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APPLICATIONS PRATIQUES DE LA TECHNIQUE DE PCR QUANTITATIVE
EN TEMPS REELCongrès ATC 2012Myriam SEJORLaboratoire de CytogénétiqueService du Pr B. BENZACKENHôpital Jean VERDIER
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La PCR quantitative en temps réel
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Principe de la PCRq
Les trois étapes d’un cycle de PCR:1. Dénaturation 95°C 1 min2. Hybridation 55-60°C 1 min3. Élongation 72°C 1 min
~ 35 cycles
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Principe de la PCRq• En PCR classique PCR classique , le produit amplifié est détecté lorsque les
cycles de PCR sont terminés.
• La PCR quantitativePCR quantitative détecte et mesure l’accumulation du produit amplifié au cours de la réaction (détection rendue possible en ajoutant une molécule fluorescente au mélange réactionnel).
• Le thermocycler mesure une émission de fluorescence proportionnelle à la quantité d’ADN amplifié à chaque cycle.
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Chimie SYBR Green•Fluorochrome s’intercalant spécifiquement dans l’ADN double brin nouvellement synthétisé.•Sous une excitation UV, émet un signal de fluorescence dont la mesure permet de quantifier l’ADN double brin.
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Autre marqueur fluorescent
• Sonde fluorescente spécifique: La technologie TaqMan®
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Cycles de la PCRq
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Principe de la PCR
• Augmentation du nombre d’amplicons (produits de PCR) selon une exponentielle d’ordre 2 (2n)
droite en échelle logarithmique
• jusqu’à épuisement des réactifs (dNTP, amorces…) plateau
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Une ligne seuil d’intensité de fluorescence est déterminée arbitrairement (au-dessus du bruit de fond) de façon à ce qu’elle coupe la courbe d’amplification dans la phase exponentielle de la PCR.
La valeur Ct cycle seuil ou « threshold cycle »
Ct Ct
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La valeur Ct cycle seuil ou « threshold cycle »
• Plus quantité ADN diminue Plus Ct augmente.Donc le Ct est inversement proportionnel au nombre de copies d’ADN initiales à amplifier, d’où l’aspect quantitatif de la PCRq. Le Ct est reproductible.
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La quantification relative• Détermination du nombre de copies d’un gène d’intérêt cible
relativement au nombre de copies d’un gène de référence. • Gène de référence: PTEN sur le chromosome 10• Gène servant de Contrôle interne: gène du facteur IX (F9) sur
le chromosome X.• Un témoin masculin et un témoin féminin.
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La quantification relative
• La méthode de calcul utilisée par le logiciel StepOne™ est la méthode desCt :
Méthode des Ct :
1. Ct gène cible – Ct gène de référence = Ct
2. Ct patient – Ct témoin = Ct
3. Variation de 2-Ct
Livak et al 2001, Methods
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Choix des amorces
• Amorce: petites séquences oligonucléotidiques (~20b) bornant la séquence cible à amplifier.
• Utilisation de plusieurs sites informatiques de bases de données:
Site Database of Genomic Variants (DGV)Site EnsemblSite NCBI logiciel PrimerBlast
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Choix du gène cible sur DGV
• Localisation de la séquence cible, trouvée anormale en ACPA.• Choix du gène qui paraît le plus pertinent.
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Choix des séquences sur Ensembl
• ADN génomique du gène cible.
• Distinction exons/introns.• Possibilité de choisir des
séquences contenant des exons pour le choix des amorces.
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Choix des amorces par PrimerExpress
• Logiciel recherchant les 50 meilleures combinaisons de paires d’amorces (« forward » et « reverse »), à partir de la séquence cible choisie.
• Sélection des amorces ne comportant pas (dans la mesure du possible):
Configuration en « hairpin » ou épingle à cheveux
Formation de « self-dimer » et « cross-dimer »
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Spécificité des amorces sur PrimerBlast (NCBI)
• Vérification de la fixation spécifique de la paire d’amorces choisie sur la séquence cible.
• PrimerBlast permet de savoir si les amorces ne se fixent pas ailleurs sur le génome humain.
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Test d’efficacité des amorces par PCRq
• Gamme d’étalonnage en cinq points faite avec un ADN témoin.
• PCR réalisée en duplicate.• Élaboration d’un plan de
manipulation (plaque de 96 puits).
• Appareil à PCRq en temps réel: StepOne Plus™.
• Efficacité acceptée entre 90% et 125%.
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Technique de PCRq
• PCRq faite pour le patient et pour ses parents en même temps: détermine caractère de novo ou hérité de l’anomalie.
• Chaque échantillon d’ADN (patient, parents, témoins M et F) fait en triplicate.
• ADN dilué à 5 µM.• Gène de référence PTEN.• Gène de contrôle interne F9.• Puits contrôle négatif en duplicate.• Élaboration d’un plan de technique (plaque de 96 puits).• Feuille de calcul des Mix de PCR.
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Technique de PCRq
• Appareil PCRq StepOne Plus™.• Durée de la PCRq: 2h30.• Résultats analysés par le logiciel de l’appareil. • Résultats sous forme de courbes, graphes et diagrammes.
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Cas Pratique: Duplication
• Enfant de 8 ans (garçon)• Clinique: omphalocèle, malformations
ophtalmologiques• Caryotype normal• Résultat ACPA : duplication en 3p26.3• Taille : 413 kb
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Résultat ACPA
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Gène cible sur DGV
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Test d’efficacité des amorces
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Résultat PCRq
Patient Mère Père
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Cas Pratique : Délétion
• Enfant de 13 ans (fille)• Clinique: Psoriasis, hypotrophie, retard de
croissance, paraplégie spastique• Caryotype normal• Résultat ACPA : délétion en 13q12.11• Taille : 80 kb délétion non visible en
technique de FISH
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Résultat ACPA
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Gène cible sur DGV
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Test d’efficacité des amorces
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Résultat PCRq
Patient Mère
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• Enfant de 10 ans (fille)• Clinique: dysmorphie, retard psychomoteur• Caryotype normal• Résultat ACPA : triplication en 12p12.3• Taille : 1,3 Mb
Cas Pratique : Triplication
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Résultat ACPA
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Gène cible sur DGV
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Test d’efficacité des amorces
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Résultat PCRq
Patient Mère Père
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• Test en une seule fois du patient et des parents
• Meilleure résolution que la FISH pour les duplications
• Rapide (partie analytique)• Reproductible• Spécifique du gène cible• Ne nécessite que de petites
quantités d’ADN du patient (200ng/patient)
• Mise au point et commande de nouvelles amorces pour chaque anomalie à vérifier
• Partie pré-analytique longue
• Nécessité de réplicas• Peu de patient par plaque
de PCR (96 puits) (deux familles au max)
Avantages Difficultés
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Remerciements
• Pr Brigitte BENZACKEN, chef de service• Dr Andrée DELAHAYE (PCRq)• Dr Eva PIPIRAS (ACPA)• Toute l’équipe technique du laboratoire: Evelyne, Céline,
Nathalie, Véronique et Jean.
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Merci de votre attention