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ESTUDIO DE VALIDACIN DE LA METODOLOGA PARA LA DETERMI-NACIN DE VITAMINA A EN ALIMENTOS INFANTILES INSTANTNEOS

POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTO RENDIMIENTO (HPLC)

Ruth Prez Caldern.

* Divisin de Qumica, Centro Nacional de Alimentacin y Nutricin, Instituto Nacional de Salud.

RESUMEN

Con la finalidad de controlar la calidad de alimentos infantiles instantneos se efectu la validacin de la metodologapara la determinacin de la vitamina A por cromatografa lquida de alto rendimiento (HPLC). Para la precisin delsistema se evaluaron tres parmetros: tiempo de retencin, rea y altura, hallndose una desviacin estndar relativa(RSD) mxima de 1,78%. En la linealidad se obtuvo un coeficiente de correlacin r=0,99 y una precisin con un RSD de2,70%. La exactitud del mtodo se evalu en trminos de recuperacin mediante la adicin de vitamina A al alimentoobtenindose un porcentaje de recuperacin de 97,98%; y para la sensibilidad del mtodo se obtuvo un lmite dedeteccin (LOD) de 0,06 mg/g y un lmite de cuantificacin (LOQ) de 0,58 mg/g. Con los resultados obtenidos sedemuestra que el mtodo en estudio es preciso, exacto, lineal y altamente sensible para ser utilizado en el control decalidad de alimentos infantiles instantneos para la determinacin de vitamina A.

Palabras claves: Vitamina A; Cromatografa lquida; Alimentos infantiles (fuente: BIREME).

ABSTRACT

Validation of the methodology used to determine Vitamin A through High Performance Liquid Cromatography (HPLC)was performed to assess instant food for children.Three parameters were assessed in order to determine the systemsaccuracy: retention time, area and height and a maximum variation (RSD) of 1.78% was found. A correlative coefficient ofr=0.99 was obtained for the lineal parameter, and an accuracy with 2.70% for RSD. The accuracy of the method wasevaluated in terms of recovery through the addition of Vitamin A to the food, the recovery percentage obtained was97.98%, and for the sensitivity a limit of detection (LOD) 0,06ug/g was obtained, as well as a limit of quantification (LOQ)0,58%. The findings demonstrate that the method assessed is accurate, exact, lineal and highly sensitive to be used inquality control of instant food for children for the determination of Vitamin A.

Key Words: Vitamin A; Liquid cromatography; Infant food (source: BIREME).

Correspondencia: Ruth Prez Caldern. Centro Nacional de Alimentaciny Nutricin. Tizn y Bueno 276, Lima 11, Per. Telf.: (0511) 4639588 Fax:(0511) 4639617.Email: r_whittembury@yahoo.es

INTRODUCCION

Vitamina A es el nombre genrico utilizado paradescribir al retinol, sus steres y los correspondientesismeros. Slo est presente, como tal, en los alimentosde origen animal, aunque en los vegetales se encuentracomo provitamina A en forma de carotenos.

Los diferentes carotenos se transforman en vitamina Aen el cuerpo humano, se almacenan en el hgado engrandes cantidades y tambin en el tejido graso de lapiel (palmas de las manos y pies, principalmente), por loque podemos subsistir largos perodos sin su aporte1.

La principal funcin de la vitamina A es la proteccin de lapiel y su intervencin en el proceso de visin de la retina.Tambin participa en la elaboracin de enzimas en elhgado y de hormonas sexuales y suprarrenales. El dficitde vitamina A produce ceguera nocturna, sequedad enlos ojos (membrana conjuntiva) y en la piel, y afeccionesdiversas de las mucosas. En cambio, el exceso de estavitamina produce trastornos como alteraciones seas, eincluso inflamaciones y hemorragias en diversos tejidos.La vitamina A se encuentra principalmente en productosanimales tales como leche, crema, mantequilla, queso,huevos, carne, hgado, rin y aceite de hgado de bacalao.Por lo general, se encuentra como steres de cidosgrasos de cadena larga pero tambin se encuentra comoretinol. Se destruye muy fcilmente con la luz, con la

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temperatura elevada y con los utensilios de cocina dehierro o cobre2.

Los alimentos infantiles instantneos, en su gran mayora,son fortificados normalmente utilizando formulacionesespeciales que mejoran su estabilidad y valor nutritivo,siendo la ingesta diaria recomendada (RDA) de 400 -700 mg de vitamina A, para nios de 1-10 aos de edad3.

En el Per, los programas de complementacinalimentaria distribuyen alimentos instantneos a lapoblacin con alto riesgo de desnutricin; en ese sentido,el desarrollo de tecnologas adecuadas para laevaluacin de micronutrientes como la vitamina A, sonnecesarias para el control de calidad de los productosdesignados a los beneficiarios de estos programas.

El anlisis de las vitaminas en los alimentos es un grandesafo para los analistas dado que se asocia conproblemas significativos. Muchos de estos problemashan sido eliminados gracias a los recientes avances enla tecnologa y el desarrollo de nuevos enfoquesanalticos. A pesar de ello, no es una tarea fcil analizarvitaminas y se necesita experiencia y los conocimientosadecuados para producir resultados reproducibles, quesean exactos y vlidos.

El primer mtodo vlido para la determinacin deVitamina A fue un bioensayo4; luego, se establecieron losmtodo espectrofotomtrico y fotomtrico5, sin embargo,ambos mtodos estn expuestos a interferencias, desdealgunas sustancias como carotenos, derivados yproductos de descomposicin de la vitamina A quepodran absorber luz en la misma regin ultravioleta odar colores similares con los reactivos utilizados en ladeterminacin fotomtrica. Es as, que estos mtodosno son lo suficientemente especficos para determinaresta vitamina, adems que la confiabilidad de susresultados depende del xito en los pasos de purificaciny los procedimientos de trabajo.Como vemos, el problema realmente no son los mtodosde determinacin, sino ms bien los procedimientos deextraccin, ya que debido a su inestabilidad, algunosautores prefieren extraer separadamente cada vitaminaliposoluble6.

En ese sentido, y buscando una ptima metodologa deanlisis, en el presente estudio se realiz la validacinde la metodologa por HPLC para la determinacin devitamina A contenida en alimentos infantiles instantneos.

MATERIALES Y METODOS

EQUIPOSSe utiliz un equipo de cromatografa lquida de alto

rendimiento (HPLC), marca Shimadzu, modelo LC10A,con inyector automtico, bomba con sistema de degasificacin,con integrador o sistema de registro, software para elprocesado de datos cromatogrficos, detector de arreglode diodos (longitud de onda variable). La columnacromatogrfica fue de acero inoxidable LC-18 para fase

reversa, de 25 cm x 4,6 mm de dimetro interno, 5mm dedimetro de partcula, y guarda columna con cartuchoC18, Supelco. Las condiciones tpicas de operacin fue-ron: sistema isocrtico, flujo 1,2 mL/min, volumen de in-yeccin 20 ml, deteccin UV 242 nm, temperatura de hor-no, ambiente, y tiempo de corrida 7 min. La fase mvil fuemetanol al 100% grado HPLC.

REACTIVOSMetanol grado HPLC( Merk), estndar all-trans Retinol:

Vitamina A (Sigma), hexano p.a. (Merck), etanol absolutop.a. (Merk), solucin de hidrxido de potasio al 50%, BHT Acido Ascrbico (antioxidantes), y agua tridestilada ogrado HPLC. Solucin stock estndar de vitamina A: Sedisolvieron 100 mg del estndar en 100 mL de etanolabsoluto, con aproximadamente 0,002 g de BHT, y seguard la solucin en congelacin (-20C), se verific lapureza del estndar mediante la medicin de su espec-tro de absorcin (la vitamina A y los correspondientessteres muestran un espectro de absorcin caractersti-co, donde la posicin del pico mximo depende del sol-vente): en etanol, el retinol a 325 nm, tiene un coeficientede extincin (E 1% - 1cm.) de 1843).

PROCEDIMIENTOSe pesaron 20 g de la muestra de alimento infantil

(papilla) en un baln de base plana, se coloc un mag-neto y se adicion 70 mL de etanol absoluto. Se coloca-ron los tubos de reflujo y se agit la mezcla hasta suebullicin con corriente de nitrgeno. Luego, se adicion20 mL de solucin de KOH al 50% y se saponific lamezcla por 30 minutos con agitacin moderada. Antesde finalizar esta etapa se enjuag el contenido con 50 mLde agua en 3 porciones. La solucin se enfri a tempera-tura ambiente y luego se filtr al vaco. Se coloc inme-diatamente el contenido en una pera de separacin de250 mL y se adicion 50 mL de hexano p.a. para proce-der a la extraccin. Se agit la mezcla por 20 segundos yal separarse las fases se coloc la capa superior (faseorgnica) en un baln de 250 mL de base redonda quecontena aproximadamente 0,5 g de BHT cidoascrbico. Se efectu dos veces ms la extraccin y sejuntaron los extractos en el baln de 250 mL. Se evapora sequedad el solvente, haciendo uso de un rotavaporcon bao de agua a 40C, se diluy inmediatamente conmetanol grado HPLC el residuo, y se llev a volumen enun matraz volumtrico de 10 mL. Finalmente, se pas la so-lucin final por un filtro de 0,2 mm, llenndolos en viales m-bar de 2 mL para colocarlos en el inyector del cromatgrafo.

CLCULOS

Concentracin de Vitamina A (mg/g ppm ) = Am x Cs x D As Wm

Donde: Am (Area del pico de vitamina A en la muestra), As(Area del pico de vitamina A en el estndar), Cs (Concen-tracin de vitamina A en el estndar, mg/ml), D (Factor dedilucin), Wm (Peso de la muestra, g).

Determinacin de vitamina A por HPLC

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DISEO EXPERIMENTALSe analizaron muestras de papilla realizndose los

ensayos en las muestras previamente homogenizadascon 2 analistas en 2 das diferentes para cuantificar lavitamina A expresada en mg/g. Cada analista realiz 08ensayos por da, bajo condiciones de repetibilidad yreproducibilidad. La temperatura en el rea de cromatografalquida fue 23C + 2C. La precisin del mtodo analticose estudi sobre el sistema, evaluando la dispersin de4 inyecciones por cada uno de los 5 niveles de concen-tracin de la solucin estndar de vitamina A; y sobre elmtodo, evaluando la dispersin de la preparacin de lamuestra. La evaluacin correspondi a todo el procedi-miento, desde la preparacin de la muestra hasta la me-dicin del analito por parte del instrumento.

La exactitud del mtodo se evalu en trminos de recu-peracin. El analito se adicion a la matriz, disuelto en elmismo solvente usado para la extraccin, y se dej encontacto con sta por muchas horas antes de la extrac-cin, para permitir su interaccin. Para tal efecto, se tra-baj con 3 niveles de concentracin diferentes adiciona-dos a la muestra. Las concentraciones de trabajo adicio-nadas fueron las siguientes: Nivel 1 = 3 ppm; Nivel 2 = 5ppm; Nivel 3 = 7 ppm. Se tomaron 0,76 mL, 1,27 mL y1,78 mL de una solucin estndar de 100 ppm de vitami-na A y se adicionaron a 6 muestras de papilla por nivel.Se dej en contacto la solucin estndar con las mues-tras durante toda la noche bajo refrigeracin y, al da si-guiente, se realiz el tratamiento y se hicieron las lectu-ras de los resultados de las 18 muestras.

La especificidad del mtodo se represent mediante losespectros y el reporte de su correspondiente pureza conlas muestras empleadas para la evaluacin de la preci-sin y con la solucin estndar. La evaluacin de la es-pecificidad del sistema se realiz mediante el softwaredel equipo, trabajndose con la solucin estndar y laevaluacin. La determinacin de los lmites de detecciny cuantificacin se evalu sobre las muestras emplea-das para la prueba de precisin. Estos parmetros tam-bin fueron determinados por el software del equipo6.

RESULTADOS

En la Figura 1 se muestran los cromatogramas re-presentativos de dos concentraciones (mayor y menor)de vitamina A para la curva de calibracin. El tiempo deretencin de la vitamina A fue 3,91 0,5 min, siendo eltiempo total de anlisis para una muestra de 7 min. Larespuesta de deteccin fue lineal en el rango de concen-traciones de 5 15 mg/g (Figura 2), obtenindose uncoeficiente de correlacin r=0,99. El lmite de deteccindel mtodo en base a la seal / ruido (S/N) fue de 0,06 mg/gy el lmite de cuantificacin de 0,58 mg/g. El perfil de laprecisin que se obtuvo en 16 determinaciones poranalista en dos das diferentes, fue: CV de repetibilidadde 3,09% para el analista A, y 2,25% para el analista B vs.en tanto, el mtodo oficial de la AOAC (CV de 3,62%); el

CV de reproducibilidad fue 2,70 % vs el obtenido por elmtodo oficial (de 9,72%).Los resultados de la precisin del sistema, basados enla variacin del tiempo de retencin, rea y altura; se mues-tran en la Tabla 1. La recuperacin obtenida fue de 97,98%vs. la obtenida por el mtodo oficial de la AOAC (de 98,8%).

Tr: tiempo de retencin.A: rea.H: altura.

Tabla 1. Precisin del Sistema

%RSD , terico %RSD, experimental

5 ppm 7 ppm 9 ppm 12 ppm 15 ppm

Tr < 10% A 0,43 0,62 0,44 0,47 0,32A < 3% H 1,78 1,045 0,64 0,89 0,66H > 3% Tr 0,12 0,061 0,061 0,032 0,064

Figura 1. Cromatogramas de la curva de calibracin correspondientes a5ppm y 15ppm de vitamina A.

Figura 2. Curva de calibracin de Vitamina A.

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La especificidad del mtodo se muestra en la Figura3, donde se observa la ausencia de interferencias debi-do a la adecuada extraccin del analito, y adems semuestra la comparacin del espectro del estndar purovs el espectro del analito en la muestra.

DISCUSION

Varias tcnicas han sido propuestas para la medi-cin de la vitamina A en alimentos infantiles frmulasinfantiles. Cada una de ellas tiene sus ventajas y limita-ciones, pero, comparado con otros mtodos por HPLC,nuestra metodologa propuesta tiene la ventaja de que eltratamiento de la muestra se realiza en menos tiempo,en relacin al mtodo oficial de la AOAC 992.06 VitaminaA (Retinol) in Milk-Based Infant Formula. Adems, la co-lumna que se utiliza en el mtodo propuesto (C18) esms comercial que la columna del mtodo de la AOAC(ciano), ya que esta ltima trabaja en fase normal siendo,por tanto, ms difcil de controlar y por la naturaleza nopolar del extracto, se debe usar cromatografa en fasereversa. El tiempo de corrida por muestra es tambinms corto en nuestra metodologa (7 minutos), compa-rado con el mtodo oficial que es de 10 minutos. Estascaractersticas contribuyen al menor costo del anlisis.

Es necesario tener presente que tanto la saponificacin,la isomerizacin y la ruptura de la vitamina A son retarda-dos por la adicin del antioxidante (cido ascrbico) y eluso de nitrgeno, el cual interfiere con los agentes deoxidacin presentes. Asimismo, el retinol y sus steresson rpidamente destruidos por la luz, el oxgeno y loscidos, por lo que deben almacenarse en frascos mbaro cubiertos con papel platino o su equivalente.

La muestra y el extracto de la muestra deben protegersede la luz y la oxidacin, evitndose la luz solar directa y laluz brillante. La iluminacin artificial es mejor proporcio-nada por tubos fluorescentes dorados equivalentes.En ciertos casos, las diferentes etapas en el procedi-miento deberan realizarse en material de vidrio mbarpara prevenir la degradacin.

Dado que el calor tambin contribuye a la isomerizacin oa una posterior alteracin de las vitaminas, debera evi-tarse el calor innecesario. Por lo tanto, debe tenerse cui-dado que, por ejemplo, la evaporacin de los solventesse realice lo ms suave posible utilizando un evaporadorrotatorio, con un buen control de la temperatura, un enfria-miento adecuado de los condensadores y un vaco ptimo.Adems, se debe hacer un control espectrofotomtricode la pureza del estndar.

De acuerdo a los resultados obtenidos, podemos con-cluir que el Mtodo de ensayo CENAN-DQ.ME.16: Mtodopara la Determinacin de Vitamina A (retinol) en alimen-tos infantiles instantneos por HPLC es preciso, exacto,especfico y sensible para los parmetros evaluados eneste estudio, ya que se encuentran dentro de los rangosestablecidos.

REFERENCIAS

1. Curso de Alimentacin y Salud. 1998 Octubre 07; pg.1. URL disponible en: http://laisla.com/uned/guianutr/compdt1.htm

2. Morn C, Zacaras Y. Produccin y manejo de datos decomposicin qumica de alimentos en nutricin. Universidadde Chile. Instituto de Nutricin y Tcnica de los Alimentos(INTA). Santiago de Chile; 1999.

3. Curso de Alimentacin y Salud. Recomendaciones RDA1996 sobre vitaminas. URL disponible en: http://laisla.com/uned/guianutr/tablvita

4. Jebrell WH, Harris RS. The vitamins. Vol. 1. 2nd ed. NewYork: Academic Press; 1967.

5. Freed M. Methods of vitamin assay. 3ra ed. The Associa-tion of vitamins Chemists. New York: Interscience Publish-ers; 1966.

6. Rougereau A, Person O, Rougereau G. Determination ofvitamins. In: ROCHE. Analysis of food constituents. Chapter 9.1987.

Determinacin de vitamina A por HPLC

Figura 3. Cromatograma de muestra con espectro del analito.