arthur antonio ruiz pereira aar. … · dedico esse trabalho: primeiramente a deus, pois sem fé...
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Arthur Antonio Ruiz Pereira
ANÁLISE DA EXPRESSÃO DOS GENES TNF E LRP1 E CARACTERIZAÇÃO DOS
POLIMORFISMOS -850 C/T E -308 G/A DO TNF NA DOENÇA DE ALZHEIMER
Marília
2016
Arthur Antonio Ruiz Pereira
Análise da expressão dos genes TNF e LRP1 e caracterização dos polimorfismos -850
C/T e -308 G/A do TNF na Doença de Alzheimer
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado Acadêmico em “Saúde e Envelhecimento”, da Faculdade de Medicina de Marília, para obtenção do título de Mestre. Área de concentração: Saúde e Envelhecimento.
Orientador: Prof. Dr. Spencer Luiz Marques Payão Co-orientador: Prof. Dr. Lucas Trevizani Rasmussen
Marília
2016
Autorizo a reprodução parcial ou total deste trabalho, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina de Marília
Pereira, Arthur Antonio Ruiz. Análise da expressão dos genes TNF e LRP1 e caracterização dos polimorfismos -850 C/T e -308 G/A do TNF na Doença de Alzheimer / Arthur Antonio Ruiz Pereira. - - Marília, 2016. 50 f. Orientador: Prof. Dr. Spencer Luiz Marques Payão. Coorientador: Prof. Dr. Lucas Trevizani Rasmussen. Dissertação (Mestrado Acadêmico em Saúde e Envelhecimento) - Faculdade de Medicina de Marília.
1. Doença de Alzheimer. 2. Fator de Necrose Tumoral alfa. 3. Proteína-1 Relacionada a Receptor de Lipoproteína de Baixa Densidade. 4. Reação em Cadeia da Polimerase Via Transcriptase Reversa.
P436a
Arthur Antonio Ruiz Pereira
Análise da expressão dos genes TNF e LRP1 e caracterização dos polimorfismos -850
C/T e -308 G/A do TNF na Doença de Alzheimer.
Dissertação apresentada ao Programa de
Mestrado Acadêmico em “Saúde e
Envelhecimento”, da Faculdade de Medicina de
Marília, para obtenção do título de Mestre. Área
de concentração: Saúde e Envelhecimento.
Comissão Examinadora
_____________________________________
Prof. Dr. Spencer Luiz Marques Payão
Faculdade de Medicina de Marília - FAMEMA
_____________________________________
Profa. Dra. Tânia Araújo Viel
Universidade de São Paulo - USP
______________________________________
Profa. Dra. Rita Luiza Peruquetti
Universidade do Sagrado Coração – USC Bauru
Data da aprovação: ______________________
Dedico esse trabalho:
Primeiramente a Deus, pois sem fé não alcançamos os
objetivos.
Aos meus pais Antonio Aparecido Ruiz Pereira e Maria
Neide da Silva Ruiz Pereira pelo amor, carinho e paciência,
não conseguiria chegar até aqui sem vocês.
Ao meu irmão Vitor Antonio Ruiz Pereira
pelo companheirismo, força e apoio incondicional.
A todos meus familiares que, direta ou indiretamente,
participaram e torceram por mim.
Agradecimentos
Obrigado a minha família, especialmente a meu pai Antonio, minha mãe Neide
e meu irmão Vitor, por todo apoio dado e pela contribuição imprescindível ao longo de
toda caminhada. Agradeço aos demais familiares que de uma maneira ou de outra
viveram, torceram e me ajudaram em determinados momentos. Muito obrigado a todos,
sem vocês não seria possível.
Obrigado ao meu orientador, a quem considero também um amigo, Prof. Dr.
Spencer Luiz Marques Payão pela oportunidade ímpar de conhecimento e
crescimento, pela acolhida e atenção, principalmente no início, onde tudo era muito
novo pra mim, e pelos ensinamentos ao longo de todo esse caminho. Obrigado por
esse convívio de dois anos, eu tenho muito orgulho de termos trabalhados juntos.
Obrigado ao Prof. Dr. Lucas Trevizani Rasmusen, meu Co-orientador, parceiro
de laboratório, amigo, e que me ensinou muito. Obrigado por todo companheirismo, sou
muito grato por todo convívio e conhecimento que me passou.
Obrigado ao Roger William de Lábio, grande mestre e responsável por toda
rotina do Laboratório de Genética e Biologia Molecular da FAMEMA. Agradeço pela
disponibilidade e atenção no decorrer de todo trabalho. Também um amigo que fiz ao
longo dessa jornada.
Obrigado a todos do Laboratório de Genética e Biologia Molecular da FAMEMA,
Cris, Dani, Fernanda Barbi, Fernanda Miller, Jamily, Rosi, Angélica e Marina.
Vocês são responsáveis por fazer o ambiente gostoso de trabalhar. Obrigado pelo
convívio e ajuda nos momentos que precisei.
Obrigado aos funcionários do Hemocentro e da própria FAMEMA pela
disponibilidade de atender e esclarecer certas dúvidas. Agradeço, em especial o
Amauri, Fabrício e a Helô, pelo convívio mais próximo e por participarem desse ciclo
de mestrado.
Obrigado ao Prof. Dr. Agnaldo Bruno Chies pelo convívio e aprendizado junto
aos estudantes do 1º ano, na Unidade de Educação. Agradeço também pelo empenho
no Programa de Mestrado Acadêmico em Saúde e Envelhecimento, que é
indispensável para a evolução do programa.
Obrigado aos amigos que fiz em Marília, Isabela, Antonio (Tonhão), Guilherme
(Goiano), a todos do grupo O Pulo do Gato (Alessandra, Elaine, Marcus, Michelly,
Naira, Patrícia, Renata, Stephanie, Ricardo e Dani), ao nosso amigo Lucas que,
infelizmente, não está presente entre nós, mas que contribuiu para a união da nossa
turma de mestrado. Agradeço muito a vocês por cada risada e cada encontro nosso,
tornaram tudo mais fácil.
Agradeço a Faculdade de Medicina de Marília pela oportunidade de ingressar e
me enriquecer como estudante e como pessoa.
Por fim, quero agradecer a todos que, de alguma forma, participaram e
contribuíram para esse trabalho ser realizado. Peço desculpas se esqueci de alguém,
mas sintam-se abraçados, serei sempre grato por tudo.
“As pessoas felizes lembram o passado com gratidão, alegram-se com o
presente e encaram o futuro sem medo.”
Epicuro
RESUMO
A Doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa irreversível, com
aproximadamente 21 milhões de pessoas acometidas no mundo, que se caracteriza
pelo comprometimento progressivo dos neurônios. Muito se têm estudado sobre quais
são as causas da DA e como se relacionam com o ambiente e com a herança genética
dos indivíduos. Nesse trabalho, dois aspectos foram considerados; o primeiro visou a
neuroinflamação, e nesse contexto, o Fator de Necrose Tumoral (TNF) surgiu como
alvo de estudo para possíveis tratamentos e terapias contra a DA. Dentre os
polimorfismos do gene TNF foram caracterizados o rs1799724 -850 C/T e o rs1800629 -
308 G/A e, posteriormente, comparados com a análise da expressão gênica do TNF. O
outro aspecto abordado foi a relação entre DA e o metabolismo lipídico, a partir daí o
gene da Proteína Relacionada ao Receptor de Lipoproteína de Baixa Densidade (LRP1)
aparece como um dos genes a ser estudado. O presente trabalho teve como objetivos;
1) quantificar a expressão do mRNA e avaliar as frequências alélicas e genotípicas dos
polimorfismos -850 C/T e -308G/A, para o gene TNF, e 2) quantificar a expressão do
mRNA do LRP1 . Sendo que nas duas abordagens foram utilizadas amostras de
sangue. O desenvolvimento deste trabalho pode possibilitar novos mecanismos e
perspectivas no âmbito gênico relacionado à DA, afim de produzir maior conhecimento
sobre o tema, visando novas abordagens de diagnóstico, tratamento e prevenção dessa
doença. Palavras-chave: Doença de Alzheimer, Fator de necrose tumoral alfa,
Proteína-1 Relacionada a Receptor de Lipoproteína de Baixa Densidade, Reação em
Cadeia da Polimerase Via Transcriptase Reversa
ABSTRACT
Alzheimer's disease (AD) is an irreversible neurodegenerative disease, with
approximately 21 million people affected in the world, which is characterized by
progressive impairment of neurons. Much has been studied about what the causes of
AD and how they relate to the environment and the genetic background of individuals. In
this work, two aspects were considered; the first aimed at neuroinflammation, and in this
context, the Tumor Necrosis Factor (TNF) emerged as a subject of study for possible
treatments and therapies for AD. Among the polymorphisms in the TNF gene were
characterized in the -850 rs1799724 C / T rs1800629 and -308 G / A and subsequently
compared with the analysis of gene expression of TNF. The other aspect was addressed
the relationship between AD and lipid metabolism, thereafter the gene of Related
Protein low density lipoprotein receptor (LRP1) appears as one of the genes to be
studied. This study aimed; 1) quantify the mRNA expression and to assess the allele
and genotype frequencies of the polymorphism -850 C / T and -308G / A for TNF gene,
and 2) to quantify the mRNA expression of LRP1. Since the two approaches blood
samples were used. The development of this work may enable new mechanisms and
perspectives within the gene related to the DA, in order to produce greater insight into
this issue to new approaches for diagnosis, treatment and prevention of this disease.
Keywords: Alzheimer disease, Tumor necrosis tumoral-alpha, Low Density Lipoprotein
Receptor-Related Protein-1, Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
Lista de ilustrações
Figura 1: Quantificação de DNA obtido de sangue periférico, em gel de agarose 1%
corado com brometo de etídio.
Figura 2: Quantificação do RNA obtido de sangue periférico, em gel de agarose 1%
corado com brometo de etídio.
Figura 3- Visualização da amplificação do Produto da PCR de um fragmento de 107 pb
referente ao polimorfismo -308 G/A e caracterização dos genótipos para as mesmas
amostras.
Figura 4- Visualização da amplificação do Produto da PCR de um fragmento de 128 pb
referente ao polimorfismo -850 C/T e caracterização dos genótipos para as mesmas
amostras.
Lista de tabelas e quadros
Quadro 1- Distribuição dos indivíduos do grupo controle e pacientes com DA quanto ao
sexo e idade.
Tabela 1- Descrição dos primers utilizados para amplificar os fragmentos de 128pb e
107pb referentes aos polimorfismos -850 C/T e -308 G/A, e das condições para
amplificação.
Tabela 2- Associação dos haplótipos com a Doença de Alzheimer, com valores de "p"
para cada associação, e também o valor global, analisando todas as associações.
Lista de gráficos
Gráfico 1- Distribuição dos genótipos do polimorfismo -850 C/T nos grupos Controle e
Pacientes com Doença de Alzheimer.
Gráfico 2- Comparação entre o genótipo C/C e os genótipos C/T e T/T, do polimorfismo
-850 C/T, em relação aos grupos Controle e Pacientes com Doença de Alzheimer.
Gráfico 3- Distribuição dos genótipos do polimorfismo -308 G/A nos grupos Controle e
Pacientes com Doença de Alzheimer.
Gráfico 4- Comparação entre o genótipo G/A e os genótipos G/G e A/A, do polimorfismo
-308 G/A, em relação aos grupos Controle e Pacientes com Doença de Alzheimer.
Gráfico 5- Comparação entre o genótipo A/A e os genótipos G/G e G/A, do polimorfismo
-308 G/A, em relação aos grupos Controle e Pacientes com Doença de Alzheimer.
Gráfico 6- Expressão relativa do gene TNF em amostras de sangue de idosos sadios e
pacientes com Doença de Alzheimer. Comparação dos valores de 2-ΔΔCT entre os
grupos estudados.
Gráfico 7- Expressão relativa do gene TNF em amostras de sangue de idosos sadios e
pacientes com Doença de Alzheimer em relação ao polimorfismo -308 G/A.
Comparação dos valores de 2-ΔΔCT entre os grupos estudados.
Gráfico 8- Expressão relativa do gene TNF em amostras de sangue de idosos sadios e
pacientes com Doença de Alzheimer em relação ao polimorfismo -850 C/T.
Comparação dos valores de 2-ΔΔCT entre os grupos estudados.
Gráfico 9- Expressão relativa do gene LRP1 em amostras de sangue de idosos sadios e
pacientes com Doença de Alzheimer. Comparação dos valores de 2-ΔΔCT entre os
grupos estudados.
Lista de abreviaturas
A2M - Alfa 2 Macroglobulina
APOE - Apolipoproteína E
Aβ - Beta Amilóide
AβPP - Protéina Precursora da Beta Amilóide
B2M - Beta 2 Microglobulina
BDNF - Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro
BHE – Barreira Hematoencefálica
cDNA - Ácido Desoxirribonucleico Complementar
CDR - Coeficiente de Demência
DA - Doença de Alzheimer
DNA - Ácido Desoxirribonucleico
DSM-IV - Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais
EDTA - Ácido etilenodiamino tetra-acético
GAPDH - Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
IL-1 - Interleucina 1
IL-1β - Interleucina 1 Beta
IL-6 - Interleucina 6
IL-8 - Interleucina 8
LDL - Lipoproteína de baixa densidade
LRP1 - Proteína 1 Relacionada ao Receptor de LDL
mRNA - Ácido Ribonucleico Mensageiro
PCR - Reação em Cadeia da Polimerase
PSEN1 - Presenilina 1
PSEN2 - Presenilina 2
qRT-PCR - Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
RNA - Ácido Ribonucleico
rRNA - Ácido Ribonucleico Ribossômico
SD - Síndrome de Down
TNFα - Fator de Necrose Tumoral Alfa
TNFαR1 – Receptor 1 de TNFα
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO _____________________________________________________ 14
1.1 Aspectos gerais da Doença de Alzheimer _________________________________ 14
1.2 Componente genético e aspectos moleculares da Doença de Alzheimer ________ 15
1.3 Fator de Necrose Tumoral (TNF), o envelhecimento e a Doença de Alzheimer ___ 17
1.4 Gene da Proteína 1 Relacionada ao Receptor de LDL (LRP1) e a Doença de
Alzheimer _______________________________________________________________ 18
1.5 PCR em tempo real (qRT- PCR) e suas aplicações __________________________ 19
2 OBJETIVOS _______________________________________________________ 20
3 MATERIAL E MÉTODOS _____________________________________________ 20
3.1 Material ______________________________________________________________ 20
3.1.1 Sangue periférico _______________________________________________________ 20
3.2 Métodos _____________________________________________________________ 21
3.2.1 Extração de DNA do sangue ______________________________________________ 21
3.2.2 Extração de RNA de sangue e síntese de cDNA ______________________________ 22
3.2.3 Análise dos polimorfismos do gene do TNF -850 C/T e -308 G/A _________________ 23
3.2.4 Análise da Expressão gênica por qRT-PCR do gene do TNF e LRP1. _____________ 25
3.2.5 Análise Estatística da expressão gênica do TNF e LRP1 em amostras de sangue ____ 26
3.2.6 Análise estatística dos polimorfismos -850 C/T e -308 G/A do gene TNF em amostras de
sangue _________________________________________________________________ 26
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO _________________________________________ 27
4.1 Polimorfismo -850 C/T do gene TNF ______________________________________ 27
4.2 Polimorfismo -308 G/A do gene TNF ______________________________________ 29
4.3 Análise de haplótipo dos polimorfismos -850 C/T e -308 G/A do gene TNF ______ 31
4.4 Análise da Expressão gênica por qRT-PCR do gene TNF. ____________________ 32
4.5 Análise da Expressão gênica por qRT-PCR do gene TNF em relação ao
polimorfismo -308 G/A. ____________________________________________________ 34
4.6 Análise da Expressão gênica por qRT-PCR do gene TNF em relação ao
polimorfismo -850 C/T. ____________________________________________________ 35
4.7 Análise da Expressão gênica por qRT-PCR do gene LRP1. ___________________ 36
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ___________________________________________ 38
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS _____________________________________ 40
7 ANEXOS __________________________________________________________ 49
14
1 INTRODUÇÃO
1.1 Aspectos gerais da Doença de Alzheimer
Em 1907, Alois Alzheimer comunicou o primeiro caso da Doença de Alzheimer
(DA). Na época, supunha-se que a doença estivesse restrita a formas graves de
demências pré-senis de evolução rápida. Depois de muitos estudos, a DA passou a ser
considerada uma doença neurodegenerativa progressiva, heterogênea quanto aos seus
aspectos etiológicos, clínicos e neuropatológicos1.
Na definição de demência do tipo Alzheimer, o paciente apresenta um declínio
progressivo da memória e de outras funções corticais, como linguagem, conceito,
julgamento, habilidades visuoespaciais, e perde a capacidade de interpretar o que vê,
ouve ou sente, podendo manifestar mudanças no comportamento em função das
alterações cognitivas2.
Em 2007, havia no mundo entre 17 e 25 milhões de pessoas com DA, sendo a
terceira causa de morte de idosos nos países desenvolvidos. No Brasil estima-se que
um milhão de idosos tenham DA3. Entre 2% a 5,8% dos indivíduos idosos com mais de
60 anos são atingidos pela DA, e 15 a 20% desses indivíduos possuem mais de 80
anos, mostrando como muitas vezes os sintomas demoram a aparecer e o diagnóstico
é dificultado4.
Por se tratar de uma doença neurodegenerativa, caracteriza-se pela deterioração
progressiva de células nervosas. Vários sinais e consequências aparecem devido a
grande área encefálica afetada pela doença. O prejuízo de memória é o evento clínico
de maior magnitude. Nos estágios iniciais, geralmente encontramos perda de memória
episódica e dificuldades na aquisição de novas capacidades, evoluindo gradualmente
com prejuízos em outras funções cognitivas. Nos estágios intermediários, pode ocorrer
afasia fluente e também apraxia. Nos estágios terminais, encontram-se marcantes
alterações do ciclo sono–vigília; alterações comportamentais, como irritabilidade e
agressividade; sintomas psicóticos; incapacidade de deambular, falar e realizar
cuidados pessoais5.
15
1.2 Componente genético e aspectos moleculares da Doença de Alzheimer
Estudos envolvendo casos da DA familiar com início precoce mostram mutações
em três genes principais: gene da proteína precursora da β-amilóide (AβPP) e genes da
presenilina 1 e 2 (PSEN1 e PSEN2)6,7. A PSEN1 e a PSEN2 estão associadas com o
aparecimento dos sintomas na fase pré-senil, enquanto o peptídeo β-amilóide (Aβ) é
associado ao inicio do desenvolvimento da DA8.
Entretanto, casos com início tardio representam mais de 98% de todas as formas
da doença e são potencialmente causadas pela interação de múltiplos genes
associados a fatores ambientais. Nesses casos, o alelo ɛ4 do gene da apolipoproteína
E (APOE), que apresenta uma frequência duas a três vezes maior em indivíduos com
DA, tem sido identificado como o principal fator de risco genético, podendo aumentar
em ate 50% o risco da DA9-11.
Muitas mutações associadas a esses genes levam ao aumento da expressão do
gene AβPP e o aparecimento precoce dos sintomas.
Além de predisposições genéticas, não pode-se excluir outros fatores, como os
inflamatórios, que também podem influenciar a formação das placas senis e dos
novelos neurofibrilares. Dentre esses fatores, as citocinas são consideradas
fundamentais, uma vez que, sua síntese endógena pode influenciar o acúmulo do
peptídeo Aβ e a formação dos novelos neurofibrilares no cérebro, levando à perda
sináptica irreversível e consequentemente, alterações comportamentais12,13.
Evidências sugerem que a neuroinflamação, mediada pelo sistema imunológico,
contribui para a ocorrência da DA e agrava sua evolução. No entanto, não existe relato
experimental para uma relação causal entre a neuroinflamação e o início da doença em
si14.
Sabe-se que marcadores neuroinflamatórios específicos são potencializados em
áreas do cérebro afetadas pela DA, e que em indivíduos cuja estrutura cerebral não
evidencia nenhuma demência, praticamente não há sinais de neuroinflamação. Isto é
ainda confirmado por estudos que demonstraram que o estado cognitivo está
inversamente correlacionado com a ativação da microglia, em pacientes com DA14.
16
A etiologia da DA é complexa15, e vai além de questões no Sistema Nervoso
Central, pois trata-se de uma doença sistêmica. Razões que vão desde a disfunção
mitocondrial até co-morbidades que se relacionam com o aparecimento de um déficit
cognitivo16. Mas há evidências de que mutações em pelo menos quatro diferentes loci
genéticos podem conferir susceptibilidade inerente à DA: I é causada pela mutação no
gene AβPP localizado no cromossomo 2116,17; II é associada com o alelo ɛ4 da APOE
no cromossomo 19; III é causada pela mutação no gene da PSEN1 localizada no
cromossomo 14 que codifica uma proteína transmembranar integral com pelo menos
sete domínios18 e a IV é causada pela mutação do gene da PSEN2 localizada no
cromossomo 119.
É importante destacar que a associação entre a DA e a Síndrome de Down (SD)
levou à descoberta do primeiro gene supostamente associado à DA no cromossomo 21,
cromossomo extra, envolvido na SD. Indivíduos com SD apresentam envelhecimento
prematuro e praticamente todos desenvolvem a DA, clínica e neuropatologicamente,
entre 40 e 50 anos de idade20-22.
O gene AβPP foi o primeiro a ser identificado como sendo associado à DA, e tem
sido considerado como responsável pela produção do peptídeo Aβ, que se deposita nas
placas senis no cérebro de afetados13,16,22-25.
Os genes ribossômicos se encontram localizados no interior do nucléolo durante
a atividade transcripcional e são transcritos pela RNA polimerase I, após o
processamento, os transcritos estão entre os componentes estruturais e funcionais dos
ribossomos e constituem 90-95% do RNA citoplasmático. A transcrição dos genes
ribossômicos não é somente bastante eficiente, mas também altamente regulada nos
eucariontes, uma vez que as células necessitam produzir milhares de novos ribossomos
para a próxima geração, indispensáveis à síntese protéica das células filhas26.
Segundo trabalhos publicados por nosso grupo, foi observada, através de
estudos realizados por técnicas citogenéticas e posteriormente técnicas moleculares,
uma diminuição na atividade dos genes ribossômicos, em pacientes com DA27-30. Os
resultados obtidos nestes estudos sugerem uma possível alteração em processos como
17
a transcrição, tradução ou maturação da fração maior de RNA, ou seja, degradação
preferencial da subunidade maior de rRNA 28S.
1.3 Fator de Necrose Tumoral (TNF), o envelhecimento e a Doença de Alzheimer
O processo de envelhecimento é caracterizado por mudanças que ocorrem no
indivíduo. Com as células do sistema neuroimunológico, por exemplo, não é diferente,
uma prova disso é a microglia, que apresenta alterações funcionais com o
envelhecimento, resultando na diminuição na capacidade de síntese31. Durante o
crescimento ela contribui para a formação de uma rede neural estável, estimulando a
vascularização cerebral, mantendo a homeostase e auxiliando na diferenciação das
células32. Ainda no envelhecimento ocorre um aumento de danos e alterações na
estrutura do DNA e essa desestabilização compromete a síntese de proteínas, e
consequentemente diminui o nível de manutenção celular33. Esses danos percebidos no
DNA provocam exposição maior a um desequilíbrio homeostático, peroxidação lipídica,
causando toxicidade e lesões que podem evoluir para mutações no DNA, interferindo
não só no sistema nervoso, mas de forma sistêmica no indivíduo34. Nesse contexto, a
microglia atua na liberação de citocinas pró-inflamatórias como o Fator de Necrose
Tumoral-α (TNFα) e Interleucinas (IL-1 e IL-6). Adicionalmente, há uma diminuição na
síntese de citocinas anti-inflamatórias, contribuindo para que o quadro inflamatório
tenha um perfil mais crônico32.
Dentre as citocinas pró-inflamatórias sintetizadas pela microglia o TNFα é,
aparentemente, uma boa premissa para relacionar a neuroinflamação e a DA. Estudos
demonstraram que concentrações de TNFα são encontradas no líquido
cefalorraquidiano de indivíduos com DA e em indivíduos com perda cognitiva leve,
sugerindo uma relação entre o surgimento de sintomas demenciais e o processo
inflamatório35.
Dentre os polimorfismos encontrados para o gene TNF, serão destacados dois,
com suas especificidades e fenótipos definidos. O polimorfismo rs1800629,
caracterizado por uma troca de base nitrogenada Guanina por Adenina (G/A) na
posição -308, está associado ao aumento da produção de TNFα, a ocorrência de
18
Esclerose Múltipla e o aparecimento de casos pré-senis da DA; e o alelo rs1799724
que, também, se associa com a DA, e em menor número com demências vasculares,
caracterizado por uma troca simples de base Citosina por Timina (C/T) na posição -850.
Esse mesmo estudo que caracterizou os polimorfismos mostrou, depois de reunir uma
amostra de mais de 700 indivíduos, que o polimorfismo mais frequente nos pacientes
estudados com um possível diagnóstico de DA foi o rs179972435.
Uma hipótese para se relacionar o TNFα com a DA está ligada ao ciclo celular
dos neurônios. Estudos recentes mostraram que o aumento na produção de TNFα
consequente do envelhecimento induz a eventos de ciclos celulares neuronais que não
deveriam ocorrer, pelo motivo dos neurônios serem células fortemente diferenciadas
que em determinado momento de maturação saem do ciclo celular e entram em G0,
levando a degeneração de todo sistema32,36.
Outra correlação com a DA é que o aumento de citocinas pró-inflamatórias como
o TNFα aceleram o processo de hiperfosforilação da proteína tau e de formação de
agregados Aβ, causando um ciclo neuroinflamatório e neurodegenerativo37.
1.4 Gene da Proteína 1 Relacionada ao Receptor de LDL (LRP1) e a Doença de
Alzheimer
Além da hipótese neuroinflamatória utilizada para entender e pesquisar com
maior ênfase a patogênese da DA, existem alguns estudos que relacionam o
metabolismo lipídico e suas vias de transporte com a etiologia da DA. Alguns trabalhos
mostram um aumento nos níveis de colesterol no plasma, no cérebro e no fluido
cerebroespinhal de pacientes com DA, mas por enquanto esses resultados são
controversos, pois o aumento desses níveis é discreto e há outros estudos que não
encontram diferença na comparação entre pacientes com DA e controles38.
Considerando a etiologia genética da DA, e que essa ainda não está totalmente
esclarecida, novos genes devem ser considerados para estudo. Com essa premissa, o
gene da Proteína 1 Relacionada ao Receptor de LDL (LRP1), alvo do presente projeto,
o qual está localizado no cromossomo 12, com expressão diminuída ao longo do
envelhecimento, codifica uma proteína relacionada a um receptor endocítico,
19
participando ativamente do transporte de substâncias para o interior da célula39. Alguns
de seus ligantes são a A2M, APOE e Aβ, proteínas diretamente relacionadas com a
DA40. LRP1 também parece estar relacionado no transporte de moléculas pela barreira
hematoencefálica (BHE), sendo crucial em alguns mecanismos homeostáticos41.
Uma relação entre LRP1 e Aβ parece ser mais efetiva, onde uma porção do
primeiro interage com o domínio citoplasmático da AβPP, e essa interação influencia na
geração e depuração da Aβ41. Na DA os níveis de LRP1 parecem estar comprometidos,
tanto cerebrais quanto periféricos, e isso pode levar a um acúmulo de Aβ, originando as
placas senis encontradas em pacientes com DA42.
1.5 PCR em tempo real (qRT- PCR) e suas aplicações
A PCR em tempo real é descrita como uma extensão da técnica da PCR
convencional, descoberta por Mullis em 1980, permite o monitorar e analisar a
amplificação, a cada ciclo43,44.
Existem muitos métodos que mensuram a quantidade de material genético,
entretanto o qRT-PCR apresenta ótimos resultados, com uma alta sensibilidade e
especificidade, além de uma excelente reprodutibilidade45. Dentre todas as aplicações
do qRT-PCR, podemos destacar a quantificação da expressão gênica (relativa ou
absoluta), validação de plataformas de “microarray”, detecção e quantificação de
microorganismos, identificação de polimorfismos e diagnósticos moleculares46.
Na DA, estudos recentes utilizando a técnica de PCR em Tempo Real
apresentaram resultados controversos quanto à expressão gênica, em amostras de
cérebro e sangue, de pacientes com DA e controles47-49, tornando a expressão do gene
da AβPP, ץ e β secretases e PSEN1 e PSEN2 candidatas a estarem associadas a
etiologia da DA. Roher et al.20 propõe que a super expressão do gene AβPP, é o
principal marco no inicio do desenvolvimento da DA.
Kumar et al.50 e Gileberto et al.51 destacaram o aumento da expressão do gene
da PSEN1 associados ao grande deposito de placas senis e acumulo do Aβ. Smith et
al.52 e Payão et al.53, do nosso grupo, relataram uma diminuição da atividade e menor
20
expressão dos genes ribossomais em pacientes com DA sugerindo também sua relação
com a etiologia da doença.
A literatura atual sugere que os dois genes do presente estudo podem estar
relacionados com a etiologia e desenvolvimento da DA. Porém o que não se sabe ao
certo é em que momento da doença essas interações participam, por isso há
necessidade de maiores investigações e estudos, com a finalidade de conhecer melhor
e, posteriormente, encontrar meios que possibilitem um tratamento ou um controle
maior da DA.
2 OBJETIVOS
Utilizando amostras de DNA e RNA de pacientes com DA e controle, este
trabalho teve como objetivos:
Avaliar as frequências alélicas e genotípicas dos polimorfismos -850 C/T e -308
G/A do gene TNF;
Quantificar a expressão do mRNA desse gene, por meio das técnicas de PCR –
RFLP e PCR em Tempo Real, respectivamente, em sangue periférico;
Correlacionar os resultados da análise da expressão do gene TNF com os
resultados das frequências alélicas dos seus polimorfismos.
Quantificar a expressão do mRNA do gene LRP1 em sangue periférico;
3 MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em pesquisa
da Faculdade de Medicina de Marília, sob o nº do parecer 951.024 (Vide anexo).
3.1 Material
3.1.1 Sangue periférico
O grupo dos pacientes com DA totalizam 117 amostras, de ambos os sexos.
Caracterizados clinicamente no presente projeto, somente pacientes que apresentaram
um mínimo de três anos de evolução da doença e caracterizados pelo coeficiente de
demência (CDR) 54.
21
Todos os pacientes com DA foram selecionados no Ambulatório de Neurologia
do Comportamento da UNIFESP/EPM, sob supervisão do Prof. Dr. Paulo Bertolucci.
O critério diagnóstico utilizado para a caracterização da DA foi o NINCDS-
ADRDA (National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke-
Alzheimer’s disease and Related Disorders Association)55,56. Tal critério foi estabelecido
com base no DSM-IV (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders), com
adaptações para o diagnóstico provável da DA.
O grupo controle foi constituído 110 idosos (as) sadios (as) com idades
aproximadas à dos pacientes com DA, sem sequela de Acidente Vascular Cerebral,
sem depressão profunda e não alcoolista. Foram avaliados pelo Mini Exame do Estado
Mental e pela aplicação do Índice de Katz.
A distribuição dos dois grupos quanto ao sexo e idade, está descrita no quadro 1.
Aproximadamente 4 mL de sangue total periférico foi obtido através de punção
venosa com seringa e agulha estéril em anticoagulante EDTA e utilizados para extração
de RNA total e DNA
Quadro 1- Distribuição dos indivíduos do grupo controle e pacientes com DA quanto ao sexo e idade.
Total de indivíduos Mulheres Homens
n(%)
Idade Média ± DP
n(%) Idade Média ±
DP n(%)
Idade Média ± DP
CI 110(100%) 71,1 ± 8,8 73(66,4%) 71 ± 8,9 37(33,6%) 71,2 ± 8,8
DA 117(100%) 74,4 ± 7,8 80(68,4%) 74,9 ± 7,6 37(31,6%) 73,3 ± 8,2
Total 227(100%) 72,8 ± 8,5 153(67,4%) 73,1 ± 8,5 74(32,6%) 72,2 ± 8,5
CI: Controle Idoso, DA: Pacientes com Doença de Alzheimer, n: Número absoluto, DP: Desvio padrão.
3.2 Métodos
3.2.1 Extração de DNA do sangue
Para extração de DNA de sangue total periférico obtido por meio de punção
venosa, foi utilizado o kit QIAamp DNA Blood Midi Kit® - 51185 (QIAGEN), segundo
instruções do fornecedor.
22
A qualidade das extrações foi analisada por meio da eletroforese em gel de
agarose 1%, corado com brometo de etídio (Figura 1). A quantificação do DNA extraído
foi realizada no NanoDrop (ND-2000 Spectrophotometer).
Figura 1: Quantificação de DNA obtido de sangue periférico, em gel de agarose 1% corado com brometo
de etídio.
3.2.2 Extração de RNA de sangue e síntese de cDNA
Para a extração de RNA total de sangue periférico foi utilizado RiboPure™ –
Blood – AM1928 (Ambion), segundo instruções do fornecedor.
A qualidade das amostras foi confirmada por eletroforese em gel de agarose 1%
(Figura 2), e sua quantificação feita no NanoDrop (ND-2000 Spectrophotometer) para
posterior armazenamento a -80ºC.
A síntese do DNA complementar (cDNA) a partir do RNA foi realizada depois das
concentrações de RNA devidamente ajustadas para 800ng total. Foi utilizado o kit High-
CapacitycDNA Reverse Transcription Kits (AppliedBiosystems™), segundo protocolo do
fabricante.
DNA
2.072 pb
600 pb
100 pb
23
Figura 2: Quantificação do RNA obtido de sangue periférico, em gel de agarose 1% corado com brometo
de etídio.
3.2.3 Análise dos polimorfismos do gene do TNF -850 C/T e -308 G/A
Para determinação dos polimorfismos em -850 (C/T) e -308 (G/A) (a partir do
sítio de início da transcrição) foi realizada a técnica da PCR, para amplificação de
fragmentos de 128pb e 107pb, respectivamente. Seguida do tratamento enzimático
(RFLP – Restriction Fragment Lenght Polimorphism), de acordo com as condições
descritas por Laws35, que consistiu no tratamento do produto de PCR com as enzimas
de restrição HindIII e NcoI, respectivamente. Após o tratamento, esses produtos foram
fracionados em um gel de agarose a 3%, corado com brometo de etídio, visualizado em
um transluminador ultravioleta, fotografado e analisado quanto à distribuição dos alelos,
por meio do sistema de captura de imagens Alpha Imager 2200 (Alpha
InnotechCoorporation) (Figuras 3 e 4). A descrição dos “primers” assim como as
condições de amplificação estão especificadas na tabela abaixo (Tabela 1)
18S
28S
24
Figura 3- Visualização da amplificação do Produto da PCR de um fragmento de 107 pb referente ao
polimorfismo -308 G/A e caracterização dos genótipos para as mesmas amostras.
Figura 4- Visualização da amplificação do Produto da PCR de um fragmento de 128 pb referente ao
polimorfismo -850 C/T e caracterização dos genótipos para as mesmas amostras.
100 pb
600 pb
107 pb
100 pb
600 pb
128 pb
M CI02 CI05 CI09 CI15 C- M CI02 CI05 CI09 CI15
A121 A122 A126 A128 A129 A133 M A121 A122 A126 A128 A129 A133 M
GA GA GG AA
TT CT CC CC CT CC
107 pb
87 pb
128 pb
105 pb
25
Tabela 1- Descrição dos primers utilizados para amplificar os fragmentos de 128pb e 107pb referentes
aos polimorfismos -850 C/T e -308 G/A, e das condições para amplificação.
Primers Sequência (5’- 3’) Condições de Amplificação Bibliografia
TNF1 (-308) AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT 35 ciclos de: 45 seg a 94ºC, 45
seg a 60ºC e 45 seg a 72ºC
Laws et al.,
2005
TNF2 (-308) TCCTCCCTGCTCCGATTCCG
TNF3 (-850) TCGAGTATCGGGGACCCCCCGTT 35 ciclos de: 45 seg a 94ºC, 45
seg a 60ºC e 30 seg a 72ºC TNF4 (-850) CCAGTCTGTGGGCATATCTTCTT
(rs1799724 -850 C>T) - Produtos: Genótipo CC: fragmentos de 105pb e 23pb,
Genótipo TC: fragmentos de 128, 105 e 23pb, Genótipo TT: fragmento de 128pb
(rs1800629 -308 G>A) - Produtos: Genótipo AA: fragmento de 107pb, Genótipo
GA: fragmentos de 107, 87 e 20pb, Genótipo GG: fragmentos de 87 e 20pb
3.2.4 Análise da Expressão gênica por qRT-PCR do gene do TNF e LRP1.
A análise da expressão dos genes do TNF e LRP1 foi realizada no termociclador
automático (ABI Prism 7500 Fast Sequence Detection System) e para quantificação do
RNA nas amostras utilizou-se os valores de Ct pela fórmula 2(-ΔΔCt).
Os genes de referência utilizados para análise das amostras foram GAPDH e
B2M. Todos testados utilizando os software GeNorm e BestKeep.
Nesse trabalho, os iniciadores e sondas específicas para amplificação e detecção
dos genes foram escolhidos, a partir de uma relação (selection guide) de ensaios
testados, validados e disponibilizados comercialmente como TaqMan® Gene
Expression Assay – inventoried (Applied Biosystems), os ensaios utilizados foram: TNF
(target; assay id: Hs00174128_m1), LRP1 (target; assay id: Hs00233856_m1), B2M
(endogenous control; assay id: Hs99999907_m1) e GAPDH (endogenous control; assay
id: Hs03929097_g1*).
26
As reações foram realizadas utilizando o sistema TaqMan® (Life Technologies/
Applied Biosystems) com iniciadores e as sondas específicas para a amplificação e
detecção dos genes.
Para determinar a eficiência de amplificação dos iniciadores foram construídas
curvas-padrão com diluições em série de amostras de cDNA (pool de cDNA puro e
diluições).
O método escolhido para quantificação da expressão gênica foi o método CT
comparativo (Método ΔΔCT), de acordo com LivakErro! Fonte de referência não
encontrada..
3.2.5 Análise Estatística da expressão gênica do TNF e LRP1 em amostras de
sangue
Os valores relativos a cada um dos grupos (pacientes com DA e idosos sadios)
foram comparados, por meio do teste t student e Mann-Whitney. As variáveis
dicotômicas foram avaliadas pelo teste χ2 de acordo com a distribuição e natureza
dessas.
Os valores de p < 0,05 foram considerados significativos.
Todas as análises foram realizadas utilizando o programa SPSS 21.0.
3.2.6 Análise estatística dos polimorfismos -850 C/T e -308 G/A do gene TNF em
amostras de sangue
a) O tamanho amostral referente ao número de indivíduos com DA e indivíduos do
grupo controle foi calculado pela distribuição binomial, considerando-se a frequência
dos alelos raros, cujos relatos da literatura e de amostra de trabalho de nosso grupo,
variaram entre 0,20 a 0,30. Considerando-se estas frequências, o poder do teste igual a
0,99, nível α igual a 0,05 e teste bilateral, uma amostra de 117 indivíduos com DA e 110
idosos sadios se mostrou adequada ao estudo.
b) A distribuição dos genótipos foi testada em relação ao equilíbrio de Hardy-Weinberg;
27
c) Foi realizado estudo de associação caso-controle referente a cada polimorfismo, aos
haplótipos, e ao efeito da interação entre os polimorfismos por meio de teste do Qui
Quadrado, regressão logística binária e/ou teste de Odds Ratio (OR).
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Polimorfismo -850 C/T do gene TNF
Os resultados encontrados para o polimorfismo -850 C/T mostraram que não
houve diferença estatística significante na distribuição dos três genótipos entre os
grupos Controle e Alzheimer (p=0,197) (Gráfico 1).
Foram realizadas, também, comparações de um genótipo em relação aos outros
dois, e houve um aumento estatisticamente significante para genótipo C/C em
pacientes com DA, quando comparado com os genótipos C/T e T/T (p=0,044) (Gráfico
2).
Gráfico 1- Distribuição dos genótipos do polimorfismo -850 C/T nos grupos Controle e de Pacientes com
Doença de Alzheimer.
0
20
40
60
80
100
T/T C/T C/C
Controle
Alzheimer
p=0,197
Polimorfismos -850
28
Gráfico 2- Comparação entre o genótipo C/C e os genótipos C/T e T/T, do polimorfismo -850 C/T, em
relação aos grupos Controle e de Pacientes com Doença de Alzheimer.
Os resultados encontrados na literatura para o polimorfismo -850 C/T do gene
TNF ainda se mostram conflitantes, evidenciando uma dificuldade em se relacionar, de
forma mais clara, esse polimorfismo com a DA. Uma meta análise feita com seis
estudos, mostrou que indivíduos com o genótipo T/T possuem maior risco de
desenvolver DA. Esse mesmo trabalho ainda verificou uma discreta diferença, porém
não estatisticamente significante, entre indivíduos C/T e C/C, sugerindo uma possível
influência do alelo recessivo T com a DA58.
Essa relação fica um pouco mais clara no estudo de Laws et al., que relacionou
os polimorfismos -850 do TNF com os polimorfismos da APOE. O alelo T parece atuar
de maneira sinérgica ao alelo ɛ4 para o desenvolvimento da DA 35.
Os achados do nosso estudo, para o polimorfismo -850 do gene TNF indicaram o
genótipo C/C como sendo mais recorrente em pacientes com DA, quando comparados
com os idosos do grupo controle. Possivelmente, esse fato está relacionado à alta
frequência de genótipo C/C nos dois grupos em comparação aos genótipos C/T e T/T,
principalmente ao genótipo recessivo T/T com 6 e 4 indivíduos nos grupos controle e
DA, respectivamente.
0
20
40
60
80
100
C/C C/T e T/T
Controle
Alzheimer
p=0,044*
Comparação do genótipo C/C com os demais
29
A frequência dos genótipos nos grupos com DA e idosos sadios segue uma
distribuição semelhante. Portanto, o resultado obtido parece estar relacionado com a
frequência genotípica da população. Nos estudos encontrados do polimorfismo -850
C/T, o genótipo dominante C/C foi encontrado mais comumente. Já o genótipo T/T
apareceu em menor número, o que sugere esse genótipo como sendo raro na
população como um todo35,58.
4.2 Polimorfismo -308 G/A do gene TNF
Para o polimorfismo -308 G/A, encontramos uma diminuição estatisticamente
significante do genótipo A/A nos pacientes com DA em relação ao grupo controle
(p=0,0002). Para os genótipos G/G e G/A, não houve diferença estatisticamente
significante entre os grupos estudados (Gráfico 3).
Além da análise individual dos genótipos feita nos dois grupos, esse estudo
também avaliou a correlação genotípica (G/G x G/A+A/A, G/A x G/G+A/A e A/A x
G/G+G/A) para os pacientes com DA e controle. Os resultados encontrados
evidenciaram um aumento estatisticamente significante do percentual de G/A no grupo
com DA (p=0,042). Na análise A/A x G/G+G/A, houve uma diminuição estatisticamente
significante do genótipo A/A em amostras de indivíduos com DA (p=0,004) (Gráficos 4 e
5). A correlação G/G x G/A+A/A não apresentou diferença estatisticamente significante.
Gráfico 3- Distribuição dos genótipos do polimorfismo -308 G/A nos grupos Controle e Pacientes com
Doença de Alzheimer.
0
20
40
60
80
100
A/A G/A G/G
Controle
Alzheimer
p=0,0002*
Polimorfismos -308
30
Gráfico 4- Comparação entre o genótipo G/A e os genótipos G/G e A/A, do polimorfismo -308 G/A, em
relação aos grupos Controle e Pacientes com Doença de Alzheimer.
Gráfico 5- Comparação entre o genótipo A/A e os genótipos G/G e G/A, do polimorfismo -308 G/A, em
relação aos grupos Controle e Pacientes com Doença de Alzheimer.
Os resultados encontrados para o polimorfismo -308 do gene TNF mostram um
efeito protetor nos indivíduos com o genótipo homozigoto para o alelo A. Segundo Di
Bona et al.,58 em sua meta análise, esse polimorfismo pode se comportar de maneira
diferente quanto ao risco ou proteção, dependendo do grupo étnico no qual o estudo é
0
20
40
60
80
100
G/A G/G e A/A
Controle
Alzheimer
p=0,042*
Comparação do genótipo G/A com os demais
p=0,04
0
20
40
60
80
100
120
A/A G/G e G/A
Controle
Alzheimer
p=0,004*
Comparação do genótipo A/A com os demais
p=0,0
31
realizado. Um estudo mais recente confirma essa hipótese, evidenciando o genótipo
A/A como sendo de risco em indivíduos asiáticos, e como protetor para caucasianos59.
Ainda com relação ao polimorfismo -308, nosso trabalho verificou um aumento
estatisticamente significante do genótipo G/A, na análise de correlação genotípica (G/A
x G/G+A/A), no grupo de pacientes com DA em relação ao grupo de idosos sadios. Um
estudo em cluster encontrou esse mesmo padrão de resultado em pacientes com DA
entre os 60-69 anos, indicando uma possível relação entre o genótipo e o início da
doença60.
4.3 Análise de haplótipos dos polimorfismos -850 C/T e -308 G/A do gene TNF
Além das análises dos polimorfismos -850 C/T e -308 G/A isoladas, o presente
trabalho associou os alelos dos dois polimorfismos entre si. Essa análise em
combinação de alelos provenientes de regiões distintas de um mesmo gene é
denominada análise em haplótipo.
A associação dos haplótipos desenvolvida nesse estudo demonstrou não haver
diferença estatisticamente significante quanto a combinação de alelos e aos grupos de
indivíduos estudados (Tabela 2).
Tabela 2- Associação dos haplótipos com a Doença de Alzheimer, com valores de p para cada
associação, e também o valor global, analisando todas as associações.
Associação dos haplótipos com Doença de Alzheimer (n=227)
-850 -308 Frequência OR (95% IC) Valor de p*
1 C G 0.7182 1.00
2 T G 0.1474 0.68 (0.42 1.10) 0.12
3 C A 0.121 0.82 (0.47 1.43) 0.48
4 T A 0.0133 0.23 (0.03 2.08) 0.19
Valor de p=0.16 para a associação global dos haplótipos
*Valor de significância considera p<0.05
32
4.4 Análise da Expressão gênica por qRT-PCR do gene TNF.
A análise da expressão gênica do TNF mostrou uma diminuição estatisticamente
significante em indivíduos com DA, se comparada com a expressão do grupo controle
(p=0,0001) (Gráfico 6).
Gráfico 6- Expressão relativa do gene TNF em amostras de sangue de idosos sadios e de pacientes com
Doença de Alzheimer. Comparação dos valores de 2-ΔΔCT entre os grupos estudados.
A relação etiológica da DA com a neuroinflamação, na literatura científica, ainda
mostra resultados contraditórios. Estudos de expressão gênica e de quantificação de
citocinas tem sido recorrentes nos últimos anos, afim de encontrar explicações que
evidenciem, de fato, a ligação entre o processo neuroinflamatório e a DA. De Luigi et
al., (2002)61, Licastro et al., (2000)62 e Dursun et al., (2015)63 encontraram um aumento
nos níveis IL-1β no plasma de pacientes com DA, porém esse aumento não foi
correlacionado com a análise da expressão do gene.
33
Um estudo feito com o gene IL-8 mostra um aumento na expressão em pacientes
com DA64, em contrapartida as concentrações plasmáticas da IL-8, encontrada por Kim
et al., (2011)65, em pacientes com DA, comprometimento cognitivo moderado e idosos
sadios, não evidenciaram qualquer diferença estatistica significante.
Dursun et al., (2015)63 também analisaram os níveis séricos da IL-6 em pacientes
com DA e controle, porém só houve um aumento estatisticamente significante na
concentração de IL-6 em indivíduos com DA de início precoce. Luterman et al., (2000)66
encontrou um aumento estatisticamente significante na expressão gênica da IL-6 em
cerébro de indivíduos com DA e emaranhados neurofibrilares densos, se comparados
com pacientes com DA, porém sem ou com novelos neurofibrilares mais dispersos,
sugerindo uma relação com a agregação da proteína tau no cérebro de indivíduos
doentes.
Da mesma forma que alguns genes que sintetizam os mediadores do processo
inflamatório, a expressão do TNF parece ser um caminho complexo, dentro da relação
entre processo neuroinflamatório e DA. Luterman et al., (2000)66 não encontraram
diferença nos níveis de mRNA entre cérebros sadios e com DA, sugerindo que o
processo inflamatório pode não ser mediado pelo TNFα. Um dado interessante mostra
que as concentrações cerebrais da citocina TNFα parecem se comportar de forma
distinto quanto a sua neurotoxicidade ou neuroproteção67 e isso dificulta delimitar o
TNFα como um fator determinante para a fisiopatologia da DA. Sabe-se que existe uma
concentração fisiológica específica de TNFα no sistema nervoso central, que auxilia na
funcão sináptica e na consolidação da memória68,69. Quando essa concentração
fisiológica estável se altera, podem haver complicações no funcionamento do sistema
nervoso. Concentrações muito baixas dessa citocina podem prejudicar a eficiência das
sinapses, por outro lado, quando os níveis estão muito elevados, o TNFα tem um papel
neurotóxico68.
Um estudo em camundongos revelou ainda, que quanto menor a quantidade de
TNFα no cérebro, menor a síntese do Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF)
que possui importante papel na plasticidade cerebral, relacionada à aquisição de novos
34
aprendizados, capacidade de memorizar situações novas e adaptação a uma condição
menos favorável ao sistema nervoso70.
Nosso estudo observou uma diminuição na expressão do gene TNF em tecido
periférico (sangue) de pacientes com DA, porém esse perfil não está necessariamente
ligado ao sistema imune periférico, e sim com um processo patológico neuronal já
estabelecido, diretamente ligado ao desenvolvimento da DA. Gezen-AK et al., (2013)71
indicaram que os níveis séricos de TNFα são inversamente proporcionais a idade dos
pacientes com DA, propondo uma ligação entre a síntese de TNFα e o momento de
evolução da DA.
4.5 Análise da Expressão gênica por qRT-PCR do gene TNF em relação ao
polimorfismo -308 G/A.
Os resultados referentes a expressão gênica do TNF foram relacionados ao
polimorfismo -308 G/A. Nessa análise foram utilizadas apenas as amostras com o
genótipo caracterizado e que possuiam, também, a quantificação da expressão já
realizada (Gráfico 7).
O presente estudo encontrou uma diminuição estatisticamente significante para
os genótipos G/G (p=0,0001) e G/A (p=0,049) de pacientes com DA, em relação aos
mesmos genótipos para o grupo controle. Não houve análise para o genótipo A/A, pois
não existiam amostras com esse genótipo no grupo de pacientes com DA,
inviabilizando a comparação.
Os valores encontrados nesse trabalho para expressão gênica do TNF
relacionada a região promotora -308 G/A, indicaram o mesmo padrão de diminuição na
análise feita sem considerar o polimorfismo, propondo que a diferença genotípica não
influencia a expressão do gene TNF na DA.
35
Gráfico 7- Expressão relativa do gene TNF em amostras de sangue de idosos sadios e pacientes com
Doença de Alzheimer em relação ao polimorfismo -308 G/A. Comparação dos valores de 2-ΔΔCT entre
os grupos estudados.
4.6 Análise da Expressão gênica por qRT-PCR do gene TNF em relação ao
polimorfismo -850 C/T.
Os resultados encontrados para a expressão gênica do TNF relacionada ao
polimorfismo -850 C/T partiram da mesma premissa de utilizar apenas as amostras com
caracterização dos genótipos e análise da expressão, já realizadas.
Esse trabalho encontrou uma diminuição estatisticamente significante apenas
nos pacientes com DA e genótipo C/C, quando comparados ao mesmo genótipo no
grupo controle (p=0,0003). Para os genótipos C/T e T/T não houve diferença
estatisticamente significante entre os grupos (Gráfico 8). Esses resultados sugerem
que, além do alelo T aumentar o risco de DA e ter relação com o alelo ɛ4 da APOE35,58,
36
ele também influencia na expressão gênica do TNF em pacientes com DA, interferindo
na síntese de TNFα.
Gráfico 8- Expressão relativa do gene TNF em amostras de sangue de idosos sadios e pacientes com
Doença de Alzheimer em relação ao polimorfismo -850 C/T. Comparação dos valores de 2-ΔΔCT entre
os grupos estudados.
4.7 Análise da Expressão gênica por qRT-PCR do gene LRP1.
Os resultados encontrados para a expressão do gene LRP1 em amostras de
sangue mostraram um aumento estatisticamente significante na expressão de mRNA
em pacientes com DA (p=0,0128), quando comparados com idosos sadios (Gráfico 9).
37
Gráfico 9- Expressão relativa do gene LRP1 em amostras de sangue de idosos sadios e pacientes com
Doença de Alzheimer. Comparação dos valores de 2-ΔΔCT entre os grupos estudados.
A literatura parece indicar uma relação entre DA e mecanismos envolvidos no
metabolismo lipídico. E em um desses mecanismos, a proteína sintetizada pelo gene
LRP1 participa efetivamente, a depuração de Aβ do cérebro, passando pela BHE, para
a corrente sanguínea periférica72,73. Essa relação fica mais clara com o trabalho de
Kang et al onde há menor expressão de LRP1 no cérebro de indivíduos com DA, se
comparados com idosos sadios, e consequentemente, menor depuração Aβ na corrente
sanguínea74. Deane et al., 2009 também encontrou menor expressão do gene LRP1,
dessa vez na BHE, em estudo com modelo experimental de DA75.
Nosso trabalho encontrou um aumento da expressão de LRP1, em amostras de
sangue, justamente o contrário do que a literatura aponta em tecido cerebral. E isso
implica em diferentes grupos celulares nos quais LRP1 é expresso e até mesmo
mecanismos nos quais ele é regulado. Na corrente sanguínea, LRP1 é bastante
expresso pelos macrófagos, grupo de células do sistema imune que desempenha
funções importantes na resposta inflamatória. Esse aumento na expressão de LRP1 em
38
pacientes com DA, pode indicar um maior recrutamento de macrófagos em resposta a
um quadro inflamatório estabelecido.
Se por um lado a expressão do LRP1 parece estar diminuída no cérebro de
indivíduos com DA, segundo a literatura, e isso implica no acúmulo de agregados Aβ.
Em contrapartida o aumento da expressão em amostras de sangue de pacientes com
DA, encontrado no presente trabalho, reforça a hipótese de que complicações
vasculares podem influenciar a ocorrência da DA. E nesse cenário, Overton et al., 2007
mostraram, em um estudo com ratos, que a deleção de LRP1 em macrófagos acelera a
formação de placas de ateroma nos vasos76. Além disso, há indícios de que LRP1 tem
um caráter anti-inflamatório, regulando a expressão do Receptor 1 de TNFα (TNFαR1),
onde os níveis de LRP1 são inversamente proporcionais a expressão de TNFαR1,
portanto quanto maior a concentração de LRP1, menor a ativação da cascata
inflamatória via TNFα77.
Uma possível ligação entre DA, problemas cardiovasculares e inflamação, pode
ser vista na Aterosclerose, onde a uma formação de placas no interior dos vasos,
decorrente de um processo inflamatório, repercute muito no fluxo sanguíneo, inclusive
pela BHE, podendo ocasionar um processo isquêmico, dificultando o transporte de
substâncias essenciais para a manutenção e plasticidade cerebral78.
O gene LRP1 e, mais precisamente, a proteína que ele sintetiza, participa de
vários mecanismos importantes, seja no transporte de moléculas, seja na regulação de
outras substâncias. E esta característica faz desse gene uma boa premissa para
entender a fisiopatologia da DA e como ela se relaciona com outras morbidades, no
caso, metabólicas e vasculares.
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Esse estudo utilizou os genes TNF e LRP1, partindo de dois pressupostos na
etiologia da DA, o primeiro é a neuroinflamação e o segundo é o metabolismo lipídico.
O tipo de estudo e o objetivo para cada gene é diferente, por isso esse trabalho utiliza
duas linhas de abordagem distintas. Numa primeira abordagem, a intenção é
correlacionar a expressão gênica com os polimorfismos do gene TNF, âmbito pouco
39
explorado na literatura científica, até o momento. E, por fim, analisar a expressão
gênica do LRP1 em amostras de sangue, de perfil mais sistêmico e fazer um paralelo
com a ocorrência da DA, podendo relacionar outras morbidades com o aparecimento da
demência, ampliando o conhecimento da relação entre expressão gênica e DA.
40
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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and gerontology. Principles of geriatric medicine and gerontology. 1999.
2. Saúde OMd. CID-10: Classificação Estatística Internacional de Doenças com disquete
Vol. 1: Edusp; 1994.
3. Fonseca AM, Soares E. Interdisciplinaridade em grupos de apoio a Familiares e
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