Mtodo de purificacin de ADN separndolo de sustancias hmicas

coextraidas a partir de muestras de suelo, con el uso de columnas de

exclusin molecular.

Lic. Manuel Oliveros Omaa

Resumen

En la actualidad los laboratorios de microbiologa de suelos y biotecnologa, encuentran

una barrera al momento de estudiar las poblaciones autctonas de un suelo agrcola, debido

a que al momento de realizar la extraccin de ADN total de las muestras, se coextraen otros

elementos a los que conocemos como sustancias hmicas. Dichas sustancias hmicas,

como los cidos hmicos y flvicos, poseen un gran tamao (5000Da hasta 1.000.000Da y

500-5000Da respectivamente). A su vez estas sustancias hmicas interfieren el momento de

realizar PCR y cuantificacin al ADN total proveniente de muestras de suelo. Basndonos

en trabajos que proponen la cromatografa de exclusin molecular usando resinas de

sephadex G-200 y G-50, el uso de las resinas de sefarosa CL-4b y CL-6b para realizar un

paso de purificacin de las muestras de suelo antes de someterse a la PCR. El suelo

utilizado es proveniente de la Estacin Experimental del INIA, en San Juan De Lagunillas,

Mrida, Venezuela, en una plantacin de cacao (Theobroma cacao). Obtuvimos que la

resina CL-6b (tamao de poro 10.000-1.000.000m), retiene con mayor eficiencia los cidos hmicos, permitiendo que estos sean separados de las muestras de ADN por

separacin de las fracciones que se recuperan de la columna de exclusin. Los resultados

quedan evidenciados al momento de realizar electroforesis a las muestras de ADN total de

suelo, obteniendo bandas bien definidas e intensas, que sugieren la pureza y concentracin

del ADN luego del tratamiento.

Palabras clave: cidos hmicos, cidos Flvicos, cromatografa de exclusin molecular,

sephadex G-200 y G-50, sefarosa CL-4b y CL-6b.

Introduccin

Anteriormente al momento de realizar un

anlisis detallado de los microorganismos

del suelo, los investigadores tendan a

disear medios de cultivo, mediante los

cuales haran crecer los microorganismos

en el laboratorio logrando finalmente la

identificacin de los mismos. Debido a

que solo cerca del 1% de las bacterias son

cultivables en condiciones de laboratorio

(Atlas, 1984), se han desarrollado

tcnicas moleculares, que permiten el

reconocimiento de la flora microbiana en

su totalidad y su potencial metablico

(Amorim, 2008), analizando las

secuencias de ADN extrado. Cuando se

quiere realizar una extraccin de ADN

total en el suelo, se siguen protocolos ya

bien establecidos (Moran, 1993; Zhou,

1996; Yeates, 1997), que en su gran

mayora se ven afectados al momento de

la amplificacin usando PCR, por la

presencia de sustancias contaminantes

coextraidas (cidos hmicos), (Yates y

col.,1998).

Muchas de las metodologas para

separacin de ADN y sustancias hmicas

son dependientes de los niveles

diferenciales de enlazamiento de

materiales hmicos y cidos nuclicos a

matrices o del tamao de dichas

molculas (Yeates y col., 1997).

En 1997 Jackson y colaboradores

proponen una metodologa eficiente y

simple para la separacin del ADN de

dichas sustancias hmicas. Para ese

experimento los investigadores contaban

con tres columnas de exclusin

(Sepharose 4B, Sephadex G-200, and

Sephadex G-50), concluyendo que la

Sefarosa 4B lograba una mayor

separacin del ADN y las sustancias

hmicas, y a su vez el ADN sometido al

protocolo de purificacin, mostr

consistentemente una mejor

amplificacin, en comparacin a los otros

materiales usados.

Para esta investigacin nos propusimos

incluir nuevos materiales que permitan

una mejor y mayor separacin del ADN y

sustancias hmicas, asegurndonos de

esta manera que las muestras de ADN

proveniente del suelo, queda

suficientemente pura para la realizacin

de cualquier anlisis molecular posterior,

que generalmente depende en gran

medida de la amplificacin mediante PCR

del material inicial.

Materiales y Mtodos

El suelo que se somete a tratamiento es

proveniente de cacaotales localizados en

la estacin experimental del INIA en San

Juan de Lagunillas, Estado Mrida,

Venezuela, Ubicada a 8 o

31 latitud

Norte, 71 o

21 longitud oeste, 1110

m.s.n.m., temperatura promedio de 27 o

C,

precipitacin promedio anual 500mm,

bosque seco pre montano subtropical.

Tipo de suelo Cambortid tpico (actual

Haplocambid tpico), franco fino (ez y

Vsquez, 2005).

Se tienen seis muestras compuestas

(aproximadamente 4kg) de 4 sub-

muestras, tomadas al azar entre 0-10 cm

de profundidad (Rivero, 2010). Dos de las

muestras provienen de un compost

realizado con residuos de cacao y suelo

de la misma parcela experimental, uno

conservado a 25C y otro a -10C.

La extraccin del ADN total fue realizada

por una modificacin del mtodo

empleado por Yeates y col. (1998). A 10g

de cada muestra de suelo fresco, se aadi

10 ml de solucin amortiguadora Tris-

EDTA-NaCl pH 8 y Ananasa al 20% m/v.

Se agit durante 2 minutos en vortex. Se

aadi 1ml de solucin de SDS al 20% y

se incub a 65C durante 1 hora. Se

centrifug por 20min a 3000xg. Se

colect el sobrenadante y al pellet se le

realiz nuevamente el procedimiento

anterior.

Los sobrenadantes fueron transferidos a

tubos limpios y estriles, que contenan

volumen de polietilenglicol en NaCl y se

incub durante 2 horas a temperatura

ambiente. Se centrifug a 3000xg por 30

minutos. El pellet se resuspendi en 2 ml

de buffer Tris-EDTA (TE) y se le aadi

140l de acetato de potasio 7,5M. Se incub luego en hielo por 5 minutos y se

centrifug por 1 hora a 4C. Se realizaron

extracciones con cloroformo/alcohol

isoamlico (1:24) y luego

cloroformo/fenol/alcohol isoamlico

(25:24:1). Se precipit con 2,5 volmenes

de etanol absoluto frio y se incubaron 1

hora a -20C. Se centrifug 30 min a

3000xg. Se descart el sobrenadante y el

pellet se resuspendi en 100l de buffer TE.

Para armar las columnas se utilizaron

macrogoteros, a los cuales se les agreg

3cm de resina hidratada. Se utiliz

sepharose CL-6b (tamao de poro

10.000-1.000.000m), Sepharose CL-4b

(Tamao de poro 30.000-5.000.000m), Sephadex G-200 (tamao de poro5000

600,000m) y Sephade G-100 (tamao de

poro 4000150,000m) (Sambrook y col. 1989) Se dej correr buffer TE pH 8 por

cada una de las columnas para

estabilizarlas. Alcuotas de 100l de cada

muestra fueron cargadas en las columnas,

lavando con buffer y colectando 16

fracciones de 100l. Cada muestra se le

midi la densidad ptica a 260m, que se

relaciona con la aparicin de las

sustancias hmicas (Yeates, 1997).

Adems cada muestra se hizo correr en

geles de agarosa al 1% para determinar la

intensidad de bandas con el uso del

programa ImageJ. La cuantificacin del

ADN por mtodos espectofotomtricos

no fue posible debido a que los valores

necesarios para realizar la relacin

DO260/280 se ven afectados

directamente por la presencia de los

cidos hmicos.

A la solucin de ADN extrado se le

realizaron diluciones de 1:50, 1:100,

1:300, 1:500 y 1:1000, con el fin de

determinar a cual dilucin se lograba la

amplificacin del ADN (Armado, 2011;

Yeates y col., 1997) De cada una de las

diluciones se tom 1l para realizar la

PCR en un volumen de reaccin de 25l,

utilizando iniciadores especficos para los

fragmentos del gen ADNr 16s de

Bacterias (Wilson y col., 1990; Yeates y

col., 1997). Se us pFD1 y pK2R, para

obtener fragmentos de aproximadamente

500pb. El programa trmico de PCR fue

de 95C por 3min; 35 ciclos de 94C por

1min; 55C por 1min, 72C durante 2min

y finalmente 72C por 3min (Yeates y

col., 1997). Los resultados fueron

observados en geles de Agarosa al 1,5%

baados con bromuro de etidio, con el

uso de una cmara electrofortica y luz

UV.

Resultados y discusin

Se logr mejorar la intensidad de banda (concentracin de ADN), proveniente de las muestras de ADN total de suelo, usando columnas de exclusin molecular,

para luego ser amplificado el gen ARNr

16s y mostrar los resultados en geles de

agarosa al 1,5%. Los valores que solo

llegaban hasta 35% son mejorados hasta

obtener hasta un 79% con el uso de

Sepharose CL-6b. La densidad ptica

medida a 260m, se atribuye a la

presencia de cidos hmicos y las

intensidades de banda nos muestran

verdaderamente, la pureza y

concentracin de los amplicones (Jackson

y col., 1997).

La mayor efectividad se logr obtener

cuando usamos la columna Sepharose

CL-6b (figura 1a), los picos de intensidad

de banda y DO 260nm pueden separarse

fcilmente gracias a la distancia en cuanto

a volumen de muestra colectada que

tienen uno de otro. A medida que

reducimos el tamao de la columna, se

comienzan a solapar ambas grficas,

disminuyendo a su vez la intensidad de

banda. La figura 1c y 1d, nos permiten

observar claramente como la retencin de

las sustancias hmicas, que absorben a

260nm, es mnima, mientras en la figura

1b se logra ver el comienzo de la deseada

separacin.

Todo esto es ms fcil de observar en

fsico, es decir, la diferencia que existe en

el tamao y la intensidad de banda es

fcil de percibir en un gel de agarosa.

Dado a esto los resultados nos muestran

la diferencia entre las bandas de ADN

cuando son sometidas al proceso de

purificacin mediante las columnas de

exclusin molecular (Figura 2a), en este

caso la de mayor efectividad, Sepharose

CL-6b. A muestras salidas de dicha

columna se le realiz PCR, logrando

obtener bandas bien definidas y del peso

correcto (figura 2b).

Figura 1. Separacion de ADN (visto como intensidad

de banda en geles de agarosa, diamantes azules) y

sustancias hmicas (determinado como DO260, cuadros rojos), de muestras de suelo cacaotero tratados con

distintas resinas: Sepharose CL-6b (a), Sepharose CL-4b (b), Sephadex G-200 (c) y Sephadex G-100 (d). Cada punto

representa una fraccin octenida luego de lavar la columna con

100l de Buffer TE.

Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa 1% de las

muestras de ADN total, proveniente de suelo cacaotero,

pasadas por las distintas columnas de exclusin (a).

Amplicones de muestras de ADN total proveniente de

suelo luego de la purificacin con sepharosa CL-6b, en

gel de agarosa 1,5% (b).

Asumimos que el mayor tamao de poro, retiene en mayor parte los cidos

hmicos. Estos cidos contenidos en el

humus poseen un peso molecular que

flucta entre 5000Da hasta 1.000.000Da,

siendo mucho ms grandes que otras

sustancias hmicas como los cidos

flvicos (500-5000Da) (Snchez, 2002).

Las estructuras de los cidos hmicos son

ms complejas que las de los cidos

flvicos, al igual que la naturaleza

anfiflica (Yates III y Wandruszka, 1999).

Nosotros podemos establecer que esas

caractersticas qumicas hacen que queden

atrapados en las columnas del tipo CL-6b,

siendo esto de gran utilidad al poseer

muestras de ADN contaminadas con

sustancias hmicas, que sern sometidas

luego a PCR.

Para poder realizar el anlisis del ADN

proveniente del suelo es necesario que

est en gran medida puro, evitando la

interferencia de sustancias hmicas tanto

al momento de la PCR como de la

cuantificacin, dado a que los valores de

densidad ptica pueden verse afectados

por la interferencia de dichas sustancias

(Jackson y col. 1997).

Por otra parte nuestros resultados son

similares a los encontrados por Jackson y

col. (1997), que aseguran la separacin de

las sustancias hmicas con el uso de

cromatografa de exclusin (G-200).

Mejoramos esta separacin cuando

utilizamos las columnas cargadas con la

resina CL-6b.

Conclusiones

El ADN extrado de muestras de suelo

cacaotero, se puede purificar utilizando la

cromatografa de exclusin molecular,

particularmente usando la resina CL-6b.

La intensidad de banda que aumenta hasta

un 80% respecto al fondo seala el alto

grado de pureza del ADN y a su vez su

concentracin.

Referencias Bibliogrficas

Amorim J.H., Macena T.N.S., Lacerda-Junior G.V., Rezende

R.P., Dias J.C.T., Brendel M. y

Cascardo J.C.M. (2008) An

improved extraction protocol for

metagenomic DNA from a soil of

the Brazilian Atlantic Rainforest

Departamento de Ciencias

Biolgicas, Universidade Estadal

de Santa Cruz, Ilhus, BA, Brasil

p. 1226-1232.

ez P. y Vsquez A. (2005). Efecto de la densidad de

poblacin sobre el crecimiento y

rendimiento de la zabila (Aloe

barbadensis M.) Rev. Fac. Agron.

(LUZ), 22:1-12.

Atlas, R.M. (1984) Diversity of microbial communities. Advances

in microbial Ecology. 7, 1-47.

Morn, M. A., V. L. Torsvik, T. Torsvik, and R. E. Hodson (1993)

Direct and purification of rRNA

for ecological studies. Appl.

Environ. Microbiol. 59:915918.

Jackson C., Harper J.,

Willoughby D., Roden E. y

Churchill P. (1997). A simple,

efficient method for the separation

of humic substances and DNA

from Environmental samples.

Applied and environmental

microbiology. p. 49934995.

Rivero, N. 2010. Efecto de la

adicin de codornaza sobre las

actividades -glucosidasa y

celulasa de los suelos de San Juan

De Lagunillas, Municipio Sucre

del Estado Mrida, Venezuela.

Trabajo especial de grado.

Facultad de ciencias. Universidad

de Los Andes, Mrida. P. 7.

Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989) Molecular

cloning: a laboratory manual, 2nd

ed. Cold Spring Harbor

Laboratory, Cold Spring Harbor,

N.Y.

Snchez, A. (2002) Mejora en la eficacia en los quelatos de hierro

sintticos a travs de sustancias

hmicas y aminocidos. Tesis

Doctoral. Universidad de

Alicante, departamento de

Agroqumica y Bioqumica. P.p

60-78.

Wilson, K. H.; Blitchington, R. B. y Green, R. C. (1990)

Amplification of bacterial 16S

ribosomal DNA with polymerase

chain reaction. J. Clin. Microbiol.

28: 1942-1946.

Yates III, L. M., von Wandruszka, R. (1999) Effects of

pH andmetals on the surface

tension of aqueous humic

materials. Soil Science of America

Journal. Vol. 63, No. 6.

Yeates, C.; Guillings, M.R.; Davison, A. D.; Altavilla, N. y

Veal, D. A. (1997) PCR

amplification of crude microbial

DNA extracted from soil. Letters

in Applied Micribiology, 25:303-

307.

Yeates, C.; Gillings, M. R.; Davison, A. D.; Altavilla, N. y

Veal, D. A. (1998) Methods for

microbial DNA extraction from

soil for PCR amplification.

Biologic. Procedur. Online, 1:41-

47.

Zhou, J., Brans, M.A., Tiedje, J.M. (1996) DNA recovery from

soils of diverse composition.

Applied and Environmental

Microbiology. 62:316-322.