MICROBIOLOGIA LABORATORIAL

Prof Maria Luisa Bertelle Faron1

MEIOS DE CULTURA Os meios de cultura destinam-se ao cultivo artificial dos microrganismos. Alm dos principais nutrientes necessrios eles devem oferecer tambm todas as outras condies indispensveis ao desenvolvimento dos microrganismos, como por exemplo, pH, atividade de gua, agentes inibidores a flora de associao, etc.2

CLASSIFICAOQUANTO CONSISTNCIA: SLIDOS Usa-se normalmente o Agar, pois este no decomposto pelas bactrias, por no ser alimento, e se funde por volta de 49 C. Ex.: Agar Nutriente

Agar Nutriente em placa de Petri

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CLASSIFICAOQUANTO CONSISTNCIA SEMI SLIDOS Possuem uma baixa porcentagem de agar (0,4%). So usados para verificar a motilidade das bactrias. Ex: Agar motilidadeAgar Motilidade

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CLASSIFICAOQUANTO CONSISTNCIA LQUIDOS (CALDOS DE ENRIQUECIMENTO)No Seletivos Agem como diluentes iniciais, permitindo a manuteno e moderado desenvolvimento de um ou mais microrganismos.

Caldo BHI (caldo infuso crebro corao) .Meio de enriquecimento e manuteno para uso geral.

gua Peptonada (protena semi hidrolisada). Diluente para homogeneizao e diluio de amostras para anlise.

CLASSIFICAOQUANTO CONSISTNCIA LQUIDOS (CALDOS DE ENRIQUECIMENTO)SeletivosPossuem nutrientes bsicos para o desenvolvimento do microrganismo desejado, e agentes seletivos capazes de inibir o desenvolvimento dos contaminantes. Devem recuperar unidades ou dezenas do microrganismo em estudo.

Caldo Rappaport Para Salmonella

Caldo Lauril Sulfato Triptose Deteco presuntiva de coliformes totais, Fecais e E. coli pelo mtodo de NMP.

Caldo EC

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Para Coliformes

CLASSIFICAOQUANTO COMPOSIOSIMPLES So destinados ao cultivo de microrganismos pouco exigentes de agentes nutritivos. Servem de base para outros meios, como tambm para conservao e transporte de cepas de bactrias.

Agar TSA/TSB (gar Tripticase de Soja)

CLASSIFICAOQUANTO COMPOSIOENRIQUECIDOS

So meios com bases simples adicionados de substncias que vo melhorar o seu valor nutritivo. So usados para o cultivo de microrganismos mais exigentes. Como substncias enriquecedoras so usados: extrato de carne, extrato de levedura, hidratos de carbono como glicose, sacarose, arabinose, etc.8

CLASSIFICAOQUANTO FINALIDADEDE ENRIQUECIMENTO So meios destinados a facilitar o isolamento de certos microrganismos que esto em determinados materiais em quantidade reduzida ou acompanham uma flora de associao rica. So meios lquidos na maioria das vezes e agem favorecendo a recuperao dos microrganismos a serem isolados e inibindo 9 freqentemente a outra flora.

Caldo Fraser- Listria

CLASSIFICAOQUANTO FINALIDADE DIFERENCIAISEMB (E.coli - lactose (+))

So os meios que diferem as espcies de bactrias, pelo comportamento bioqumico. Ex.: EMB (eosina-metileno-blue). Possui em sua composio: lactose, agar e corantes (eosina e azul de metileno indicadores de pH). As bactrias lactose (+) fermentam o acar produzindo cido ltico, baixando o pH do meio e precipitando os corantes. As UFC (Unidade Formadora de Colnias) das bactrias lactose 10 (+) apresentam cor escura e as lactose (-) incolores

CLASSIFICAOQUANTO FINALIDADEDIFERENCIAIS e SELETIVOS So aqueles que ao mesmo tempo selecionam e diferenciam as espcies bacterianas. Ex.: Agar SS Salmonella. Possue citrato de sdio, tiossulfato de Sdio e cloreto frrico que participam do metabolismo dessa bactria. Tambm possui sais biliares que favorecem o crescimento desse microrganismo e inibem os contaminantes, como por exemplo, os Gram positivos (enterococos).

SS AGAR

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CLASSIFICAOQUANTO FINALIDADEMEIOS DE IDENTIFICAO Identificam os microrganismos atravs de provas bioqumicas especificas. Ex.: Trplice Agar Modificado (IAL).

Indol LTD Fermentao da Sacarose Glicose Produo de Gs Produo de H2S Produo de Urease Interfase Lisina descarboxilase Motilidade12

Trplice Agar Modificado (IAL) um meio usado para a identificao bioqumica das enterobactrias, atravs de 8 reaes especficas (produo de Indol, produo de LTD L-triptofano desaminase, fermentao de sacarose e glicose, produo de H2S, produo de Urease, Descarboxilao de Lisina e Motilidade). Dessa maneira podemos identificar primariamente as enterobacterias veiculadoras de doenas tais como:

E.coli

Salmonella sp

Vibrio cholerae

Shigella sp 13

CLASSIFICAOQUANTO FINALIDADEMEIOS DE IDENTIFICAO Outros meios indicadores soAGAR MOTILIDADE

usados tambm em pesquisas de microrganismos diversos como: Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, etc.AGAR PALCAM14

PREPARO, DISTRIBUIO E CONTROLE DOS MEIOS DE CULTURA

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PREPARO DOS MEIOS DESIDRATADOS:

- Os meios desidratados so higroscpicos e muito sensveis a umidade, ao calor e a luz. - So afetados de maneira adversa por mudanas drsticas na temperatura, como p.ex., variaes na temperatura ambiente que podem ocorrer no inverno.16

RECONSTITUIO DOS MEIOS DESIDRATADOS:

Instrues completas para o preparo do meio so dadas no rtulo do frasco. Como regra geral, interessante preparar uma quantidade suficiente para uma semana.17

RECONSTITUIO DOS MEIOS DESIDRATADOS: Usar gua destilada, ons txicos como cobre devem estar ausentes. Verificar os controles de resduos na vidraria, antes do uso. Para permitir uma homogeneizao adequada, preparar o meio em frasco com capacidade igual a duas vezes o volume final do meio. Seguir as instrues do rtulo da cada produto. Abrir o frasco do meio de cultura longe de correntes de ar e umidade. Evitar inalar o p e o contato prolongado com a pele. Pesar o meio rapidamente de maneira precisa, sem criar nuvens de poeira. Fechar novamente o frasco, to logo seja possvel. 18

RECONSTITUIO DOS MEIOS DESIDRATADOS: Meios sem gar geralmente dissolvem-se com uma leve agitao. Meios contendo gar devem ser aquecidos antes da autoclavagem para completa dissoluo. Ferver o meio sem queim-lo. Meios que no podem ser autoclavados estaro prontos para serem distribudos em placas ou em outros materiais aps o aquecimento necessrio. Para o preparo desses meios, usar todo o material estril. A maioria dos meios de cultura requer esterilizao final em autoclave a 121 por 15 minutos. C19

ESTERILIZAO DOS MEIOS DE CULTURA:

Esterilizao em autoclave

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VERIFICAO DA ESTERILIZAO: Os indicadores biolgicos de esterilizao indicam a capacidade da autoclave de destruir esporos bacterianos.

B. subtillis

B. stearothermophillus

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MORTE MICROBIANA E FORMAS DE DESTRUIO DE MICRORGANIMOSMorte microrganismo perde a capacidade de se reproduzir Agentes de destruio microbiana - inibi ou destroem os microrganismos : - Lesando sua membrana citoplasmtica - Alterando seu metabolismo celular - Alterando as protenas e cidos nuclicos (DNA e RNAde sua clula.

Mtodos de controle e destruio dos microrganismos ASSEPSIA: processo usado para eliminar microrganismos patognicos das superfcies, equipamentos e manipuladores.

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Mtodos de controle e destruio dos MicrorganismosA assepsia engloba as seguintes etapas: Degermao a remoo de microrganismos da pele por meio de limpeza mecnica (sabes, detergentes ou escovagem) aplicada sobre tecidos vivos. Desinfeco - destruio dos microrganismos patognicos e/ou inativao dos vrus, no necessariamente destruindo os esporos. A desinfeco aplicada em pisos, paredes, superfcies, equipamentos, mveis e utenslios.24

Mtodos de controle e destruio dos microrganismos DESINFESTAO: a exterminao ou destruio de insetos, roedores ou outros que transmitam contaminaes ao homem, a outros animais ou ao meio ESTERILIZAO e DESCONTAMINAO: a eliminao total dos microrganismos, de seus esporos, bem como a inativao completa dos vrus. A esterilizao aplicada nos instrumentais, vidrarias e no ar ambiente (ultra-violeta).25

Meios de destruio microbiana Meios fsicos: - Calor seco: (ar quente circulante) produzido por: estufas ou forno de Pasteur - esteriliza materiais, vidrarias instrumentos 180C/1 hora morte por oxidao do material celular. Vantagem: material sai seco. - Calor mido sob presso: - autoclave esteriliza a 121C a uma presso de 15 libras num tempo de 15 a 30 minutos - morte por coagulao do material celular. (desnaturao protena, inativao enzimtica, desorganizao dos lipdeos e alterao dos cidos nuclicos). mais eficiente que o calor 26 seco.

Meios de destruio microbiana- Radiao ultravioleta:

reduz microrganismos de

reas de processamento, laboratrios, cmaras de repicagem, etc. para isso usada lmpadas que emitem radiao ultravioleta, que provoca radiaes letais ou modificaes qumicas irreversveis no DNA da clula.27

Meios qumicos de destruio microrganismos Sanificantes qumicos: visa reduzir os microrganismos a nveis seguros de superfcies e utenslios.

Principais sanificantes: cloro, iodo, desinfetantes fenlicos, clorhexidina, lcool 70%, lcool iodado.28

METODOLOGIA MICROBIOLGICAMTODOS DE AVALIAO QUANTITATIVA E CARACTERIZAO DAS BACTRIAS E FUNGOS

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Os principais mtodos de semeadura podem ser: Em placas - meios slidos (Contagem padro em placas). Em tubos mltiplos meios lquidos (NMP = Nmero Mais Provvel). Tais mtodos tm sido usados para determinar as populaes microbiolgicas viveis em alimentos e gua. Eles nos do resultados reais.30

Os meios e as condies ideais para determinar a contagem variam de um microrganismo para outro (tempo e temperatura de incubao).

Microrganismos mesfilos 10C a 45C, sendo a temperatura ideal em torno de 30C a 35 com tempo de incubao de 48 C horas Microrganismos termfilos 20C a 37C sendo capazes de se multiplicar a 50C - 55 com tempo de incubao de 48 C horas

Microrganismos psicotrficos Abaixo de 7C sendo a temperatura tima de crescimento em torno de 20C a 30C com perodo de incubao de 7 a 10 dias Microrganismos Termo-Resistentes (Termotolerantes) 44,5C 45,5C ou mais com perodo de incubao de 24 horas

SEMEADURA EM PLACAS:Superfcie: (Surface ou Spread plate) Aps o preparo, distribuio em placas de Petri, incubao e devidos controles, o meio de cultura estar liberado para uso. Proceder as diluies seriadas da amostra com auxlio de pipetes bacteriolgicas.33

SEMEADURA EM PLACAS: Verter 0,1ml de cada diluio sobre o meio.

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Com auxlio da Ala de Drigalsky ou do Basto em L, espalhar todo o material sobre a superfcie do meio de cultura at o total esgotamento do mesmo. Incubar (tempo e temperatura indicados). Deixar secar por 15 minutos e incubar as placas na posio invertida

EXEMPLOS DE SEMEADURA DE SUPERFCIE:

Agar Baird Parker: Pesquisa de S.aureus

Agar MYP (Mossel): Pesquisa de B.cereus

Semeadura de superfcie: usada para contagem em meios especficos, slidos (BP, MYP, etc). o meio especfico no caso tambm usado para isolamennto e pr identificao do microrganismos, para isso trabalha-se com alquotas menores (0,1ml). Pode-se tambm semear em superfcie com ala de platina. Desvantagem: carregar muito as placas com semeaduras sem critrio, 36 pode crescer "melecas" e nenhuma colnia isolada.

SEMEADURA EM PLACAS Profundidade: (Pour Plate) Preparar as diluies necessrias da amostra; Pipet-las nas placas correspondentes com auxlio de pipetas bacteriolgicas; Verter o meio de cultura fundido e resfriado (44-46 e homogeneizar; C) Deixar solidificar o Agar e incubar as placas invertidas (tempo e temperatura indicados). A contagem considerada entre 30-300 UFCs (Unidades Formadoras de Colnias). Expresso dos resultados = n de UFC x Diluio utilizada = UFC/g ou ml.

EXEMPLOS DE SEMEADURA DE PROFUNDIDADE:Agar Nutriente ou PCA (Plate Count Agar): Contagem Total de Aerbios Mesfilos Viveis.

IMPORTANTE: O Mtodo de Semeadura de Profundidade deve ser acompanhado de um controle branco, uma placa aberta com o meio de cultura usado, durante toda semeadura38

EXEMPLOS DE SEMEADURA DE PROFUNDIDADE:Agar OGAY ou Agar PDA (Potato Dextrose Agar): Contagem Total de Bolores e Leveduras.

Bolores

Leveduras

Semeadura em profundidade: a quantidade de inculo grande (1mL) e por isso deve ser homogeneizada juntamente com o meio de cultura, fundido e resfriado. Desvantagem: pode haver contaminao cruzada ambiental durante o processo. 39

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

Barbosa, H. R. & Torres, B. B. Microbiologia bsica, Atheneu, 1999. Franco, B. D. G. M. & Landgraf, M. Microbiologia dos alimentos. Atheneu, 1996. Forsythe, S. J. Microbiologia da segurana alimentar. Artmed, 2002. Tortora, G. J., Funke, B. R. & Case, C. L. Microbiologia. Artmed, 6. edio, 2000.

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