe pressure must be <30 mmHg and/or transcutaneous oxygen pressure (TcPO2) must be between 30-50 mmHg. In these conditions, limb salvage through surgical or endoluminal means is imperative, but not always feasible, due to the lack of an exploitable recipient route or due to multiple surgical interventions. CLLI is often associated with diffuse occlusions of the arterial bed with no distal vasculari-sation. In the latter situation, which represents 20 to 30% of cases, medical treat-ment remains the only therapeutic possibility before resorting to amputation [5]. The TASC consensus estimates that 10 to 30% of patients with CLLI will die within 6 months and that 25 to 35% will undergo a major amputation [6]. Peri-operative mortality of amputation ranges from 5 to 10% for leg amputations and 15 to 20% for amputations above the knee. This happens relatively frequently and is a demonstra-tion of therapeutic failure since to date, no alternate treatment has been shown to be effective.

The TASC consensus no longer recommends such treatments as posterior cord stimulation or subcutaneous stimulation in the treatment of CLLI; the consensus also judges the evidence in favour of lumbar sympathectomy to be inadequate [3].

Several therapeutic trials have studied the use of prostacyclin and its derivatives, initially by intra-arterial administration and then by intravenous administration. The results of the ICAI study, the largest randomised trial using a prostacycline deriva-tive, lead to recommending the infusion of prostacyclin derivatives in CLLI patients


139

with a viable limb, in whom revascularisation was impossible, particularly when the alternative was amputation [6]. Although treatment was shown to be effective after 1 month, the effect was transitory and unfortunately had disappeared after 6 months.

Considering the aforementioned data in the medical treatment of CLLI, where revascularisation is not a viable option, it is reasonable to state that none of the currently available treatments can lead to signiἀcant improvement in patients and ensure leg salvage in critical ischemia [7].

GENE THERAPY

One possible solution that is currently being assessed with a view to avoiding ampu-tation in cases of chronic critical ischemia, may be found in therapeutic angiogenesis, i.e., the possibility of developing a substitute vascular network. Growth factors, such as VEGF (vascular endothelium growth factor) or FGF (ἀbroblast growth factor) induce physiological angiogenesis. However, administering these factors in the form of recombinant proteins is a difἀcult undertaking. These factors have a very short half-life and must therefore be used at high doses. Efἀcacy is thus limited due to the poor tolerability and the risk of systemic side effects at these doses. Gene therapy allows the insertion and transfer of genes coding for angiogenic growth factors in the muscle cells of patients with PAOD. The transfected cells then steadily produce low concentrations of these angiogenic proteins over a period of 1 to 2 weeks. Two types of vectors are used in clinical practice: viral vectors (adenovirus) and non-viral vectors (use of bare plasmids or liposome-encapsulated plasmids).

In the early 1980s, Elizabeth Nabel demonstrated the feasibility of gene therapy as a treatment for vascular lesions and since 1996 gene therapy has been developed via various different approaches [8]. Research has lead to the discovery of vascular growth factors, such as VEGF, which have been used in phase 1 trials to promote angiogenesis in CLLI [9, 10]. These trials have used gene therapy with adenovirus or bare plasmids coding for VEGF or FGF-1.

The factors were initially administered intra-arterially, but systemic dilution of the gene transfer and diffuse atherosclerosis limited the efἀcacy. Intramuscular injection is currently the preferred delivery method. Intramuscular injection of a bare plasmid has been shown to be feasible; it remains in a non-replicative form, and does not integrate with the genome, thereby limiting mutagenic risk [11].

The results described demonstrated clinical efἀcacy; however, the lack of blinded, randomised trials available at this time must be taken into consideration. The Transatlantic Conference on Clinical Trial Guidelines in Peripheral Arterial Disease recommends that randomised trials need to focus on such events as the complete disappearance of pain without analgesics, complete healing, and amputa-tion frequency [12].

Joseph Emmerich

140

To date, no published study has fulἀlled these criteria and, although it seems a positive association has been found, it is not yet sufἀcient for a complete recov-ery from CLLI. In addition, premature interruption of the expression of the growth factor could lead to a regression of the new vascularisation [13]. The results from the main gene therapy trials in critical ischemia are summarised in Table 1. A total of just over 300 patients have been included in phase I and II trials. To date, no serious adverse effects have been reported in the clinical follow-up of this relatively small number of patients.

The only randomised study was TALISMAN, published in 2008 [14]. In subjects with CLLI associated with ulcers or gangrene, the study compared the injection of

Table 1. Review of gene therapy trials in critical lower-limb ischemia.

Author (year) Treatment

Number of patientsFollow-up Results

Treated Control

Isner (1996)

Plasmid VEGF165 intra-arterial (polymer hydrogel)

1 – 12 weeks Increase in collaterals (angiogram).Transient oedema

Baumgartner (1998)

Plasmid VEGF165 intramuscular

9 – 6 months Increase in collaterals (angiogram) and SBPI

Isner (1998)

Plasmid phVEGF165 6 – ? Increase in collaterals (angiogram), improvement in SBPI

Makinen (2002)

Adenovirus VEGF intra-arterial

18 19 2 years Adenovirus VEGF intra-arterial.Increase in collaterals (angiogram), no difference in SBPI.No difference in clinical events

Plasmid/liposome VEGF intra-arterial (in combination with angioplasty)

17 19

Comerota (2002)

Plasmid FGF-1 intramuscular 51 – 6 months

Reduction of ulcers, increase in SBPI and TcPO2

Shyu (2003)

Adenovirus VEGF165 intramuscular 24 – 6 months

Increase in collaterals (angiogram) and SBPI.Reduction of pain at rest and healing of ulcers

Rajagopalan (2003)

Adenovirus VEGF121 intramuscular

33 72 6 months Patients without CLLI but with intermittent claudication.No improvement in walking distance or SBPI


141

Author (year) Treatment

Number of patientsFollow-up Results

Treated Control

Shyu (2003)

Plasmid VEGF165 intramuscular, 2 series of injections with 1 month interval

21 – 6 months Improvement in pain and SBPI.Healing of ulcers and increase in collateral Ḁow (angio MRI)

Motyas (2005)

Adenovirus 5FGF-4 intramuscular

10 3 12 weeks Increase in collaterals (angiogram). Impossible to come to a conclusion on the efἀcacy because the study was too small and the dosage too low

Kusumanto (2006)

VEGF165 intramuscular

27 27 100 days No signiἀcant reduction in amputation frequency, but improvement in pain, care of ulcers

Marui (2007)

bFGF (biodegradable gelatin hydrogel)

7 – 4-24 weeks Increased walking perimeter, improvement in SBPI, to 4 steps at 24 weeks

Rajagopalan (2007)

Adenovirus HIF-1α intramuscular

34 7 12 months Feasibility of treatment, no correlation between SBPI and prognosis

CLLI: critical lower limb ischemia; SBPI: systolic blood pressure index; TcPO2: transcutaneous oxygen pressure

NV1FGF, in 4 treatment sessions at 15-day intervals, to the injection of a placebo. The results are positive, with a reduction in the risk of amputation in patients receiving gene therapy. One hundred and twenty-ἀve patients were randomised to either 4 mg of plasmids coding for FGF-1, for 4 weeks, with the injections at 2 weekly intervals, or a placebo (saline solution). Injection of the plasmid coding for FGF-1 reduced the risk of amputation by 50% and the risk of major amputation by 37%. Alongside these beneἀts, there was a trend towards a reduction in mortality. The TAMARIS study currently in progress, is expected to conἀrm these interesting results, particularly because the positive outcomes from the TALISMAN study have been deἀned as secondary variables in the TAMARIS study design.

CELL THERAPY

In 1997, Asahara discovered the circulating endothelial progenitor cells in human adults and this revolutionised the concept of postnatal angiogenesis [15]. Several

Joseph Emmerich

142

trials have conἀrmed the existence of these progenitors, their medullary origin, and their ability to penetrate vascular structures in two models: tumor angiogenesis and revascularisation of ischemic tissue. Adult endothelial stem cells are a potential source for endothelium regeneration in the cardiovascular system and would be ideal for use in autologous cell therapy. This is the process known as vasculogenesis.

Many pre-clinical trials on ischemia models have used cell therapy to induce thera-peutic angiogenesis by integration with a new vascular network and/or by the secre-tion of growth factors [16]. Cell therapy offers several advantages over gene therapy. First of all, autologous cells are used, thus potentially eliminating the risk of rejec-tion. Additionally, the theoretical risk of gene therapy-induced diseases is reduced. Such diseases may be either directly linked to the action of the growth factor coded by the injected plasmid or to the insertion of the plasmid itself (despite all necessary precautions). The cells used are “stem cells” of medullary origin and the conditions for their differentiation are still not clearly understood.

Two types of cells have been used in pre-clinical trials: circulating endothe-lial cells (EPC, endothelial progenitor cells) of monocyte origin (CD14+), known as early cells but also called CFU-Hill, and EPCs known as late or outgrowth endothelial cells (CD14–) [17]. Though these cells can induce angiogenesis in vivo in animal models, only bone marrow mononuclear cells (BMMNC) or peripheral blood mononuclear cells (PBMNC), after stimulation by G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor), have been used in phase I and phase II clinical trials in humans. After encouraging results in animal models, the ἀrst study was carried out in humans in 2002; it used intramuscular injection of medullary autologous mononuclear cells in patients with chronic critical lower limb ischemia [18]. A ἀrst group of 25 patients with unilateral ischemia were injected with the medullary cells in the affected limb and saline solution in the contralateral lower limb. As these results were very encouraging, a second group of 22 patients with bilateral ischemia was randomised to medullary cells or blood mononuclear cells, the latter treatment group being the control group. After 24 weeks, a signiἀcant improve-ment in all clinical parameters was noted in patients treated with medullary cells and neo-angiogenesis was conἀrmed on lower limb arteriograms. The treatment was very well tolerated. Several other studies using the same procedure have since been published with similar results, a summary of which is shown in Table 2. At present, more than 600 cell-based therapies have been carried out in humans, with more than half of the cases reported in publications from Asia. In France, 3 open-label trials in this indication are currently underway using medullary autologous mononuclear cells (Amiens, Nantes, Reims, Grenoble, Paris [Hôpital Européen Georges-Pompidou], Marseilles). A randomised, double-blind, trial (the BALI study) has been undertaken in France to assess the efἀcacy of this therapeutic approach on major clinical events including amputation and mortality.


143

Table 2. Review of trials in cell therapy in critical lower-limb ischemia.

Author (year)

Treatment (number of

cells)Injection Number of

patients Follow-up Results

Tateishi-Yuyama (2003)

BMMNC(0,7-2,9 × 109)

IM, calf40 × 0,75 mL

45 24 weeks Increase in collaterals (angiogram), SBPI and TcPO2

Higashi (2004)

BMMNC(1,6 ± 0,3 × 109)


7 24 weeks Increase in collaterals (angiogram), SBPI and TcPO2 and vasomotricity

Huang (2004)

PBMNC(3 × 109)

IM, thigh, calf and foot

5 12 weeks Increase in SBPI and perfusion (laser-Doppler)

Saigawa (2004)

BMMNC(6,04 ± 1,58 × 107/kg)

IM 8 4 weeks Correlation between SBPI improvement and the number of CD34+ cells in the cell therapy product

Huang (2005)

PBMNC(3 × 109)


14 treated, 14 control (randomised trial)

3 months Increase in SBPI and perfusion.78% healing in active group vs. 39%

Yang (2005)

PBMNC IM, foot and calf

62 6 months Pain improvement in 87% of cases.Ulcer healing. TcPO2 and SBPI improved

Kim (2006)

BMMNC stimulated

6 intraosseous injections,tibia

27 20 months Moderate pain improvement.Healing de 13/17 ulcers.Increased collaterals

Gu (2006)

BMMNC stimulated

IM, intra-arterial or both

35 5 months Improvement of pain in 90% of cases.Healing of 10% of ulcers.Improvement SBPI, TcPO2

Durdu (2006)

BMMNC IM, foot, calf, forearm

28 20 months Healing in 83% of cases.Pain improvement.Collateral visible on arteriogram

Miyamoto (2006)

BMMNC(3,5 × 109)

IM, calf, foot 8 12 months 1 unexplained death, 4 unfavourable outcomes

Saito (2007)

BMMNC IM 14 24 weeks Reduction of rest pain, improvement in ulcers

BMMNC: bone marrow mononuclear cells; PBMNC: peripheral blood mononuclear cells after stimulation by G-CSF; IM: intramuscular; SBPI: systolic blood pressure index.

Joseph Emmerich

144

Huang et al. [19] published a study on a different approach, using PBMNC that are mobilised by subcutaneous injection of G-CSF at a dose of 600 µg/day for 5 days. On the ἀfth day of stimulation, a sample of approximately 300 mL of PBMNC was taken and concentrated, then injected into 40 sites on the ischemic leg for a total injected dose of 3 × 109 PBMNC. The authors randomised 28 patients with diabetes and CLLI to either PBMNC or conventional treatment, with a follow up of 3 months. There was a signiἀcant improvement in the main symptoms (pain and ulcer) in the 14 treated patients. No amputation was performed in the treat-ment group compared with 5 amputations in the control group (p = 0.007). This study suggests that the autologous transplantation of PBMNC, after G-CSF stimu-lation, could also be an effective and reliable procedure for CLLI. An advantage of this procedure is that neither general anaesthesia nor bone marrow puncture is required.

A recent anatomopathological study carried out at our centre on patients treated by cell therapy, demonstrated considerable neovascularisation in vivo. The immuno-histochemical analysis of amputation samples from patients treated with the cell therapy was compared to that of control patients, amputated during the same time period and matched according to age and sex. In 3 patients that received cell therapy, active angiogenesis was observed in the ischemic leg at the distal level, but not in the leg muscle. All new vessels were positive for endothelial markers (CD31, CD34, von Willebrand factor) and negative for lymphatic markers (podoplanin). The immuno-histochemical markings for Ki 67 and c-kit showed raised endothelial proliferation in the newly formed vessels [20].

BUERGER’S DISEASE

Cell therapy and gene therapy have both been used in subjects with Buerger’s disease, which is an occlusive and segmental inḀammation of arteries and of veins, charac-terised by thrombosis and recanalisation of affected vessels. This non-atheromatous inḀammatory disease affects small and medium-caliber arteries; diagnosis is made according to the clinical criteria published by Olin in 2000 [21]: less than 45 years of age, present or past tobacco consumption, presence of ischemia in distal extremities (lower and/or upper limbs). In patients with Buerger’s disease, surgical revascularisa-tion can prove difἀcult because the affected area is systematically distal. Therefore, with the exception of tobacco cessation, the currently available treatments show limited efἀcacy and cannot guarantee a long-term response or complete recovery.

Isner et al. [22] conducted a phase I clinical study to show the efἀcacy and toler-ability of intramuscular injection of VEGF165 in 6 patients with Buerger’s disease. The results showed that if the treatment was initiated before gangrene developed, ulcers were seen to heal completely and no amputations were necessary. However, this study did not have a control group.


145

Cell therapy was used in a pilot study in 8 patients with Buerger’s disease, diag-nosed according to Olin’s criteria [23]. The treatment used bone marrow mononu-clear cells with a 4 year follow-up: the results demonstrated a long term improve-ment in ischemic symptoms.

However, the main advantage of this trial was that it highlighted the possibility of developing a secondary vascular network in this particular population. It must be noted that one patient died 20 months after treatment administration; this patient did not have any cardiovascular risk factors and had given up smoking before inclusion in the trial. The possible relation between this death and the cell therapy administered cannot be excluded, coronary mortality being a rare occurrence in young subjects with Buerger’s Disease.

The injection of BMMNC in apolipoprotein E knockout mice is likely to promote the development of atherosclerotic lesions, because angiogenesis is necessary for the development of intima-media plaques [24]. Further studies are necessary to assess treatment safety in patients with this disease.

CONCLUSION

To date, no studies on gene or cell therapy have reached an authoritative conclusion on the efἀcacy or tolerability of these innovative treatments. Addressing such ques-tions requires randomised trials on a larger scale, with the reduction in the frequency of major amputation as the primary endpoint.

Although these new treatment possibilities for PAOD have opened up some fasci-nating perspectives, they have also raised many questions.

Which cells should be used? Several studies are currently investigating mesenchy-mal cells, adipocytes, and embryonic stem cells.

At what frequency should the injections be given and which delivery route should be used?

Is it necessary to combine gene therapy and cell therapy (transfection of the cells used by the gene in question)?

Is short-term and long-term safety really guaranteed, given the theoretical risk of stimulating the development of latent cancers or aggravating atherosclerosis?

Furthermore, critical ischemia with trophic disorders is the ἀnal stage of PAOD and is associated with a high rate of morbimortality; therefore, a better means of assessing treatments aimed at stimulating angiogenesis may well exist. A more appropriate approach may be to focus on patients with rest pain only or to combine gene or cell therapy with distal bypasses or angioplasty in subjects with a better prognosis. Another recent innovative approach involves developing artiἀcial vessels. This technique represents a new angle of research for the management of operable patients but who no longer possess the autologous material necessary for surgical intervention [25].

Joseph Emmerich

146

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148

Cell therapy in cardiac disease

Philippe Menasché

The possibilities offered by cell grafts in the heart give rise to a great deal of hope. With the objective of giving renewed functionality to myocardial territories that have become akinetic following infarction, cell therapy in cardiology is already proving to be a clinical reality, attested to by the large number of currently ongoing clinical trials.

CELL THERAPY IN MYOCARDIAL INFARCTION

Excessive left ventricular dilatation after infarction is one of the strongest predic-tive factors of the risk of death [1]. One of the main objectives of cell therapy is to achieve greater reduction in left ventricular remodelling than that obtained with the currently available treatments of myocardial infarction, such as revascularisation by angioplasty during the acute stage, thrombolysis, and stents, etc. Considering the high success rate of these existing approaches, the challenge is evidently an ambi-tious one.

Assessment of cell therapyNowadays the procedure for cell therapy is perfectly standardised. A catheter is inserted into the artery, which was repermeabilised some hours or days earlier, and mononuclear bone marrow cells of the patient are injected. These cells are chosen because they are immediately available and also small in size, thus ensuring the safety of the intracoronary injection [2].

A meta-analysis of 13 controlled trials including 811 patients recently assessed this procedure. Left ventricular ejection fraction showed a statistically signiἀcant improvement of 3% (p = 0.0007). Though modest, the beneἀt derived from cell ther-apy is not a negligible one. In contrast, no notable effect on ventricular remodelling was observed [3].

Some have concluded from the meta-analysis that cell therapy is and will remain ineffective. In reality, however, these apparently negative results are extraordinarily positive due to the mass of information which they have brought to light. In particu-lar, they have led to the identiἀcation of the factors responsible for the poor results, thus opening the way to more appropriate angles of research.


149

Factors of success or failure related to delivery procedureWhat are the factors which may explain the limited beneἀts derived from cell therapy? Some have to do with the procedure used. For example, it was shown that the timing of cell delivery must be taken into consideration. Additionally, cell homing can vary a great deal depending on whether the injection was performed 1 hour or 24 hours after the acute stage of the myocardial infarction. Clinical studies are currently seeking to identify the optimal moment for cell administration; this question is thus likely to be clariἀed. The dose of cells administered is also undoubtedly a key factor to success. The meta-analysis has thus shown that the greater the number of cells injected, the more signiἀcant the improvement in ventricular ejection fraction. Success is therefore dose-dependent and the dosage can certainly be optimised (ἀg. 1) [3].

Impaired cell functionImpaired cell function is probably a far more arduous stumbling block. In an animal model of leg ischemia, it has been shown that administration of bone marrow cells taken from a healthy subject improved the ischemia, while cells from a subject with ischemic heart disease had no effect. The situation is similar when coronary patients are treated with the injection of marrow cells, rendered non-functional as a result of the coronary disease.

Studyor sub-category

01 <10(7) cells

02 <10(8) cells

03 <10(9) cells

04 <10(10) cellsMeyer (2006)

Huang (2006)Janssens (2004)Kang (2006)Schachinger (2006)Suarez de Lezo (2007)

Ge (2006)Lunde (2006)

Li (2007)Penicka (2007)

Meluzin LD (2006)

Meluzin HD (2006)

Meluzin HD (2006)

Subtotal (95% CI)

Subtotal (95% CI)

Subtotal (95% CI)

Subtotal (95% CI)

Test for heterogeneity: not applicable

Test for heterogeneity: x2 = 15.69. df = 4 (p = 0.003). I2 = 74.5%

Test for heterogeneity: x2 = 9.51. df = 4 (p = 0.05). I2 = 57.9%

Test for heterogeneity: x2 = 31.46. df = 11 (p = 0.0009). p= 65.0%

Test for overall effect: Z = 0.71 (p = 0.48)



Test for heterogeneity: not applicableTest for overall effect: Z = –3.16 (p = 0.002)

Test for overall effect: Z = –3.00 (p = 0.002)

Total (95% CI)

BMSC Mean (SD)

No BMSC Mean (SD)

WMD (random)95% CI

WMD (random)95% CI

Weight%n n

22107

108

109

1010

222222

10

2030259510

180

3030

357

3030

350

2030259210

177

44223514

1044223510

125 121

3.00 (4.69) 2.00 (4.69) 10.50 1.00 (–1.77, 3.77)1.00 (–1.77, 3.77)10.50

4.839.95

10.509.664.93

39.86

9.608.926.75

12.033.65

40.95

8.698.69

100.00

–10 –5 0 5 10Favors no BMSC Favors BMSC

5.30–3.103.004.50

–2.001.51

2.501.205.302.50

14.003.60

6.006.00

2.74

(–1.21, 11.81)(–6.15, –0.05)(0.23, 5.77)(1.30, 7.70)(–8.41, 4.41)(–1.96, 4.98)

(–0.73, 5.73)(–2.39, 4.79)(0.39, 10.21)(0.52, 4.48)(6.06, 21.94)(1.04, 6.16)

(2.28, 9.72)(2.28, 9.72)

(0.98, 4.50)

2.00 (4.69)

53.30 (3.50)58.60 (9.90)

57.10 (7.80)45.00 (9.00)

7.00 (6.20)3.40 (6.90)5.10 (9.10)5.50 (7.30)

20.00 (8.00)

6.70 (6.50) 0.70 (8.10)

4.50 (3.99)2.20 (7.30)

–0.20 (8.60)3.00 (6.50)

6.00 (10.00)

1.20 (7.50)5.00 (4.69)

4.30 (7.10)

52.60 (5.70)47.00 (7.00)

BMSC: bone marrow stem cells; CI: 95% conἀdence interval; WMD: weighted mean difference.

Figure 1. Improvement of left ventricular ejection fraction in myocardial infarction patients according to quantity of cells administered. (Reproduced with permission from Martin-Rendon, et al.[3]).

Philippe Menasché

150

The cells could be tested before the injection, but the procedure would then prove too long, too complex and too costly for routine use. A second strategy would be to have stocks of cells at our disposal; these would be allogeneic but already tested and proven functional beforehand. The product would then be “ready-to-use” just like a traditional drug. The problem of rejection persists, but this could be avoided by using mesenchymal stem cells (MSC) if the “immunological advantage” currently attributed to them is conἀrmed.

Which delivery route for these cells?What is the best way to administer allogeneic MSCs? Theoretically, the intrave-nous route is the most appealing: access is simple and without risk, but before they reach the heart the cells are captured by the marrow, the spleen, and the lung. In this respect, left endocardial delivery would be more effective, but this method is not without risk when used a few hours after myocardial infarction. The alternative is the intracoronary route: recent animal studies conducted to assess the impact of the dose administered and associated antithrombotic treatment showed that MSCs from adipose tissue or marrow delivered by intracoronary injection are indeed beneἀcial to cardiac function. In addition, these studies have proved reassuring with regard to formerly existing concerns about the risk of capillary occlusion by MSCs which are twice as large as mononuclear cells [4-6].

If these results are conἀrmed and validated, we will have made a big step forward in the development of a functionally effective cell therapy, which can be easily stored, and used in emergencies.

Homing of injected cells remains inadequateAfter intracoronary injection, only approximately 3% of the cells administered are found in the heart. Different techniques have been developed with a view to improv-ing this rate. Some of these are based on biological approaches, such as the manipu-lation of host tissue to trigger ampliἀcation of the homing signal. A number of simple technical improvements have also been considered, such as a catheter which, rather than releasing the cells within the vessel lumen, distributes them around it, which would appear to be an effective way of increasing the number of cells that actually penetrate into the myocardial parenchyma.

Inadequate improvement in ventricular ejection fractionThe meta-analysis of randomised trials that assessed the beneἀt of administering bone marrow cells following myocardial infarction showed only a very modest improve-ment in ventricular ejection fraction. Some have interpreted this result as conclusive proof of the failure of this technique. It is useful to remember that studies of drugs such as beta-blockers or angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors showed


151

similar results, whereas nowadays, no-one contests the capacity of these drugs to save lives. For example, in 2004, the CAPRICORN (Carvedilol post-infarct survival control in left ventricular dysfunction) study evaluating the effects of carvedilol, a beta-blocker, on left ventricular remodelling following acute myocardial infarc-tion only demonstrated a 4% improvement in left ventricular ejection fraction [7]. In 2007, a meta-analysis of the effects of ACE inhibitors also revealed similar ἀgures [8].

It is therefore still too soon to claim that cell therapy in cardiac pathology has no future.

CELL THERAPY IN HEART FAILURE

With 5 million people affected, heart failure is the ἀrst cause of hospitalisation in the United States. In France, 150 000 new cases are reported every year, 10 000 of which are serious forms; 3% of the healthcare budget is spent on patient manage-ment. Despite recent progress in terms of treatment of heart failure, cardiovascular deaths are still frequent in these patients. Cell therapy for heart failure aims to regenerate post infarction akinetic scars. Three randomised controlled trials were conducted to study administration of skeletal myoblasts in this indication. In two studies, the cells were injected via an endoventricular catheter. The results were positive for one and negative for the other. In the MAGIC (Myoblast Autologous Grafting in Ischemic Cardiomyopathy) study, surgical cell transplantation was performed in addition to coronary bypass but did not succeed in reaching its primary endpoint [9]. This trial included a relatively large number of patients (120 randomised patients in 5 countries). It was conducted to study the effects on cardiac function of injecting myoblasts into infarction scars. Although cardiac function was indeed improved in the patients treated, there was no difference between this and the placebo group.

It is however interesting to note that the group treated with the highest dose of myoblasts showed a signiἀcant reduction in left ventricular end systolic and diastolic volumes (p < 0.05). Therefore, although cell therapy was indeed shown to have an effect on ventricular remodelling, it was insufἀcient to improve cardiac function (ἀg. 2) [9].

Trials conducted with bone marrow cells have not shown any better results than those with myoblasts. The safety proἀle of cardiac cell therapy would appear to be satisfactory except for a number of concerns regarding a possible increase in the risk of ventricular arrhythmia; interpretation nevertheless remains complex because of the diversity of causal factors. The patients in the MAGIC study underwent cardio-verter deἀbrillator implantation. Objective monitoring of ventricular arrhythmias was therefore possible, and this showed no signiἀcant difference between treatment and placebo groups at the 6-month study point.

Philippe Menasché

152

Areas for improvement: cellsThere are two potential courses of improvement: the ἀrst can be qualiἀed as conserva-tive and the second as aggressive. The conservative option recognises the unfeasibility of regenerating damage caused by the infarction and focuses on optimal exploitation of the paracrine effect of grafted cells by selecting the most effective. The potential paracrine effects include stimulation of angiogenesis, an anti-apoptotic effect, remod-elling of the extracellular matrix (which increases the elasticity of scar tissue and reduces ἀbrosis) and salvaging cardiomyocytes (since damage is reversible).

Which types of cells are involved? The CD34+ and CD133+ fractions of hemato-poietic stem cells or mesenchymal stem cells possess a paracrine effect. One recent study showed that these cells secrete sufἀcient mediators to reduce apoptosis and therefore the extent of the infarction, thus improving left ventricular function. It is probably this paracrine effect that explains the beneἀts on ventricular remodelling reported with cell therapy in the MAGIC study.

With the aggressive option, we are faced with the challenge of generating new cardiomyocytes from stem cells. Cardiac stem cells would appear to be the most

ED

V in

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fro

m b

asel

ine

20

10

0

-10

-20

*p < 0.05

n = 25-12.6 (-19.4, 0)

n = 295.9 (-11.8, 15.2)

n = 27-3.9 (-17.0, 12.6)

Median and IQR Low doseHigh dose Placebo

NS

EDV: end diastolic volume; BSA: body surface area.The data are expressed as medians and interquartile intervals.

Figure 2. Six-month change from baseline in indexed end diastolic volume in heart failure patients according to quantity of cells administered. (Reproduced with permission from Menasché, et al.[9]).


153

appealing candidates but only exist in infants, during the ἀrst months of life. On the other hand, pluripotent embryonic stem cells would appear to be the best candidates. In our group, Michel Pucéat and colleagues have developed a process whereby these cells are pre-oriented towards a cardiac phenotype; subsequently, cardiac progenitors alone are selected. Trials carried out in an animal model of infarction subsequently showed that these cells indeed become functional cardiomyocytes. The induced pluripotent stem cells, or iPS, are the latest potential progenitors [10] but their poten-tial clinical use is still fraught with several limitations.

The main advantage of these cells is that they originate in the patient himself. However, autologous products do create considerable logistical problems, particu-larly when large numbers of patients are to be treated.

Improving delivery and survival of cellsEighty per cent of the cells administered are likely to be lost when they are injected via a syringe. Computer-controlled injection systems improve precision and may lead to better results. The incorporation of cells in biomaterials could also favour better retention. In our experience, alternative techniques using cellularised collagen patches or sheets of cells held together by the extracellular matrix proved to be more effective than conventional injection.

Furthermore, the populations of administered cells are subjected to considerable mortality in the days following the injection [11, 12]. The reasons for this cellu-lar death are now better known, and include inḀammation, ischemia, and apoptosis caused by the detachment of the extracellular matrix. These ἀndings provide a pleth-ora of research paths in order to attempt optimisation of cell graft survival.

CONCLUSION

The choice of cells should be determined by clinical indication. Different types of cells, whether adult or embryonic, may be effective in certain cases but less so in others. It is therefore necessary to take into consideration the patient and the speciἀc disease in order make the most appropriate choice of cells.

The improvement of transfer/survival techniques is as important as the identiἀca-tion of the “best” cell. Indeed, it is of no beneἀt to have highly effective cells if we are incapable of delivering them where they are needed and keeping them alive once delivered. Cell survival may require that the cells are delivered with their vascular support and extracellular matrix.

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Philippe Menasché

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On the symbolism of angiogenesis and anti-angiogenesis

Janine Chanteur

Departing slightly from scientiἀc research, which has brought to light the process of angiogenesis and anti-angiogenesis and is striving to master it, let us dwell brieḀy on its underlying symbolism. Such reḀection highlights two lamentable misjudgements which have entered contemporary mindsets and are jeopardising research work.

One is the unquestioning veneration of the sacredness of Nature and the other is the absurd notion that Man and animals are equals. Such convictions, and the outrageous propaganda used to publicise them, are genuinely appalling – activists are attempting to halt scientiἀc research on fallacious moral grounds based on pseudo philosophi-cal or purportedly scientiἀc arguments. In the light of the reality of angiogenesis and anti-angiogenesis, these impassioned assertions have neither rhyme nor reason, and stem from arbitrary ideas and misguided sentimentality.

ANGIOGENESIS AND THE SACREDNESS OF NATURE

Angiogenesis is considered a “natural” phenomenon, ensuring the growth of embryos and normal human development through till adulthood, and also helping to heal bodily wounds (also a “natural” process). It thus plays a vital role and encounters no difἀculties when functioning normally. This life force belongs to the so-called “bright” side of Nature, which labours to promote harmony.

In contrast, when angiogenesis evolves in an anarchic (although equally “natural”) fashion, it produces a form of life which can be considered to work “against” Life. As such, it encourages the proliferation of cancerous cells, helping them devour healthy cells and spread throughout the body via blood vessels that it either creates or hijacks. Although this is also a natural process per se, it is potentially lethal if there is no outside intervention. The voracity of cancer cells may be likened to latter-day conquerors who starved their captives to death.

So how can we come to terms with Nature, which is so admirably capable of promoting Life yet which, with equal verve, can cause death by actively encourag-ing an invasive, anarchic form of life? This “natural” phenomenon not only kills what feeds it, but may also commit suicide. It should be noted that “natural” is not

Janine Chanteur

156

synonymous with “normal” although the terms are sometimes (mistakenly) used interchangeably. “Natural” denotes how things are without any human intervention, whereas “normal” is a value judgement with legal, scientiἀc, even moral overtones. Incidentally, the two words have very different etymological roots.

Should we, therefore, continue to fantasise about the perfection of what is “natural” regardless of how it manifests itself? Or revert to the notion of the ambiguity (even ambivalence) of Nature for which Man is not responsible, even though his wrong-doing may worsen or even cause damage. Ecology is a laudable idea and worthy of respect, except when the “idea” veers towards “ideology” and its adepts fail to see that it has moved beyond well-intentioned ecology and into toying with Death. Alfred de Vigny made a harsh yet realistic comment in his poem La maison du berger where a personiἀed Nature deἀnes itself thus: “On me dit une mère et je suis une tombe” [I am known as Mother Nature, yet I am a tomb]. In fact, like angiogenesis and many other “natural” phenomena, it is both at the same time.

Although it is undoubtedly harmful and worthy of condemnation to pollute the air in our cities and pour toxic substances into the soil, oceans or rivers, it is equally wrong to worship Nature and give it power of life or death over Mankind. An idol by deἀni-tion lives off those who worship it. However, the worst thing is that the idolatrous often worship themselves - convinced they hold the Truth, zealously propagating it and attempting to crush any opposition. Think of Greenpeace and its emulators who would love to bring back obscurantism. Mutatis mutandis – cancer itself can claim as much arrogance and tenacity.

ANGIOGENESIS AND THE WORSHIPING OF ANIMALS

Research into angiogenesis revealed a process which treatments at the time were not always able to control. Once it was understood how Nature produced cancer cells, the idea came up in the 70”s to prevent them from multiplying by depriving them of their blood supply. Anti-angiogenetic drugs were discovered, thanks to experimenta-tion on animals (on mice in this instance).

Animal rights activists, without giving the slightest thought to curing the termi-nally ill ahead of the medical breakthrough, vociferously condemned the massa-cre of mice and other animals vital to research, on the pretext (and, alas, doubtless sincerely convinced) that animals have the same rights to live as Man. It is widely known that certain treatments, pharmacological or otherwise, cannot be identiἀed or developed without experimention on animals, and thus be legally used on humans without animal testing. Stringent regulations govern any experiments of this sort and are designed to prevent abuse. However, hardcore activists have no qualms about disrupting laboratory experiments, committing criminal offences and even physically assaulting research workers in order to defend animal rights. Contemporary zoolatry is a new form of idolatry – it is the worship of animals to the detriment of Man.

On the symbolism of angiogenesis and anti-angiogenesis

157

Affection and concern for animals is normal, even laudable. However, a hysterical preference for animals over people verges on the pathological. It is not because Man is a “thinking animal” (the classic deἀnition since Aristotle) that we should prefer Man to animals, but because we alone are capable of distinguishing between Good and Evil, and of acknowledging the existence of “neighbours” who we should help to cure when necessary. Even if animals have some powers of reason (an undeniable fact), they never consider it their “duty” to treat the ailments of their peers or retrieve a wounded enemy. It should be noted, moreover, that these glimmers of intelligence have not resulted in any inventions or their advancement.

CONCLUSION

To conclude, it still remains that to sacriἀce living, feeling animals is a serious act and one that is hard to face. However, although Man is the most consummate of beings (despite his all too frequent acts of evil), he is also alone in wishing to surpass himself while recognising the ever precarious nature of his achievements and accept-ing the inevitability of his own death.

It is the ἀnite nature of the human condition that makes us consider caring for our fellow men more important than an animal”s life, yet prevents us from totally ignor-ing the contradiction between affection for animals and using them in experiments. This is why we should strive to save our neighbour while doing as little harm to animals as possible. In other words, we should make every effort to do good in the knowledge that we will never achieve total success. This is why we should work for the beneἀt of Man with courage and modesty and dismissing any form of dogma-tism, without ignoring the underlying contradiction between caring for animals and making use of them. We should set our sights on moral perfection, even if we are unable to achieve it, in this life at least. It is a reḀection of the harshness, weakness and misery of the human condition, but also its undeniable value.

To me, treating both Nature and animals as sacred are exposed as blatant aberra-tions if one considers angiogenesis, a natural life-giving process which can also prove lethal, and anti-angiogenesis which, thanks to human ingenuity, offers a wonderful opportunity to save our fellow human beings.


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Hypoxia and tumor progression: new therapeutic approaches

Jacques Pouysségur

ANGIOPOIETINS AND VEGF-A: TWO KEY PLAYERS IN NEOVASCULARIZATION

Among the wide range of angiogenic factors, VEGF-A and angiopoietin are two major players in neovascularization. We know that signaling by the Tie-2 tyrosine kinase receptor when bound by angiopoietin 1 stimulates the recruitment of pericytes. The Notch pathway activated in endothelial cells maintains these cells in quiescence by blocking the cyclin D-Cdk4 pathway. When neovessel formation is required, for exam-ple in tissue repair or tumor development, angiopoietin 2, a natural antagonist of angi-opoietin 1, “turns off ” the Tie-2 receptor signaling by displacing angiopoietin 1. This process breaks down the structure of the existing capillaries, which allows vascular endothelial cells to become responsive to VEGF-A and, subsequently, the basic steps of migration and division thus ensuring neovascularization [1].

DECREASED OXYGEN PRESSURE (HYPOXIA) IS THE SIGNAL FOR NEOVASCULARIZATION

Angiopoietin 2 and VEGF-A are induced by hypoxia, and neovascularization occurs when there is oxygen deἀciency. The key regulator of the cellular response to hypoxia is the HIF factor (hypoxia inducible factor) which was discovered some 15 years ago by the Semenza group [2]. The application of hypoxic stress in cell cultures (from a wide variety of species ranging from Caenorhabditis elegans to humans) causes the rapid induction of an HIF-1α subunit. HIF-1α migrates into the nucleus and associates with HIF-1β, forming the transcription factor HIF-1, which ensures cell survival by inducing transcription of various genes. This process is extremely fast and can be observed within 10 minutes of inducing hypoxic stress. Similarly, increasing oxygen supply stops the process by preventing the further release of HIF-1α protein, which has a half life of less than ἀve minutes under normoxic conditions.


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OXYGEN SENSORS CONTRIBUTE TO THE DESTRUCTION AND THE INACTIVATION OF HIF-1α

The study of HIF-1α regulatory mechanisms, particularly by P. Ratcliffe’s group in Oxford, has revealed the key role played by a group of hydroxylases. Inactivation of HIF-1α involves three HIF prolyl-hydrolase enzymes (PHD1, 2 and 3), PHD2 being the enzyme responsible for the low levels of HIF-1α under normoxic conditions. These PHD enzymes are genuine oxygen sensors, and as such are capable of detect-ing and reading the oxygen pressure within a cell’s nucleus and cytoplasm. They have two cofactors, oxygen and 2-oxoglutarate. Under normoxic conditions, PHD2 hydroxylizes two proline residues located in the N-TAD transactivation domain. The hydroxylated proline residues are then recognized by the pVHL (von Hippel Lindau) protein, which is a subunit of a multiprotein complex with ubiquitin ligase activity that transfers several ubiquitins onto its substrate. The polyubiquitin chain is recog-nized by the proteasome catalytic system, which then rapidly degrades HIF-1α.

The Km for oxygen of these enzymes is relatively high, so that a greater than 20% decrease in oxygen levels results in a decrease in PHD activity, inducing the concom-itant stabilization of HIF-1α. The stabilized HIF-1α protein can induce genes that then participate in the genetic response to hypoxia.

In addition, the fraction of HIF-1α that escapes the proteasome is inhibited by another oxygen sensor, HIF-asparaginyl hydroxylase (FIH). FIH hydroxylates aspar-agine located in the C-TAD transactivation domain, which prevents the binding of a general transcription coactivator (p300) and prohibits the introduction of dependent genes.

HIF-1α activity is regulated by two cellular oxygen sensors, PHD and FIH, which are dependent not only on cellular pO2 but also on 2-oxoglutarate levels.

HIF-1α BIFUNCTIONALITY CONFERS GREATER FLEXIBILITY FOR ADAPTATION TO HYPOXIC CONDITIONS

We examined the physiological signiἀcance of the presence of two transactivation domains on HIF-1α and have been able to show that N-TAD and C-TAD induce different groups of genes. This observation is of both academic and physiological interest. Under high oxygen pressure in cells located near a capillary, both oxygen sensors, PHD2 and FIH, are activated and HIF-1α is degraded and/or inhibited. The intracellular oxygen gradient drops in cell populations further away from the capil-lary, PHD2 and FIH tend to be inactivated and HIF-1α is stabilized. However, PHD2 is the ἀrst of the two hydrolases to be inactivated when the decrease in intracellu-lar pO2 is moderate. Only the C-TAD transactivation area remains blocked by FIH activity which is highly sensitive to oxygen. Under these conditions, only the genes induced by C-TAD are expressed, such as the proapoptotic gene BNIP-3. When the

Jacques Pouysségur

160

cell becomes more hypoxic, both N-TAD and C-TAD areas are “freed” and the entire gene repertoire controlled by HIF-1 is induced.

Therefore, two oxygen sensors with different afἀnities for oxygen are present. These sensors act on two distinct transactivation domains and provide various responses to different oxygenation conditions (ἀg. 1).

On a physiological level, this dual mode of control gives the cell greater Ḁexibility when adapting to cellular pO2 values [3, 4].

HIF-1, A FACTOR IN CELL SURVIVAL

Inactivation of PHD2, induced by the decrease in pO2, results in the induction of the bnip-3 gene. Initially, the BNIP-3 protein was thought to induce cell death. However, it has become difἀcult to support this simple view because the bnip-3 gene is induced when oxygen pressure is moderately decreased and it does not cause cell death. Why would HIF-1, which is a survival factor, induce a gene for cell death? In fact, we found that the gene products of bnip-3 and its family member bnip-3L, both induced by HIF-1 and expressed in the mitochondria, induce autophagy [5]. When nutritional conditions decline, the cell can survive by initiating a controlled autolysis process, which supplies nutrients until adequate nutritional conditions return. This is, therefore, a survival process and it is remarkable that a decrease in pO2, the signal triggering neovascularization, also triggers the autophagic process. The decrease in intracellular oxygen pressure signals the general reduction of nutrients to which the

instability

Oxygensensors

proteasome

inactivation

Figure 1. Oxygen sensors and HIF-1α regulation.


161

cell responds by the induction of an autophagic process, which enables it to compen-sate, to some extent, for a nutritional deἀciency (ἀg. 2).

HIF-1 IS INVOLVED IN THE REGULATION OF INTRACELLULAR TUMORAL PH

Since the pioneering work in the last century by Otto Warburg, we know that most cancer cells use glycolysis, even in the presence of oxygen. This process transforms glucose into pyruvate, the ἀnal byproduct of which is lactic acid. This system, which produces only two adenosine triphosphate (ATP) molecules per glucose molecule, is inefἀcient. In addition, the accumulation of lactic acid decreases the pH locally, which can be toxic and require the implementation of pH regulation mechanisms. We have recently found that the expression of HIF-1 is crucial in this metabolic “switch” and that HIF-1 is directly involved in the regulation of intracellular pH [3].

Although hypoxia is the main factor in HIF-1α induction, other stimuli are able to increase the level of this transcription factor in certain cell types. For example, in

Vessel

Figure 2. HIF-1: a survival molecule for cells under hypoxic stress. Human colon adenocarcinoma (LS174) tumor implanted in a nude mouse. Carbonic anhydrase CAIX, a marker induced by HIF, is detected (anti-CAIX antibodies appear as the light coloured mesh-work.). This marker coincides with the expression of HIF-1α. It is detected more frequently in cells further from the vessel in the center of the ἀgure.

Jacques Pouysségur

162

oncogenic conditions, such as those caused by the deletion of PTEN, HIF-1 activ-ity can be increased even in the presence of oxygen, as a result of the Akt pathway being activated by the constitutive activation of phospho-inositide 3 kinase (PI3K). Furthermore, mutations in the HIF-1α destabilization process have been identiἀed in several types of human tumor (vhl, sdh, idh1, etc.), leading to the activation of HIF under normoxic conditions. HIF-1 induces the kinase PDK1, which prevents pyru-vate dehydrogenase activity, and which, by induction of LDH-A, somehow “forces” glycolytic metabolism, a process of ATP generation requiring an excessive consump-tion of glucose [7]. This aberrant metabolism is currently widely used in FDG-PET (F-18 Ḁuorodeoxyglucose positron emission tomography) diagnostics that detect the accumulation of the non-metabolized analogue of glucose. Beyond that, we are convinced that improved knowledge of this aberrant glucose metabolism will lead to better cancer therapy management (ἀg. 3).

HOW DO MAMMALIAN CELLS CONTROL INTRACELLULAR PH?

If intracellular pH regulation is blocked, glycolysis and glycolytic ATP production will also be blocked by a feedback mechanism. If the cell is strictly dependent on glycolysis for its energy supply, this action will cause cell death by necrosis.

Figure 3. Aberrant glucose metabolism in cancer cells. Accumulation of Ḁuoro-deoxyglucose in a case of metastatic lung cancer visualised by FDG-PET (Reproduced with permission from Beer, et al. [6]).


163

Which intracellular pH regulatory systems have been identiἀed? The sodium-proton exchanger is a universal pH regulator. It uses the sodium “inward” gradient to extract protons from the intracellular medium. This exchanger, activated at acidic pH, is the target of all growth factors. All mitogens are able to increase the afἀn-ity for the H+ regulatory site, allowing cell proliferation to impose a more alkaline intracellular pH. Lactic acid, which is also a factor in acidiἀcation of the intracellular medium, is extracted from the cell by the lactate-proton cotransporters MCT1 and MCT4. The carbonic anhydrases, especially those induced under hypoxic conditions, as discussed below, are also enzymes that can play a key role in the adaptation of cells to an acidic micro-environment.

To understand the impact of acidosis on tumor incidence, we isolated and studied a series of ἀbroblast mutants from different metabolic steps: mutants lacking phospho-glucose isomerase (pgi–), which no longer produce lactic acid, mutants lacking respi-ration (res–) and, as a consequence, are totally dependent on glycolysis and generate high levels of lactic acid, and ἀnally mutants lacking the Na+/H+ (nhe1–) exchanger.

In summary, the loss of the Na+/H+ (nhe1–) exchanger particularly affected the tumorigenicity of cells producing high levels of lactic acid. The pgi– cells formed tumors normally, even in the absence of the Na+/H+ (nhe1–) exchanger. These impor-tant results provide “proof of concept”; tumor cell pH regulators with high glycolysis are potential anticancer targets [3].

CONTROL OF INTRACELLULAR PH: WHAT IS THE CLINICAL TRANSLATION?

Under hypoxic conditions, tumor cells are forced to draw their energy from glyco-lysis and, consequently, produce large quantities of lactic acid. If the regulation of intracellular pH is inactivated, tumor development rapidly collapses.

Could this observation be translated into a clinical beneἀt by providing new thera-peutic targets?

In addition to Na+/H+ (nhe1–), carbonic anhydrase (CA) could be one of these new targets. We know approximately 13 isoforms of carbonic anhydrases, but we are particularly interested in carbonic anhydrase IX (CAIX) and XII (CAXII), which are strongly induced by HIF-1 and can be found in most human epithelial tumors.

The carbonic anhydrases are localized in the plasma membrane. Their catalytic domain, located outside the cell, catalyses the hydration of CO2 which releases bicar-bonate and a proton (H2O + CO2 = HCO3

– + H+). Bicarbonate is rapidly taken up by the cell while the proton remains in the extracellular domain. The presence of CAIX or CAXII contributes to the acidosis that is found in most solid tumors, while the uptake of bicarbonate should help maintain a more alkaline intracellular pH, allowing glyco-lysis and protein synthesis to take place in a very hostile acidic environment (ἀg. 4).

Jacques Pouysségur

164

CAIX INDUCED BY HYPOXIA PROMOTES THE SURVIVAL OF TUMOR CELLS

We have attempted to understand what beneἀt tumor cells derive from the expres-sion of CAIX and if CAIX could be a therapeutic target. Under normoxic conditions, neither HIF-1α nor CAIX are expressed, although they are strongly expressed under hypoxic conditions. We carried out a very simple experiment involving the addition of carbonic gas to a suspension of ἀbroblasts. We measured extracellular pH and demonstrated the progressive acidiἀcation of the culture medium. The same experi-ment using ἀbroblasts expressing CAIX induced very abrupt acidiἀcation of the culture medium within ἀve seconds of CO2 injection. Interestingly, the cells express-ing CAIX and incubated at acidic pH (6.5-7.0) demonstrated an intracellular pH of 0.4 to 0.2 pH units more alkaline than that of the control cells. Such a difference has considerable implications for the rate of glycolysis and ATP metabolism. We showed in vitro that cells without CAIX lose their viability under highly acidic conditions that mimic the acidic environment of tumors.

Can the expression of CAIX and CAXII be advantageous to tumor cells in vivo? In a mouse model with human colon carcinoma, we inactivated CAIX using a small RNA molecule (RNA interference) whose expression can be controlled by doxycycline. The inhibition of CAIX expression by adding doxycycline to drinking water caused a 45% decrease in tumor development. This decrease was modest, but

1800

1600

1400

1200

1000

800

600

400

200

0

Tum

or

volu

me

(mm

3 )

Days after cell injection

LS174colon adenocarcinoma

LS-shCA9 - DOX

+ DOX

- DOX

+ DOX

LS-shCA9

LS-shCA9/CA12-

LS-shCA9/CA12-45%

85%

7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29

Figure 4. CAIX and CAXII are potential targets for anticancer therapeutics.


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it appeared that reducing CAIX expression led to strong overexpression of CAXII, another carbonic anhydrase. We created cells lacking CAXII, but retaining CAIX. The development of these tumor cells was comparable to that of the control line, however inhibiting CAIX with doxycycline in these cells led to an 85% reduction of the tumor. Therefore, it appears that the carbonic anhydrases CAIX and CAXII that are induced in hypoxic areas of many tumors are relevant therapeutic targets [8].

ARE MONOCARBOXYLIC TRANSPORTERS POTENTIAL THERAPEUTIC TARGETS?

We have seen that carbonic anhydrases are not the only agents involved in the regu-lation of intracellular pH. This process involves, in particular, the lactic acid trans-porters MCT1 and MCT4. Fibroblastic cells only express MCT1. A speciἀc MCT1 inhibitor developed by AstraZeneca in ἀbroblast cultures made the cells unviable in hypoxic conditions and, in vivo, in nude mice, reduced the tumor volume by a factor of 10. However, many cancer cells, such as epithelial tumor cells, have both MCT1 and MCT4. We therefore mimicked this situation by introducing the human MCT4 form into ἀbroblasts. When these cells were placed under hypoxic condi-tions, blocking MCT1 had no effect on viability, demonstrating the crucial role of MCT4 in the functioning of glycolysis and cell survival. MCT4 would there-fore appear to be a potential target for new anticancer therapies because this trans-porter is crucial for the maintenance of glycolysis in a large number of tumors under hypoxic conditions. The future approach currently being considered is a MCT1/MCT4 double inactivation, targeting basigin (or CD147), the common chaperone of these two carriers.

CONCLUSION

We are convinced that a strategy targeting the exacerbated glycolytic metabolism of tumors is a new approach offering relatively unexplored therapeutic potential. In this paper, we have analyzed the potential to target the intracellular pH regulation of tumors. Several pH control systems are used by cells and their relative contributions in each tumor type should be analyzed in a preclinical study in mice. These models will allow the development of the best drug combinations targeting intracellular pH in order to prevent intracellular ATP production while having little impact on healthy tissue. The high proἀle of cellular metabolism in the last century has now entered a new phase where cellular physiology and molecular genetics provide new insight into tumor metabolism. These new therapeutic approaches are currently being thor-oughly explored.

Jacques Pouysségur

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An appraisal of anti-angiogenics in oncology

Olivier Rixe

Anti-angiogenics have brought about a real change in the oncologist’s profession, aligning it more closely with those of specialists in internal medicine and those of individual organs who treat diseases of the kidneys, skin, blood vessels and the gastro-intestinal tract. Adverse effects of anti-VEGF treatments, such as haemato-logical, dermatological or renal toxicity, have taken us into the realm of multidisci-plinary oncology. We have been obliged to broaden the scope of our activities and add comparative medicine to our regular arsenal, as the reports contained in this study will show.

TUMOR NEO-ANGIOGENESIS: DRUG TREATMENT FOCUSED ON MORE THAN JUST VEGF

Treatments focusing on VEGF had to aim at an “ideal” single target. In reality, the more we learn, the more we are obliged to admit that matters are far more compli-cated than we had imagined. While it is true that VEGF is an essential path used by tumor cells to stimulate vascular proliferation, there are nonetheless other pro-angiogenic factors that have been identiἀed – or that still remain to be identiἀed – whose path of action is either direct, from the tumor cell to the endothelial cell, or indirect, via the peritumoral environment and the stromal cell [1].

Despite a certain delay compared to our colleagues in cardiology, we have begun to take an interest in bone marrow precursors and their importance within the tumoral and peritumoral vascular system. It is a mistake to restrict the target of drug treatment to VEGF alone. We now have drugs that are either very “clean”, that target VEGF, or very “unclean”, viz. “dirty” drugs, that focus on several of the key factors in the angiogenic network [2]. The tools at our disposal that target VEGF and its receptor are monoclonal anti-VEGF antibodies such as bevacizumab, soluble receptors such as the VEGF Trap, and drugs that inhibit the functional part of the VEGF receptors (ἀg. 1). Trials focusing on these small molecules that are more-or-less speciἀc and have a more-or-less broad spectrum of activity are published every day.

The real advantage offered by drugs that speciἀcally target VEGF compared to those with a much wider collateral action (including all the “ibs”: e.g. sunitinib, sorafenib, axitinib, pazopanib, etc) has yet to be determined.

Olivier Rixe

168

ACTIONS OF ANTI-VEGF STILL POORLY UNDERSTOOD

In reality, our understanding of what happens when we administer an anti-VEGF is extremely limited. It is true that the rarefaction of the vascular system is clearly linked to regression in tumor volume. It has been shown that the use of a type 2 anti-VEGF receptor in mice reduces tumor volume to an extent that is entirely compara-

SorafenibSunitinib

VEGF

VEGFR-2

VEGFR-1VEGFR-3

PDGF

PDGFR

PDGFR kit

signal transduction cascadevascular permeability, cell survival,

proliferation, migration

SunitinibSorafenib

vasculogenesisangiogenesis

lymphangiogenesis

angiogenesis

pericyte

SunitinibSorafenib

Sorafenib

Sunitinib

Raf

Ek

MEK

endothelial cell

tumor cell

tumorautocrine stimulation

angiongenesistumor interstitial pressure

proliferationsurvival

Figure 1. Sites of action of anti-angiogenics.


169

ble to that of vascular rarefaction [3]. However, the scope of action of anti-VEGFs would appear to be much broader. It is highly probable that they have a direct anti-tumor action. For instance, sunitinib has an anti-tumor action in vitro against cell cultures, thus in the absence of any vascular system. It has also recently been shown that tumor cells are capable of mobilising normal bone marrow cells and causing them to migrate to premetastatic niches, thus preparing this new environment for the tumor to take hold [4]. The tumor supposedly releases a signal by way of VEGFR-1 and VEGFR-2 and prepares these niches for potential secondary tumors by making them adhesive. These bone marrow cells settle on healthy lungs, liver and bone and then, attract tumor cells to enable them to proliferate and allow secondary metastases to develop. This phenomenon mediated by VEGFR-1 and VEGFR-2 may constitute a further important drug impact point, which would explain the reduction in new metastases when inhibitors of these receptors are used.

VEGFs thus also appear to be implicated in the immunosuppression phenomena that are observed in the tumor environment. VEGF produced by tumor cells inhibits the maturing of dendritic cells in the tumor environment, and these cells then appear to be unable to induce anti-tumor effector T-lymphocyte responses.

STARTLING DEMONSTRATION OF VALIDITY OF THE ANTI-VEGF CONCEPT

Effective anti-VEGF treatment tools were developed during the early 2000s, with sunitinib being one of the most powerful. The phase 1 study for this drug was performed in France [5]. One of the ἀrst patients treated was suffering from a meta-static renal carcinoma. His lung metastases regressed almost completely, which was, in itself, proof that the anti-VEGF concept was valid. However, this level of efἀcacy in treating tumors from as early as phase 1 is quite exceptional in oncology.

Phase 2 was performed on the other side of the Atlantic, with the regimen that was developed at the Institut Gustave-Roussy: four weeks of treatment p.o. followed by two weeks off [6]. A standing ovation was given when the results were presented at the American Society of Clinical Oncology (ASCO) in 2005. The lesions had regressed in 42% of the 60 patients treated. Although their renal tumors had been considered as being resistant to any form of medication, they proved sensitive in almost one case out of every two, with their response lasting about 14 months and a median survival period of two years. On the basis of this study that was conducted in only 60 patients, the drug was approved by the Food and Drug Administration (FDA) in the US in the ἀrst instance, and then by the European authorities; this was subsequently conἀrmed by an extensive phase 3 study [7], which compared sunitinib with one of the standard treatments for metastatic disease. This drug has doubled the duration of progression-free survival. The median survival period changed from 21 months in the standard interferon group to 26 months in the sunitinib group. The

Olivier Rixe

170

small difference between the two treatment groups can be explained in particular by the change to sunitinib by patients initially treated with interferon, which tends to bring the two survival curves into alignment.

MAJOR IMPACT ON PROGRESSION-FREE SURVIVAL

At the same time, at the Pitié-Salpêtrière hospital, we were working on another anti-VEGF, axitinib [8, 9]. Signiἀcant results were also observed with this agent as from phase 1 in various types of tumor, particularly in metastatic renal carcinoma. The particular interest of axitinib is that it very speciἀcally inhibits types 2 and 3 VEGF receptors and therefore has very little effect on the other receptors involved in angio-genesis or on other tyrosine kinases. We treated 50 patients, with objective responses in 44%; full remissions persisted beyond four years.

STUDIES HAVE FAILED TO DEMONSTRATE A BENEFIT IN TERMS OF PROLONGED SURVIVAL

The treatment strategy for renal carcinoma was completely overturned by these few trials, including key studies also performed with bevacizumab and sorafenib. In 1980, guidelines for treatment of renal carcinoma advocated the use of progesterone, cytotoxics (vinblastine) and particularly immunotherapy using interferon and inter-leukin-2. However, the results of treatment were still unremarkable. The arrival of the anti-angiogenics turned these recommendations around completely, and now 80% of patients with renal carcinoma are – or will be – given treatment that directly targets the vascular growth factors.

What is the real impact however, of anti-VEGF treatments in terms of prolonged survival? Of all of the phase 3 studies published on renal carcinoma using anti-angiogenic treatments, only one showed a survival beneἀt of about six months achieved with sunitinib compared to the reference treatment (interferon). The other studies have shown positive results with regard to survival without relapse.

DEVELOPMENT OF NEW TREATMENT STRATEGIES

Oncologists have developed two different strategies. One makes use of a single-treatment approach with VEGF receptor inhibitors in renal carcinoma and hepato-carcinoma. The results of randomised studies are positive, with a relatively modest impact on progression-free survival (one to three months) in the case of hepato-carcinoma, and longer for renal carcinoma. For other tumor types (breast, lung or colon cancer), anti-VEGFs have been used in combination with conventional treat-ment, chemotherapy in particular. These trials revealed a synergy between chemo-therapy and bevacizumab. The exact mechanism of action however, is still not fully understood. Although this activity has been demonstrated for most tumors, includ-


171

ing those affecting the colon, lung or breast, and with response rates greater than those observed with chemotherapy alone, the impact remains moderate in terms of progression-free survival and overall survival. Other indications for largely “orphan” tumors are currently being developed. Phase 2 studies on thyroid tumors and neuro-endocrine carcinoid tumors of the pancreas have recently been published. Signiἀcant response rates have been achieved and phase 3 trials are therefore being carried out. Bevacizumab is currently being assessed in the treatment of glioblastoma.

THE QUESTION OF RESISTANCE TO ANTI-ANGIOGENIC AGENTS

Do these anti-angiogenic treatments increase long-term survival? The response is clearly “very little”. The phase 2 trial of axitinib is one of the few in which patients are still alive after more than four years. The improvement in response rates achieved with anti-angiogenic treatments has not really translated into complete responses and real improvements in long-term survival rates. What is the reason behind this? Mechanisms of resistance to anti-angiogenics are currently the subject of numerous publications.

There are two types of resistance to anti-VEGF treatment [10]: intrinsic resistance, in which the patient does not respond to anti-angiogenic treatment at all, and acquired resistance, where, following an initial phase of rarefaction, the vascular network once again begins to proliferate and spread. The mechanisms involved would appear to be highly variable. The phenomenon by which vessels escape anti-VEGF treat-ment therefore equates to a reactivation of tumor angiogenesis that is independent of VEGF and associated with hypoxia-mediated induction of other pro-angiogenic factors, including members of the ἀbroblast growth factor (FGF) family. Treatment with FGF inhibitors reinitiates vascular rarefaction. As a consequence, targeting the VEGF pathway will derepress other pathways such as that of FGF, which will consti-tute a signiἀcant escape mechanism.

Another resistance mechanism involves a sub-population of stem cells in the myeloid line. These cells inἀltrate the tumor and render it resistant to anti-VEGFs. It must be emphasised that these cells are highly sensitive to chemotherapy, which could explain the synergy of action achieved by associating an anti-VEGF with a cytotoxic.

TOWARDS IDENTIFICATION OF PATIENTS LIKELY TO BENEFIT FROM ANTI-ANGIOGENIC TREATMENTWe are still unable to identify patients who will respond to anti-angiogenic treatment. EGFR ampliἀcation and KRAS mutations make it possible to identify patients who will respond to erlotinib. Herceptin is effective in 40% of patients with an ampliἀca-tion of the HER2 gene. Imatinib is active only in patients suffering from a stromal tumor with c-kit overexpression in association with particular mutations that have been fully identiἀed. Nonetheless, we are still unable to identify the anomalies in the VEGF receptor that would enable us to predict anti-VEGF activity.

Olivier Rixe

172

Even so, certain factors (mainly clinical) can be related to a treatment response. For example, patients who develop hypertension during treatment with axitinib tend to have a better survival rate than others. The onset of hypertension (elevated diasto-lic levels) is therefore a factor that is related to the efἀcacy of an anti-angiogenic treatment, probably indirectly associated with improved bioavailability of the drug in these patients [8, 11].

What are the future prospects for the various types of anti-angiogenic treatment? Should they be used in combination? Should their spectrum of activity be broad-ened? Should they be used at an earlier stage, particularly as adjuvant treatment? Is it possible to identify sub-groups of patients who are likely to respond to treatment? Should the independent VEGF pathways also be targeted? As the presentations at this meeting showed, physicians from different medical disciplines such as cardiol-ogy and oncology have similar questions.

The future of these drugs in clinical use lies in identifying factors that will predict the response to this targeted treatment, which will make it possible to improve their therapeutic index.

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173

Anti-angiogenesis and eye disease; age-related macular degeneration


OCULAR NEOVASCULARISATION: THE INITIAL CONCEPTS

In 1948, Michaelson, an ophthalmologist at the University of Jerusalem, postulated the existence of a factor released by the hypoxic retina and stimulating vessel growth in the context of vascular development and diseases. Michaelson also raised the possibility of blocking this factor x at some stage in the future, once it had been identiἀed [1].

MEDIATORS OF OCULAR NEOVASCULARISATION

Michaelson’s hypothesis was conἀrmed more than 40 years later, when VEGF (vascular endothelial growth factor) was identiἀed as a major player in neovascular eye diseases. As for any biological process, it is becoming clear that VEGF is not the sole mediator involved in the angiogenic process. More generally, it is currently thought that there is a balance between pro-angiogenic factors, chieḀy VEGF, PDGF (platelet-derived growth factor), FGF-2 (ἀbroblast growth factor-2) and natural antiangiogenic factors, particularly PEDF (pigment epithelium-derived factor), which is synthesised by the pigmented epithelium in particular. Recently, Chemtob et al. in Montreal showed that the accumulation of succinate in the hypoxic retina acts as a powerful media-tor of angiogenesis and that this agent is involved in ischaemic diabetic retinopathy. Succinate acts by way of its receptor, GPR-91 (G protein-coupled receptor 91), the effects of which are themselves mediated by retinal ganglion cells which, in response to an increase in succinate levels, regulate the production of numerous growth factors, VEGF in particular [2].

AGE-RELATED MACULAR DEGENERATION: MECHANISMS OF NEOVASCULARISATION

Our chief focus here is age-related macular degeneration (ARMD). This common condition affects 1.5 million people in France, one-tenth of whom are deemed to


174

be blind. Until the early 2000s, very few treatment options existed and these were essentially limited to laser treatment, which was applied in very speciἀc forms of the disease, covering fewer than 8% of patients, in whom the neovessels appeared outside the macula.

The mechanism leading to the formation of neovessels in ARMD has not been explained as clearly as it has in diabetic ischaemia or venous occlusion. The role played by local inḀammation appears increasingly evident in the light of the many genetic studies highlighting the role of complement factor polymorphism in predispo-sition to this disease. Among the different mechanisms that would appear to co-exist, ischaemia plays a relatively obscure part. One hypothesis that has now been accepted though is still to be conἀrmed, suggests that a given level of VEGF would appear to maintain the structure and function of choriocapillary circulation in the normal retina. Then, as the subject ages, the accumulation of debris in the retina inhibits oxygen distribution toward the photoreceptors, and this in turn leads to hypoxia, with an increase in VEGF synthesis contributing to neo-angiogenesis.

CHOROIDAL NEOVASCULARISATION IN ARMD

ARMD begins with a thickening of the macula. Fluorescein or indocyanine green angiography reveals the presence of neovascularisation with exudates that feed the macular oedema. There are thus two elements making up the disease: neovascular proliferation and the vascular hyperpermeability that follows it. The neovascularisa-tion is the cause of the exudation and haemorrhages in the region of the macula.

The efἀcacy of drug therapy used in ARMD would appear to be related to their action on vascular permeability as well their anti-angiogenic effect per se. Indeed, it is interesting to note that VEGF is also known as vascular permeability factor. Clinical experience has shown that, in terms of improving macular function, the main target of anti-VEGFs is very likely to be vascular permeability.

Our particular interest lies in the exudative form of this disease. Its atrophic forms are also common, but are characterised by involution of the vessels and thus a patho-logical process that is the opposite of that observed in the exudative form [3].

ADVANCES IN TREATMENT IN RESPONSE TO OCULAR NEOVASCULARISATION

Neovessels do not provide an effective response to ischaemia. Their ectopic location means that they do not have a signiἀcant effect on the oxygenation of ischaemic tissue. They are however, responsible for severe, blinding complications, essentially as a result of ἀbrosis and secondary retraction.

With a view to identifying treatment options, it was therefore reasonable to target new vessels. Historically, lasers have been used mainly in diabetic retinopathy for


175

ablation of ischaemic tissue (retinal panphotocoagulation). This procedure is a form of amputation, involving sacriἀcing the tissue so as to limit the synthesis of VEGF and pro-angiogenic factors, but is performed to the detriment of the neurons that are destroyed in the process.

Although this form of treatment cannot be considered satisfactory, does this mean nevertheless that anti-VEGFs are an ideal alternative? VEGF does play a part in the process of neovascularisation but also has a key role in the physiological proc-esses of vascularisation. Thus, in the adult eye, the VEGF receptors are expressed on the endothelium, but also in the retinal cells, regardless of whether they involve the pigmented epithelium or photoreceptors. VEGF has a pro-inḀammatory effect and it is probably involved in ensuring that the choriocapillaries remain trophic. Lastly, it has been shown that VEGF plays a neuroprotective role [4, 5]. Anti-VEGFs could therefore have a toxic effect on the retinal neurons, with consequent changes in the electroretino-gram and thus in visual function, which could pose a problem for both long-term and repeated treatment, although this has not been established beyond doubt.

INVESTIGATION INTO EFFECTS OF VEGF ON THE EYE

The role played by VEGF in the retina has been investigated mainly by way of exam-ining the consequences of intra-ocular injection. The effects of this treatment vary from one species to another. In rats, for instance, it results less in the formation of neovessels than in vascular dilation and very marked diffusion. The main effect of VEGF in this case is thus increased vascular permeability, which may well be related to a pro-inḀammatory effect. In monkeys, on the other hand, VEGF leads to the formation of neovessels [6, 7].

Investigation into the pathological role of VEGF has been conducted principally by Malecaze et al. and Plouet et al. in France, and by Aiello et al. in the US, who demonstrated the increase in VEGF concentrations in different pathologies, and particularly in diabetic retinopathy (ἀg. 1), while this phenomenon was less evident in ARMD [8, 9]. The numerous studies showing that blocking VEGF resulted in the inhibition of neovascularisation have formed the basis for the development of anti-VEGF strategies in ophthalmology in recent years [10 – 12].

ANTI-VEGF STRATEGIES

Macular oedema and preretinal neovascularisation are the main indications for anti-VEGFs in ARMD. Intravenous administration is possible, but the intravitreal method is most commonly used, and is currently performed on a routine basis in the form of monthly injections. The drugs that have already been registered for commercial use, or are still being studied, target RNA that codes for VEGF: VEGF itself, VEGF receptors or the tyrosine kinase activation pathway [13].


176

Pegaptanib sodium and ranibizumab are currently approved for use in ophthalmol-ogy. Ranibizumab is a fragment of bevacizumab that appears to offer better penetra-tion of the eye with enhanced afἀnity. Clinical trials have chieḀy shown a reduc-tion in diffusion, and thus a reduction in the macular oedema. Above all, treatment with ranibizumab stabilises visual acuity and has even been shown to improve it in approximately one third of patients. This treatment has without doubt been a major step forward in terms of treatment: visual acuity is stabilised or even improved in 90% of patients whereas until recently, ophthalmologists were relatively powerless in this indication (ἀg. 2) [14]. Tolerability of ranibizumab would appear to be satisfac-tory, even though the risk of stroke remains.

VEGF TRAP: SELECTIVE OR NON-SELECTIVE BLOCK?

The VEGF Trap is a soluble VEGF receptor that is currently in phase 3 of clinical development. It is a non-speciἀc receptor that binds all forms of VEGF and appears,

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No ProliferativeDisease

No PDR

Diabetes Mellitus Iris Neovascularization

QuiescentQuiescent PDR ActiveActiveCRVO

Active PDR

CRVO: central retinal vein occlusion; PDR: peripheral diabetic retinopathy.

Figure 1. Concentrations of immunoreactive VEGF in ocular Ḁuids from patients undergoing intra-ocular surgery. (Reproduced with permission from Aiello, et al. [9]).


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in vitro, to be 140 times more effective than ranibizumab. Its main appeal lies in permitting a considerable interval between doses.

The question of whether to opt for selective or non-selective VEGF blocking has been widely debated, particularly with regard to the important physiological func-tions of the angiogenic factor. Experimental studies have shown that, although block-ing VEGF-165 alone may be ineffective against physiological vascularisation, the overall inhibition provided by ranibizumab could, conversely, be associated with undesired effects on vascularisation [15, 16]. Pegaptanib is a speciἀc aptamer with a strong afἀnity for VEGF-165 that has been approved for ophthalmological use. Its efἀcacy has been demonstrated versus no treatment at all, with a beneἀt in terms of visual acuity. However, this treatment only slows the loss of vision, whereas “pan-VEGF” blocking stops it entirely, and in some cases even improves visual acuity. As a consequence, pegaptanib has not enjoyed the same success as the “pan-VEGF” approach in ophthalmology. This may be explained by the anti-oedema effect of ranibizumab.

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+20.8letters*

24 months

Sham injection, 1 injection/month (n = 238)Ranibizumab 0.5 mg, 1 injection/month (n = 238)

PDT, 1 injection every three months if necessary (n = 143)

Ranibizumab 0.5 mg, 1 injection/month (n = 139)

*p < 0.01

*p < 0.01

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Figure 2. Stabilisation and improvement in visual acuity with ranibizumab in ARMD. (Reproduced with permission from Rosenfeld, et al. [14]).


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A recent article in Cancer Research reported data relating to VEGF-165b, a sub-type of VEGF-165, which appears to have anti-angiogenic effects. Inhibition of VEGF-165 could therefore have a double effect, simultaneously pro- and anti-angiogenic, and targeting this factor may well prove difἀcult due to a lack of speciἀcity [17, 18].

OTHER ANTI-ANGIOGENIC STRATEGIESVarious anti-angiogenic strategies are currently being developed. Clinical trials are under way to assess tyrosine kinase inhibitors. A topical form of an Src kinase inhibitor, a VEGF antagonist, has been studied but was found to cause corneal lesions, which greatly reduces its appeal, except from the perspective of improved pharmacokinetics.

Ophthalmology was one of the ἀrst disciplines to use interfering RNAs. Trials have shown a beneἀt compared to no treatment at all, though this remains slight in comparison to what is achieved with anti-VEGFs. A phase 3 trial, currently under way, is assessing their use from the perspective of stabilisation, as follow-on treat-ment from anti-angiogenics. Nonetheless, interfering RNAs remain controversial. They appear to bring about a non-speciἀc inhibition of neovascularisation by means of the Toll R3 pathway. Toll R3 receptors are present in the pigmented epithelial cells and activation by interfering RNAs could be associated with cell death. Interfering RNAs could thus have non-speciἀc effects on the pigmented epithelium.

OTHER MEANS AND PATHWAYS OF TREATMENTAlternative approaches are currently under consideration, such as gene therapy using AdPEDF (Adenovector Pigment Epithelium-Derived Factor). Animal studies have shown that increased expression of PEDF in the eye could prevent angiogenesis.

The concept of using combined treatments has also been raised. Friedlander, of the Scripps Research Institute, thus suggested attacking the angiogenic process simul-taneously at three levels. He suggests intervening on the triggering of the process of neo-angiogenesis using an anti-VEGF aptamer, drawing on the αvβ3 and αvβ5 integrins to counter neovessel proliferation and, lastly, using T2-TrpRS, a soluble factor that inhibits neovessel maturation.

CONCLUSIONAnti-angiogenics are nowadays an integral part of everyday ophthalmological prac-tice, and this must be considered as a major step forward. Every day, hundreds of patients are given anti-VEGF injections. These treatments are, however, still costly and lengthy, and the long-term consequences are not known. Moreover, the atrophic forms of ARMD remain incurable. Great hopes are therefore placed in the clinical trials currently under way and also in our ability to prevent the complications of this disease.


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Tumor blood vessels: a major therapeutic target

Gérard Tobelem

A VISIONARY, A CONCEPT

Angiogenesis, the growth of new blood vessels, is an essential process in embryonic development and tissue repair. This process is deregulated in various pathological conditions, notably cancer, but also during inḀammatory, ischemic, infectious and immunological diseases.

Modern angiogenesis began in 1971 with Judah Folkman who devoted his whole life, up until his recent death on 14 January 2008, to research in the ἀeld of angiogen-esis. He originally trained as a surgeon, then went on to become professor at Havard and Director of the Vascular Biology Program at Boston Children’s Hospital. For many years however, Folkman was confronted with scepticism from the medical and scientiἀc community as a result of his avant-garde hypothesis published in 1971 [1]. One has to recognise that at the time, it was no more than a hypothesis resulting more from a “vision or a revelation” than from robustly supported research. Folkman’s vision: a dream in that era!

Cancerous tissue is like any other tissue in that it needs nutrients and oxygen carried by blood vessels in order to grow, multiply and expand. In light of this observation, the notion of the “angiogenesis dependence” of tumors arose. Accompanying tumor progression from a dormant stage to one of invasive growth and metastatic dissemination, blood vessels were thought to undergo a phenotypic change, the famous “angiogenic switch”. From then on, at least for Folkman the visionary, inhibiting angiogenesis appeared quite naturally as a new anti-cancer therapeutic strategy consisting quite simply of starving the cancer by depriving it of blood vessels. Thus, with this pioneer, the ἀrst concept of targeted therapeutics for cancer was born, a strategy which today is undergoing tremendous development. Although for nearly two decades, only a small number of initiated scholars were interested in angiogenesis, it is no longer the case today with the anti-angiogenesis approach to the management of cancer now well accepted into the daily clinical practice of oncologists, ophthalmologists and soon other specialists too.


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Four years before his sudden death (very probably an ischemic heart attack), Folkman was able to see with satisfaction that his dream had become reality. Today, tumor blood vessels are a major target for cancer treatment and indications are becoming increasingly more common in colorectal, breast, lung, and kidney cancers. Likewise, the number of registered drugs is increasing, and many others are in pre-clinical and clinical development phases. This has become a key area of research for phar-maceutical and biotechnology industries. There are now vast numbers of academic research groups working on the molecular and cellular mechanisms of angiogenesis. This mobilisation reḀects the stakes: there are many questions remaining regarding fundamental research as well as therapeutic aspects. Targets are more clearly deἀned and anti-angiogenetic approaches are becoming more and more complex. A better understanding of the characteristics of tumor blood vessels is today at the origin of some very promising translational research.

WHAT ARE THE CHARACTERISTICS OF TUMOR NEOVESSELS?

Tumor neovessels are extremely abnormal: they are disorganised, anarchically distributed, permeable and fragile. To survive, they require continual presence of VEGF (vascular endothelial growth factor) which is necessary for their proliferation and also for the increase in their permeability. Their pericyte coverage is weakened. Consequently, there is an increase in the intratumoral interstitial pressure which, on one hand, promotes the spreading of tumor cells to the blood or lymphatic system, i.e. metastasis, and, on the other hand, hinders access by chemotherapy to the tumor cells. Hypoxia, which is present within the tumor, induces further genetic instability and selects the most malignant tumor cells. Thus, tumor blood vessels are profoundly abnormal in terms of phenotype, markers and haemodynamics. They are at the heart of a major remodelling process. Certainly they are more abundant than normal blood vessels, with capillary density being increased in many cancers, but they are above all qualitatively different from normal blood vessels. We have demonstrated this in a murine hepatocarcinoma model [2, 3], as have other research groups [4]. In summary, we can say that tumor blood vessels express a signiἀcant arterial speciἀca-tion: angiogenic endothelial cells are positive for Notch 4, Dll4 and ephrin-B2, mark-ers which are normally only present (and to a lesser extent) on arterial endothelial cells. Vascular remodelling is in fact the result of hyperstimulation by VEGF, which is expressed even more greatly when the hypoxia inside the cell is increased. Thus, there is a cascade which we were able to clarify in our murine hematocarcinoma model, and also in vitro in endothelial cell cultures: VEGF → Notch 4 → Dll4 → ephrin-B2. This remodelling brings about modiἀcations in blood Ḁow. Indeed, using Doppler ultrasonography, we were able to demonstrate in this model that an increase in blood Ḁow velocity in the hepatic artery precedes carcinoma diffusion [5]. Altogether, these phenotypic modiἀcations, changes in the expression of molecular

Gérard Tobelem

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markers, and haemodynamic disruptions result in the profound vascular remodeling which occurs in the tumoral vasculature.

WHAT ARE THE ANTI-ANGIOGENIC THERAPEUTIC STRATEGIES?

There are currently three approaches: the growth of new vessels can be blocked, neovessels can be destroyed or, and this is an emerging approach, they can be made even more abnormal. Genuine anti-angiogenics are used for the ἀrst strategy [6, 7], and molecules known as vascular disrupting agents (VDA) are used for the second [8]. These two groups have different targets, different mechanisms of action, and possibly even different therapeutic indications and methods of administration. The third and most recent approach, involves blocking Dll4 [9-12].

Given the major role of this growth factor in vascular remodelling, the main target of anti-angiogenics is VEGF and/or its receptors. Anti-angiogenics are now more clearly understood, and some of them are more and more widely used in oncologists’ daily clinical practice. In line with Folkman’s initial theory, it was expected that anti-angiogenics would inhibit the growth of new tumoral blood vessels, or even destroy existing neovessels. The fact that endothelial cells rely on VEGF for their survival gave further hope to this expectation. On the other hand, the resulting increase in hypoxia would have made it even more difἀcult for chemotherapies to gain access to the tumor. Yet, this did not occur. On one hand, strict anti-VEGFs, such as bevacuzimab, did not appear to be effective against tumors when used alone; on the other hand, associating them with standard chemotherapy enhanced the effect of the chemotherapy. In fact, although these anti-angiogenics, and anti-VEGFs in particular, are expected to inhibit the growth of tumor neovessels, they have also been shown to normalise tumor vascu-lature, and this was an unexpected effect. This concept was developed by Jain [13, 14], and conἀrmed by other research groups, including ours. The loss of VEGF brought about by an antibody or a binding compound which inhibits its receptors causes the angiogenic endothelial cells to revert to a normal arterial phenotype. The result is haemodynamic normalisation, improved oxygenation of the tumor cells, and therefore enhanced accessibility for and sensitivity to classic anti-cancer treatments (chemother-apy or radiotherapy). If the anti-angiogenic treatment exclusively targets VEGF (as is the case for bevacizumab, for example) it will demonstrate limited efἀcacy when used as a monotherapy because signiἀcant anti-tumor activity is only seen when they are used in combination with chemotherapy and/or another targeted drug. Furthermore, as long as the tumor cells persist, it seems logical to pursue this therapeutic approach in order to prevent any new resurgence of angiogenic activity.

VDAs, the second class of anti-angiogenics, are still being developed. They are therefore less well understood. This group is made up of two types of molecules:

Firstly, tubulin-binding agents (at the colchicine binding site of the tubulin – β sub-unit), which depolymerize microtubules, thus disrupting the cytoskeleton of the endothelial


183

cell. They also act on VE-cadherin by interfering in endothelial cell-endothelial cell contacts; the chief molecule in this category is combrestatin A4 phosphate;

Secondly, Ḁavanoid analogues, which cause apoptotic lesions in endothelial cells; –the classic example of a molecule in this class is DMXAA (5,6-dimethylxanthenone-4-acetic acid).

VDAs destroy established tumor blood vessels by targeting the immature endothe-lial cells and pericytes of these blood vessels. In reality, endothelial cells are highly dependent on their tubulin cytoskeleton for mobility, invasion, attachment, align-ment and proliferation. VDAs therefore bring about a rupture of the cytoskeleton and cell-cell contacts. This results in destructive disorganisation, a veritable collapse of the neovessels, greater hypoxia and therefore more tissue necrosis downstream of the destroyed blood vessels. But while this cytotoxicity occurs in the centre of the tumor, in the periphery a veritable crown of viable tumor cells seem to persist; passive diffusion from adjacent normal blood vessels ensures their nutritional support. This crown can represent a large contingent of cancerous cells which are likely to start growing again. In principle, these activated endothelial cells are more sensitive to VDAs, but initial clinical studies seem to show that a normal vascular endothelium can also be affected. This results in signiἀcant cardiac and neurological side effects. We must therefore wait for the results of ongoing phase 2 studies to determine if the risk/beneἀt ratio is favourable.

The third approach is even more recent. Dll4, which is activated by VEGF, binds to Notch, and in return negatively regulates VEGF, thus limiting the abnormal hyper-angiogenesis which arises from the over-expression of VEGF. Its inhibition produces a paradoxical effect whereby angiogenesis increases and tumoral mass is reduced. In fact, blocking Dll4 is equivalent to letting the VEGF pathway spiral out of control; this increases the number of neovessels, but also their abnormalities. As a result, there is an increased number of non-functional new blood vessels without directional blood Ḁow, and therefore more tumoral hypoxia. The inhibition of Dll4 creates more vascular abnormalities within the tumor, and the imperfect angiogenesis which is thus induced is accompanied by regression of the tumor. This approach appears very promising in vitro and in vivo in animal models, and also to complement other strat-egies, notably in cases of resistance to VEGF blocking. Thus, the use of anti-Dll4 antibodies or soluble Dll4 (soluble Dll4 blocks the Notch receptor without triggering the signalling cascade and prevents endogenous Dll4 from accessing it) has demon-strated robust antitumor activity in numerous models.

SO SHOULD WE NORMALISE, DESTROY OR “ABNORMALISE” TUMOR BLOOD VESSELS?

Currently, only anti-angiogenics (notably VEGF inhibitors) have demonstrated proven efἀcacy in several therapeutic indications. The clinical development of VDAs

Gérard Tobelem

184

is not yet completed and so we cannot gamble on their future as therapeutic drugs without taking risks. As for Dll4 blockers, the most important question is to deter-mine their tolerability before verifying if the proof of pathophysiological concept is conἀrmed in cancer patients.

Anti-angiogenic strategies are today a realistic option, even though numerous ques-tions remain regarding the drugs in this therapeutic class: which dose, which combina-tions, which administration regimen, what treatment duration, what are the markers of efἀcacy or primary or acquired resistance, what are the long-term effects? Much has yet to be conἀrmed or demonstrated. Amongst these questions, that of the administra-tion regimen is crucial. If the concept concerning the window of normalisation elabo-rated by Jain is followed, would it not be more effective to use a different sequence of administration than that of giving the anti-angiogenic and chemotherapy at the same time? Should we not ἀrst of all normalise tumor blood vessels through an initial admin-istration of anti-VEGF, and then, after a given period (12 hours, 24 hours, 48 hours?), administer the reference chemotherapy? Another crucial question is that of the impor-tance of the real beneἀt given to patients. The impact is still weak, but surely, the pallia-tive treatment of today is an investment for the curative treatment of tomorrow.

In reality, the same sorts of questions exist with regard to VDAs. According to preclinical studies and initial clinical phases, it seems unlikely that VDAs will be effective as a monotherapy. The persistence of the viable tumoral crown is probably the reason for this. The option of a combination with chemotherapy (possibly low dose metronomic chemotherapy) has therefore already been adopted. The ἀrst phase 2 results are encouraging. But again, there is the question of the regimen: should both treatments be used concomitantly or should they be staggered? Another option could be to associate VDAs and anti-angiogenics. Indeed, initiating treatment with an anti-angiogenic after a VDA makes sense in addition to the growth inhibition and to maintain the remaining viable tumor cells in a dormant stage since they are deprived of angiogenesis.

And ἀnally, the right answer to the question “normalise, destroy or abnormalise?” is perhaps “all three!”, though not necessarily at the same time; all three would make up the right combination of strategies to help us take another step forward towards improved survival. And also to make Folkman’s dream live on!

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Limitations and complications of anti-angiogenic treatments

Jean-Jacques Mourad

Anti-angiogenic drugs (bevacizumab, sunitinib, sorafenib) are becoming more and more widely used in the treatment of advanced colon, breast, lung, liver and kidney cancers. Their mechanism of action is based on inhibition of VEGF (vascu-lar endothelial growth factor), a pro-angiogenic factor. The side effects of this inhibition are not clearly understood by doctors.

AN IMPORTANT ROLE IN MAINTAINING MICROTUBULAR HOMEOSTASIS

A lack of VEGF is lethal or causes major anomalies during embryogenesis and develop ment. In adults, on the other hand, it was thought that this factor was only involved in the menstrual cycle, wound healing, and hair growth. It was therefore thought that an anti-VEGF would mainly act on blood vessels with high turnover, notably tumor blood vessels (ἀg. 1) [1].

However, clinical trials and pharmacovigilance have rapidly identiἀed speciἀc complications associated with these treatments, demonstrating that VEGF plays

Age

Embryogenesis/postnatal development Adulthood Adult pathogenesis

VasculogenèseVasculogenesis

Angiogenesis Choroidsystem

formation

Hyaloidsystem

formation

VEGFdeficiency

Partial VEGFinhibition

Lethal Abnormalpulmonaryvessels and

lungdevelopment

inhibitionof choroidalformation(in vitro)

absence ofchoriocapillaris

vascular maintenance

HeartTrachea Brain Lungs

Kidneys

Eyes

VEGFinhibition

Partial VEGFinhibition

VEGFinhibition

Reducescapillariesin mucosa

Alveolarcell loss

Enlarges airspaces

Angiogenesis

Reproductivecycle Hair

growth

Woundhealing

Angiogenesis

Tumors Maculaoedema

NeovascularAMD

Proliferativeretinopathies

VEGFinhibition

VEGFinhibition

VEGFinhibition

Prolongssurvival

Maintainsvision

Reducesmacular

thickening

CNVreduction

Maintainsor

improvesvision

VEGF+

VEGF–

AMD: age-related macular degeneration; CNV: choroidal neovascularization.

Figure 1. VEGF: a key role in vascular homeostasis. (Reproduced with permission from Bhisitkul [1].)


187

an important role in the maintenance of circulatory homeostasis, especially in the microcirculation, and that inhibition of VEGF brings about a decrease in capillary density, with the magnitude of this decrease depending on the tissue in question [2]. Signiἀcant capillary regression can be seen in the pancreas, thyroid, adrenal glands, pituitary gland, choroid plexus, and intestinal villi. The extent of this regression is dose-dependent and reaches 68% in the thyroid.

VEGF INHIBITION AND PROTEINURIA

VEGF is produced by podocytes, and is a strong modulator of capillary permeability; it acts by inducing fenestration of the glomerular capillaries. VEGF-inhibition is associated with a loss of fenestration, thus bringing about glomerular dysfunc-tion with, in particular, the apparition of proteinuria [2] (ἀg. 2). This complication, frequently associated with the use of anti-VEGFs, is dose-dependent and usually reversible after treatment is discontinued.

A BControl Ad-sVEGFR-1 14d

Renal glomerular capillaries

sVEGR: soluble VEGF receptor.

Figure 2. Loss of capillary fenestration associated with VEGF inhibition. (Reproduced with permis-sion from Kamba, et al. [2]).

VEGF INHIBITION AND RISK OF HYPERTENSION

The most common complication associated with anti-angiogenic treatments is arte-rial hypertension. A recent review of medical literature reported hypertension in a quarter of patients on bevacizumab with the relative risk varying between 4 and 7 compared to controls [3]. It is however worth noting that clinical trials use the usual NCI-CTCAE (National Cancer Institute - Common Terminology Criteria for Adverse Events) which do not contain any of the international recommendations for the diagnosis or management of hypertension. The ἀrst trials to study the risk of hypertension associated with bevacizumab demonstrated a toxic dose-response effect. It is present regardless of the method of VEGF inhibition, and has also been

Jean-Jacques Mourad

188

demonstrated with sorafenib [3]. Clinical manifestations associated with hyperten-sion, such as reversible posterior leukoencephalopathy associated with severe hyper-tension, have been reported, but fortunately remain rare [4-8].

MECHANISMS OF ONSET OF SECONDARY HYPERTENSION ASSOCIATED WITH ANTI-ANGIOGENIC TREATMENT

The pathophysiological mechanisms underlying this effect have not been widely studied. It was only in 2006 that the ἀrst article examining the reasons for the occur-rence of hypertension in patients receiving anti-angiogenics was published. The authors hypothesised that the cause was hormonal modiἀcations, but were neverthe-less unable to demonstrate this [9].

In reality, we know that peripheral resistance, essentially localised in the microcir-culation, plays a central role in the mechanism of hypertension. It has been demon-strated that arterial-capillary rarefaction plays a decisive role in the development of hypertension, and that it appears at a very early stage in the natural history of hypertensive patients.

In partnership with Professor Bernard Lévy from the Lariboisière imaging labora-tory, we carried out a study with the aim of detecting a possible association between hypertension and capillary rarefaction in patients receiving anti-angiogenic treat-ment. After 6 months of bevacizumab treatment, an increase in blood pressure was observed in all the patients included (n = 18). In particular, intravital videocapillar-oscopy of the ἀnger demonstrated a dose-dependent decrease in capillary density (table 1 and ἀg. 3) [10, 11]. Our observations were consolidated by another study, which found the same results with telatinib, a tyrosine kinase inhibitor [12].

In the same study, using laser Doppler Ḁowmetry, we were able to establish the existence of major endothelial dysfunction with total inhibition of pilocarpine-induced vasodilation associated with bevacizumab treatment [11].

Table 1. Change in dorsal ἀnger skin capillary density following treatment with bevacizumab (from Mourad et al. [11]).

n = 18 Baseline 6 months p (Student’s t-test)

SBP (mmHg) 129 ± 13 145 ± 17 0.0001

DBP (mmHg) 75 ± 7 82 ± 7 0.0001

Basal capillary density 84 ± 13 75 ± 12 0.0001

Maximal capillary density 90 ± 13 81 ± 11 0.0001

SBP: systolic blood pressure; DBP: diastolic blood pressure


189

HYPERTENSION: A PREDICITVE FACTOR OF THE ACTIVITY OF ANTI-ANGIOGENIC TREATMENT

A study presented at the American Society of Clinical Oncology (ASCO) in 2005 however, provided new evidence likely to draw the attention of oncologists to the question of hypertension related to treatment with anti-angiogenic agents: it showed a signiἀcant correlation between survival of patients receiving bevacizumab and gemcitabine for pancreatic cancer and an early increase in blood pressure (p = 0.007) [13]. Thus, hypertension seems to be an early marker of the anti-tumoral activity and efἀcacy of bevacizumab (table 2).

In 2007, Professor Olivier Rixe also published a study showing that hyperten-sion was signiἀcantly associated with an improved response to sunitinib in patients

25

20

15

10

5

0

R2 = 0.43; p = 0.008

0 1000

Cumulative dose of bevacizumab

Red

uct

ion

of

cap

illar

y d

ensi

ty o

bse

rved

at 6

mo

nth

s (n

° ca

pill

arie

s/m

m2 )

2000 3000 4000 5000

Figure 3. Dose-dependent effect of bevacizumab on the reduction of cutaneous capillary density. (Reproduced with permission from Mourad, et al. [11]).

Table 2. Survival rates according to early hypertension status (from Friberg, et al. [13]).

Cohort n Survival (months) 95% CI

No HTA 40 8.7 7.3-9.7

Early HTA 6 13.7 9.6-inἀnity

All admissible patients 46 9.0 7.7-10.5

Jean-Jacques Mourad

190

with metastatic renal cancer. The presence of grade 3 hypertension, according to the NCI-CTCAE classiἀcation, in 22% of patients was associated with a more nota-ble response to anti-angiogenic treatment [14]. These results have recently been conἀrmed by a study of patients with metastatic colon cancer treated with beva-cizumab. Around one third of patients developed hypertension. A response rate of 75% and median survival of 13.7 months were observed in the hypertensive patients compared to 32% and 8.7 months respectively in normotensive patients [15].

ESTABLISHING GUIDELINES

Is the question of an increased risk of iatrogenic hypertension really crucial when the treatment in question leads to an increase in life expectancy? In reality, oncolo-gists only really began to consider this issue once the Food and Drug Administration (FDA) banned the use of bevacizumab in patients with hypertension or signiἀcant proteinuria.

This decision may well have had signiἀcant repercussions on treatment implemen-tation, with hypertension and/or proteinuria delaying the initiation of anti-angiogenic therapy.

For this reason, guidelines for the management of hypertension and proteinuria in patients requiring anti-VEGFs have recently been established by various schol-arly Societies in France (Société de Néphrologie, Société Française d’Hypertension Artérielle, Association Pédagogique Nationale des Enseignants de Thérapeutique, and Fédération Francophone de Cancérologie Digestive). The main message of these guidelines can be summarised in four points [16]:

the existence of ambulatory hypertension or raised blood pressure ἀgures reported –in an outpatient setting (except for rare cases of acute hypertension), or proteinuria (except for rare cases of massive proteinuria) does not justify postponing the ἀrst dose of an anti-angiogenic agent;

patients who are due to receive their ἀrst dose of anti-angiogenic treatment should –continue to receive this treatment in the vast majority of cases, regardless of their blood pressure readings the day they are admitted for treatment;

there is no reason to administer an oral or IV antihypertensive medication prior –to initiating anti-angiogenic treatment, even if blood pressure on that occasion is elevated;

there is no particular reason to suspect that patients due to receive their ἀrst dose of –anti-angiogenic treatments will present exceptional acute hypertension. If this does occur however, they should be managed in a specialist unit.

Fundamentally, the aim is to avoid delaying programmed chemotherapy on the pretext that the systolic blood pressure is elevated, because these patients are likely to respond well to treatment. Blood pressure is frequently monitored in the location where the chemotherapy is performed, i.e. in non-satisfactory conditions. Ambulatory


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blood pressure monitoring should be the preferred approach. We are currently trying to promote self-measurement of blood pressure at home, thus avoiding the stress of the oncology outpatient department.

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angiogenèse et anti-angiogenèse angiogenesis and anti

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