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Aula de Bioquímica I
Tema:
Exemplos de Mecanismos de Catálise Enzimática
Prof. Dr. Júlio César Borges
Depto. de Química e Física Molecular – DQFM
Instituto de Química de São Carlos – IQSC
Universidade de São Paulo – USP
E-mail: [email protected]
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Enzimas Proteolíticas: Proteases
Renovação de proteínas
- Reciclagem de Aminoácidos novas proteínas
- Energia Livre a partir de aminoácidos
- Digestão
Regulação celular
- Desenvolvimento - Coagulação sanguínea - Inflamação
Hidrólise de ligações peptídicas
- Adição de uma molécula de água
- t1/2 para hidrólise em pH neutro 10 a 1000 anos
Ressonância
Carbono da Carbonila é menos eletrófilo
Menor suscetibilidade a ataque nucleófilo
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SERINA-PROTEASES
Mecanismo envolve a participação de uma Ser particularmente reativa
- Funciona como um poderoso nucleófilo para atacar o C da Carbonila da ligação peptídica
- Catálise covalente formação de um intermediário ligado à Enzima
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SERINA-PROTEASES
Quimotripsina
- Cliva ligações Peptídicas do lado carboxílico de aminoácidos hidrófobos volumosos
Nomenclatura de especificidade para
interações Proteases-substrato
Pn= posição dos radicais Amino-cidível
Pn’= posição dos radicais Carboxi-cidível
Sn= Local na enzima para o radical Amino
Sn’= Local na enzima para o radical Carboxi
Sequência substrato da Quimotripsina
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Marcação covalente com DIFP
(diisopropylphosphofluoridate)
Apenas a Ser reativa ligou ao DIFP
- 1 de 20 Ser na Quimotripsina
Estudos de Cinética enzimática
Uso de substrato cromogênico: Clivagem de uma ligação Éster libera produto amarelo
SERINA-PROTEASES
Identificação do sítio ativo
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SERINA-PROTEASES
Identificação do sítio ativo
Estudos de Cinética enzimática
Stopeed-flow (fluxo interropido)
Reação em 2 fases
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SERINA-PROTEASES
Identificação do sítio ativo
Reação em 2 fases
Reação em duas etapas
1º) Acilação Formação de
Acil-Enzima
2º) Desacilação Saída do
grupo abandonador
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SERINA-PROTEASES
Quimotripsina
Quimotripsinogênio produzido no pâncreas e
ativado no estômago Ativação proteolítica
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SERINA-PROTEASES
Sítio ativo é formado pela Tríade catalítica
- Asp, His e Ser forma rede de H-bound que reduz pKa da Ser catalítica
Hiper-polarização da OH da Ser
- Formação de um íon alcóxido
reativo poderoso nucleófilo
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SERINA-PROTEASES
Quimotripsina Estrutura protéica
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SERINA-PROTEASES
Quimotripsina Estrutura protéica
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Mecanismo envolve:
- Catálise ácido-base
- Catálise nucleofílica
+
SERINA-PROTEASES
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SERINA-PROTEASES
Sistema de revezamento de cargas
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SERINA-PROTEASES
Mecanismo envolve:
- Catálise eletrostática
- Catálise por tensionamento ajuda a formar a estrutura tetraédrica
- Intermediário tetraédrico é estabilizado pelo “Buraco Oxi-ânion”
1
Subtilisina
Carboxipeptidase II
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SERINA-PROTEASES
Tríade catalítica
- Importância foi estudada por mutagênese sítio específica
- Atividade analisada por Cinética Enzimática
Subtilisina
Mutantes S221A, H64A e D32A e Triplo Mutante Menor atividade catalítica em 106 x
Mantém KM constante Afinidade E + S inalterada
Triplo mutante é ainda 103 vezes mais ativo do que Tampão
Explicação O mecanismo de catálise por tensionamento é mantida.
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SERINA-PROTEASES
Quimotripsina, Tripsina, Elastase e TEV Evolução Divergente
Apresentam ~ 40% de identidade na seqüência
Estrutura terciária similar
Mecanismo de catálise similar
Diferem na especificidade por substratos
Superposição da
Quimotripsina e Tripsina
Alta similaridade estrutural
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SERINA-PROTEASES
Quimotripsina, Tripsina e Elastase Evolução Divergente
Bolsão S1
Principal fator de
especificidade destas
enzimas
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SERINA-PROTEASES
Tripsina Bovina
- Tríade catalítica
- Substrato Arg no bolsão
- Asp enterrado no cerne da Estrutura
- 5 Pontes dissulfeto
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SERINA-PROTEASES
- Quimotripsina – Subtilisina – Carboxipeptidase
II e ClpP protease
Sem correlação na estrutura primária e terciária
Evolução convergente
A Natureza parece ter descoberto de maneira
independente o mesmo mecanismo catalítico pelo
menos Quatro vezes
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Outras PROTEASES
1- Ativação do nucleófilo 2- Polarização da lig. Peptídica
3- estabilização do intermediário tetraédrico
Cisteino-proteasesSerino-proteases
Metalo-proteasesAspartato-proteases
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INIBIDORES DE PROTEASES
Muitos medicamentos são inibidores de proteases
Ex: Captopril:
Inibidores da Enzima Conversora de Angiotensina: antihipertensivos
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INIBIDORES DE PROTEASES
Muitos medicamentos são inibidores de proteases
Aspartato proteases
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INIBIDORES DE PROTEASES
Muitos medicamentos são inibidores de proteases
Inibidores da aspartil protease do HIV
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ANIDRASE CARBÔNICA
“Tornando mais rápida uma reação rápida”
Não-catalisada V = 1,3 x 10-1 (s-1)
Catalisada V = 1,0 x 10+6 (s-1)
Catálise depende da
presença de 1 íon Zn2+,
coordenado por 3 His,
localizado no fundo do
Sítio Ativo à 15 Angstrons
da superfície da enzima
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ANIDRASE CARBÔNICA
Catálise por Zn2+ ocasiona a ativação de uma molécula de H2O
Dependência da V em função do pH
- Catálise Básica
Zn2+ reduz o pKa da H2O de 15,7
para 7,0
- Aumento da [HO—] local mesmo em
pH = 7,0
- Íon HO— é um nucleófilo mais
poderoso do que a H2O
15,7Efeito do pH na Atividade da
Anidrase carbônica
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ANIDRASE CARBÔNICA
Catálise ocorre em 4 etapas
- Catálise por Orientação - Catálise base geral
Próton liberado é captado pela His64
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ANIDRASE CARBÔNICA
Mecanismo de Catálise apoiado pelo Análogo sintético de coordenação do Zn2+
- Em pH 9,2, o complexo sintético mostra V hidratação do CO2 100 x maior
O Análogo sintético reduz o pKa da H2O = 8,7
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ANIDRASE CARBÔNICA
Regeneração da Enzima depende da liberação do próton passo limitante
V da hidratação do CO2
= 1,3 x 10+6 (s-1)
-1-111
1
-1-1-11 sM10sM10 é H do difusão a Se
k
)sM(1x10M)1x10(M1x10 1-1-117-
1
7-
1
1
kk
kK
?
-14
1 s1x10k
- A liberação do H+ é fator limitante para a Velocidade da Reação
O meio celular é tamponado!!!! buffer com pKa = 7.0
- A Keq será = 1
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ANIDRASE CARBÔNICA
A Velocidade da reação depende da presença de um tampão para receber os prótons
liberados da H2O para formar o nucleófilo OH—
-1-19
11 sM10 a' e' limita meio do difusãoA
kk
’.[B]kpor dada será prótons de retirada de A taxa 1
-163-1-19
1 s10)10(*)sM(10 ]'.[ MBk
Concentração de Tampão da ordem de mM
(1.10-3 M) são suficientes para alcançar
Velocidades de 1.10+6 s-1
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ANIDRASE CARBÔNICA
O Zn2+ está a 15 Å de profundidade da superfície da enzima
Sem contato com o meio externo
O transporte de H+ do sítio ativo para o tampão depende de um mecanismo especial
His64 “LANÇADEIRA DE PRÓTONS”
na estrutura da proteína
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ANIDRASE CARBÔNICA
O Zn2+ está a 15 Å de profundidade da superfície da enzima
Sem contato com o meio externo
O transporte de H+ do sítio ativo para o tampão depende de um mecanismo especial
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ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO
Enzimas de Restrição
Enzimas Especializadas em degradar DNA exógeno em bactérias
- Mecanismo de defesa contra infecção viral
Endonucleases de Restrição tipo II
Clivam dentro da seqüência de
reconhecimento
Grande importância na
Engenharia Genética, Biologia
Molecular e Biotecnologia
Permitem a construção de
moléculas de DNA específicas
- Clonagem de DNA
Emprego em testes de
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ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO
Especificidade das Enzimas de Restrição: Altíssima
- Atuar somente na sequência de reconhecimento e NÃO devem degradar o DNA endógeno
Reconhecem sequências específicas – Sítios de restrição
- Seqüência palindrômica = permite a mesma leitura em ambos os sentidos
Reconhecem apenas o DNA Exógeno
Metilases
Enzimas específicas que modificam o DNA endógeno no mesmo sítio de reconhecimento
Para cada Enzima de Restrição existe uma Metilase correspondente
- Enzima de Restrição + Metilase: Sistema de restrição-modificação
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ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO
Mecanismo da Hidrólise
Presença de Intermediários ligados à enzima?
Mecanismo 1 Catálise covalente
2 Passos sem inversão da configuração do P.
Mecanismo 2 Hidrólise direta
1 Passo Inversão da configuração do P.
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ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO
Mecanismo da Hidrólise
1 Passo com inversão da configuração do P
Sem intermediários reacionais
Sem catálise covalente
Envolve hidrólise direta
Uso de fosfotiatos marcador de
estereoisomeria
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EcoRV
Dependência de Magnésio – Co-fator
- Mecanismo em Deslocamento Sequencial Ordenado
1º DNA
2º H20
Íon Magnésio (Co-fator)
Coordenado por 6 ligantes
- 3 H2O
- 2 Asp
- 1 O do Pi
Ativa uma H2O para Ataque
Nucleofílico no grupo fosfato
Catálise por íon Metálico
- Posicionamento
- Catálise Eletrostática
- Catálise ácido-baseOrdem de ligação à EcoRV
1º: DNA
2º: Co-fator Mg2+
3º: H20 reativa
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EcoRV
Interação EcoRV-DNA ocorre por simetria Bilateral
Sequência de reconhecimento é uma
sequência invertida
Enzima dimérica age nas duas fitas do DNA
Interação EcoRV-DNA
A Enzima envolve o DNA
Metilação no DNA endógeno
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EcoRV
Afinidade EcoRV-DNA Inespecífico e específico é similar
- Distorção do DNA só ocorre com interações produtivas com DNA específico
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EcoRV
Afinidade EcoRV-DNA Inespecífico e específico é similar
- Distorção do DNA só ocorre com interações produtivas com DNA específico
Distorção do DNA tem um grande custo entrópico
que é compensado pelas interações produtivas
com DNA específico
Catálise por tencionamento
Distorção do DNA ajuda a posicionar o Pi
próximos aos grupos Asp reativos
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EcoRV
Complexo catalítico é montado somente após ser garantida a
especificidade da interação Enzima-DNA Distorção do DNA
- Reação só progride se a especificidade for garantida
- Mecanismo em Deslocamento Sequencial Ordenado
A Enzima usa a Energia livre de ligação
com o DNA para deformar o Substrato e
preparar o complexo catalítico para a
reação.
Mg2+ é coordenado pelo Pi a ser clivado e
Asp posicionados próximos na conformação
distorcida
DNA cognato = específico
DNA não-cognato = inespecífico
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ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO TIPO II
Sem identidade Sequencial
Com identidade Estrutural
São proteínas homólogas transferência gênica horizontal
O gene foi disseminado por um plasmídio após a divergência evolutiva das bactérias