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8/13/2019 APUNTESME

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UNIVERSIDAD DE CHILEFACULTAD DE MEDICINA

ESCUELA DE TECNOLOGA MDICAMORFOFISIOPATOLOGA Y CITODIAGNSTICO

Microscopalectrnica

Apuntes de Clases IV Ao

PROF. ENCARGADO: T. M. Nancy Olea RossonPROF. COORDINADOR: T. M. Nancy Olea Rosson

AYUDANTE T. PRCTICOS: T. M. Marta Gacita

2003

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Microscopa Electrnica Gabriel Rodrguez 1

Del Microcosmos al Macrocosmos: Una Visin de la MicroscopaElectrnica y su Contribucin al Conocimiento del Universo.

Prof. Gabriel RodrguezIDIEM

Martes 30 de Septiembre de 2003

a sed de conocimiento del ser humano le ha llevado a indagar la composicin de suentorno y de s mismo, para as descubrir de qu forma lo existente se interrelaciona. Estainfinita necesidad de aprender lo ha llevado a observar desde su medio ms inmediato hasta el

plano de lo nfimo o ms bien pequeo (el subuniverso microscpico) y de lo abismantementeenorme y/o lejano (el subuniverso macroscpico), comenzando a entender con ello la granvariedad de estructuras, formas, diseos y entidades existentes en el Universo.

Al iniciar este curso de Microscopa Electrnica, haremos una breve pero didcticarevisin de cmo el ser humano ve y los medios de apoyo que ha desarrollado para la visin yobservacin de su mundo. Nuestro entorno lo vemos con nuestros sentidos, y particularmentecon el sentido de la vista. El ser humano puede ver medidas limitadas en torno a l; de hecho elmetro fue creado como medida de referencia considerando la estatura del ser humano, y sobreesta base se crearon subunidades y amplificaciones de la unidad referencial (micrometros,milmetros, centmetros, decmetros, kilmetros, etc.). El ser humano puede ver, en trminosinferiores a la unidad, objetos de milmetros de dimetro, y por debajo de 0.2 mm le es difcil vera simple vista, en tanto que en dimensiones grandes, a distancias mayores de 1 km le resulta pococlaro distinguir objetos grandes. Cuando los objetos son muy grandes, debemos alejarnos para

poder contemplarlos. Por ejemplo, hasta el siglo XV el ser humano no se percat de la redondezde la Tierra, pues se pensaba que era plana y si bien existan hiptesis sobre la posibilidad de suredondez, no exista la certeza fehaciente de ello, pues no existan medios de transporte yobservacin que permitieran verla desde lejos. Entonces se deba rehacer poco a poco lageografa para entender cmo era su forma. Afortunadamente hay objetos ms lejanos que

podemos visualizar, pero que por su distancia debemos acercarlos a la vista, lo mismo quecuando queremos ver objetos muy pequeos. Dada la capacidad de la vista de ver slo puntosdistantes entre s a un mximo de 0.2 mm (lmite de resolucin, mnima distancia a la que 2objetos separados entre s pueden ser distinguidos como 2 entidades diferentes). Este lmite deresolucin se da porque uno ve realmente el ngulo bajo el cual esos 2 puntos se observan (lo queest dado por la distancia a la que los fotorreceptores estn separados entre s).

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Las Dimensiones del Universo- Gabriel Rodrguez 1

Del Microcosmos al Macrocosmos: Una Visin de laMicroscopa Electrnica y su Contribucin al Conocimiento del

UniversoProf. Gabriel Rodrguez

IDIEMMartes 30 de Septiembre de 2003

La sed de conocimiento del ser humano le ha llevado a indagar la composicin desu entorno y de s mismo, para as descubrir de qu forma lo existente se interrelaciona.Esta infinita necesidad de aprender lo ha llevado a observar desde su medio ms inmediatohasta el plano de lo nfimo o ms bien pequeo (el subuniverso microscpico) y de loabismantemente enorme y/o lejano (el subuniverso macroscpico), comenzando a entendercon ello la gran variedad de estructuras, formas, diseos y entidades existentes en elUniverso.

Al iniciar este curso de Microscopa Electrnica, haremos una breve pero didcticarevisin de cmo el ser humano ve y los medios de apoyo que ha desarrollado para lavisin y observacin de su mundo. Nuestro entorno lo vemos con nuestros sentidos, y

particularmente con el sentido de la vista. El ser humano puede ver medidas limitadas entorno a l; de hecho el metro fue creado como medida de referencia considerando laestatura del ser humano, y sobre esta base se crearon subunidades y amplificaciones de launidad referencial (micrometros, milmetros, centmetros, decmetros, kilmetros, etc.). Elser humano puede ver, en trminos inferiores a la unidad, objetos de milmetros dedimetro, y por debajo de 0.2 mm le es difcil ver a simple vista, en tanto que endimensiones grandes, a distancias mayores de 1 km le resulta poco claro distinguir objetos

grandes. Cuando los objetos son muy grandes, debemos alejarnos para podercontemplarlos. Por ejemplo, hasta el siglo XV el ser humano no se percat de la redondezde la Tierra, pues se pensaba que era plana y si bien existan hiptesis sobre la posibilidadde su redondez, no exista la certeza fehaciente de ello, pues no existan medios detransporte y observacin que permitieran verla desde lejos. Entonces se deba rehacer pocoa poco la geografa para entender cmo era su forma. Afortunadamente hay objetos mslejanos que podemos visualizar, pero que por su distancia debemos acercarlos a la vista, lomismo que cuando queremos ver objetos muy pequeos. Dada la capacidad de la vista dever slo puntos distantes entre s a un mximo de 0.2 mm (lmite de resolucin, mnimadistancia a la que 2 objetos separados entre s pueden ser distinguidos como 2 entidadesdiferentes). Este lmite de resolucin se da porque uno ve realmente el ngulo bajo el cual

esos 2 puntos se observan (lo que est dado por la distancia a la que los fotorreceptoresestn separados entre s).

2003. Alumnos de la Mencin Morfofisiopatologa y Citodiagnstico. Escuela de Tecnologa Mdica. Facultad de Medicina.Universidad de Chile. Prohibida su reproduccin total o parcial, y su publicacin con fines acadmicos sin mencin a losautores. Su utilizacin debe ser solicitada expresamente a los autores

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LAS DIMENSIONES DEL UNIVERSO

Gabriel Rodrguez J. (socio 41) El Universo, desde el micro al macrocosmo, tiene dimensiones que la mente

humana difcilmente llega a comprender. Por un lado estn las partculas subatmicas,infinitamente chicas, que rayan en la nada misma. Por otro lado estn los espaciosintergalcticos que son tan grandes que cuesta entender que la luz, que viaja a la pasmosavelocidad de 300 mil kilmetros por segundo, demore miles de millones de aos enrecorrerle. Pero as es.

El problema de imaginar ms o menos correctamente esas dimensiones pasa pornuestra limitacin mental de comprender cabalmente los grandes nmeros. Estamosfamiliarizados con las unidades comunes, milmetros, metros y kilmetros, tiles en eldiario vivir, los que comprendemos correctamente porque los usamos a menudo, pero rarasveces nos codeamos con dimensiones de millones de millones de kilmetros o, en el otroextremo, millonsimas de millonsimas de milmetro. Entonces, cuando nos enfrentamos atales cantidades, perdemos la nocin de lo que ellas representan verdaderamente. Muchasveces manejamos grandes cantidades con demasiada liviandad, hablamos por ejemplo deuna riqueza de mil millones de pesos o de un trabajo que demand un milln de horas-hombre o de un vehculo que tiene un milln de kilmetros recorridos o que la poblacinmundial llega a 6 mil millones de habitantes, etc. Se ha detenido Ud a pensar realmente loqu significan esas cifras? Sabe Ud. que si contramos a razn de un nmero por segundosin descansar da y noche, demoraramos once das y medio en contar un milln? Otroejemplo, si todos los habitantes del mundo actual se pusieran en fila india y pasaran frente aalguien que los contabilizara a razn de una persona por segundo, ese alguien demorara190 aos en contarlos! En el intertanto la poblacin mundial crecera y, como lo haceduplicndose cada 30 aos aproximadamente, significa que ese alguien estara eternamentecontando, sin poder nunca acabar su tarea. Otro caso: cuntos segundos cree Ud. que hantranscurrido desde que Cristbal Coln descubri Amrica, hace algo ms de 500 aos? A

primera vista se creera que es un nmero gigantesco, casi inexpresable. No es tanto. Larespuesta es aproximadamente 15 mil millones de segundos(producto de multiplicar 500aos por 365 das por 24 hora por 60 minutos y por 60 segundos). Curiosamente esta cifraes la edad del Universo desde su nacimiento hasta ahora, si cada segundo equivaliese aun ao!

Cun lejos est la Luna? Si consideramos nuestra conocida unidad de distanciallamada kilmetro (equivalente a 1000 metros) entonces la distancia Tierra-Luna es algomenos de medio milln de kilmetros (exactamente 384.500 km). Esta es una enormedistancia que en nuestro diario vivir casi no se usa. Pero todo es relativo porque si en vez deusar el kilmetro como unidad usamos la distancia de la Tierra al Sol (llamada por losastrnomos unidad astronmica , que equivale a 150 millones de kilmetros!), entonces ladistancia Tierra-Luna resulta ridculamente chica, algo as como 3 milsimas partes de esa2003. Alumnos de la Mencin Morfofisiopatologa y Citodiagnstico. Escuela de Tecnologa Mdica. Facultad de Medicina.Universidad de Chile. Prohibida su reproduccin total o parcial, y su publicacin con fines acadmicos sin mencin a losautores. Su utilizacin debe ser solicitada expresamente a los autores

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distancia. Es decir que si el Sol y la Tierra fuesen dos puntos que estuviesen a 100 metrosde distancia la Luna estara a menos de 30 cm de la Tierra. Cun cerca est la Luna y qulejos est el Sol! Sin embargo, en nuestra vida comn, consideramos que la Luna est muylejos, tan lejos que los astronautas que viajaron a ella, demoraron ms de tres das en llegara su destino aun cuando se desplazaban a velocidades de unos 30.000 kilmetros por hora

aunque haciendo un recorrido en espiral.Estas comparaciones muestran que a nuestra mente le cuesta bastante darse cuenta

lo que significan los grandes nmeros que, por decirlo crudamente, usamos tan sueltos decuerpo. En otras palabras, las unidades corrientes, por ejemplo metros, resultanridculamente chicas si las usamos para medir la distancia a las galaxias y ridculamentegrandes si la usamos para medir cosas pequeas, tales como microbios o partculasatmicas.

Veamos algo ms del macrocosmos. La estrella ms cercana a nosotros se llamaPrxima Centauro y est a 4,3 ao-luz 1, vale decir que se encuentra a unas 270.000 vecesla distancia Tierra-Sol, repito 270.000 veces la distancia de la Tierra al Sol que, a suvez, es de 150 millones de kilmetros!Es algo casi inimaginable verdad?y esto es sloel principio de las distancias astronmicas pues se han podido fotografiar galaxias que estna ms de 10 mil millones de aos luzde nosotros.

Una manera didctica de representar estas cantidades es hacer saltos de 10 en 10, esdecir crecer (o decrecer) en factores de diez. Me explico, es posible hacer una escala(similar a una regla graduada en centmetros) en que cada mdulo sea 10 veces superior alanterior (los matemticos la llaman escala logartmica). Para ejemplarizar hagamos en un

papel una escala logartmica. Tracemos una recta y hagamos una marca cada centmetro demodo que cada una valga 10 veces la anterior, del siguiente modo: primera marcarepresenta 1 metro, segunda marca representa 10 m, tercera marca 100 m, cuarta marca1000 m, quinta marca 10.000 m, sexta marca 100.000 m y as sucesivamente. (Para evitartener que escribir tantos ceros, puede emplearse el mtodo que usan los matemticos, esdecir colocar un exponente junto al nmero 10 que represente el nmero de ceros quetendra la cantidad que se quiere representar, por ejemplo, el valor cien, que tiene dos ceros,se representa como 10 2 ; mil, que tiene tres ceros, se escribe 10 3 ; un milln, que tiene seisceros, como 10 6 , y as sucesivamente. Como la distancia Tierra-Sol es de 150 millones dekm, se representa abreviadamente como 150 x 10 6 kilmetros o bien en nuestra escalalogartmica en metros sera 150 x 10 9 metros.

Pues bien, para representar el tamao del Universo 2 en metros es necesario hacer 26marcas en la regla en que cada una valdra 10 veces la anterior. En una tal regla podramos

2003. Alumnos de la Mencin Morfofisiopatologa y Citodiagnstico. Escuela de Tecnologa Mdica. Facultad de Medicina.

1 Un ao-luz es la distancia que la luz recorre en un ao a la velocidad de 300.000 km/seg. Equivale amultiplicar los 365 das por 24 horas por 60 minutos por 60 segundos y por 300.000 = 9.5000.000.000.000km, lo que se puede escribir abreviadamente 9,5 x 10 12 km (se lee 9,5 billones de kilmetros). Para expresaresta cantidad en metros hay que multiplicar por mil, vale decir que se llega a 9,5 x 10 15 metros.2 El tamao del Universo puede calcularse multiplicando su edad por los metros que la luz recorre en un ao .Como la actual estimacin de la edad del Universo desde que ocurri el Big Bang o gran explosin

primogenia es del orden de 15 mil millones de aos y, puesto que la luz inicial viene viajando desde

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representar cualquier distancia aproximada, por ejemplo, la altura de una casa de 10 metros(10 1 ) o la altura de una torre de 100 metros ( 10 2 ), o la distancia Tierra-Sol que como sedijo es de 150 mil millones de metros (150 x 10 9 ), etc. En la Tabla final se muestran estasy otras distancias hasta llegar a cubrir el tamao total del Universo.

Similarmente se pueden representar cantidades pequeas. Por ejemplo, un dcimode metro puede escribirse en forma decimal 0,1 m. Un milsimo de metro (llamadomilmetro, mm) se escribe 0,001 m. Para llevarlo a nuestra escala se escribe en formaexponencial similar a como se hizo anteriormente con los grandes nmeros, colocandocomo exponente de 10 el nmero de ceros que contiene el decimal y anteponiendo un signomenos (-) para sealar que es fraccionario. As los nmeros decimales sealadosanteriormente como ejemplo, se escriben del siguiente modo: 0,1 m se escribe 10 1 m, y 1mm que equivalente a 0,001 m se escribe 10 3 m y as sucesivamente.

En este mbito, una hormiga de 2 mm puede escribirse como 2 x 10 3 m ; unmicrobio de un milsimo de mm se puede escribir 10 6 m ; el tomo de hidrgeno tiene untamao de 10 12 m y un protn 10 18 m.

Como se dijo el radio del Universo mide 10 26 m y un protn mide 10 18 m loque significa que desde el microcosmos al macrocosmos hay una relacin de 10 18 hasta10 +26 = 10 44 . Es decir el Universo es 10 44 veces ms grande que un protn, cifra que deno disponerse de una escritura abreviada habra que escribirla del siguiente modo:

100000000000000000000000000000000000000000000

En la pgina siguiente se muestra una tabla en escala logartmica donde se sealanlos tamaos del macrocosmos.

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entonces, el radio total del Universo ser de 9,5 x 10 15 metros multiplicado por la edad 15.000.000.000 deaos lo que da muy aproximadamente la bonita cifra de 1,4 x 10 26 m.

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ESCALA (LOGARTMICA) PARA REPRESENTAR EL TAMAO DE OBJETOSObjeto Tamao metrosAltura de un nio 1 m 100

Altura de una casa de 3 pisos 10 m 101 Altura Torre Entel 100 m 102 Longitud de 1 kilmetro 1.000 m 103 Distancia Santiago-Lo Espejo 10 km 104 Distancia Santiago-Valparaso 100 km 105

Distancia Santiago-Puerto Montt 1.000 km 106 Distancia Polo-Ecuador 10 mil km 107 2,5 vueltas a la Tierra 100 mil km 108

2/3 del dimetro del Sol 1 milln km 109

26 veces la distancia a la Luna 10 millones km 10102/3 distancia Tierra-Sol 100 1011Distancia Sol-Saturno (1 hora-luz)1 mil 1012 10 h-l dimetro Sistema Solar 10 1013 100 h-l, espacio vaco 100 1014

1000 h-l 1 billn km 1015 1 ao-luz (a-l), zona de cometas 10 1016 10 a-l , zona con algunas estrellas 100 1017 100 a-l estrellas, nebulosas, etc. V.Lctea 1000 1018 1000 10000 1019

10.000 100000 1020

100.000 dimetro Va Lctea 1 milln de billones km 1021 1.000.000 espacio vaco, Andrmeda 10 milln de billones km 1022 10.000.000 galaxias, Grupo Local 100 1023 100.000.000 galaxias 1000 1024 1.000.000.000 10000 102515.000.000.000 radio del Universo 100000 1026

En resumen, el macrocosmo est compuesto en su tamao por 6 niveles:

Pri mer n ivel. Nuestro mundo cotidiano, mensurable en metros o kilmetros.Segundo ni vel . Nuestro Sistema Solar mensurable en millones de km. Tercer ni vel. Grupo de estrellas cercanas al Sol mensurable en aos-luz.Cuar to nivel . Nuestra Va Lctea mensurable en miles de aos-luz.Quin to nivel. Grupos de galaxias mensurable en millones de aos-luz.Sexto nivel. Universo mensurable en miles de millones de aos luz

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MET Juan Carlos Olavarra 6

Microscopio Electrnico de Transmisin MET)Prof. Juan Carlos Olavarra

IDIEMMartes 30 de Septiembre de 2003

El microscopio electrnico de transmisin se ha instituido desde su creacin en los ao30 en una herramienta de apoyo fundamental para el entendimiento de la ultraestructura dentidades biolgicas y no biolgicas. En esta presentacin haremos una revisin prcticorientada a aspectos tcnicos del funcionamiento del microscopio electrnico.

Aquellos que hemos trabajado con microscopios pticos hemos logrado obtener aumento prcticos de 1000 veces, pero sabemos que cambiando la fuente de luz o radiacin (por ejempempleando radiaciones UV), puede variarse el aumento de un microscopio. Esto se basa enlimitacin que pone la longitud de onda utilizada en el poder o lmite de resolucin de umicroscopio. En la medida que la longitud de onda empleada es menor, la resolucin (distanc

mnima a la que 2 cuerpos cercanos deben estar separados para ser distinguibles como entidaddistintas) aumenta. Si consideramos que el ojo humano tiene una limitada capacidad de visique slo comprende las radiaciones ubicadas entre los 350 y 700 nm (violeta a rojo, rangvisible del espectro de longitudes de onda), y que no percibe ni las longitudes de onda inferiora 350 nm (UV, radiacin X, , , , rayos csmicos) ni aquellas superiores a 700 nm (IR,microondas, ondas de radio, TV), nos encontramos con la sorpresa de tener una pobre percepcide nuestro entorno (Figura 1). Nuestro lmite inferior llega a niveles de longitudes de onda qcumplen con las condiciones exigidas a la luz, es decir, reflejadas, focalizadas y colimada(concentradas), pero no deflectadas, salvo que sufran efecto de masas tal como lo explica la teode la relatividad de Einstein.

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Figura 1: Longitudes de Onda de los diferentes tipos de radiacin existentes.

El manejo de las longitudes de onda nos permite determinar los lmites de ampliacin de limgenes. En la microscopa de luz empleamos fotones, en tanto que en microscopa electrnila muestra es iluminada por electrones. stos son de un manejo relativamente fcil. Se ilumi puntualmente, con un menor lmite de resolucin. Puede tomarse una seal y trasladarla espectro visible.

Sin embargo, tienen una baja penetracin pese a la alta aceleracin que se les puede imprim por lo que es necesario que las muestras sean muy finas. Dependiendo del espesor y el peatmico (P.A.) de la masa en observacin, ser la penetracin que tengamos. A mayor peatmico, menor penetracin. Generalmente, el material observado en biologa es de PA bajo.

El MET empleado en biologa se caracteriza por tener bajas aceleraciones de electrones, ent40 y 100 kV. Al aumentar la energa de los electrones por mayor kV aplicados, se les imprimmayor velocidad, pudiendo pasar desde el estado esttico a la velocidad de la luz.

Componentes del Microscopio Electrnico de Transmisin:

En el esquema que sigue, se presentan de manera simplificada los diferentes componentdel MET:

(i). Sistema de iluminacin: Constituido por un can de electrones, encargado de emitir haz electrnico que incidir sobre la muestra, y por un sistema de lentes condensadoras qucoliman o pulen el haz, mantenindolo recto.


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(ii). Sistema ptico o de magnificacin: Constituido por una lente objetivo, lentes intermediy una lente de proyeccin, que amplifican la imagen del espcimen.

(iii). Pantalla: Encargada de convertir la seal del haz de electrones que traspas la muestra, eluz visible, permitiendo que se vea el espcimen.

(iv). Sistema de grabacin: Consistente en placas fotogrficas, sistema de video o sistema dcaptura digital, que permite el almacenamiento de la informacin ptica de la muestra, lo que necesario para el anlisis de las muestras.

a. Can: El can es la fuente de electrones que incidirn en la muestra. Se comportcomo una fuente electromagntica (FEM), aportando aceleracin a los electrones. El can econstituido por un sistema de transmisin termoinica, que se comporta como un conductor (qtiene electrones libres; diferente es el caso de los aislante, cuya cantidad de electrones libres nfima o nula) en que al calentar el conductor aumenta la cantidad de electrones libres en material conductor, por fuerzas que producen una nube electrnica en torno a este material. Estelectrones libres, al ser estimulados con una energa mayor a aquella que los mantiene unidos tomo del que forman parte, son expulsados del orbital en que se encuentran y pueden viajar pel vaco hasta que encuentren un objeto en su camino.

Cuando se pone una placa positiva (+) respecto del elemento, sta atrae los electronelibres que se mueven por el espacio; debemos recordar que esta libertad de movimiento escondicionada a que no exista algn elemento que interfiera en el trayecto de estos electronePara que los electrones se desplacen libremente el camino a seguir por ellos debe estacompletamente libre, por lo que es necesario proporcionar vaco extrayendo gases de la column


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El aire que respiramos tiene una densidad de 1kg por m3

; cuando lo calentamos seaumenta el volumen por aumento de la energa cintica de los tomos que lo componen. Pcada kg de aire, cuando es calentado, aumenta en la carga que ste puede elevar. Por ejemp para elevar a una persona de 100 kg se requieren 200 m3. Los electrones que se encuentran en elaire tienen poca masa comparados con los de algunos metales, principalmente aquelloempleados en microscopa electrnica. Uno de ellos es el oro, cuya densidad es 20 kg/l; el a por contrapartida tiene una densidad y peso equivalente a 20000 veces menos. Cuando existe u perforacin en la pantalla, la mayora de los electrones quedan detenidos en el nodo, peaquellos que pasan a travs de la perforacin viajan por el vaco en direccin al infinito con u baja eficiencia.

El nodo mide de 4 a 5 mm2, en tanto la perforacin mide 3 mm de dimetro. Elfilamento generador de electrones tiene forma de punta en V y est conectado a la FEM. Cuanalcanza la temperatura de 1000 C este filamento incandesce, generando trabajo y potencia.

El filamento es un pequeo alambre de 1 cm por lado; no importa la polaridad pues lFEM se encarga de calentar el filamento aumentando con ello la energa cintica de los electronde la punta del filamento. En el otro extremo del circuito hay un nodo, que es un elemencircular con una perforacin central, cuyo potencial es (+). Dado que los electrones se repelentre s por similitud de cargas, estos se dirigen hacia el nodo.


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Protegiendo al filamento se encuentra un componente denominado Cilindro de Wehnelque focaliza el haz de electrones. A travs de la apertura central de este cilindro se produce cruce de electrones, formndose un embudo de electrones, de los que la gran mayora pasantravs de la perforacin. La fuente del filamento genera una tensin de 6 a 12 V, en el cilindro Wehnelt se produce una tensin de 100 V, y en la FEM de 400 a 250 kV. Algunos microscopio

particularmente los de alta aceleracin, emplean FEM de 2 MV. Los kV aplicados al filamendan energa a los electrones para acelerar y ser liberados desde el filamento al vaco.

En la fuente del filamento, la intensidad o corriente final define la cantidad de electroneque fluyen en el haz. Al aumentar la cantidad de energa, se incrementa el kV, y al elevarse cantidad de electrones, tambin la Vf.

Un concepto importante es la corriente de saturacin, que corresponde al mximcontraste o brillo a obtener. Para que todos los electrones tengan la misma energa el voltaje deser estable. En caso de haber fluctuaciones en el voltaje, las diferencias de energa de loelectrones se traducir en la alteracin de las imgenes obtenidas. Lo mismo ocurre con el flujocorriente de electrones. La medicin de la estabilidad del sistema se hace en ppm.

b. Lentes: El haz de electrones tiene un comportamiento similar a la luz con los lentepticos, es decir, iluminan el sector a observar. La iluminacin debe ser uniforme.

c. Portamuestra: Permite mover la muestra en los planos X e Y, as como en direccioblicua (ngulo Till). Cuando se estudia material cristalino, se produce una imagen de difraccide electrones al mover el portamuestra.

Las imgenes obtenidas pueden ser transparentes (por transparencia del objeto), u opac(obtenidas por reflexin de la imagen del objeto). En el MET las imgenes se obtienen ptransmisin. Cuando se estudia material cristalino, por difraccin de electrones se configur puntos que permiten al especialista en cristales analizar las estructuras.

Retomando el anlisis del sistema de lentes, mencionaremos las componentes y posteriormente cmo se forman las imgenes.

(i). Lente Objetivo: Es el que realiza el aumento, focalizando la imagen en la pantallaAumenta en aproximadamente 20 veces (20x) el objeto.

(ii). Lentes Intermedia y Proyectiva: Aportan la potencia ptica al microscopiocontribuyendo a un aumento ms alto. La lente proyectiva, que da una alta magnificacin, una pieza polar intercambiable (anloga a los objetivos de los microscopios), dando un aumende unas 5000 veces (5000x). por su parte, la lente intermedia da un aumento de 100x.

(iii). Pantalla: Compuesta por una lmina metlica cubierta por un polvo de Fsforo, Carbono Cadmio, convierte la energa elctrica en luz. Los elementos antes mencionados emitefotones siguen una onda dentro del espectro visible, al ser bombardeados por electrones. emplea tambin cristales que convierten electrones en fotones.


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En la pantalla, las imgenes se forman con tonos de grises, presentando una granresolucin de elementos pequeos. Habitualmente, se asocia a la pantalla un sistema dgrabacin o almacenamiento de imgenes, como cmaras fotogrficas convencionales digitales, fotomultiplicadores, sensores, u otros que puedan conectarse a computadores, qu

capturan las imgenes a una resolucin que es deseable para su interpretacin.Forma y funcin de los lentes:

En un conductor, la velocidad de los electrones que fluyen por l depende de la cantidade electrones excitados. El valor de la velocidad puede alcanzar la velocidad de la luz.

La formacin de las imgenes se relaciona con el tiempo de demora de la ampolleta eencenderse. La velocidad de los electrones, comparada con la de la luz, es lenta.

Considerando que cada lente tiene una distancia focal fija (distancia entre el lente y lmuestra), uno tiende a pensar que slo cambiando la forma de ste puede obtenerse una distanfocal (Df) diferente. Al pasar los electrones por los condensadores y los lentes (que en esquema de la figura 2 son representados con forma de cajn), son focalizados en un punto. distancia focal es ajustable. En el caso de la luz, sta puede ser focalizada y reflejada, pero reflectada con campos visuales. En el caso del LASER este se basa en un sistema de reflexiresistente a espejos. Los electrones, por su parte, pueden ser generados (por el can delectrones), focalizados, colimados (condensados y enfocados, en ambos casos por las lentelectromagnticas y el sistema de apertura) y deflectados (por campos elctricos E, electromagnticos B). En el universo, la luz es reflectada por efecto de la masa, tal como ocucon la luz de los astros al pasar cerca de algn planeta.

El flujo de electrones sucede a travs de material magntico, formando un campo en eaire. Cuando el electrn se mueve en el sentido del campo magntico no existe fuerza sobre l.

F=B x v sen

En la frmula, el valor de la fuerza ejercida sobre el electrn aparece cuando el ngul

formado entre su direccin y el campo magntico es mayor que 0.


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Las lneas de fuerza, como vemos en la figura, forman un ngulo igual a 0. El electral moverse en forma espiralada, genera una vuelta. Todos los electrones pasan por un punto. electrn puede salir en cierto ngulo con un giro.

Ahora bien, el punto de focalizacin depender de la geometra y de la corriente que pas por el lente. La capacidad de focalizacin desde el infinito por el punto focal mximo, cuancon 0 se produce en infinito. La variacin del poder cambiando.

La calidad del MET est en ntima relacin con la perfeccin de la pieza polaraumentando el umbral de calidad al microscopio.

La mecnica debe ser muy precisa. Todos estos factores cambian las funciones de cadlente. Algunas lentes proyectivas tienen piezas intercambiables, por lo que la pieza polar de lente le otorga la capacidad de cambio. Como puede deducirse de lo antes dicho, el volumen yforma de la lente cambian entre las diferentes lentes, pero la constante transferi no.

J= Ri 2

La frmula anterior es la sntesis de la ley de Joule. La generacin de calor ocurre por u

cambio en la geometra de los cuerpos. Las lentes, dentro de la columna del microscopelectrnico se calientan siguiendo esta ley; debido a ello, es necesario un sistema de enfriamienformado por una camisa fra por la que circule agua u otro lquido fro, que ayude a mantenertemperatura de la columna interior estable, y que adems evite un sobrecalentamiento.

Sistema de formacin de imgenes:

La columna del microscopio requiere vaco en su interior para la obtencin de imgenedebido a ciertos inconvenientes intrnsecos: los electrones, por la longitud de onda que tiene presentan un bajo poder de penetracin, siendo necesario vaco para que transiten libremencuando existe aire, puede formarse un arco voltaico entre el nodo y el ctodo (en este caso filamento), que pudiera causar perjuicio al microscopio al producirse la oxidacin del filamenque se quemara, y adems en el aire que pudiera haber, se encuentra agua, que puede tambideteriorar el funcionamiento del microscopio.

Siempre debe considerarse la presin atmosfrica del lugar geogrfico donde se encuentel microscopio electrnico de transmisin. Por convencin, se considera que la presi


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atmosfrica normal es de 760 mm de Hg a 25 C a 0 metros sobre el nivel del mar (msnm). presin interna en el ME va desde un mnimo de 10-4 mm de Hg hasta el nivel ptimo de 10-6 mm de Hg. El vaco se hace de forma anloga al secado de un balde lleno de agua:

1. Se saca la mayor parte del aire con una bomba

2. Se extrae el aire residual con bombas de alta presin de vaco, para extraer al mximo.

Habitualmente, queda una presin de aire inferior a 1 mm de Hg, en forma de humedadCon una bomba mecnica o rotatoria se logra un vaco de 10-1 a 10-2 mm de Hg, en tanto que conuna bomba de alto vaco se extraen diferenciad de presin de 10-2 a 10-4 mm de Hg. Con la bomba gruesa, se saca la fraccin mayor de aire (10-1 a10-2 mm de Hg), mientras la diferenciamenor es succionada con una bomba de alto vaco, como se muestra en el esquema.

La bomba de alto vaco puede ser de tipo difusora de aceite, una de las ms econmicas de fcil mantencin; puede tambin ser turbo molecular, o bien inica. En el caso de la bomrotatoria, la pared se sella con aceite.


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El aceite de la bomba de vaco pasa del estado slido a gaseoso saturando el medio; paque exista un flujo debe existir una diferencia de presin (P) que en este caso es de 10-3 a 10-4 mm de Hg. Como condicin de preoperacin, debe existir un prevaco producido por saturacide gas, optimizando la bomba con faldas. En la prctica, se intercalan vlvulas para ayudarvaciar gradualmente la columna. La bomba difusora requiere de un precalentamiento d

aproximadamente hora.Cuando se abren por ejemplo V1 y V3, se saca aire con la bomba rotatoria, se hace and

el sistema de calefaccin de la bomba difusora, y luego se cierran estas vlvulas. Entonces hace el prevaco abriendo V2, que luego se cierra para abrir V1 y V3. Para inyectar aire, cierran V1 y V2, abrindose V4 (que no aparece en la figura). Las llaves del sistema se abren.

Algunos cambios en la configuracin bsica se relacionan especialmente con la medicide vaco. Por ejemplo, se emplean sistemas de prdida de calor o de ionizacin de gas. Si entrega calor a un cuerpo, ste eleva su temperatura hasta que se estabiliza, dependiendo de cantidad de electrones y de aire en contacto.

En el vaco puede aumentar la temperatura de un cuerpo. Este aumento de temperatur puede medirse con una termocupla, que consiste de un filamento de cobre y fierro conectado a circuito alimentado por una fuente electromagntica; este sistema est conectado a un medidor voltaje que muestra una variacin de voltaje, manifestacin de un cambio de tensin en funcide la temperatura. Habitualmente la termocupla est conectada a un sistema de prevaco p prdida de calor.


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A travs de la termocupla circula corriente, que calienta un cuerpo, generando mV. En caso de un sistema de vaco cambia la temperatura al vaco. La termocupla, como cualquier otinstrumento, puede ser calibrado para obtener mejores mediciones.

Otro sistema empleado para generar vaco es el de autovaco, que consiste en un sistemde ionizacin en que un fusible o botella con 2 electrodos conectados a un sistema de alto vacoa un microampermetro alimentados por una FEM. En condiciones normales de presiatmosfrica el gas no se ioniza (es decir, no es conductor) y la temperatura es igual a 0. al extrael aire, la presin disminuye ionizndose el gas (circula corriente). No existen elementos ionizacin en forma normal, pero al hacer vaco se ionizan. Los componentes fundamentalesconsiderar para la ionizacin o paso de corriente son la existencia de iones, electrones y bloqude masa.


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Deben considerarse condiciones de doble ionizacin, electrones. Al sacar aire hastlmites cercanos a 0, se produce un vaco mximo, dando una parbola que muestra uncondicin similar a la de un sistema lleno de aire.

Dado el calentamiento del microscopio electrnico de transmisin, debe contar con usistema de enfriamiento, idealmente cerrado. Uno de estos es el de pared fra, que capta el cadel microscopio, enfra el aire y elimina el calor por un radiador. Este tipo de refrigerademplea un circuito de caera cerrada en que circula agua por un serpentn que mejora enfriamiento. Este enfriador debe ser tratado para extraer las sales calcreas que se acumulan las caeras. A su vez, debe controlarse la temperatura, y usarse controles de calidad doxidacin y de pH adecuado (que no sea destructivo). El sistema de enfriamiento debe manten baja la temperatura de las lentes.

Estas lentes se caracterizan por tener bobinas de bronce y piezas magnticas. Existecmaras que sirven para enfriamiento.

El aumento de temperatura por volumen se mide en caloras. 1 caloras equivale a lelevacin de 1 cc de agua en 1 C de temperatura. Para el caso del aceite, la elevacin de temperatura en 1 C requiere de 4 caloras. Como ancdota, debemos tener en cuenta que 1 gode aceite caliente causa menos dao que una de agua. Sin embargo, dado que el agua tiene ucapacidad de transporte de calor equivalente a 1.6 veces la del aceite, la posibilidad de enfriar sistema por parte del agua (la reduccin de la temperatura interna), es mejor respecto del aceite.


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Los sistemas de refrigeracin emplean compresin y enfriamiento. La temperaturhabitual de uso es 15 C. Debido a esto, es necesario un enfriamiento forzado.

Para redondear lo antes expresado, veremos a continuacin los criterios de eleccin de umicroscopio electrnico.

Primero, debemos considerar el propsito de utilizacin; debe reunirse al personal que lemplear; cotizar con antecedentes y utilidades proporcionadas por los diferentes fabricantes. disponibilidad del servicio tcnico. Analizar el costo, el buen funcionamiento del campo, informacin tcnica de repuestos e insumos, el compromiso de aporte del representante, informacin disponible, la capacitacin del personal a cargo.

Establecer un protocolo de entrega: montaje del microscopio, supervisin de cada etapade la forma de montaje, verificar las condiciones. Revisar las especificaciones, las condicionde iluminacin, verificar si cuenta con proteccin contra ruido y antissmica. Para evitvibraciones, debe ser puesto en un lugar que tenga suelo firme y adems lejos de reas dvibracin (en un zcalo o patio, alejado de la calle). Crear fundaciones slidas assmicas concreto armado, aislado de la tierra. Las vibraciones de menos de 1 ciclo son perjudiciales pael microscopio; lo mismo ocurre con los movimientos ssmicos, que son vibraciones de ms un ciclo. Las vibraciones entre 0.1 y 1 ciclo, son de baja audibilidad.

El equipo de microscopa electrnica debe traer aislamiento de tierra y vibracionesDeben evitarse tambin los cambios electromagnticos de baja frecuencia que son nocivos. De prevenirse la presencia de ductos y lneas de potencia, que han de aislarse. Ha de protegeradems el espacio fsico.

En Chile, la frecuencia de la corriente es de 50 Hz. Para proteger al microscopio de ladiferencias de frecuencias se emplea una celda Fahrenheit para radiofrecuencias. Debcomprobarse adems la calidad de la lnea elegida (en relacin con la calidad de la imagen).


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Hay que revisar la alta tensin diferente de la lnea, que debe regularse sin conexin motores (debe ser estable, no conectarla a generadores o grupos electrgenos). No deben habalfombras (generan esttica y pelusas que contaminan el microscopio), el piso debe seantiesttico, de ser posible el cuarto de microscopa debe tener diferencia de presin y dob puerta, el piso debe ser totalmente pulido, sin rayaduras posibles.

ADOLFO ROS-ALCORTA


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Fijacin en M E- Julieta Gonzlez 19

Fijacin en Microscopa lectrnicaProf. Julieta Gonzlez

Mircoles, 15 de Octubre de 2003

Las muestras biolgicas, para ser observadas a la microscopa electrnica de transmisin,deben ser fijadas. El proceso de fijacin tiene como finalidad ltima conservar la estructuracelular de forma similar a aquella que tena en vida. Para los estudios ultraestructurales seemplean principalmente 2 tipos de fijadores: glutaraldehdo y tetrxido de osmio, que sonutilizados en forma secuencial. Para la eleccin del fijador ms apropiado siempre debe tenerseclaro el objetivo y el propsito del estudio.

Es as, por ejemplo, que el uso de enzimas, el estudio con anticuerpos, o de la morfologainfluyen de manera similar al tiempo, pH y temperatura. Siempre deben emplearse solucionestamponadas de fijador al pH del sistema biolgico en estudio, procurando mantener un equilibrioentre la solucin en uso y los elementos intracelulares. Es fundamental para ello considerar laosmolaridad, o cantidad de partculas presentes, determinando la densidad del tejido.

Para este fin debe primero homogeneizarse el tejido y luego con un osmmetro se mide laosmolaridad.

Los tampones utilizados contienen una sal y su base o cido, segn sea el caso. Laconcentracin aproximada de los tampones es 0.1 M. Para mantener la osmolaridad se usan otrassustancias neutras que no modifican por carga los dominios celulares. Por ejemplo la sacarosaaumenta el nmero de partculas.

Al preparar un fijador debe calcularse la contribucin de la sacarosa, medir el pH y laconcentracin, y agregar luego sacarosa. Las propiedades del fijador se estandarizan de acuerdoal tipo de tejido. Las modificaciones de concentracin, pH, temperatura, pueden producirartefactos.

Analicemos ahora los 2 fijadores empleados en MET.

1. Glutaraldehdo: Es un dialdehdo, con 5 carbonos, lineal, con 1 enlace y 1 . Loselectrones del grupo aldehdo de esta molcula se deslocalizan hacia el O. El carbonoelectropositivo causa que los H cidos salgan. Una molcula con centro positivo se formay da interacciones entre 2 molculas de glutaraldehdo generando grupos - nosaturados. Estos grupos generan compuestos heterocclicos que luego polimerizan.Todos estos grupos se encuentran en las soluciones comerciales de glutaraldehdo y soncontaminantes. Se puede evitar con atmsferas inertes, sellando con atmsfera de Ngaseoso, midiendo por densidad ptica de la solucin (Absorbancia). En atmsfera ricaen oxgeno se genera cido glutrico, que no sirve como fijador. Este inconveniente essuperado usando filtros de carbono activado que captura productos cclicos permitiendo el

paso de los - no saturados y del cido glutrico. Tambin se emplean columnas desephadex (poros muy pequeos para capturar partculas). El producto se mantiene en


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ampollas de 1 ml, que una vez abiertas pueden ser reselladas en ampollas con atmsferade N; se usa en poca cantidad o bien se resella con parafilm a -20 C. Al pasar el tiempoel contenido de las ampollas se modifica. A pH 4.5 el glutaraldehdo es ms estable porexistir ms cantidad de H +. El carbanin se estabiliza saliendo H + al medio paracompensar la formacin de carbonio. La forma lineal del glutaraldehdo es la requerida

para la fijacin. Las propiedades de uso del glutaraldehdo se basan en elentrecruzamiento. Es as que 2 grupos vecinos dentro de una misma protena o entre 2 protenas, o bien lejos entre protenas o en una misma protena, pueden formar puentesmetilnicos con el glutaraldehdo.

La forma de interaccin vara la estabilidad molecular, y modifica la conformacin proteica. Estas interacciones permiten conservar grupos reactivos para ser identificadoscon diferentes metodologas.

Por ejemplo, para inmunocitoqumica, el glutaraldehdo se usa muy diluido enconjunto con otros aldehdos como el paraformaldehdo. La fijacin se hace por untiempo mnimo con el fin de mantener reactivos la mayora de los grupos.

Como mecanismos propuestos, se sugiere la adicin nucleoflica, en que gruposcon afinidad por cargas positivas interactan. Un ejemplo de ello son los grupos amino,

que tienen 2 electrones libre, sin compartir, que pueden ser cedidos a grupos deficientesen electrones o electrfilos. En las protenas existen grupos sulfhidrilo (cistena), amino,hidroxilo (tirosina). Los grupos ms importanten son los amino, que abundan ms que losotros y tienen mejor capacidad nucleoflica.

Los grupos amino forman enlaces metilnicos con el glutaraldehdo. Losaldehdos modifican la estructura terciaria, en tanto las estructuras primaria y secundariason poco modificadas, lo que explicara que algunas enzimas conserven su actividad;adems permiten medir las caractersticas osmticas pues la mantienen en las clulas (porejemplo el transporte de membrana). Conserva adems los dominios intramembrana pormantener la -hlice.

2. Tetrxido de Osmio (OsO 4): Este fijador estabiliza los lpidos. El osmio tiene nmerosde oxidacin 2, 4, 6 y 8. fue introducido como fijador aproximadamente en 1936 porCriege. El tetrxido de osmio es un fijador de tipo oxidante, de larga data (antigedad)de uso, lo mismo que el permanganato de potasio (oxidante ms enrgico).


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Un ejemplo de utilizacin de tetrxido de osmio es el de fijacin de bacterias, que presentan entre sus estructuras un mesosoma, que corresponde a una invaginacin de lamembrana plasmtica con presuntas funciones REDOX. Este organelo se ha observado

adems en hongos como Neurospora crassa . Cuando las bacterias son fijadas con permanganato de potasio, esta estructura se observa estirada, en tanto que con tetrxido deosmio se ven espiralazas, enrolladas. A partir de esto sera interesante determinarmediante criofractura cul es la real forma del mesosoma in vivo , pues no se usa fijacinqumica.

Los lpidos, compuestos de glicerol, cidos grasos y aminoalcoholes, puedenformar interacciones con estos fijadores oxidantes, y particularmente con tetrxido deosmio, el que acta a nivel de los dobles enlaces de las molculas de lpidos. Losoxgenos con carga negativa de la molcula de tetrxido de osmio van a reaccionardeslocalizando electrones en el doble enlace, esto lleva a la formacin de un intermediario1,2-glicol (grupos OH vecinos) o 1,2-diol. Esto hace que OsO 4 se reduzca a OsO 2, quese observa como un precipitado negro y en caso de continuar la oxidacin forma nuevosgrupos 1,2-glicol.

Los monosteres de osmio, al reaccionar con 1,2-glicol forman alcoholes. Estareaccin se traduce en entrecruzamientos entre 2 fosfolpidos, que corresponde a un puntode transicin. Por esta razn no es conveniente utilizarlo en ICQ. Los cidos grasos

puros extraen todos los tipos de disteres de osmio formados.

La forma de presentacin del osmio es lquida, transparente, ligeramenteamarillento cuando est concentrado (+8) y negro profundo cuando su estado deoxidacin es (+2). Este fijador se prepara en solucin acuosa; el osmio es voltil, tieneuna presin de vapor muy alta, por lo que produce una rpida fijacin. Los trozos a fijar,sin embargo, deben ser muy pequeos por su baja velocidad de penetracin, pues de sergrande la muestra slo fija las caras de contacto y el centro de la muestra quedara crudo,sin fijar. La velocidad de difusin del osmio depende de la densidad de trama del tejido,la periferia se fija antes que el interior y esto da una mayor rigidez. El tetrxido de osmioes empleado por 1 hora a temperatura ambiente para fijar, tiene una penetracinhomognea. Slo se fija con la cantidad necesaria, pues el tejido podra fragilizarse yquebrarse.

Adolfo Ros-Alcorta


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Inclusin en ME- Cecilia Leyton 22

2002. Alumnos de la Mencin Morfofisiopatologa y Citodiagnstico. Escuela de Tecnologa Mdica. Facultad de Medicina. Universidad de Chile.Prohibida su reproduccin total o parcial, y su publicacin con fines acadmicos sin mencin a los autores. Su utilizacin debe ser solicitadaexpresamente a los autores

Medios de nclusin

Prof. Cecilia LeytonMircoles 8 de Octubre de 2003

L a mayora de los preparados que se ven en ME son artefactos. Cada preparado pasa por un procesoque se inicia con la fijacin, para M.E. se fija con dos fijadores, primero con glutaraldehdo y luego una post-fijacin con tetrxido de osmio. Cada fijador tiene un efecto sobre las estructuras celulares, por tanto no seven las clulas tal cul son, sino que se ve un artefacto de tcnica repetitivo consecuencia del uso de esosfijadores o consecuencia del uso de los deshidratantes si es que se utiliza un medio hidrfobo.Posteriormente, a las protenas, que estn constituyendo las estructuras celulares, se les da un contraste concolorantes electrnicos que son metales pesados que se van a adherir a las protenas de una manera ms omenos selectiva. Entonces, cuando se obtienen preparados, las estructuras celulares que se ven representanartefactos de tcnica, pero cuando los artefactos de tcnica son repetitivos, en cuanto a las condiciones en quese trata un determinado tipo celular, pasa a constituir la normalidad para ese determinado tejido.

El procesamiento de los tejidos para ME es similar al que se realiza para M ptica con la diferenciadel uso de algunos reactivos y que se va a tratar el tejido de una manera distinta especialmente porque eltamao de las muestras es muy pequeo (2 mm), importando sobre todo el grosor de las muestras. Entonces,en el procesamiento de las muestras hay que tratar de minimizar al mximo los artefactos de tcnica. Cuandose comienza a tratar un tejido nuevo se debe estandarizar la tcnica para ese tejido hasta conseguir lo que se

pretende en las mejores condiciones de morfologa que se requiere.Los tipos de medios de inclusin son:

- resinas acrlicas: hidrfobas: metacrilatoshidroflicas.

- resinas epoxy: hidrfobas: epn 812, araldita, spurr (baja viscosidad)hidroflicas: LR white, LR gold, lowicryl.

- resinas polister.

Dependiendo del objetivo del estudio, las resinas incluso se pueden mezclar. Supongamos queinteresa preservar estructuras celulares que son solubles en el deshidratante y por las cualidades de corte, sedesea incluir en una buena resina epoxy hidrfoba (epn 812),resistente al haz de electrones y permeable alos colorantes electrnicos. En este caso, lo que se puede hacer es despus de pasar por los lavados delfijador, pasar por una resina hidroflica en concentraciones crecientes, como el durcupan, que adems esmiscible con epn, lo que permite realizar despus una impregnacin con epn en concentraciones crecientes

para finalmente incluir la muestra manteniendo la estructura soluble porque se elimina la deshidratacin.La mayora de las resinas epoxy son mezclas de resina, acelerados, plastificante y endurecedor. Las

resinas de ltima generacin tienen la ventaja que se usan tal como vienen, no es necesario prepararlas. Pero,cuando se prepara la resina de impregnacin se enriquece el preparado porque cada uno maneja cuan dura esla mezcla final, cuan blanda, cuan plastificada porque se pueden variar los componentes de acuerdo a losobjetivos del estudio.

Si consideramos una resina hidrfoba como el epn, los pasos que se deben seguir son:- fijacin: glutaraldehdo.- lavado: en el mismo buffer en que se prepar el fijador.- postfijacin: tetrxido de osmio.- lavado: en el mismo buffer en que se prepar el fijador o en agua.

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- deshidratacin: etanol, acetona, alcohol isoproplico, cloroformo. El ms usado es el etanol en escalaascendente para extraer el agua del tejido.- lquido intermediario: Como el etanol no es miscible con las resinas (epn, araldita, spurr), luego de ladeshidratacin hay que pasar por un lquido orgnico que se llama aclarante, que tiene la ventaja de sermiscible con el etanol y con el medio de impregnacin.- impregnacin: con el mismo medio en que se va a realizar la inclusin, se hacen baos en concentracincreciente para reemplazar el aclarante por la resina hasta llegar a resina pura en la que se incluye el tejido.

lquido aclarante resina

3 11 11 30 resina pura

La proporcin y tiempo de la impregnacin depende del protocolo establecido, pero siempre el ltimo baoes de resina sola. La resina de inclusin debe ser recin preparada y sin agitacin para evitar la formacin de

burbujas.

Esto es en trminos generales, lo que se hace siempre que se utiliza un medio de inclusin hidrfobo.Todo este proceso puede ser a temperatura ambiente o a 4C, dependiendo del trabajo que se realice.Una vez realizada la inclusin con su nmero de identificacin correspondiente, se lleva el molde a

una estufa con una temperatura entre 70-80C para que polimerice. Esta estufa debe estar destinadaexclusivamente para este fin, no puede ser en la que se seca el material de vidrio porque no pueden habervapores de agua. Otras resinas para que polimericen hay que exponerlas a luz UV o a luz de cuarzo. Se dejan

polimerizando entre 2-5 das.El procesamiento de una muestra para ME es largo, razn por la cual es necesario cuidar los detalles

para obtener un buen preparado, porque slo se va a evidenciar un mal procesamiento al momento de realizarel corte. Si el bloque est blando quiere decir que no polimeriz bien porque le qued lquido aclarante,entonces se va a romper. Si el bloque est muy duro va a ser difcil cortarlo. Otras veces no va a costar cortar

el bloque y se va a poder teir los cortes, pero una vez en el microscopio, si se prepar mal la mezcla de epnlas cualidades de resistencia del plstico, que va a ser expuesto al bombardeo del haz de electrones, no se vaa mantener y se va a disgregar junto con el tejido. Entonces es necesario tener una buena mezcla de inclusiny una buena impregnacin de la resina en el tejido.

Deshidratantes

Como deshidratantes se utilizan lquidos anhdros como alcohol etlico, metlico, butlico,isoproplico, cloroformo y acetona. Cuando se usa acetona se puede eliminar el paso por el lquidointermediario porque es miscible con algunas resinas, por ejemplo con el vestopal. Pero, al comparar laacetona con el alcohol etlico, la acetona es un deshidratante mucho ms fuerte, provocando mayor retraccin

al tejido. Entonces hay que equilibrar el costo-beneficio. Puede ser muy bueno eliminar el paso por elaclarante, que es el xido de propileno, pero por evitarlo se produce una gran alteracin al tejido. Igual que para la MO, la deshidratacin se hace en una escala ascendente de alcoholes, pero para la ME es conveniente, por lo delicado del trabajo y porque cualquier salida brusca de agua va a provocar distorsin de lasmembranas, va a arrastrar componentes celulares, etc, comenzar con una graduacin de alcoholes mucho ms

baja que para la MO.El tiempo de deshidratacin va a depender del tipo de tejido, del grosor de la muestra y del medio

deshidratante a emplear, si se usa acetona los tiempos son ms cortos que con etanol, en general no son

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tiempos largos, pero en el caso de tejidos ms densos aumentan al igual que en el caso de tejidos que cuestasacarles el agua como los tejidos vegetales.

La mayora de los deshidratantes son solventes orgnicos enrgicos, que provocan retraccin de lostejidos y extraccin de constituyentes celulares. Hay que tener cuidado con el tiempo de deshidratacin

porque si se deja mucho tiempo se puede extraer los lpidos, especialmente los de membrana aun cuando sehaya realizado una postfijacin en tetrxido de osmio. Algunos investigadores como Milloning (1996),aconsejan para evitar los artefactos de retraccin en la salida brusca de agua, agregar a los baos de

deshidratacin cuando se usa etanol, NaCl 0.5%. Otro autor afirma que se obtienen mejores resultados alusar metanol en comparacin al uso de etanol. En el caso de la acetona, aconsejan usarla a 4C; otros dicenque provoca menos retraccin que el etanol cuando se usa por poco tiempo; no reacciona con el tetrxido deosmio, mientras que el etanol s lo hace, precipita, si no se lava bien el tejido luego de la postfijacin y se veal microscopio como un fino precipitado negro; no reacciona qumicamente con algunos monmeros epoxy,lo que permite evitar el paso por el aclarante; extrae menos los fosfolpidos que el etanol; algunos autores

prefieren comenzar la deshidratacin a temperatura ambiente y luego seguirla en fro, con lo cual seminimizara la extraccin de lpidos. En el caso que se tenga que dejar la muestra por fuerza en etanol, serecomienda dejar en etanol de 70 a 4C.

Lquidos Intermediarios

Los lquidos intermediarios o aclarantes ms usados son la acetona y el xido de propileno, que es unepoxipropano, introducido en MET por Left (1961). El xido de propileno se caracteriza por tener unaviscosidad relativamente baja, infiltra rpidamente el tejido y reduce la viscosidad de las resinas, quemientras menos viscosas sean van a infiltrar ms rpidamente el tejido, entonces es una buena caractersticael hecho que reduzca la viscosidad de las resinas, especialmente de algunas que son muy viscosas. Es uncompuesto muy reactivo que puede combinarse con algunos grupos reactivos de las clulas y afectar algunasreaccin histoqumicas e inmunohistoqumicas. Cuando se va a hacer un estudio ICQ para MET hay quetener mucho cuidado con el uso del xido de propileno, probablemente se va a tener que evitar. Esto se puedeevitar usando acetona o un medio de inclusin hidrfobo.

El ltimo bao de impregnacin, que es el ms largo, dura 1 da para tratar de extraer del tejido todo

el xido de propileno que pudiera quedar porque va a influir en la calidad del bloque de inclusin. Si quedantrazas de xido de propileno en los tejidos, este va a reaccionar con los grupos epoxy de algunas resinasinhibiendo o alterando la polimerizacin, lo que se va a reflejar en la dureza del bloque de inclusin, se va aobtener un bloque muy blando. Se recomienda usar en tiempos muy cortos, 5-10 min, como mximo.

RESINAS

Caractersticas generales de los medios de inclusin:- poca extraccin de los componentes celulares.- en su forma monomrica, que es la forma comercial, deben ser de fcil solubilidad en los solventes usados.- penetrar los tejidos en forma fcil y rpida.

- termoestabilidad alta durante el bombardeo electrnico.- baja viscosidad, los que son muy viscosos demoran ms en infiltrar el tejido.- buenas cualidades de bloque de inclusin: que sea homogneo en cuanto a su dureza.- que tenga una dureza suficiente para hacer cortes ultrafinos (nm).- que tenga una plasticidad y una elasticidad suficientes, no se necesitan bloques duros y rgidos, tienen quetener cierta plasticidad y para eso se les agrega ciertos monmeros que dan esa caracterstica, los llamados

plastificantes.- polimerizacin uniforme.

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- que preserve las estructuras, es decir, que no extraiga los constituyentes celulares.- que permitan la penetracin de los medios contrastantes que son metales pesados.- que sean miscibles con otros medios de inclusin, lo que permite hacer mezclas.

Los mayores inconvenientes que se pueden presentar para lograr un buen bloque de inclusin paraME son:- no conseguir una buena infiltracin del medio de inclusin porque el tejido no qued bien deshidratado ni

bien aclarado.

- no conseguir un bloque de inclusin con la dureza apropiada para poder hacer cortes ultrafinos, debe ser nimuy duro ni muy blando.

Generalidades de los medios de inclusin:- se venden como compuestos semifluidos, de una viscosidad diferencial entre unos y otros, y decomposicin qumica monomrica.- tienen un tamao molecular, viscosidad y un ndice de polimerizacin variable para cada resina.- por accin de reactivos activadores, endurecedores, plastificantes, aceleradores, luz UV o del calor pasan demonmeros lquidos a polmeros slidos.- los polmeros se clasifican en polmeros inestables o reversibles o en polmeros irreversibles. Para METinteresa obtener los irreversibles, porque los reversibles bajo ciertas condiciones recuperan su estado lquido,

lo que no servira porque entre los componentes de las mezclas se establecen enlaces dbiles, en cambio enlos polmeros irreversibles, al asociarse los monmeros de las mezclas se forman nuevos grupos qumicosque forman uniones covalentes o electroestticas, lo que va a permitir mayor estabilidad de los componentesal momento de recibir el haz de electrones.- de acuerdo a la forma de asociacin de los monmeros en estos polmeros, se van a clasificar en polmerosde distinta estructura, por ejemplo los metacrilatos, que fueron las primeras resinas que se usaron en la METse dejaron de usar porque formaban polmeros lineales . Los metacrilatos estn formados por N-metilmetacrilato y N-butil metacrilato y a eso se le agrega un acelerador, cuando comienzan a polimerizar, lasmolculas se asocian en forma lineal, lo que no es estable por no ser termoestable. Entonces al colocar loscortes en metacrilatos con polimerizacin lineal, con el bombardeo del haz de electrones la resina se rompe yadems al romperse se subliman contaminando la columna del microscopio. Otro tipo de polmeros son los

polmeros cclicos , formados por la adicin de monmeros que presentan anillos de cuatro o ms tomos decarbono, no son muy usados. Los mejores para MET son los polmeros cruzados , se forman polmeroslineales o cclicos que presentan grupos reactivos que interaccionan formando redes tridimensionales muyestables, los grupos reactivos presentes en los monmeros de las mezclas de resinas establecen puentes que

pueden ser teres y eso le da estabilidad a la molcula, porque este tipo de puentes son resistentes al calor y alos solventes orgnicos. Los grupos epoxy, caractersticos de las resinas epoxy, pueden interaccionar conotros grupos epoxy presentes en otros monmeros de la mezcla o pueden interaccionar con grupos hidroxilos

presentes tambin en la molcula de la resina epoxy, o bien pueden interaccionar con anhdridos cidos queestn presentes en los agentes endurecedores, que tambin estn como monmeros. Entonces, si hayinteraccin entre dos o ms grupos epoxy, entre grupos epoxy-hidroxilo y entre grupos epoxy-anhdridoscidos, obviamente que la red de interacciones que se constituye en el polmero es mucho ms estable y dacualidades de inclusin mejores que otras resinas.

Caractersticas generales de algunas resinas:

resina viscosidad densidad

vestopal 900 1170araldita 2500 1081

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epn 812 1400 1158maraglas 565 1121

La viscosidad de las resinas tambin tiene que ver con el tamao de cada molcula, hay monmerosque son mucho ms grandes, la araldita, por ejemplo, al compararla con el epn es mucho ms grande, siendolas dos resinas epoxy y eso se refleja en su viscosidad. Si se trabaja con araldita se obtiene una solucin deimpregnacin y de inclusin mucho ms densa y por lo tanto, los tiempos van a tener que ser mayores que losque en el caso del epn o cuando se trabaje con otra resina de menor viscosidad.

Otra cualidad importante en trminos generales es la cantidad de retraccin que se obtengan con estasresinas.

El spurr es un monoepxido y presenta la menor viscosidad entre las resinas epoxy y tiene ademsmuy buenas cualidades de inclusin.

Resinas Epoxy

Hidrfobas: epn, spurr, araldita, maraglas.Hidrfilas: durcupn, acun.

- Son resinas sintticas, caracterizadas por la presencia de uno o ms grupos epxidos terminales y gruposhidrxilos esparcidos a lo largo de la molcula. De color amarillo claro o miel, viscosos y termoestables.- Son los medios de inclusin ms utilizados en los laboratorios, aun cuando son ms difciles de cortar ymenos elsticos que las resinas acrlicas.- Polimerizan uniformemente.- Los cortes que se obtienen de los bloques de inclusin son estables al haz de electrones y pueden sermontados sobre grillas descubiertas o desnudas. En algunos casos se opta por poner una membrana sobre lasgrillas, que puede ser formvar, parlodin o colodin, para dar ms estabilidad a los cortes, a este tipo degrillas se les llama cubiertas.- El medio de inclusin es una mezcla cuidadosamente balanceada, constituida por:

resina epoxy

uno o dos tipos de endurecedor o curadoracelerador o catalizador

plastificante o modificadorLos componentes de la mezcla se guardan separados para evitar que polimericen y a 4C porque al sermonmeros, a temperatura ambiente son inestables y menos fluidos.La mezcla se prepara en un mismo vaso plstico midiendo los componentes o en un vaso plstico pesando loscomponentes, para esto hay que calcular cuanto pesa cada cantidad de componente a una temperaturadeterminada.Lo ltimo que se hace es agregar el acelerador porque activa la polimerizacin.Los restos de resina que sobran se dejan polimerizar y una vez slidos se eliminan.- Cada uno de los componentes de la mezcla tiene diferentes viscosidades, por lo tanto penetran en el tejido a

diferentes velocidades (si no se ha tenido l precaucin de realizar una mezcla homognea).- La velocidad a la que la mezcla de trabajo infiltra el tejido depende no slo de la densidad del tejido,tambin del tamao de la molcula infiltrante, la viscosidad de la mezcla, etc. Esta ltima se puede modificarvariando las cantidades de los endurecedores.Ej. araldita, por el tamao de su molcula infiltra lentamente; el epn tiene una viscosidad menor e infiltrams rpido y el spurr (ciclohexeno-dixido) presenta una muy baja viscosidad e infiltra muy rpido.- La mezcla de trabajo polimeriza formando enlaces cruzados muy estables, por efecto del calor y/o de la luzUV.

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Desventajas del uso de resinas epoxy:- Los grupos epxido y anhdridos pueden reaccionar con las protenas.- Lo anterior puede reducir la antigenicidad y provocar sensibilizacin en los operadores que trabajan en loslaboratorios, quienes absorben estos compuestos por la piel o los inhalan (se recomienda el uso de campanasy guantes).- Los componentes de las resinas epoxy son txicos y el VCD (vinilciclohexano) es un conocido

carcingeno.

Endurecedores o curadores

Participan directamente en la reaccin de polimerizacin. La mayora son cidos dicarboxlicos o anhdridoscidos que reaccionan con los grupos hidroxilos y epoxy formando enlaces esteres.Ejemplos:DDSA: anhdrido dodecil succinico

NSA: anhdrido monenil succinico NMA: anhdrido metil ndico

Aceleradores o catalizadores Aumentan la reactividad del proceso de polimerizacin, promoviendo las reacciones entre los grupos epoxy-epoxy y epoxy- hidroxilo.Ejemplos:BDMA: bencildimetil aminoDMAB: dimetilaminoetanolDMP-30: amina terciaria: 2,4,6- tridimetil amino metilfenolLa mayora de ellos son aminas .Es el componente que va en menor proporcin en la mezcla.

Plastificantes

Son opcionales, pero mejoran las cualidades de la mezcla porque aumentan la extensibilidad de los bloquesde inclusin. Confieren suavidad y flexibilidad a la mezcla de resina epoxy-endurecedor ( que suelen serextremadamente rgidas).Ejemplos:DibutilftalatoDER736: diglicil ter de propilen glicol ( recomendada spurr por su baja viscosidad )

Proceso de infiltracin o impregnacin en el medio de inclusin

Previo a la infiltracin, el operador deber preocuparse de preparar adecuadamente la mezcla de resina con la

que infiltrar los tejidos.- Componentes a temperatura ambiente ( si la infiltracin se realizara a esta temperatura )- Obtener una mezcla con las proporciones exactas de componentes, mezclados en forma homognea ycompleta.- Recordar que los reactivos que componen la mezcla de impregnacin son molculas de distintos tamaos,con diferente viscosidad y diferentes ndices de polimerizacin.Ejemplo: DDSA (endurecedor) es ms rgido y menos viscoso que la araldita, de tal manera que si no semezclan bien, el DDSA penetrara primero el tejido y desplazara a la araldita.

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Cuchillos

Los cuchillos que se utilizan en ME son de dos tipos: vidrio o diamante. En el caso de los cuchillos devidrio, se deben confeccionar en el mismo laboratorio y para eso nosotros compramos el material a la LKBque es material de importacin. Se compran barras de vidrio de una cierta dimensin, es ms bien un cristalde muy buena calidad, y de esas barras que se lavan y secan muy bien para que no tengan pelusas se cortancuadraditos que tienen una cierta dimensin. Una vez que tengo los cuadraditos con un diamante hago una

lnea diagonal y posteriormente hago presin con unas tenazas en esa lnea y el cuadrado de vidrio se va aescindir en dos y de cada cuadrado voy a obtener dos cuchillos de vidrio. Esto se hace con una mquina que permite que la presin que se ejerce sea ms homognea de modo que el rendimiento en la obtencin decuchillos sea mejor.

Los cuchillos de vidrio fueron introducidos en el ao 1950 y los de diamante en el ao 1953. Tienenuna gran ventaja los cuchillos de diamante que es su gran duracin, pero su gran desventaja es su alto costo,

pero para la gente que trabaja en forma rutinaria en microscopa electrnica son necesarios y no haylaboratorio que no tenga uno o dos cuchillos de diamante.

Los cuchillos de vidrio son fabricados por el operador, se utilizan barras de vidrio destensado? y seobtienen cuadrados de vidrios de 2 a 2,5 cm de lado. Estos cuadrados se pueden obtener por un sistemaartesanal o con mquinas y de cada uno de los cuadrados se obtiene dos cuchillos. La arista de uno de los

ngulos del cuadrado es la que se utiliza como borde cortante y la longitud del borde cortante va a dependerdel grosor del vidrio que utilicen para fabricar el cuchillo.Los sistemas de fabricacin son por fractura trmica o por fractura mecnica, esta ltima puede ser

utilizando una mquina que se llama Messer Sunkay.Es importante evaluar el filo del cuchillo y adems hay que agregarles un bao a los cuchillos que es

donde van a ir cayendo los cortes. Este bao se puede hacer de cinta adhesiva plstica, cinta adhesiva dealuminio o de cinta aisladora y deben ser sellados con barniz para uas, cera dental lquida o parafina.

Una vez que los cuchillos han sido seleccionados deben ser guardados en una caja protegidas del polvo y la humedad, porque cualquier cosa que tenga el filo del cuchillo va a ir en desmedro de la calidad desu corte.

La evaluacin de los cuchillos se hace bajo un microscopio de luz. El filo del cuchillo posee un

ngulo muy agudo que se llama pico de destruccin? y bajo esa zona una serie de rayas, toda esta zona no estil para utilizarla como filo. Tambin podemos ver una arruga que se llama arruga de fractura. La zona mstil que puede usarse como filo es la que est un poco ms all de la arruga de fractura y antes del pico dedeflexin.

Una vez que tenemos hecho nuestro segundo tallado tenemos que cambiar el cuchillo.En el bao es posible poner un poco de acetona par que los cortes se estiren al caer. Si se utiliza slo

agua yo puedo con un palito de naranjo al que el he puesto un algo don con cloroformo, acercarlo a los cortessin tocarlos y de ese modo se estiran. Una vez que estn estirado tengo que evaluar si los cortes son delgrosor que yo necesito a pesar de que yo he puesto un grosor en el micrtomo. Luego con una pinza que ensu extremo tiene una grilla yo me acerco con la pinza a los cortes que estn estirados y son del tamaoadecuado y puede pasar dos cosas, o que los cortes se adhieran a la grilla al ponerla encima, o bien podemossumergir la pinza y que los cortes se atrapen por debajo. Pueden ser grillas desnudas o cubiertasdependiendo de lo que hayamos decidido.

Cuando son cortes seriados no podemos perder ningn corte y en ese caso se utilizan grillas con unhoyo que pueden estar cubiertas o no.

Para evaluar el grosor del corte utilizamos los colores de interferencia. Cuando los cortes estnflotando sobre la superficie del agua del bao los vamos a ver coloreados y los colores van entre gris claroque es lo mejor, a color violeta que para los efectos de nuestro trabajo es lo peor en cuanto al grosor porqueson los ms gruesos. Los colores de interferencia reflejan el grosor del corte.

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Color grosor ( )gris claro 150-200

Gris 200-250 plata mate 250-400

plata brillante 500-700oro plido 700-900oro mate 900-1100Violeta 1100-1500

Lo ms comn es plata brillante. Mientras ms delgada sea la muestra ms dbil va a ser al bombardeoelectrnico, y tambin hay que considerar que si usamos grillas cubiertas el corte no puede ser muy grueso

porque la cobertura de la grilla va a influir. Todo esto hay que tenerlo en cuenta porque va a influir en laobservacin que vamos a hacer.

Las grillas son de varios modelos. Se llaman grillas o rejillas y son el medio soportante de los tejidos

ultrafinos, o de las suspensiones que sern observadas al microscopio electrnico de transmisin, tienen lacaracterstica de disipar el calor y las cargas elctricas producidas por el haz de electrones. En general, sondiscos de metal de 2,3 a 3,05nm de dimetro y 0,10 a 0,20mm de espesor, con un rea central que presenta

perforaciones de distinta forma y dimetro y un borde que es perifrico, slido y liso. Estn hechas de cobre,nquel, oro, platino, oro-paladio, acero inoxidable, etc., y va a depender de la metodologa que vamos aaplicar que se elige el material de la grilla. Las ms comunes son las de cobre, pero a veces las de cobre nosirven; las de platino sirven cuando sobre los cortes se hacen tratamientos con cidos. Tambin puedenocuparse grillas de nylon, tefln o slice cuando es necesario contar con un aislante electrnico.

La trama se refiere al nmero de barras por pulgada, y a eso se le llama unidades MESH. A mayornmero de barras, menor es el rea descubierta de la grilla. Hay grillas de 70 mesh, 100 mesh, 200 mesh, etc.hay grillas con agujeros de diferentes formas, con un agujero o con varios, descubiertas o cubiertas con un

film o membrana soportante (que puede ser fabricada por el operador).Si necesitramos incluir una suspensin de clulas que necesitamos cortar lo podemos hacerutilizando un medio soportante como la agarosa 4% despus de haberlas fijado, y despus esto puede sertratado como si fuera un tejido cualquiera.

Las membranas soportantes son delgadas films, fabricados por el operador, que se colocan sobre lasgrillas con el fin de sostener los cortes ultrafinos o suspensiones que van a ser puestos en las grillas para serobservados al M.E., son fabricadas de diferentes materiales y la eleccin del material con que se fabrican va adepender del tipo de trabajo a realizar y el tipo de grilla a emplear. Las caractersticas que pretendemos delas membranas soportantes son: ser de lata resistencia mecnica; ser de baja absorcin electrnicaespecfica; y que no cambien de dimensin al ser bombardeadas por el haz electrnico.

Comnmente se usa para fabricarlas soluciones diluidas de diferentes plsticos como fomvar

(polivinilformol), colodin o parlodin (nitrocelulosa), etc. las concentraciones son de 0,5 a 1,0 %. Se puedeutilizar materiales evaporados al vaco como carbn, berilio, monxido de silicn, berilio+aluminio, xido dealuminio. las ms utilizadas son las de carbn y de fomvar.

Las de formvar y colodin son las ms utilizadas porque se obtienen grosores de 20 a 200nm. Las decolodin son menos resistente que las de formvar, pero son ms fciles de fabricar. Con las de carbntambin se obtienen membranas de bajo grosor pero son utilizadas para trabajos muy especializados. Los

plsticos y sus solventes son: Formvar dicloruro de etileno, cloroformo o dioxan

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Colodin acetona, acetato de etilo o acetato de amiloPerspex cloroformo.Poliestireno bencinaPolivinilalcohol agua destiladaUna forma de preparar las membranas es por evaporacin del solvente de una solucin diluida (ej,

formvar 0,2 0,5 o 1,0%). Se hecha una gotita de la solucin en un recipiente con agua y se deja evaporar elsolvente y debera quedar una pelcula.

Otra forma es sumergir rpidamente un portaobjeto muy limpio en la solucin de plstico, rpidamente para que la membrana quede homognea, delgada y sin arrugas. Luego este portaobjeto se deja secar en unacampana de modo que se evapore el solvente. Cuando est seco se corta con una navaja de afeitar y sesumerge en una fuente con agua y se va levantando la pelcula, hasta que toda queda flotando en el agua.Ahora sobre esta superficie voy colocando con una pinza las grillas sobre la lmina hasta que quede llena degrillas. Para recoger la pelcula ocupo papel filtro o parafilm y se deja en una placa petri para posteriormenteutilizarlo. Esto hay que hacerlo antes de ponerse a cortar.

Un tejido que fue incluido en parafina se puede reincluir para obtener una muestra para ME, y unamuestra que ha quedado mal incluida tambin se puede reincluir.

Daniela Araya Caldern

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Medios de nclusin

Prof. Cecilia LeytonMircoles, 8 de Octubre de 2003

L a mayora de los preparados que se ven en ME son artefactos. Cada preparado pasa por un procesoque se inicia con la fijacin, para M.E. se fija con dos fijadores, primero con glutaraldehdo y luego una post-fijacin con tetrxido de osmio. Cada fijador tiene un efecto sobre las estructuras celulares, por tanto no seven las clulas tal cul son, sino que se ve un artefacto de tcnica repetitivo consecuencia del uso de esosfijadores o consecuencia del uso de los deshidratantes si es que se utiliza un medio hidrfobo.Posteriormente, a las protenas, que estn constituyendo las estructuras celulares, se les da un contraste concolorantes electrnicos que son metales pesados que se van a adherir a las protenas de una manera ms omenos selectiva. Entonces, cuando se obtienen preparados, las estructuras celulares que se ven representanartefactos de tcnica, pero cuando los artefacto de tcnica son repetitivos, en cuanto a las condiciones en quese trata un determinado tipo celular, pasa a constituir la normalidad para ese determinado tejido.

El procesamiento de los tejidos para ME es similar al que se realiza para M ptica con la diferenciadel uso de algunos reactivos y que se va a tratar el tejido de una manera distinta especialmente porque eltamao de las muestras es muy pequeo (2 mm), importando sobre todo el grosor de las muestras. Entonces,en el procesamiento de las muestras hay que tratar de minimizar al mximo los artefactos de tcnica. Cuandose comienza a tratar un tejido nuevo se debe estandarizar la tcnica para ese tejido hasta conseguir lo que se

pretende en las mejores condiciones de morfologa que se requiere.Los tipos de medios de inclusin son:

- resinas acrlicas: hidrfobas: metacrilatoshidroflicas.

- resinas epoxy: hidrfobas: epn 812, araldita, spurr (baja viscosidad)hidroflicas: LR white, LR gold, lowicryl.

- resinas polister.

Dependiendo del objetivo del estudio, las resinas incluso se pueden mezclar. Supongamos queinteresa preservar estructuras celulares que son solubles en el deshidratante y por las cualidades de corte, sedesea incluir en una buena resina epoxy hidrfoba (epn 812),resistente al haz de electrones y permeable alos colorantes electrnicos. En este caso, lo que se puede hacer es despus de pasar por los lavados delfijador, pasar por una resina hidroflica en concentraciones crecientes, como el durcupan, que adems esmiscible con epn, lo que permite realizar despus una impregnacin con epn en concentraciones crecientes

para finalmente incluir la muestra manteniendo la estructura soluble porque se elimina la deshidratacin.La mayora de las resinas epoxy son mezclas de resina, acelerados, plastificante y endurecedor. Las

resinas de ltima generacin tienen la ventaja que se usan tal como vienen, no es necesario prepararlas. Pero,cuando se prepara la resina de impregnacin se enriquece el preparado porque cada uno maneja cuan dura esla mezcla final, cuan blanda, cuan plastificada porque se pueden variar los componentes de acuerdo a losobjetivos del estudio.

Si consideramos una resina hidrfoba como el epn, los pasos que se deben seguir son:- fijacin: glutaraldehdo.- lavado: en el mismo buffer en que se prepar el fijador.- postfijacin: tetrxido de osmio.- lavado: en el mismo buffer en que se prepar el fijador o en agua.

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- deshidratacin: etanol, acetona, alcohol isoproplico, cloroformo. El ms usado es el etanol en escalaascendente para extraer el agua del tejido.- lquido intermediario: Como el etanol no es miscible con las resinas (epn, araldita, spurr), luego de ladeshidratacin hay que pasar por un lquido orgnico que se llama aclarante, que tiene la ventaja de s

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