aus der abteilung versorgungsepidemiologie und ...aus der abteilung neonatologie / pädiatrische...

Aus der Abteilung Versorgungsepidemiologie und Community Health

(Leiter: Prof. Dr. med. Wolfgang Hoffmann, MPH)

des Instituts für Community Medicine

(Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. med. Wolfgang Hoffmann, MPH)

und

aus der Abteilung Neonatologie / Pädiatrische Intensivmedizin

(Leiter: Prof. Dr. med. Matthias Heckmann)

der Klinik und Poliklinik für Kinder- und Jugendmedizin

(Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. med. Holger Lode)

der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

Notwendigkeit und Möglichkeiten eines Neugeborenens creenings für Mukoviszidose

Auswertungen des Survey of Neonates (SNiP) in Vorpo mmern

Inaugural – Dissertation

zur

Erlangung des akademischen

Grades

Doktor der Medizin (Dr. med.)

der

Universitätsmedizin

der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität

Greifswald

vorgelegt von: Anja Braumann, geb. Wernecke

geb. am: 05.11.1983

in: Berlin

Dekan: Prof. Dr. med. dent. Reiner Biffar

1. Gutachter: Prof. Dr. med. Wolfgang Hoffmann

2. Gutachter: Prof. Dr. med. Wieland Kiess

Ort, Raum: Greifswald, Sauerbruchstraße, Seminarraum der Beruflichen Schule P0.22

Tag der Disputation: 22. September 2014

INHALTSVERZEICHNIS

1. EINLEITUNG ................................................................................................................................................. 1

2. GRUNDLAGEN ............................................................................................................................................ 2

2.1 MUKOVISZIDOSE – EINE MONOGENETISCHE ERKRANKUNG ........................................................................... 2

2.1.1 Die F508del-Mutation .............................................................................................................................. 5

2.2 KLINIK, DIAGNOSTIK, THERAPIE UND PROGNOSE DER MUKOVISZIDOSE ...................................................... 8

2.3 NEUGEBORENENSCREENING ........................................................................................................................ 18

2.3.1 Stoffwechselscreening bei der Mukoviszidose ....................................................................................... 22

3. FRAGESTELLUNG UND ZIELSETZUNG ............................................................................................... 28

4. MATERIAL UND METHODEN .................................................................................................................. 29

4.1 STUDIENPOPULATION ................................................................................................................................... 29

4.1.1 Angaben zur ethischen Basis ................................................................................................................. 31

4.2 METHODEN ................................................................................................................................................... 33

4.3 ANGABEN ZUR STATISTIK ............................................................................................................................. 43

5. ERGEBNISSE ............................................................................................................................................. 44

6. DISKUSSION .............................................................................................................................................. 48

6.1 INZIDENZ / PRÄVALENZ DER CF ................................................................................................................... 48

6.2 SCREENING UND KLINISCHE DIAGNOSE – EINE GEGENÜBERSTELLUNG ..................................................... 51

6.3 MÖGLICHE SCREENINGMETHODEN .............................................................................................................. 55

6.3.1 Präkonzeptionelle / Pränatale Diagnostik ............................................................................................. 61

6.4 KOSTEN ......................................................................................................................................................... 62

7. KONKLUSION ............................................................................................................................................ 64

8. ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................................................. 67

9. LITERATURVERZEICHNIS ....................................................................................................................... 69

10. DANKSAGUNGEN ................................................................................................................................... 79

1

1. Einleitung

„Salzig schmeckende Kinder sterben früh“ hieß es in volksmedizinischen Büchern aus

dem 17. Jahrhundert. 1

Mukoviszidose (Zystische Fibrose, engl. Cystic Fibrosis, CF) ist eine schwere

Stoffwechselerkrankung, die bis heute nicht heilbar ist.

Bis 1938 lag die Lebenserwartung erkrankter Kinder noch bei durchschnittlich sechs

Monaten, heute erreichen die meisten Patienten das Erwachsenenalter. 2

Derzeitige Diagnostik- und Therapiemöglichkeiten haben sowohl die Lebenserwartung

als auch die Lebensqualität der Patienten deutlich gesteigert.

Um entsprechende Therapien noch frühzeitiger einleiten zu können und damit die

Prognose Neugeborener mit CF weiter zu verbessern, wurde in einigen Ländern ein

Screening auf diese Erkrankung eingeführt.

Auch in Deutschland wird die Hinzunahme der CF zum bestehenden

Neugeborenenscreening-Protokoll diskutiert.

Zur Abschätzung der Notwendigkeit dieser Maßnahme sind Kenntnisse über die

Häufigkeit der Krankheit, die Kosten und den Nutzen eines Screenings sowie mögliche

Auswirkungen für betroffene Familien nötig.

Zentrales methodisches Ziel dieser Arbeit war es, im Hinblick auf eine eventuell

bevorstehende Einführung eines Neugeborenenscreenings für CF ein Verfahren zu

entwickeln, mit dem eine große Anzahl von Proben schnell, sicher und kostengünstig

untersucht werden kann.

Die Laborarbeit für diese Promotion wurde im Jahr 2006 unter Berücksichtigung des

damaligen Standes der Wissenschaft durchgeführt. Auswertung und Diskussion

beziehen sich daher notwendigerweise auf den damals aktuellen Wissensstand.

2

2. Grundlagen

2.1 Mukoviszidose – eine monogenetische Erkrankung

Mukoviszidose ist die häufigste autosomal rezessiv vererbte Stoffwechselerkrankung

in der kaukasischen Bevölkerung. Sie wird verursacht durch Mutationen im CFTR

(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) - Gen, welches 1989 auf dem

langen Arm des Chromosoms 7 lokalisiert wurde. 3

Es erstreckt sich über 250kb genomischer DNA, die ein Protein mit 1.480

Aminosäuren kodiert, und besteht aus 27 Exons. CFTR fungiert als Kanal für den

Transport von Chlorid- und Bikarbonationen. 1, 4

Durch die Kenntnis der in Frage kommenden Mutationen besteht die Möglichkeit einer

genetischen Diagnosestellung noch vor Auftreten klinisch manifester Symptome durch

direkte Identifikation von zwei mutanten CF-Allelen.

Die CFTR-Mutationen teilen sich in sechs Klassen auf. Während Mutationen der

Klasse I keine Proteinsynthese ermöglichen, sind bei Klasse II-Mutationen die Reifung

und der intrazelluläre Transport des CFTR-Proteins gestört. Bei Mutationen der Klasse

III ist die Regulation des CFTR-Ionenkanals defekt und bei Klasse IV-Mutationen die

Kanalleitfähigkeit verändert. Bei Mutationen der Klasse V kommt es zur verminderten

Bildung funktionsfähiger CFTR-Proteine. Bei Klasse VI-Mutationen verlaufen die

Synthese und Prozessierung von CFTR regelrecht, das gebildete Protein ist aber

instabil und wird schneller abgebaut. Generell gelten die Klassen I - III als schwere

Mutationen und die Klassen IV - VI als leichte Mutationen. 1

Abb.1 Klassifikation der Mutationen im CFTR-Gen (modifiziert nach 5)

3

Es ist nicht möglich von der genetischen Mutation unmittelbar auf die Prognose zu

schließen, da die Schwere der Lungenerkrankung, ein wichtiger Faktor für Morbidität

und Mortalität, keinen eindeutigen Zusammenhang mit dem CFTR Genotyp zeigt. Es

wird angenommen, dass die Lungenfunktion mehr von Umweltfaktoren abhängig ist.

Bezüglich der exokrinen Pankreasfunktion hingegen besteht eine starke Korrelation

zwischen CFTR Genotyp und dem Phänotyp. 4, 6

So entwickeln Patienten mit Mutationen der Klassen I, II oder III, welche 90% aller

Patienten tragen, meist innerhalb des ersten Lebensjahres eine komplette exokrine

Pankreasinsuffizienz (d.h. weniger als 2% der exokrinen Pankreasfunktion sind intakt). 7

Einige CFTR-Mutationen, insbesondere der Klassen IV, V und VI sind mit milden oder

asymptomatischen Verlaufsformen assoziiert. Die Chloridkanäle haben in diesen

Fällen eine Restaktivität oder sind nur in ihrer Anzahl reduziert, so dass die exokrine

Pankreasfunktion noch suffizient ist, die Lungenerkrankung eher weniger schwer

verläuft und die Schweißchloridkonzentration im niedrigen Normalbereich liegt. Diese

Patienten erreichen in der Regel ein höheres Lebensalter als Patienten mit schweren

Verläufen der CF. 8

In einigen Fällen ist der Krankheitsverlauf so blande, dass die Patienten ohne

Screening nie durch CF-typische Symptome diagnostiziert werden würden. 9

Der Phänotyp der CF ist sehr heterogen. Die European Diagnostic Working Group

unterscheidet die klassische oder typische von der nicht-klassischen oder untypischen

CF.

Die meisten Patienten gehören dem klassischen Typ an, sie weisen mindestens ein

phänotypisches Zeichen der CF auf. Dies sind Mekoniumileus, chronische

Lungenerkrankung, Pankreasinsuffizienz, mangelnder Ernährungszustand,

Elektrolytentgleisungen durch den erhöhten Elektrolytverlust über den Schweiß,

Leberfibrose, Diabetes mellitus sowie obstruktive Azoospermie bei männlichen

Patienten. Diese Patienten haben Chlorid-Konzentrationen von > 60 mmol/l im

Schweiß. 10

Patienten mit untypischer CF haben mindestens in einem Organsystem CF-Symptome

und normale (< 30mmol/l) oder grenzwertige (30-60mmol/l) Chloridwerte im Schweiß. 11

4

Heterozygote mit nur einem CF-Allel haben ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung

einer fibrosierenden Pankreatitis, Sinusitis oder allergischen bronchopulmonalen

Aspergillose. 12, 13, 14

Bis heute sind über 1900 verschiedene, z.T. sehr selten auftretende Mutationen auf

dem CFTR-Gen bekannt. 15

98,5% der bekannten Mutationen im CFTR-Gen sind Punktmutationen, 1,5%

Ordnungsänderungen (z.B. Deletionen, Insertionen) des Genoms. 16

Land CFTR-Mutationen Allelnachweis (errechnet) Deutschland ∆F508 (71,8%) 1789+5G�A (0,9%) 87,6%

R553X (2,0%) 3272-26A�G (0,9%) N1303K (1,8%) W1282X (0,7%) G542X (1,2%) 2143delT (0,7%) R347P (1,2%) 1078delT (0,6%) CFTRdele2,3 (1,2%) 2183AA�G (0,6%) 3849+10KbC�T (1,0%) 2184insA (0,6%) G551D (0,9%) 3659delC (0,6%) 1717-1G�A (0,9%)

Abb.2 Verteilung der häufigsten CFTR-Mutationen in Deutschland (modifiziert nach 17)

5

2.1.1 Die F508del-Mutation

Die häufigste Mutation in Deutschland ist die F508del-Mutation (siehe Abb.2), eine

Mutation der Klasse II, die etwa 70% aller CF-Chromosomen ausmacht und

besonders in Homozygotie für schwere Verläufe verantwortlich ist. 18

Patienten mit einer Homozygotie für F508del fallen in der Regel innerhalb der ersten

zwei Monate klinisch auf, 95% sind bis zum 6.Lebensjahr diagnostiziert. Sie haben ein

Risiko von 99% pankreasinsuffizient zu werden. 19, 20

Es handelt sich um eine Deletions-Mutation im CFTR-Gen. Durch Deletion des

Tripletts „TCT“ kommt es zu einer Leserasterverschiebung (Frameshift), die jedoch

wieder eine „sinnvolle“ Sequenz ergibt, wobei das Phenylalanin an Position 508 im

Exon 10 deletiert wird.

Wt sequence

500 501 502 503 504 505 506 507 508 509 510 511 512

Gly Thr Ile Lys Glu Asn Ile Ile Phe Gly Val Ser Tyr

GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATC TTT GGT GTT TCC TAT

F508del

500 501 502 503 504 505 506 507 509 510 511 512

Gly Thr Ile Lys Glu Asn Ile Ile Gly Val Ser Tyr

GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATT GGT GTT TCC TAT

Abb.3 Sequenz des CFTR-Gens, Wildtyp und F508del-Mutation 21

Die F508del-Mutation ist in ganz Europa zu finden, zeigt aber bezüglich ihrer

Frequenz bei Patienten mit CF ein Nordwest-Südostgefälle. So beträgt der Anteil

dieser CFTR-Mutation auf den Färöer Inseln (Dänemark) 100% und in der Türkei nur

21%. 22, 23

6

Abb.4 Anteil von F508del der CFTR-Mutationen in Europa 23

In der für diese Arbeit maßgeblichen Region Mecklenburg-Vorpommern machen fünf

Mutationen ca. 78,6% aller CF-Gene aus. Aus dem Jahr 2003 liegen

molekularbiologische Daten von CF-Patienten vor. 24

Anhand von 274 untersuchten CF-Chromosomen konnten folgende relative

Häufigkeiten bestimmt werden.

F508del 67,9% G542X 3,3% N1303K 3,3% CFTRdele 2,3 2,6% R553X 1,5% Abb.5 Verteilung der häufigsten CFTR-Mutationen in Mecklenburg-Vorpommern 24

Diese für die vorliegende Studie genutzten Zahlen stammen von Bauer et al. und

zeigten eine Häufigkeit der F508del-Mutation von 67,9% für Mecklenburg-

Vorpommern. 24

Schroeder et al. sehen einen Grund für die große Häufigkeit des F508del-Allels in

einem Selektionsvorteil Heterozygoter. Eine Heterozygotie für das F508del-Allel sei

assoziiert mit einem Schutz gegen Asthma bronchiale in der Kindheit und dem jungen

Erwachsenenalter. 25

7

Ebenfalls wird ein selektiver Vorteil Heterozygoter in Bezug auf schwere

Durchfallerkrankungen wie Cholera als Grund für die Ubiquität der F508del-Mutation

diskutiert. 26

Eine These von Quinton besagt, dass die Kindersterblichkeit unter Heterozygoten für

CF-Mutationen durch eine erhöhte Resistenz gegenüber Cl--sezernierenden Diarrhoen

erniedrigt sei. 27

8

2.2 Klinik, Diagnostik, Therapie und Prognose der Mukoviszidose

Mutationsfrequenzanalysen lassen vermuten, dass die Mukoviszidose eine Krankheit

ist, die schon lange besteht. Erste Mutationen sind schätzungsweise im

Jungpaläolithikum vor der letzten Eiszeit (40.000 – 30.000 v.Chr.) aufgetreten. 1

Erste Schilderungen typischer Symptome stammen aus dem Mittelalter. Ein

Sprichwort aus dieser Zeit besagt: „Kinder, die einen salzigen Geschmack

hinterlassen, wenn man sie küsst, werden nicht älter als ein Jahr.“ 27

Definiert wurde die Mukoviszidose aber erst im 20. Jahrhundert. 1905 beschreibt

Landsteiner den Mekoniumileus. 1928 folgt eine Erstbeschreibung der Mukoviszidose

durch Fanconi. 1

Andersen definiert 1938 das Krankheitsbild der Mukoviszidose zunächst nur als

Erkrankung des Pankreas („cystic fibrosis of the pancreas“). Doch schnell wurde

erkannt, dass die Mukoviszidose auch andere exokrine Gewebe betrifft und mit

Lungenerkrankungen, Malnutrition, Wachstumsstörungen, Steatorrhoe, männlicher

Infertilität und im Verlauf häufig mit Leberschäden und Diabetes einhergeht. 2, 28

Paul Quinton entdeckte 1983 die intrazelluläre Chloridsekretionsstörung als

Basisdefekt. 1989 folgte die Lokalisierung des CFTR-Gens. 2, 3

Die klinische Manifestation der Mukoviszidose zeigt sich sehr variabel. Zwischen

Beginn der Symptome und Zeitpunkt der Diagnose vergehen in einigen Fällen Monate

bis Jahre. Dies bedeutet für die Patienten und ihre Familien eine große Belastung und

z.T. einen verspäteten Beginn spezifischer Therapiemaßnahmen.

Im Jahr 1997 wurde in Deutschland bei 57% der Mukoviszidose-Patienten die

Diagnose innerhalb des ersten Lebensjahres gestellt, bei 6,4% erst im

Erwachsenenalter. 29

In den Vereinigten Staaten werden laut Zahlen von Flume et al. von 2008 etwa 90%

der Patienten mit Mukoviszidose in den ersten elf Lebensjahren diagnostiziert, 5%

bleiben bis zum Erwachsenenalter unentdeckt. 30

Steinraths et al. beschreiben laut einer Studie von 1993 bis 2005 in Vancouver ein

durchschnittliches Alter klinisch diagnostizierter Mukoviszidose-Patienten von 3,0

Jahren zum Zeitpunkt der Diagnose. Die Diagnose wird durchschnittlich 1,8 Jahre

nach Auftreten der ersten Symptome gestellt. 31

9

Jeweils 22% der Patienten haben nur gastrointestinale oder respiratorische Symptome

zum Zeitpunkt der Diagnose. 36% der Patienten stellen sich mit kombinierten

respiratorischen und gastrointestinalen Symptomen vor. 14% der Patienten mit

Mukoviszidose haben nasale Polypen, einen Rektumprolaps,

Elektrolytverschiebungen, Lebererkrankungen oder andere unspezifische Symptome

in Kombination mit respiratorischen und/oder gastrointestinalen Beschwerden, 4%

weisen ausschließlich unspezifische Symptome auf. Das Gewicht liegt bei

Diagnosestellung in 37%, die Größe in 26% unter der 5.Perzentile. 31, 32

Die Lunge eines Neugeborenen mit Mukoviszidose ist strukturell und funktionell noch

gesund. Bei Kindern, deren Diagnose durch ein Screening gestellt wurde, lassen sich

allerdings schon in den ersten Lebensmonaten durch eine Bronchoskopie oder

bronchioalveoläre Lavage Atemwegsinfektionen nachweisen, ohne dass bereits

klinische Symptome zu erkennen sind. 33

Respiratorisches Leitsymptom ist ein rezidivierender oder persistierender produktiver

Husten. In den ersten Lebensjahren kann der Auskultationsbefund unauffällig sein.

Grobblasige Rasselgeräusche, Giemen und Brummen sind bei Beteiligung der

zentralen Bronchien zu hören. Kennzeichnend für Entzündungen der peripheren

Bronchien sind feinblasige Rasselgeräusche. Bei fortgeschrittener Erkrankung fallen

eine Vorwölbung des Thorax, eine Brustkyphose sowie eine Ruhetachypnoe auf, u.U.

auch Dyspnoe, Trommelschlegelfinger und Uhrglasnägel. 1

Die Luftwege der Patienten sind durch Sekret verlegt und zudem auch durch Ödeme,

Hypertrophie der glatten Muskulatur und Bronchokonstriktion verengt.

Neben der chronischen Atemwegsobstruktion kommt es zu rezidivierenden

Infektionen.

Durch eine Infektion mit Pseudomonas erhöht sich der chronisch progrediente Abfall

des FEV1 / FVC Verhältnisses von jährlich 1,29% auf 1,81%. 34

Bei einigen Patienten kommt es zu einem Pilzbefall der Lunge. Bis zu 13% der CF-

Patienten haben eine allergische bronchopulmonale Aspergillose, welche zu einer

Verschlechterung der Lungenfunktion führt. 35

10

Basisuntersuchung ist zunächst die Röntgenaufnahme des Thorax in 2 Ebenen. So

früh wie möglich sollte eine Lungenfunktionsdiagnostik durchgeführt werden. Die in

der Spirometrie gemessene FEV1 (forciertes exspiratorisches Volumen in einer

Sekunde) ist ein starker klinischer Prädiktor der Mortalität der CF und sollte bei jedem

Arztbesuch gemessen werden. 36

Lungenfunktionstests wie die Spirometrie sind bei jungen Kindern mit CF nicht sehr

sensitiv und zuverlässig. 37

Im frühen Stadium der Krankheit, in dem eine Spirometrie noch nicht durchführbar ist

oder FEV1-Werte noch im Normbereich liegen, ist die Wachstumsgeschwindigkeit ein

guter Parameter für die Schwere der Lungenbeteiligung. 38

Eine hochauflösende Computertomographie kann früh Strukturauffälligkeiten der

Lungen asymptomatischer Kinder zeigen, deren Lungenfunktionstests im

Normalbereich liegen, jedoch sollte die hohe Strahlenbelastung bedacht werden. 39

Die Bestimmung der Lungenbezirke, die schlecht oder nicht ventiliert werden, mittels

N2-Auswaschung ist sensitiver für leichte Veränderungen der Lungenfunktion als eine

Spirometrie oder Bodyplethysmographie. 40

Der Gebrauch der Positronen-Emissions-Tomographie kann den Grad der pulmonalen

Inflammation quantifizieren, stellt jedoch keine Routinemethode dar. 41

Zur Gewinnung von mikrobiellen Kulturen ist die bronchoalveoläre Lavage am

sensitivsten, allerdings handelt es sich hierbei um einen invasiven Eingriff. 36

Grundpfeiler der Behandlung pulmonaler Symptome sind die Herabsetzung der

Viskosität des Bronchialsekrets, die Sekretelimination und die Therapie von

Atemwegsinfektionen.

Mukolytika wie N-Acetylcystein beeinflussen die chronische Sekretretention. Eine

effektive Behandlung der reduzierten mukoziliären Clearance besteht auch in einer

Inhalation mit hypertoner Kochsalzlösung. Rekombinante humane rhDNase reduziert

die Sputumviskosität. Bronchodilatatoren wie β-Adrenergika oder Theophyllin

relaxieren die glatte Muskulatur. Ein früher Beginn dieser Behandlung kann die

Verschlechterung der Lungenfunktion verzögern und Exazerbationen pulmonaler

Infektionen verringern. 42, 43, 44

11

Die Physiotherapie, bestehend aus Lagerungsdrainage, Abklopfen des Thorax und

Vibrationsmassage, Atemtherapie und körperlicher Bewegung, ist ein wichtiger

Bestandteil der Therapie von Lungenerkrankungen bei CF-Patienten. 45

Diese Behandlungen bedeuten zum Teil große Anstrengung und einen enormen

Zeitaufwand. Mehr als eine Stunde pro Tag benötigen die Patienten dafür im

Durchschnitt, während respiratorischer Exazerbationen oft auch länger. Neben

passiven Techniken wie der Lagerungsdrainage oder Kontaktatmung haben sich

zunehmend aktive „Selbsthilfetechniken“ wie Autogene Drainage, PEP (positive

expiratory pressure) - Atmung oder Oszillationstechniken als Bestandteil der

Physiotherapie durchgesetzt, bei denen die Patienten nicht auf fremde Hilfe

angewiesen sind. 10

Uridintriphosphate dienen der Aktivierung der Chloridsekretion. 46

Orale Kortikosteroide zeigen eine signifikante Verbesserung der FVC (forcierte

Vitalkapazität) bei chronischer Infektion mit Pseudomonas aeruginosa und

unterdrücken die Symptome einer chronischen allergisch bronchopulmonalen

Aspergillose sowie eines CF-assoziierten Asthmas. Bei akuten Exazerbationen zeigen

sie gute anti-inflammatorische Effekte. Sie haben allerdings Nebenwirkungen wie die

Hemmung des Wachstums, Glukoseintoleranz, Katarakt, Knochenfrakturen und

Cushing-Syndrom. Auch inhalative Kortikosteroide können die Schleimhautödeme

reduzieren. 2, 47

Intravenös verabreichte Immunglobuline können bei monatlichen Gaben über

durchschnittlich 7,5 Monate laut Dinwiddie et al. die FVC verbessern, darüberhinaus

könne der Verbrauch von oralen und inhalativen Kortikosteroiden gesenkt werden.

Selten kann es unter der Therapie zu Kopfschmerzen, Fieber, Hypertonus,

aseptischer Meningitis oder Angina pectoris kommen. 48

Vor der Einführung wirksamer Antibiotika starben 90% der Patienten mit CF vor

Vollendung des 10.Lebensjahres, meist bedingt durch eine Infektion mit

Staphylococcus aureus. 47

Eine Pseudomonas aeruginosa Infektion muss möglichst schnell nach

Diagnosestellung behandelt werden, um eine Eradikation zu erreichen. Die

Antibiotikatherapie bereits chronischer, eventuell mukoider Infektionen führt meist nur

12

zu einer Reduktion der Pseudomonas-Kolonien, einige Stämme werden gänzlich

resistent. Eine frühe Therapie mit Colistin oder Tobramycin verzögert bei 78% der

Patienten eine Chronifizierung um 3,5 Jahre. Die Erhaltungstherapie einer

chronischen Infektion muss laut europäischem Konsens aus hochdosierten

intravenösen Antibiotikagaben (Penicilline, Cephalosporine, Monobactame,

Carbapeneme, Aminoglycoside oder Colistin) bestehen. Um Resistenzen zu

verhindern und eine synergistische Wirkung zu erzielen, wird eine

Kombinationstherapie empfohlen. 45, 49

Gängige Praxis in der Betreuung von Patienten mit chronischer Pseudomonasinfektion

ist eine regelmäßige intravenöse antibiotische Interventionstherapie etwa 4x pro Jahr

über eine Dauer von ca. 14 Tagen mit einer Kombination von Ceftazidim und

Tobramycin.

Auch ein europäisches Gremium von Experten empfiehlt die regelmäßige

prophylaktische Verabreichung von intravenösen Antibiotika im Abstand von 3

Monaten, mehrere kontrollierte Studien zeigen allerdings keinen Vorteil gegenüber

einer symptomatischen Behandlung. 49, 50, 51

Makrolide, insbesondere Azithromycin zeigen eine Verbesserung der FEV1 und FVC,

für Patienten unter 6 Jahren auch vor der Kolonisation mit Pseudomonas aeruginosa.

Nebenwirkungen sind selten. 52

Inhalatives Tobramycin verzögert chronische Infektionen und eradiziert Pseudomonas

aeruginosa bei den meisten Patienten. Gentamycin zeigt bei topischer Applikation am

nasalen Epithel eine Verbesserung der CFTR-Expression. 53

Lungentransplantationen werden bei CF-Patienten im Endstadium ihrer Erkrankung

durchgeführt, pro Jahr erhalten mehr als 100 Patienten ein Transplantat. Das

Einjahresüberleben beträgt 80%, das Vierjahresüberleben weniger als 50%, das

mittlere Überleben 1037 Tage. Durch Transplantation bedingte Komplikationen sind

für 12% aller Todesfälle bei Patienten mit Mukoviszidose verantwortlich und damit die

zweithäufigste Todesursache nach Lungenerkrankungen im Endstadium. 2, 54

Die Überlebenschancen nach einer Lungentransplantation sind für erwachsene CF-

Patienten besser als für Kinder. 55

13

Pankreas und Darm sind häufig schon zum Zeitpunkt der Geburt durch Obstruktion

der Pankreasgänge in utero geschädigt. Etwa 85% der Kinder sind bei der Geburt

pankreasinsuffizient. 56

Rund 10% der Patienten mit CF werden aufgrund eines Mekoniumileus diagnostiziert,

laut Doull et al. sterben 11% der betroffenen Kinder daran. 47, 57

Leitsymptome der exokrinen Pankreasinsuffizienz sind Fettstühle, breiige Durchfälle,

Blähungen, Bauchschmerzen sowie ein aufgetriebenes Abdomen. 1

Bei der CF wird zu wenig Pankreassekret mit einer zu geringen HCO--Konzentration

produziert. Die Verdauungsenzyme verbleiben in den Pankreasgängen, werden dort

aktiviert und führen zu einer chronischen Pankreatitis mit Gewebsnekrosen und einer

progredienten Fibrose. 58

Die aus der exokrinen Pankreasinsuffizienz resultierende Malabsorption zeigt sich

häufig schon in den ersten Lebenswochen mit einer Wachstumsverzögerung, auch

wenn das Geburtsgewicht meist nicht von der Norm abweicht. 56, 59

Bei 44% der klinisch diagnostizierten Patienten mit einem durchschnittlichen Alter von

1,41 Jahren wiesen Lai et al. zum Zeitpunkt der Diagnose Zeichen schwerer

Malnutrition (Größe oder Gewicht unter der altersentsprecheneden 5. Perzentile)

nach. 60

Ein guter Ernährungszustand und ein altersentsprechendes Wachstum sind mit einer

besseren Lungenfunktion und einem geringeren Mortalitätsrisiko assoziiert. 61, 62

Patienten mit Pankreasinsuffizienz haben im Durchschnitt einen um 9,20%

schlechteren Wert für die FEV1 als Patienten mit suffizienter Pankreasfunktion, bei

Patienten mit Mekoniumileus liegt der Unterschied im Gegensatz zu Patienten ohne

Mekoniumileus bei 9,35%. 63

Eine frühe Substitution von Pankreasenzymen und der fettlöslichen Vitamine A, D, E

und K sowie gegebenenfalls essentieller Fettsäuren und Calcium ist unerlässlich. 93%

der CF-Patienten benötigen Pankreasenzyme. 29, 64

Weil sowohl die Bikarbonatsekretion des Darms als auch die des Pankreas gestört ist,

können selbst hohe Dosen substituierter Pankreasenzyme nicht vollständig die

Malabsorption ausgleichen, da der pH-Wert des Darms nicht ausreichend in den

alkalischen Bereich gebracht werden kann, um ein Optimum für die Enzymaktivität zu

erreichen. 2

14

Bei exzessiver Gabe von Pankreasenzymen kann es in seltenen Fällen zu

allergischen Reaktionen, Entzündungen des Darms oder der Perianalregion und einer

Darmstenose aufgrund einer fibrosierenden Colopathie kommen. 65, 66

Fettreiche und hochkalorische Ernährung mit einem Kalorienbedarf von 150% und

mehr der normalen Empfehlungen sind für CF-Patienten nötig, um ein weitgehend

normales Wachstum zu erreichen. 47

Laut mehreren Studien kann eine Substitutionstherapie mit Wachstumshormonen

neben einem Wachstumsvorteil und auch einen Vorteil in Bezug auf das

Körpergewicht bringen. 67, 68

Stadien der Symptomfreiheit wecken in manchen Patienten das Gefühl, die Krankheit

wäre derzeit nicht aktiv, wodurch ihre Compliance für aufwendige Therapien sinkt.

In der Patientengruppe unter zwölf Jahren werden die Medikamente regelmäßig

eingenommen. 80% halten ihren Behandlungsplan ein im Gegensatz zu 40% bei

jugendlichen Patienten. Dies ist in erster Linie auf den größeren Einfluss der Eltern

zurückzuführen. 36, 69

Kausale Therapien der Mukoviszidose sind bisher nicht bekannt. Daher ist die

Mukoviszidose eine der ersten Erkrankungen, die für eine Gen-Therapie in Betracht

gezogen wurden. Ein CFTR-Gentransfer wurde in vitro und im Tierversuch etabliert. 70, 71

Es wurden in-vivo Versuche mit viralen Vektoren und Liposomen unternommen, in

denen die CFTR-Funktion durch Transfektion - Einbringen von Zellen mit

Wildtyprezeptoren - wiederhergestellt werden sollte, allerdings ohne Langzeiteffekte

nachzuweisen. 72, 73

Trotz des leichten nicht-invasiven Zugangs zu den Atemwegen mittels Aerosolen, war

der virale wie non-virale Gentransfer in die Epithelien der menschlichen Luftwege

bislang unwirksam. Es ist offensichtlich so, dass die Epithelzellen der Luftwege beim

Menschen effektive physikalische und immunologische Barrieren entwickelt haben, um

die Aufnahme fremder Partikel, wie Vermittler von Gentransfer, zu verhindern. Es wird

geprüft, ob z.B. durch mukolytische Substanzen oder durch eine Beseitigung der

Makrophagen in der Lunge diese Barrieren zu durchbrechen sind. Hierdurch würde

15

allerdings auch die Abwehr von schädigenden Keimen erschwert werden,

möglicherweise käme es vermehrt zu pulmonalen Infektionen. 74

Etwa 97% der männlichen Patienten leiden unter kongenitaler bilateraler Aplasie des

Vas deferens. Zuvor asymptomatische Männer fallen im Erwachsenenalter meist

durch Infertilität auf. 60-70% aller Patienten mit kongenitaler bilateraler Aplasie des

Vas deferens weisen CFTR-Mutationen auf, ohne andere klinische Symptome der

Mukoviszidose zu zeigen. Die Häufigkeit der CFTR-Heterozygotie ist in der Population

infertiler Männer doppelt so hoch wie in der restlichen Bevölkerung. 75, 76

Die Fertilität der CF-Patientinnen ist weitgehend normal, kann aber durch zähes

Zervikalsekret auch eingeschränkt sein. Fast 2/3 der Frauen mit CF im gebärfähigen

Alter können spontan schwanger werden. 58, 77

Sekundärerkrankungen der CF sind z.B. Diabetes mellitus im Rahmen der

Pankreasfibrose, Lebererkrankungen (Steatose, Zirrhose), Erkrankungen der

Gallenblase/-wege (Mikrogallenblase, vergrößerte Gallenblase, Atresie des Ductus

cysticus, Gallensteine, Stenose des Ductus choledochus, sklerosierende Cholangitis),

chronische Sinusitis, Polyposis nasi, Osteoporose, Pneumothorax, pulmonale

Hypertonie, Arthritis, Hypoalbuminämie und Ödeme. 78, 79

Mehr als ein Drittel der CF-Patienten haben pathologische Ergebnisse in

Leberfunktionstests, Lebererkrankungen wirken sich aber nur in seltenen Fällen auf

die Mortalität aus. 30% aller Patienten haben eine kleine, funktionseingeschränkte

Gallenblase und bis zu 10% leiden unter Gallensteinen. 58

Etwa 12% der Patienten, die älter als 13 Jahre sind, zeigen einen insulinpflichtigen

Diabetes mellitus. Im Erwachsenenalter haben mehr als die Hälfte der Erkrankten eine

Glucoseintoleranz, 25% von ihnen sind insulinpflichtig. 2, 80

Die Knochendichte kann bereits im frühen Kindesalter abnehmen. Prädisponierende

Faktoren sind Malnutrition, chronische Infektionen, Vitamin D-Mangel,

Hypogonadismus, späte Pubertät, Steroidtherapie und mangelnde körperliche

Aktivität. 81

16

Shead et al. fanden heraus, dass zirkulierende Osteoklastenvorstufen bei Patienten

mit CF während einer akuten pulmonalen Exazerbation erhöht sind. Daraus lässt sich

folgern, dass es auch in diesem Zusammenhang wichtig ist, Exazerbationen schnell

und aggressiv zu behandeln. 82

Die Mortalitätsrate betrug 1997 in Deutschland 1,4 pro 100 CF-Patienten pro Jahr und

war damit niedriger als in den USA (1,9%) und in Frankreich (2%). Die häufigste

Todesursache war dabei mit 78% der Fälle eine pulmonale Hypertonie. 29

CF-assoziierte Todesfälle in der ersten Lebensdekade, insbesondere im ersten

Lebensjahr der Patienten sind selten geworden. Dies ist in erster Linie auf eine

verbesserte Versorgung der Patienten zurückzuführen. 83

Im Zeitraum 1943-1964 erreichte nur etwa ein Viertel der CF-Patienten das Alter von

16 Jahren. Heute stehen aber Therapiemöglichkeiten zur Verfügung, die ein Erreichen

des Erwachsenenalters möglich machen. Dadurch hat sich die Lebensdauer und

Lebensqualität der CF-Patienten in den letzten Jahrzehnten deutlich erhöht. 84, 85

In Deutschland erreichen 47% das Erwachsenenalter mit einer Lungenfunktion, die im

Normalbereich liegt (FEV1 > 80%), dennoch sterben immer noch ein Drittel der

Patienten im Alter von unter 18 Jahren. 86

Eine deutsche Studie aus dem Jahr 2008 zeigt für den Zeitraum 1995–2005 einen

Anstieg des Todesalters im Median von 18.5 auf 23.7, während die durchschnittliche

Lebenserwartung der deutschen CF-Population im Jahr 2005 37.4 Jahre betrug. 87

Dodge et al. schätzen für Neugeborene des Jahrgangs 2000 mit Mukoviszidose die

Lebenserwartung auf durchschnittlich 50 Jahre. 88

Die steigende Lebenserwartung der Patienten bedeutet, dass die Population

Erwachsener mit CF stetig wächst, mit Folgen für das Gesundheitssystem und der

nötigen Bereitstellung ärztlicher Versorgung in CF-Zentren für Erwachsene. Die

Herausforderung für die Zukunft wird die Betreuung der erwachsenen CF-Patienten

z.B. mit Diabetes mellitus, progressiver Leberzirrhose und Besiedlung des

Respirationstraktes mit multiresistenten Bakterien sein. 89

Insbesondere der Kinderwunsch bei Frauen mit CF stellt die betreuenden Ärzte vor

medizinische und ethische Probleme. Es muss einerseits eine Beratung über die

Risiken einer Schwangerschaft und der Vererbung der mütterlichen Erkrankung sowie

alternative Möglichkeiten wie eine Adoption erfolgen, andererseits aber auch die

17

Wünsche und die Autonomie der Patientin respektiert werden. Schwangere

Patientinnen benötigen intensive Betreuung, um die Gesundheit von Mutter und Fetus

nicht zu gefährden. Die Frauen sollten keinen fortgeschrittenen Verlauf der

Erkrankung mit schlechter Lungenfunktion, Mangelernährung und Diabetes mellitus

aufweisen. Auch Frauen mit milder Symptomatik zeigen während der

Schwangerschaft häufigere pulmonale Exazerbationen und eine größere Anzahl an

Krankenhausaufenthalten. 90, 91

Die Lebenserwartung wird sich vermutlich auch in Zukunft noch steigern lassen, aber

die Erfolge werden voraussichtlich kleiner, da viele CF-assoziierte Erkrankungen die

Morbiditäts- und Mortalitätsrate im Erwachsenenalter steigern. In einigen

industrialisierten Ländern scheint die Lebenserwartung ein Plateau erreicht zu haben. 45

18

2.3 Neugeborenenscreening

Das erste Neugeborenenscreening führte Bob Guthrie in New York im Jahr 1962 zur

Erkennung der Phenylketonurie ein. Er zeigte, dass auf Filterpapier getrocknete

Blutproben von Neugeborenen in ein Labor transportiert und dort auf angeborene

Erkrankungen analysiert werden können. 92, 93

Wilson und Jungner legten 1968 Kriterien für den Einschluss von Krankheiten in

Screeningprogramme fest:

1. Die Krankheit hat für das Individuum eine Bedeutung.

2. Eine effektive Behandlung ist vorhanden.

3. Die Voraussetzungen für eine Erkennung und Behandlung sind gegeben.

4. Die Krankheit kann erkannt werden, während der Patient noch asymptomatisch ist.

5. Ein adäquater Test ist verfügbar.

6. Die Untersuchung ist für die Bevölkerung akzeptabel.

7. Der Pathomechanismus ist hinreichend verstanden.

8. Es gibt einen Konsens über die Zuständigkeit für die Behandlung.

9. Das Screening ist kosteneffizient durchführbar. 94

1991 wurde eine erste Empfehlung zu einer einheitlichen Regelung des

Neugeborenenscreenings in der Bundesrepublik Deutschland durch einen Beschluss

der Arbeitsgemeinschaften für Pädiatrische Stoffwechselstörungen (APS) und

Pädiatrische Endokrinologie (APE) erarbeitet. 1995 wurde diese Empfehlung ergänzt

und im Jahr 1997 die erste Richtlinie zum Neugeborenenscreening verabschiedet.

Seitdem wird die Testung Neugeborener auf Phenylketonurie, klassische

Galaktosämie und Hypothyreose in allen Bundesländern durchgeführt. Ein Screening

auf Biotinidasemangel und Adrenogenitales Syndrom wurde ebenfalls für alle

Neugeborenen empfohlen, aber damals nur in einigen Bundesländern ausgeführt.

19

Im Jahr 2002 erfolgte eine Neufassung der Richtlinien aufgrund der Einführung des

erweiterten Neugeborenenscreenings mit der Tandem-Massenspektrometrie. 94

Nun wurde für alle Neugeborenen die Früherkennung von Hypothyreose, klassischem

Adrenogenitalem Syndrom, Biotinidasemangel und klassischer Galaktosämie durch

konventionelle Testverfahren und ein Screening auf Störungen des

Aminosäurestoffwechsels, Organoazidurien, Defekten der Fettsäureoxidation und

des Carnitinzyklus anhand der Tandem-Massenspektrometrie empfohlen.

Am 1. April 2005 trat ein Beschluss des Gemeinsamen Bundesausschusses über die

Früherkennung von Krankheiten bei Kindern bis zur Vollendung des 6. Lebensjahres

in Kraft. Diese „Kinder-Richtlinien“ regeln die Durchführung des

Neugeborenenscreenings mit 14 Zielkrankheiten und stellen die Grundlage der

Finanzierung eines Teiles des Neugeborenenscreenings durch die GKV dar. 94

Ein Nationaler Screeningreport der deutschen Gesellschaft für

Neugeborenenscreening liefert Aussagen über die Prävalenz getesteter Krankheiten,

die Recall-Rate, den positiven Vorhersagewert der Screeningtests, den Zeitpunkt des

Therapiebeginns und andere relevante Parameter des Neugeborenenscreenings.

Die Erfassung solcher Daten zielt auf die Darstellung von Screeningprozessen und

Screeningergebnissen sowie auf eine Qualitätskontrolle und Qualitätsverbesserung

des Screenings ab. 95

20

Krankheiten Erstscreening

gesamt

Recall

≥36h

Recallrate

% ≥36h

Bestätigte

Fälle

PPV%

≥36h

Spezifität % Prävalenz

(bezogen auf

Erstscreening)

Hypothyreose 665495 592 0,09 195 29,39 99,88 1:3413

AGS 665495 1883 0,29 38 1,75 99,58 1:17513

Biotinidasemangel 665495 162 0,03 33 19,14 99,98 1:20167

Klassische

Galaktosämie

665495 542 0,08 6 0,92 99,93 1:110916

PKU/HPA 665495 251 0,04 123 45,82 99,97 1:5411

MSUD 665495 62 0,01 4 6,45 99,99 1:166374

MCAD-Mangel 665495 184 0,03 74 37,50 99,98 1:8993

LCHAD-Mangel 665495 16 3 18,75 99,99 1:221832

VLCAD-Mangel 665495 112 0,02 7 6,25 99,98 1:95071

CPT I-Mangel 665495 9 0

CPT II-Mangel 665495 5 0

CAT-Mangel 665495 0 0

GA I 665495 253 0,04 4 1,58 99,96 1:166374

IVA 665495 67 0,01 6 7,46 99,99 1:110916

Gesamt 665495 4138 0,64 493 10,87 99,23 1:1350

Abb. 6 Auszug aus dem Nationalen Screeningreport 2009 96

Recallraten < 0,01% und bei sehr kleinem n nicht berichtet, aus der Analyse ausgeschlossen und nicht berichtet wurden zudem

Fälle mit fehlenden oder unplausiblen Angaben zur Konfirmationsdiagnostik sowie Fälle, die anhand der Konfirmationsdiagnostik

nicht bestätigt werden konnten.

AGS : Adrenogenitales Syndrom, PKU : Phenylketonurie, HPA : Hyperphenylalaninämie, MSUD : Ahornsirupkrankheit, MCAD :

Medium-Chain-Acyl-CoA-Dehydrogenase, LCHAD : Long-Chain-3-Hydroxy-Acyl-CoA-Dehydrogenase, VLCAD : Very-Long-

Chain-Acyl-CoA-Dehydrogenase, CPT : Carnitin-Palmitoyl-CoA-Transferase, CAT : Carnitin-Acylcarnitin-Translocase, GA :

Glutaracidurie, IVA : Isovalerianacidämie; PPV : positiver prädiktiver Wert

Das Neugeborenenscreening in Deutschland wird in insgesamt 11 Referenzzentren

durchgeführt: Berlin, Dresden, Gießen, Greifswald, Hamburg, Hannover, Heidelberg,

Leipzig, Magdeburg, München und Weiden. 94

21

Die Eltern müssen vor der Probenentnahme für das Neugeborenenscreening ärztlich

über den Zweck des Screenings aufgeklärt werden. In Deutschland ist die schriftliche

Einwilligung („informed consent“) mindestens eines Elternteiles notwendig, im

Gegensatz zu Österreich und der Schweiz, wo Eltern, falls sie kein Screening

wünschen, dies ablehnen müssen („informed dissent“). 94, 97

Gemeinsam mit der U2 werden zwischen der 36. und 72. Lebensstunde einige

Blutstropfen gewonnen und auf Filterpapier (Guthrie-Karten) getropft. 98

Die Probe wird eine Stunde bei Raumtemperatur getrocknet und am Tag der

Entnahme an das Screeninglabor versandt, wo die Untersuchung am Tag des

Probeneingangs erfolgen muss. 97

In der Kinderklinik der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald wird seit 1969 ein

Neugeborenenscreening durchgeführt, welches ständig erweitert wurde.

Es werden derzeit folgende Erkrankungen getestet: Phenylketonurie, Hypothyreose,

Adrenogenitales Syndrom, Galaktosämie und Biotiniasemangel. Desweiteren werden

in einem erweiterten Screening mit Hilfe der Tandem-Massenspektrometrie die

Ahornsirupkrankheit und Hyperphenylalaninämie, Fettsäureoxidations-Defekte

(MCAD-Mangel und LCHAD/VLCAD), Carnitinzyklus-Defekte und Organoazidurien

(Glutarazidurie Typ I, Isovalerianazidämie) erfasst. 98

Seit September 2012 können in Greifswald Eltern ihre Neugeborenen unentgeltlich auf

Mukoviszidose untersuchen lassen. Die Untersuchung steht für alle Kinder in

Mecklenburg-Vorpommern zur Verfügung. 99

In Norddeutschland stammen 91% aller eingesandten Proben aus Kliniken,

niedergelassene Ärzte und Hebammen stellen 9% aller Einsendungen. 94

22

2.3.1 Stoffwechselscreening bei der Mukoviszidose

Die CF erfüllt einige wichtige Voraussetzungen für die Einführung eines

Neugeborenenscreenings zur möglichst frühen Diagnosestellung nach der Geburt.

Häufigkeit und Schwere sind vergleichbar mit anderen Zielerkrankungen des bisher

durchgeführten erweiterten Neugeborenenscreenings. Die CF ist die häufigste

autosomal rezessiv vererbte Stoffwechselkrankheit mit einer Inzidenz von etwa

1:3300. Dieser Schätzwert basiert für Deutschland auf den Ergebnissen des CF-

Registers in dem bekannte Patienten von den CF-Zentren gemeldet werden. Genaue

populationsbasierte Zahlen liegen nicht vor, da es in Deutschland bisher kein

Neugeborenenscreening auf CF gibt. 100

Damit hat die CF eine sechsmal häufigere Inzidenz als Phenylketonurie und eine

ähnliche Inzidenz wie kongenitaler Hypothyreoidismus. Die Ahornsirupkrankheit ist um

den Faktor 45 seltener als die CF. 101, 102

Die Vorteile der frühen Diagnose durch ein Neugeborenenscreening auf

Mukoviszidose sind in vielen kontrollierten klinischen Studien geprüft worden. Es

existieren mehr veröffentlichte Forschungsergebnisse für CF als es zum Screening auf

Phenylketonurie zu dessen Einführung gab. Auch sind sehr viel sicherere Daten für

die Vorteile eines Screenings auf CF als für die Galaktosämie verfügbar. 103

Dennoch galt die CF bisher aus zwei Gründen als für ein Neugeborenenscreening

nicht geeignet: Zum einen existiert kein beispielsweise der Phenylalaninmessung bei

der PKU-Erkennung vergleichbarer, unmittelbar mit dem Defekt zusammenhängender

und für die Massenanalytik gut geeigneter Parameter. Zum anderen kann die

Krankheit zwar in ihrem Verlauf positiv beeinflusst und Lebenserwartung und –qualität

können durch intensive Behandlung deutlich verbessert werden, eine kausale

Behandlung ist jedoch bisher nicht bekannt. 102

Erste Screeningversuche auf CF erfolgten anhand einer Messung der

Albuminkonzentration im Mekonium. Diese Untersuchung eignet sich aber auf Grund

der geringen Sensitivität nicht als Screeningmethode. 28

23

Die Stuhlelastase ist bei CF-Patienten mit Pankreasinsuffizienz erniedrigt, die

Ergebnisse zeigen aber bei Frühgeborenen häufig nicht die nötige Sensitivität, so dass

sich diese Messung ebenfalls nicht für ein Screening empfiehlt. 4

1953 erkannte Di Sant`Agnese die Erhöhung der Schweißelektrolyte bei CF-Patienten

und 1959 wurde durch Gibson und Cooke der Schweißtest nach Pilocarpin-

Iontophorese eingeführt. 1

Durch fehlende oder funktionsuntüchtige CFTR-Kanäle, welche im Normalfall für die

Salz-Reabsorption zuständig sind, wird bei CF-Patienten Schweiß mit erhöhter

Chlorid-Konzentration produziert. Hierbei gilt es, die altersbezogenen Normwerte zu

beachten. 30, 104

1 bis 2% der Patienten zeigen einen normalen oder grenzwertigen Schweißtest. Diese

tragen meist zumindest ein Allel mit einer „milden Mutation“ der Klasse IV oder V. 47, 105

Der Test kann durchgeführt werden, wenn das Neugeborene zwei Wochen alt ist und

mehr als 3kg wiegt. Bei untergewichtigen oder dehydrierten Kindern kann eine erhöhte

Schweißelektrolytkonzentration gefunden werden. Die bevorzugte Methode zur

Schweißstimulation ist die Pilocarpin-Iontophorese. 106

Da eine Vielzahl verschiedener Verfahren zur Schweißstimulation, -sammlung und -

analyse existieren, wurden vom amerikanischen „National Committee for Clinical

Laboratory Standards“ Leitlinien zum Schweißtest herausgegeben. Laut einer Studie

von Naehrlich et al. bestehen zum Teil Unterschiede zwischen diesen Leitlinien und

der Durchführung des Schweißtests in deutschen CF-Zentren hinsichtlich

Schweißsammlung, Analyse und Referenzwerten. So hält sich nur jede 3. Ambulanz

an die empfohlene Sammelzeit von 30 Minuten. Nur 58% der Zentren messen Chlorid,

welches als einziges diagnostisches Verfahren anerkannt ist, der Referenzgrenzwert

von >60mmol/l wird nur von 78% dieser Zentren angewandt. 107

Zur Reduktion von unnötigen Wiederholungsuntersuchungen, falsch positiven oder

negativen Ergebnissen und im Hinblick auf ein mögliches Neugeborenenscreening

sollten nationale Leitlinien und eine externe Qualitätskontrolle erörtert werden. 107

24

1979 wurde von Crossley der IRT (Immunreaktives Trypsinogen) -Test beschrieben.

Dieser beruht auf dem Nachweis erhöhter Trypsinogenwerte im Blut Neugeborener mit

CF. 108, 109

Das Enzym wird im Pankreas produziert und gelangt auf Grund obstruierter

Ausführungsgänge des Pankreas in die Blutbahn, wo es 2- bis 5-fach erhöhte Werte

zeigt, auch wenn das Pankreas des Patienten noch suffizient ist. 4

Dieser Wert ist nur innerhalb der ersten zwei Lebensmonate aussagekräftig, da der

bei CF-Patienten initial erhöhte Trypsinogenspiegel im Blut abhängig von der

Pankreasfunktion stetig abnimmt. Nach dem zweiten Lebensjahr liegt der IRT-Wert bei

allen Patienten ohne Pankreasaktivität unter der Altersnorm. 110

Obwohl der Wert meist noch deutlich über der altersabhängigen Norm liegt, ist jenseits

der 8.Woche eine Kontrolluntersuchung unzuverlässig.

Eine neonatale Hypertrypsinogenämie ist nicht spezifisch für die CF. Bei Trisomie 13

und 18 kann es ebenfalls zu einer Erhöhung des IRT-Wertes kommen. 111, 112

Auch bei perinatalem Stress, perinataler Asphyxie und Neugeborenen auf

Intensivstationen zeigen sich gelegentlich erhöhte Werte. 113, 114

Zudem findet man bei Neugeborenen nordafrikanischer und afro-amerikanischer

Abstammung etwas höhere Werte im Vergleich zu Kindern nordeuropäischer Herkunft. 115, 116

Bei der „benignen transitorischen Hypertrypsinogenämie“ eines Neugeborenen kommt

es in den ersten Lebenswochen schnell zu einer Normalisierung des

Trypsinogenwertes. In dieser Gruppe befinden sich häufig heterozygote Träger eines

CF-Allels. 117, 118

Dahingegen können CF-Patienten mit Mekoniumileus auch IRT-Werte im Normbereich

zeigen. 119

Auf Grund dieser Unspezifität ist die Frage, bei welchem IRT-Wert man den cut-off

setzt, im Falle der CF besonders schwer. Man muss abwägen, dass zum einen

möglichst alle betroffenen Patienten entdeckt werden sollen, zum anderen die Zahl der

Falsch-Positiven möglichst gering sein soll. Setzt man den Wert zu hoch, entgehen

dem Screening einige CF-Patienten. Wählt man ihn niedrig, um eine gute Sensitivität

zu erreichen, generiert man eine große Anzahl weiterer diagnostischer Verfahren und

entdeckt mehr gesunde Träger als betroffene Patienten. 120, 121

25

Rock et al. beschreiben eine Sensitivität von 87% bei einem cut-off-Wert bei der

99,8.Perzentile. 122

1981 entdeckten Knowles et al., dass die nasale Potentialdifferenz bei CF-Patienten

von der Norm abweicht. So konnte auch dieser Test fortan zur Diagnosestellung

genutzt werden. 123

Besteht trotz eines Schweißtests im Normbereich der klinische Verdacht einer CF, gibt

es in spezialisierten CF-Zentren die Möglichkeit, die Diagnostik in Form der

transepithelialen Potentialdifferenz zu erweitern. Gewöhnlich erfolgt die Messung am

Epithel der Nase. Bei einem CF-Patienten wird durch mangelnde Chloridsekretion und

exzessiven Natriumeinstrom ein höheres elektrochemisches Potential erzeugt als bei

einem Gesunden. Diese Methode lässt sich allerdings nur schwer bei kleinen Kindern

oder Patienten mit entzündlichen Veränderungen oder Polypen in der Nase

durchführen. Es ist auch zu beachten, dass viele Heterozygote für CFTR-Mutationen

auffällige Befunde im Vergleich zu Kontrollen haben. 4, 40

Durch die Entdeckung des CFTR-Gens im Jahre 1989 ist es auch möglich, die

Diagnose CF durch Identifikation zweier mutanter CF-Allele zu stellen. 1

Ein Neugeborenenscreening auf CF wurde bereits in Österreich 117, der Schweiz 124,

den Niederlanden 125, Frankreich 126, Polen 127, Belgien 128, Großbritannien 3, 28,

Russland 102, Australien 128, Neuseeland 129, Canada 130 und einigen Regionen Italiens 131, Spaniens und Tschechiens 102 sowie in den USA 132 eingeführt.

In England wird eine DNA-Analyse in zwei Stufen durchgeführt. Zunächst werden die

Proben auf die vier häufigsten Mutationen getestet und nur im Fall einer gefundenen

Mutation nach weiteren 27 Mutationen gesucht. 133

In Schottland gibt es ein IRT/DNA/IRT-Protokoll. Eine zweite IRT-Messung wird im

Falle einer entdeckten Mutation und einem ersten IRT-Wert über der 99,5.Perzentile

oder bei Neugeborenen ohne eine detektierte Mutation und einem ersten IRT-Wert

über der 99,9.Perzentile nach 3-4 Wochen vorgenommen. Ist der zweite Test

ebenfalls erhöht, wird ein Schweißtest durchgeführt. 133

26

In Wisconsin (USA) wird das Neugeborenenscreening auf CF seit 1985, in Brittany

(Frankreich) seit 1989 durchgeführt. Sowohl in Brittany als auch in Wisconsin wurde

bis 1991 die Testung auf das Immunreaktive Trypsinogen verwandt, seither ein

IRT/DNA-Protokoll. Nach 4-6 Wochen wird in beiden Regionen ein Schweißtest zur

Bestätigung der Diagnose durchgeführt. 63

Eine Studie aus dem Jahr 2004 von Southern et al. berichtete von 26

Screeningprogrammen für CF in Europa. Die meisten Programme waren Pilotstudien

und/oder regional begrenzt. Insgesamt wurden so in einem Jahr mehr als 1.600.000

Neugeborene getestet und über 400 CF-Patienten entdeckt. 104, 127

Die Protokolle für das Neugeborenenscreening auf CF in Europa variieren aufgrund

geografischer, ethnischer und ökonomischer Unterschiede. Eine Vereinheitlichung der

Protokolle ist kaum durchführbar und wohl auch nicht nötig. Die Protokolle sehen alle

im ersten Schritt eine Testung des IRT-Wertes vor sowie einen Schweißtest zur

Bestätigung oder zum Ausschluss der Diagnose. 104

IRT

> Cut-off < Cut-off

Verschiedene Protokolle NBS negativ

NBS positiv NBS negativ

Schweißtest

Cl>60mmol/L Cl 30-59mmol/L Cl<30mmol/L

Diagnose CF Diagnose unklar falsch-positives NBS

CF-Zentrum: CF-Zentrum: Klinische Evaluation weitere Untersuchungen

Abb. 7 Prozedur des CF-Neugeborenenscreenings in Europa (modifiziert nach 104)

NBS= Neugeborenenscreening

27

Zuständig für die Entscheidung über die Einführung eines flächendeckenden

Neugeborenenscreenings auf Mukoviszidose in Deutschland ist der Gemeinsame

Bundesausschuss (G-BA) der Krankenkassen und Ärzte. In einer G-BA Untergruppe,

der AG Kinderrichtlinien, wird das Thema diskutiert. 134

Die Interessenvereinigung Mukoviszidose e.V. spricht sich für eine bundesweite

Umsetzung eines Neugeborenenscreenings aus. Man erhofft sich von einem solchen

Screening eine frühere Diagnosestellung und damit eine positive Entwicklung auf den

Krankheitsverlauf durch eine frühe Einleitung der Therapie. 135

Auch wenn es aktuell kein nationales Neugeborenenscreening für CF gibt, wurden

2001 11% der Patienten durch einen positiven Screening-Test erkannt. In einigen

Screeninglaboren in Deutschland (z.B. in Hannover) wird ein Screening auf CF als

freiwillige Zusatzleistung angeboten. 29

Das Neugeborenenscreening auf Mukoviszidose der Technischen Universität Dresden

für Ostsachsen (Regierungsbezirk Dresden) wurde 1996 etabliert. Es wurde zunächst

mit einer IRT/DNA-Screeningstrategie mit Analyse dreier CFTR-Gen-Mutationen

(F508del, G551D und R553X) und seit Januar 2008 mit einem IRT/PAP-Protokoll

durchgeführt. Es wurde eine nahezu 100%ige Einwilligung der Eltern in die freiwillige

Untersuchung erreicht und somit wurden ca. 15.000 Neugeborene pro Jahr

untersucht. Die errechnete Inzidenz für Mukoviszidose in der Region betrug 1:5547.

Der Median des Diagnosealters der mittels Neugeborenenscreening in Dresden

detektierten Kinder liegt bei 60,5 Tagen, der Median des Diagnosezeitpunktes in

Deutschland bei 1,1 Jahren. 102, 136

In Heidelberg fand ab April 2008 eine Pilotstudie zum Vergleich des IRT/DNA-

Protokolls mit einem IRT/PAP-Screening statt. Hier wurden ca. 100.000 Neugeborene

gescreent. Die Sensitivität der IRT/PAP-Methode betrug 92,8%, die der IRT/DNA-

Methode nur 71,4%. Die Spezifität lag in beiden Fällen bei 99,9%. 104, 137

In Greifswald wird seit September 2012 ein freiwilliges Screening mittels einer

IRT/PAP-Methode angeboten. 99

Zu bedenken ist, dass ein Screening keine Untersuchung unter diagnostischen

Qualitätskriterien ist und nicht 100% der betroffenen Patienten entdecken kann. 138

28

3. Fragestellung und Zielsetzung

Derzeit wird die Einführung eines Neugeborenenscrenings auf CF diskutiert. Eines der

wichtigsten Kriterien zur Entscheidungsfindung ist die Inzidenz der Erkrankung.

Daraus ergibt sich die Notwendigkeit einer populationsbasierten Studie zur

Bestimmung der Häufigkeit der Merkmalsträger in der Bevölkerung.

Es besteht ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen der Häufigkeit von

F508del und der Inzidenz der CF. Hingegen gibt es keine Korrelation für die Anzahl

der CFTR-Mutationen und der Häufigkeit der CF in einem Land. 17

Mit den Ergebnissen dieser populationsbasierten Studie sollte zunächst die Häufigkeit

der Merkmalsträger für F508del in Ostvorpommern bestimmt werden. Unter

Berücksichtigung des prozentualen Anteils dieser Mutation an allen CF-Chromosomen

der Patienten in Ostvorpommern sollte dann die Berechnung der heterozygoten CF-

Allelträger in der Region folgen und daraus die Inzidenz der CF abgeleitet werden.

Es gibt bereits Studien, die auf der Basis eines Heterozygotenscreenings für CF auf

die Inzidenz in der Bevölkerung schließen. Hierbei muss die regionale Varianz der

Frequenz der untersuchten Mutationen beachtet werden. 139, 140

Zudem ist zu berücksichtigen, dass einige CF-Allele bei Homozygoten im Vergleich zu

Heterozygoten über- oder unterrepräsentiert sein können, so dass die Berechnung der

Inzidenz aus der Allelhäufigkeit verzerrt wird. Für die F508del-Mutation ist dies nicht

beobachtet. 141

Desweiteren sollten mit dieser Arbeit die wissenschaftlichen und methodischen

Voraussetzungen für die Einführung eines Neugeborenenscreenings für CF geprüft

werden.

Dabei sollte ein einfacher Polymerasekettenreaktion (PCR) - basierter Test entwickelt

werden, mit dem die F508del-Mutation in DNA-Pools bestimmt werden kann.

29

4. Material und Methoden Diese Untersuchung einer Neugeborenenkohorte wurde in Kooperation mit dem

Institut für Community Medicine der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

durchgeführt.

4.1 Studienpopulation

Im populationsbasierten, prospektiven Survey of Neonates in Pomerania (SNiP)

wurden vom 01. März 2003 bis zum 30. November 2008 flächendeckend 6828

Neugeborene erfasst, deren Mütter zum Zeitpunkt der Entbindung ihren Erstwohnsitz

in der Stadt Greifswald oder Orten mit den Postleitzahlen 17389 - 17999 sowie in

Karlshagen, Neuendorf und Wietstock hatten. 142

Von der Studie ausgeschlossen waren Kinder von Müttern mit unzureichenden

Deutschkenntnissen, bei denen eine Befragung nicht möglich war sowie Kinder, die

von ihrer Mutter zur Adoption freigegeben wurden oder verstarben. Bei minderjährigen

Müttern musste der gesetzliche Vormund seine Zustimmung geben. 143

Das Durchschnittsalter der Erstgebärenden lag in der Studienregion zwischen 25 und

26 Jahren und zeigt damit einen bedeutsamen Unterschied zu dem von der

bundesweiten Statistik angegebenen durchschnittlichen Alter bei der Geburt des

ersten Kindes von 29,6 bis 29,8 Jahren. Die Fertilitätsrate in der SNiP-Region lag im

Zeitraum der Studie zwischen 1,19 und 1,29 Kindern pro Frau und weist somit eine

geringere Fertilitätsrate im Vergleich zu bundesweiten (1,34) als auch speziell

ostdeutschen Zahlen (1,30) auf. 142, 143

Mit der Wöchnerin wurde nach ausführlicher Aufklärung ein standardisiertes Interview

von fünf bis zehn Minuten Dauer durchgeführt. Desweiteren wurden den Eltern ein

Fragebogen überreicht und Daten aus dem Mutterpass und der Geburtsakte erfasst.

Insgesamt wurden 273 Items der Neugeborenen und Ihrer Familien erhoben. 142

Dokumentiert wurden soziodemographische Daten wie Schulbildung, Berufstätigkeit

und Lebensbedingungen von Mutter und Vater, Erkrankungen der Mutter und

Verwendung von Medikamenten während der Schwangerschaft sowie der Genuss von

Alkohol und Nikotin vor und während der Schwangerschaft.

Auf diese Weise wurden Erkenntnisse über familiäre Prädispositionen und Einflüsse

auf die Entwicklung des Kindes während der Schwangerschaft gewonnen.

30

Aus der Nabelschnur wurden nach der Geburt mit Einverständnis der Mutter 4 ml Blut

entnommen.

Statistische Vorabschätzungen der vorliegenden Studie gingen von ca. 1500

benötigten Proben aus. Bei etwa 800 erwarteten Proben pro Jahr wurden

populationsbasiert zwei Jahrgänge (Januar 2004 bis Dezember 2005), insgesamt

1530 DNA-Proben, untersucht.

Anzahl der Lebendgeburten von

Januar 2004 – Dezember 2005

im Einzugsgebiet der SNiP-Studie

laut Angaben des

Statistischen Landesamtes: 2503 verpasst: 162

von der SNiP-Studie erfasst: 2341 ausgeschlossen: 124

Studienpopulation: 2217 verfehlt, Einverständnis verweigert: 450

Teilnehmer: 1767 kein Blut vorhanden: 41

Nabelschnurblut

vorhanden: 1726 zu wenig Blut, Blut geronnen,

unreine DNA, DNA vernichtet: 196

untersuchte DNA-Proben: 1530

Abb. 8 Probengewinnung (modifiziert nach 142)

31

4.1.1 Angaben zur ethischen Basis

Nach Prüfung durch die Ethikkommission der Ernst-Moritz-Arndt-Universität

Greifswald und den Datenschutzbeauftragten des Landes Mecklenburg-Vorpommern

wurde die SNiP-Studie positiv begutachtet. Jedes wissenschaftliche Projekt, wie auch

das vorliegende wird darüberhinaus durch den Vorstand des Forschungsverbundes

Community Medicine geprüft und genehmigt.

Die Bearbeitung der Proben erfolgt pseudonymisiert. Es wurde nur nach Heterozygotie

für die F508del-Mutation gesucht und keine Daten zur Person ermittelt und

ausgewertet, so dass für Dritte kein Rückschluss auf die Identität möglich ist.

Theoretisch bestand mit einer Wahrscheinlichkeit von etwa 1:5.000 die Möglichkeit der

Detektion einer Homozygotie für die F508-Mutation im Rahmen dieses Projektes.

Damit stellte sich das ethische Problem der akzidentellen Diagnosestellung eines an

Mukoviszidose erkrankten Teilnehmers und die Frage nach Aufhebung der

Anonymisierung.

Hierfür wurde folgendes Vorgehen festgelegt:

Zum Zeitpunkt der Untersuchung waren die meisten Teilnehmer älter als ein Jahr.

Daher war bei einer durchschnittlichen Diagnosestellung der Mukoviszidose im Alter

von 7 Monaten davon auszugehen, dass bereits aufgrund klinischer Befunde eine

Diagnostik durchgeführt wurde. 29

Im Fall der Feststellung einer Homozygotie für die F508del-Mutation würde der Vorteil

einer möglichst frühen Diagnosestellung den Nachteil der Aufhebung der

Anonymisierung überwiegen. Zunächst wäre erfragt worden, ob der Patient bereits im

Mukoviszidose-Zentrum Mecklenburg-Vorpommern bekannt ist. Daraufhin sollte eine

Kontaktaufnahme zur Familie über den betreuenden Kinderarzt erfolgen. Weitere

diagnostische Schritte wären empfohlen worden, da das Ergebnis im Rahmen einer

wissenschaftlichen Untersuchung unter Screeningbedingungen ermittelt wurde und

keineswegs eine molekulargenetische Untersuchung unter diagnostischen

Qualitätskriterien ersetzen kann.

Bei Ausschluss einer Mutation sowie der Detektion der F508del-Mutation in

Heterozygotie, die keine Krankheitsrelevanz hat, wurde die Anonymität gewahrt und

32

es erfolgte laut Empfehlungen der UNESCO und der Arbeitsgruppe Ethik der

Europäischen Gesellschaft für Humangenetik keine Information des betreffenden

Probanden über das Ergebnis. 144, 145

Die CF-Studie wurde in dieser Form von der Ethikkommission der Ernst-Moritz-Arndt-

Universität Greifswald und dem Vorstand des Forschungsverbundes Community

Medicine bewilligt.

33

4.2 Methoden

Die Präparation der DNA erfolgte aus mindestens 0,5ml Nabelschnurblut, welches im

Rahmen der SNiP-Studie entnommen worden war.

Das Blut wurde mit 30ml Lysis-Puffer in einem Falcon-Röhrchen 30 min. zur Hämolyse

in einem Eisbad belassen, dabei 4-5 mal gut gemischt. Es wurde bei 4°C 10 min. bei

1900g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen, das Pellet in 10ml Lysis-Puffer

suspendiert und erneut zentrifugiert. Der Waschschritt wurde 2-3mal wiederholt bis der

Überstand hell blieb.

Das Pellet wurde mit 5ml SE-Puffer, 250µl SDS und 50µl Pronase E im

Trockenschrank bei 55°C inkubiert und im Verlauf 3-4 mal von Hand geschüttelt.

Erschien die Lösung nach etwa 24 Stunden optisch homogen, wurden 1,4ml NaCl-

Lösung bei Raumtemperatur zugegeben. Sie wurde 15 sec. auf dem Vortex-Mischer

geschüttelt und bei 25°C 15 min. bei 4000g zentrifugiert. Der Überstand mit der DNA

wurde in ein neues Falcon-Röhrchen abgegossen und 12ml Rotisol bei

Raumtemperatur zur Fällung hinzugefügt. Die Proben wurden von Hand geschwenkt,

die DNA mit Häkchen entnommen und mit 70% Ethanol mittels Pipette abgespült. Der

DNA wurde in einem Eppendorf-Röhrchen 1ml TE-Puffer (Stammlösung) zum Lösen

dazugegeben.

War nach etwa 2 Tagen bei Raumtemperatur auf einem Reagenzglasmischer mit

Drehteller kein DNA-Knäuel mehr zu sehen, wurde eine Konzentrations- und

Reinheitsbestimmung am Spektralfotometer durchgeführt.

10 µl gelöste DNA wurde mit 990 µl TE-Puffer in ein 2ml Eppendorf-Röhrchen

gegeben und gemischt. Die Reinheit, i.e. Optische Dichte (260nm) / Optische Dichte

(280nm), sollte größer als 1,75 sein.

Alle DNA-Proben wurden mittels der erwähnten Stammlösung auf eine einheitliche

Konzentration von 10 µg pro 100 µl eingestellt, um die Vergleichbarkeit der

Ergebnisse zu gewährleisten. Sie wurden bei –23°C konserviert.

34

Herstellung der Reagenzien:

Lysis-Puffer NH4CL, 155mM = 8,29g

KHCO3, 10mM = 1g

Na-EDTA, 0,1mM = 0,03722g

auf 1l mit Aquabidest auffüllen,

pH 7,4 mit HCl bzw. NaOH

einstellen, Aufbewahrung und

Verarbeitung bei 4°C

SE-Puffer NaCl, 75mM = 4,38g

Na-EDTA, 25mM = 9,31g

auf 1l mit Aquabidest auffüllen,

pH 8,0 mit 4,3ml 5n NaOH

eingestellt, Aufbewahrung bei

4°C, Verarbeitung bei

Zimmertemperatur

TE-Puffer

(Stammlösung)

TRIS 0,5M (6,05g ad 100ml

aqua ad iniectabilia Decta

Select pH 8,0)

Na-EDTA 0,5M (18,6g ad 100ml

aqua ad iniectabilia Decta

Select pH 8,0)

Gebrauchslösung: 2000µl TRIS

0,5M und 200 µl Na-EDTA 0,5M

ad 100ml aqua ad iniectabilia

Decta Select

Pronase E 10mg/ml aqua ad iniectabilia

Delta Select

haltbar bei -23°C

SDS Dodecylsulfat-Na-Salz 20% in

Aquabidest

NaCl gesättigt, 6M

Chemikalien:

NH4CL Firma Merk Darmstadt

KHCO3 Firma Merk Darmstadt

Na-EDTA (TriplexIII) Firma Merk Darmstadt

NaCl Firma Merk Darmstadt

TRIS(hydroxymethyl)-aminomethan Firma Merk Darmstadt

Pronase E Firma SERVA Heidelberg

SDS: Dodecylsulfat-Na-Salz Firma SERVA Heidelberg

Rotisol Firma Roth Karlsruhe

Ethanol 70% Universitätsapotheke Greifswald

aqua ad iniectabilia Decta Select Delta Select GmbH Pfullingen

35

Der Nachweis der F508del-Mutation wurde DNA basiert mittels PCR in zwei Schritten

durchgeführt.

Hierfür wurde der Thermocycler PERKIN ELMER Gene Amp PCR System 9600

(Waltham, Massachusetts, USA) genutzt.

Im ersten Schritt wurde eine DNA-Probe auf das Vorhandensein der F508del-Mutation

überprüft.

Das verwendete PCR-Programm beinhaltete eine sechsminütige Denaturierung bei

94°C, 35 Zyklen mit jeweils 30 sec. Denaturierung bei 94°C, dem Annealing 30 sec.

bei 51°C und einer Elongation 30 sec. bei 72°C, sowie eine Abkühlung nach weiteren

6 min. bei 72°C auf 4°C.

Für die PCR zum Nachweis der F508del-Mutation wurden zwei Primer verwendet:

5` - ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATT - 3` (selbst designt)

5` - CAT TCA CAG TAG CTT ACC CAT - 3` 21

Der PCR-Ansatz bestand aus 25 µl folgender Zusammensetzung:

H20 15,45 µl

Puffer (10x NH4 Reaktionspuffer: 750mM Tris-HCl pH 8,8 (bei 25°C),

200mM(NH4)2SO4, 0,1% Tween®20) 2,5 µl

MgCl2 (25mM) 1,25 µl

dNTPs 0,5 µl

Primer A 0,05 µl

Primer B 0,05 µl

Innu Taq Polymerase (Analytic Jena, 5U/ µl) 0,2 µl

5 DNA-Proben zu jeweils 1 µl 5 µl

36

Der zweite Schritt wurde im Fall eines positiven Ergebnisses in der ersten PCR mit der

Bi-PASA (bidirectional PCR amplification of specific alleles), einer PCR mit 4 Primern,

durchgeführt.

Bei der Bi-PASA besteht die Möglichkeit, in einem Reaktionsgefäß sowohl das

Vorhandensein des Wildtyp- als auch des gesuchten mutierten Allels nachzuweisen.

So lassen sich in einer PCR-Reaktion Homozygote von Heterozygoten unterscheiden.

Beide Allele werden in entgegengesetzten Richtungen amplifiziert.

Die PCR benötigt zwei äußere (P und Q) und zwei innere allelspezifische (A und B)

Primer.

Die inneren Primer verfügen über eine kurze komplementäre Region, ein 10

Nukleotide langes GC-reiches 5` Ende und ein Mismatch am 3` Ende.

Das GC reiche Ende steigert die Effizienz der Amplifikation nach einigen Zyklen, wenn

genomische DNA durch amplifizierte „template DNA“ ersetzt wird, da die

komplementäre Region größer wird. Desweiteren verhindert es „megapriming“,

verursacht durch in der PCR entstandene PB- oder AQ-Segmente (siehe Abb.9), die

in folgenden Zyklen als Primer für die genomische DNA agieren können.

In der Reaktion können drei Fragmente entstehen: AQ für das mutante Allel, PB für

das Wildtyp-Allel und PQ als interne Kontrolle. Sowohl homozygot Gesunde als auch

homozygot Kranke weisen also zwei, Heterozygote für die F508del-Mutation drei

Banden auf. 21

37

� P � A

--- ---

B Q PCR Possible PCR Segments: PQ wildtype PQ mutant

PB wildtype _______________________________________ _______________________________________ AQ mutant

______________________________________________ ______________________________________________

Agarose gel elektrophoresis Homozygote Homozygote Heterozygote Wildtype Mutant PQ (588bp) Wildtype Allele PB (415bp) Mutant Allele AQ (223bp)

Abb. 9 Darstellung der Bi-PASA modifiziert nach 146

P = Primer 5` - CTG AAT CAT GTG CCC TTC TC - 3` Q = Primer 5` - CAT TCA CAG TAG CTT ACC CAT - 3` A = Primer 5` - GGG CCG GGG GAT TAA AGA AAA TAT CAT T - 3` B = Primer 5` - GGC GGC GGG GAT AGG AAA CAC CAA A - 3` X = Mutation

38

Das verwendete PCR-Programm beinhaltete eine sechsminütige Denaturierung bei

94°C, 35 Zyklen mit jeweils 30 sec. Denaturierung bei 94°C, dem Annealing 30 sec.

bei 55°C und Elongation 30 sec. bei 72°C, sowie eine Abkühlung nach weiteren 6 min.

bei 72°C auf 4°C.

Für die Bi-PASA wurden vier Primer verwendet:

5` - CTG AAT CAT GTG CCC TTC TC - 3` 21

5` - CAT TCA CAG TAG CTT ACC CAT - 3` 21

5` - GGG CCG GGG GAT TAA AGA AAA TAT CAT T - 3` 21

5` - GGC GGC GGG GAT AGG AAA CAC CAA A - 3` 21

Der PCR-Ansatz bestand aus 25 µl folgender Zusammensetzung:

H20 19,325 µl


200mM(NH4)2SO4, 0,1% Tween®20)

2,5 µl


dNTPs 0,5 µl

Primer A 0,0125 µl

Primer B 0,0125 µl

Primer C 0,1 µl

Primer D 0,1 µl


1 DNA-Probe 1 µl

Zur Bestätigung der Qualität des verwendeten PCR-Ansatzes wurde das amplifizierte

Produkt der PCR mit einer Probe eines bekannten CF-Patienten mit nachgewiesener

F508del-Mutation sequenziert. So wurde sichergestellt, dass die richtige Mutation

untersucht wurde. Es entsprach der F508del-Mutation.

39

Die Sequenzierung fand im August 2006 im Institut für Humangenetik in Greifswald

mittels der „Big Dye Terminator Cycle“ – Sequenzierung (Sequenzierer Modell: ABI

Prism® 377) statt.

Sensitivität und Spezifität der Bi-PASA wurde von Liu et al. mit 100 % und 99,6 %

getestet. 146

Mit dem Ziel, das PCR-Verfahren auch für eine große Anzahl von Proben möglich zu

machen, führten wir Verdünnungsreihen einer für die F508del-Mutation heterozygoten

Probe mit Proben gesunder Probanden durch, um jeweils mehrere DNA-Proben in

einer Reaktion zusammenfügen und mit diesem Pool eine PCR durchführen zu

können.

Eine für die F508del-Mutation heterozygote Probe wurde mit jeweils 1 - 12 Proben

gesunder Probanden verdünnt und das Anschlagen der PCR im Pool beobachtet.

In der Bi-PASA wurden die DNA-Proben der Probanden einzeln untersucht.

Um ein eventuell bald eingeführtes Neugeborenenscreening noch einfacher und

kostengünstiger zu gestalten, prüften wir eine Methode zur DNA-Gewinnung, bei der

die ohnehin zur Verfügung stehenden, auf Filterpapier getrockneten Blutproben

(Guthrie-Karten) des Neugeborenenscreenings genutzt werden können. Diese sind

leicht zu transportieren und archivieren. Crossley nutzte sie bereits 1979 zur

Bestimmung des Immunreaktiven Trypsinogens. 108, 147

Ein Tropfen Vollblut wurde auf Filterpapier gegeben. Wir stanzten jeweils ein rundes

Plättchen im Durchmesser von 0,3 cm aus der getrockneten Blutprobe aus und fügten

dies der Reaktion hinzu. 148

Der PCR-Ansatz wurde nach jeweils 30 sec. bei 4°C zweimal 3 min. bei 95°C im

Thermocycler erhitzt, danach wurde er zu den ausgestanzten Plättchen aus den

Karten des Neugeborenenscreenings pippetiert und die PCR wurde wie beschrieben

durchgeführt.

40

Die Stabilität der DNA in getrockneten Blutproben ist gesichert, sie kann für

Amplifikationen und Mutationsanalysen verwendet werden. 130, 149

Bei Verwendung der ausgestanzten Plättchen aus den Karten des

Neugeborenenscreenings wurde der Ansatz verdoppelt, um ein deutlicheres Ergebnis

zu erzielen. Er bestand aus 40µl und setzte sich folgendermaßen zusammen:

H2O 30,9 µl


200mM(NH4)2SO4, 0,1% Tween®20)

5 µl

MgCl2 2,5 µl

dNTPs 1 µl

Primer A 0,1 µl

Primer B 0,1 µl


Auch für die Bi-PASA wurde bei Verwendung der ausgestanzten Plättchen aus den

Screeningkarten der Ansatz verdoppelt. Es musste zudem ein Enhancer hinzugefügt

werden. So bestand der Ansatz aus 48µl und setzte sich folgendermaßen zusammen:

Enhancer (Q-Solution, 5x konzentriert) 10 µl

H2O 28,65 µl

Puffer (TrisCl, KCl, (NH4)2SO4, pH 8,7 bei 20°C) 5 µl


dNTPs 1 µl

Primer A 0,025 µl

Primer B 0,025 µl

Primer C 0,2 µl

Primer D 0,2 µl

Qiagen Taq Polymerase (Sample&Assay Technologies, 5U/ µl) 0,4 µl

41

Bei allen Reaktionen wurden ein Pool von einer heterozygoten Probe mit vier

gesunden Proben als Positivkontrolle, sowie ein Leerwert als negative Kontrolle

mitgeführt.

Der PCR folgte eine Auftrennung und Analyse der amplifizierten DNA-Fragmente

durch eine Gelelektrophorese. Die Gelelektrophorese lief 30 min. bei 120V im POWER

PAC 200 (BIO-RAD; Hercules, California, USA), wobei jeweils 10 µl des PCR

Produktes mit 4 µl Bromphenolblaulösung (50% Glycerol in H2O) in einen Slot

pippetiert wurden.

Die PCR-Produkte wurden in ein mit Slots versehenes Agarose-Gel pippetiert,

welches in einer mit 1x TA-Puffer gefüllten Elektrophorese-Kammer lag. Für das 2%

Agarose Gel wurde 1g DNA-Agar (Serva; Heidelberg) in 50 ml 1x TA-Puffer gelöst,

welcher sich aus 50x TA-Pufferlösung (242g/l Trisbase, 57,1 ml/l Eisessig, pH 8,0) und

Aqua bidestillata zusammensetzte, wobei 10ml 50x TA-Puffer auf 500ml Aqua

bidestillata kamen.

Homozygot Homozygot

Heterozygot Heterozygot

Gesund Gesund

Leerwert

588 415 223 (bp)

Abb. 10 Gelelektrophorese nach Bi-PASA, Nachweis F508del-Mutation Laufrichtung , DNA-Leiter: pUC 19/Msp I

42

Aufgrund ihrer polyanionischen Ladung bewegen sich die Nukleinsäuren nach Anlage

einer Spannung im Gel von der Kathode zur Anode. Dabei bewegen sich kleinere

Teilchen schneller als große und es erfolgt eine Auftrennung der Fragmente nach ihrer

Molekülgröße. Im Gel wurde bei jeder Elektrophorese die DNA-Leiter pUC 19/Msp I

(Carl Roth; Karlsruhe) mitgeführt, die aus Nukleinsäuresträngen definierter Länge

besteht und eine Angabe der Größe verschiedener DNA-Fragmente möglich macht

(Fragmentgrößen: 501, 404, 331, 242, 190, 147, 111, 67 (in bp), Gesamtlänge

2686bp).

Durch das zum Gel zugesetzte Ethidiumbromid (Serva; Heidelberg) mit einer

Konzentration von 10mg/10ml H2O konnten die DNA-Banden unter UV-Licht mit einer

Wellenlänge von 312nm sichtbar gemacht und fotografiert werden.

43

4.3 Angaben zur Statistik

Zur Abschätzung der benötigten Studiengröße wurde eine Häufigkeit phänotypisch

gesunder, heterozygoter Überträger der CF von etwa 1:20 bis 1:30 angenommen.

Dieser Schätzwert basiert für Deutschland auf den Ergebnissen des CF-Registers

(Qualitätssicherung Mukoviszidose), in dem bekannte Patienten von den CF-Zentren

gemeldet werden.

Die Häufigkeit der gesuchten F508del-Mutation wurde analog der Untersuchungen

von Bauer et al. in Mecklenburg-Vorpommern mit 67,9% angenommen. 24

Damit wurden bei ca. 1500 untersuchten Proben etwa 30 bis 50 Heterozygote für die

F508del-Mutation erwartet.

Geht man von einer Inzidenz der Mukoviszidose von 1 pro 3.300 Geburten aus,

beträgt die Wahrscheinlichkeit einer Homozygotie für die F508del-Mutation unter

Berücksichtigung der Allelverteilung in Mecklenburg-Vorpommern in dieser Population

rund 1:5.000. 100

Unter allen untersuchten Probanden (n) wurden a Allele mit der gesuchten Mutation

gefunden. So war die beobachtete Wahrscheinlichkeit p, einen Merkmalsträger zu

finden p = a/n. 150

Die Berechnung der Inzidenz erfolgte mittels Allelfrequenzbestimmung nach Hardy-

Weinberg.

Für die Berechnung des Konfidenzintervalls wurde folgende Formel verwendet:

a/n ± √ (a/n (1-a/n)):n .

5. Ergebnisse Alle 1530 eingeschlossenen

ersten Ansatz amplifiziert und analysiert.

Um herauszufinden, ob mehrere DNA

erfolgten zunächst Verdünnungsreihen einer für die F508del

Probe mit jeweils 1-12 gesunden Proben.

heterozygoten Probe mit zehn homozygot gesunden Proben ließ sich in der PCR ein

eindeutiges Ergebnis nachwei

Verdünnung von 1:5 zu verwenden, um die Sicherheit der Ergebnisse zu

gewährleisten.

73 Proben, welche unter der einheitlichen DNA

lagen, wurden einzeln untersucht.

Heterozygot F508del : Gesund 5:0 0:5 1:4 1:4 1:5 1:5 1:6 1:6 1:10 1:10 Leerwert Abb. 11 Verdünnungsreihe DNA-

Laufrichtung , DNA-Leiter: pUC 19/Msp I

44

eingeschlossenen DNA-Proben aus Nabelschnurblut wurden erfolgreich im

ersten Ansatz amplifiziert und analysiert.

Um herauszufinden, ob mehrere DNA-Proben zeitgleich untersucht werden können,

n zunächst Verdünnungsreihen einer für die F508del-Mutation heterozygoten

12 gesunden Proben. Bis zu einer Verdünnung von einer


eindeutiges Ergebnis nachweisen. Wir entschieden, für unsere Studie eine


73 Proben, welche unter der einheitlichen DNA-Konzentration von 10

lagen, wurden einzeln untersucht.

: Gesund

-Proben (Heterozygot F508del (216bp):Gesund) I

Leiter: pUC 19/Msp I

Proben aus Nabelschnurblut wurden erfolgreich im

Proben zeitgleich untersucht werden können,

Mutation heterozygoten

Bis zu einer Verdünnung von einer


sen. Wir entschieden, für unsere Studie eine


Konzentration von 10 µg pro 100 µl

Proben (Heterozygot F508del (216bp):Gesund) I

1:9 1:10 1:11 1:12 Leerwert Abb. 12 Verdünnungsreihe DNA-


Die PCR lässt sich auch mit DNA aus getrockneten Blutproben auf

durchführen. Dies kann die Durchführung eines Neugeborenenscreen

gestalten, da aus einem der

dem Filterpapier der Screeningkarte

ausgestanzt und mit diesem die

F508del-Mutation F508del-Mutation Gesund Gesund Leerwert Abb. 13 PCR mit Stanzproben aus Guthrie


Nur die Proben, die ein auffälliges Ergebnis zeigten, wurden nachge

Hierbei ließ sich anhand der Bi

heterozygote oder homozygote, also krankheitsverursachende Mutation handelt

45

-Proben (Heterozygot F508del (216bp):Gesund) IILeiter: pUC 19/Msp I

Die PCR lässt sich auch mit DNA aus getrockneten Blutproben auf

die Durchführung eines Neugeborenenscreen

, da aus einem der ohnehin zur Verfügung stehenden fünf Blutstropfen auf

dem Filterpapier der Screeningkarte ein rundes Plättchen im Durchmesser von 0,3 cm

ausgestanzt und mit diesem die Reaktion durchgeführt werden kann.

PCR mit Stanzproben aus Guthrie-Karten, Nachweis F508del-Mutation (216bp)Leiter: pUC 19/Msp I

Nur die Proben, die ein auffälliges Ergebnis zeigten, wurden nachge

sich anhand der Bi-Pasa-PCR differenzieren, ob es sich um eine

heterozygote oder homozygote, also krankheitsverursachende Mutation handelt

Proben (Heterozygot F508del (216bp):Gesund) II

Die PCR lässt sich auch mit DNA aus getrockneten Blutproben auf Guthrie-Karten

die Durchführung eines Neugeborenenscreenings einfacher

fünf Blutstropfen auf

ein rundes Plättchen im Durchmesser von 0,3 cm

nn.

Mutation (216bp)

Nur die Proben, die ein auffälliges Ergebnis zeigten, wurden nachgetestet.

PCR differenzieren, ob es sich um eine

heterozygote oder homozygote, also krankheitsverursachende Mutation handelte.

46

Homozygot Homozygot

Heterozygot Heterozygot

Gesund Gesund

Leerwert

588 415 223 (bp)

Abb. 14 Bi-PASA, Nachweis F508del-Mutation Laufrichtung , DNA-Leiter: pUC 19/Msp I

Auch die Bi-PASA lässt sich mit DNA aus Stanzproben der Screeningkarten

durchführen.

Heterozygot Gesund Heterozygot

Leerwert

588 415 223 (bp)

Abb. 15 Bi-PASA mit Stanzproben aus Guthrie-Karten, Nachweis F508del-Mutation Laufrichtung , DNA-Leiter: pUC 19/Msp I

47

So ist gesichert, dass durch die Untersuchung einer Stanzprobe aus der Guthrie-

Karte eine Analyse auf die F508del-Mutation möglich ist. Dies ist ein schnelles und

einfaches Testverfahren, welches sich im Rahmen eines Neugeborenenscreenings

auf CF einsetzen ließe.

Unter 1530 Proben ließen sich in dieser Studie mit den beschriebenen Methoden 32

Heterozygote für die F508del-Mutation nachweisen.

Die Inzidenz für die Jahrgänge 2004 und 2005 liegt somit für eine Heterozygotie dieser

Mutation bei 1:47,81 (Konfidenzintervall 1:40,69 –1:57,95) bzw. 2,09 %

(Konfidenzintervall 1,73 % - 2,46 %).

Da die F508del-Mutation nur 67,9 % aller CF-Chromosomen in Mecklenburg-

Vorpommern ausmacht, ist die errechnete Inzidenz der heterozygoten Träger aller CF-

verursachenden Mutationen in der untersuchten Population 3,08 % bzw. 1:32,46. 24

Wird für die Mukoviszidose ein Hardy-Weinberg-Gleichgewicht angenommen, ist aus

den Daten eine Inzidenz der Krankheit in Ostvorpommern von 1:4.216 anzunehmen.

48

6. Diskussion

6.1 Inzidenz / Prävalenz der CF

Die in der vorgelegten Arbeit ermittelte Inzidenz der CF in Ostvorpommern liegt mit

1:4.216 im Bereich vergleichbarer Zahlen aus Deutschland. Sie ist jedoch kleiner als

bisher für Deutschland angenommen. Die Inzidenz für die Bundesrepublik

Deutschland beträgt laut einer Studie von 2008 1:3300. 100

Ein Grund für diese Differenz liegt vermutlich in einem regional abweichenden

Genpool in Ostvorpommern im Vergleich zum Rest des Landes. 96,43% der Mütter

und 94,56% der Väter, welche bei der SNiP-Studie teilgenommen haben sind in

Deutschland geboren, allerdings sind einige Familien aus osteuropäischen Staaten

zugezogen, so kann von einem Populationsshift von Ost nach West ausgegangen

werden. 151

Coutelle et al. berichten, dass der Anteil der F508del-Mutation in den neuen

Bundesländern mit 60,8% signifikant geringer ist als in den alten Bundesländern, wo

der Anteil 70-80% beträgt. Die Daten von Coutelle für die neuen Bundesländer sind

denen in Polen ähnlich und lassen auf slavische Einflüsse in dieser Population

schließen. 152

Berücksichtigt werden muss hierbei auch die Flucht vieler Zivilisten aus den östlichen

Gebieten des Deutschen Reiches im Zweiten Weltkrieg ab Oktober 1944 Richtung

Westen und die Vergewaltigungen von geschätzt 1,4 Millionen deutschen Frauen

durch Mitglieder der Roten Armee in den Vertreibungsgebieten Ostpreußen,

Ostpommern, Ostbrandenburg und Schlesien. 153

Möglicherweise ist die Rate von F508del in Ostvorpommern niedriger als in dieser

Studie angenommen und andere Mutationen sind für eine größere Anzahl von CF-

Chromosomen verantwortlich. Daraus könnte eine höhere Inzidenz folgen.

Die vorliegende Studie unterliegt einem Selektionsbias durch die Einschränkung der

Region. So hat die errechnete Inzidenz nur regionale Bedeutung. Eine Ausweitung der

Datenerhebung auf Landes- oder Bundesebene wäre wünschenswert. Allein ein

flächendeckendes Screening würde eine Kalkulation der Inzidenz der Mukoviszidose

in Deutschland möglich machen.

Es muss auch beachtet werden, dass bei unserer Untersuchung nicht alle

Neugeborenen der Jahrgänge 2004 und 2005 in der Region erfasst worden sind. Von

49

2503 Kindern, die in diesem Zeitraum laut Angaben des Statistischen Bundesamtes

geboren wurden, konnten nur 1530 Proben für unsere Studie gewonnen werden.

Zwar wurden in der SNiP-Studie 2341 der Neugeborenen registriert, jedoch wurden

124 Kinder ausgeschlossen und 94 verfehlt, desweiteren verweigerten die Eltern von

356 Kindern die Teilnahme. Möglicherweise hätte hier durch eine noch bessere

Informationspolitik eine höhere Teilnehmerrate erreicht werden können.

Von weiteren 237 Kindern fehlten DNA-Proben, weil kein oder zu wenig Blut

vorhanden war, das Blut geronnen war oder die DNA nicht in ausreichender Menge

vorhanden oder unrein war. 142

Es ist allerdings nicht davon auszugehen, dass in der untersuchten Population und in

der nicht eingeschlossenen Personengruppe eine andere Inzidenz der gesuchten

Mutation besteht. Nicht eingeschlossen wurden v.a. Proben der Kinder, deren Mütter

frühzeitig aus dem Krankenhaus entlassen wurden, minderjährig waren, kein Interesse

an der Studie oder kein Verständnis dafür hatten und auch keine Proben der Kinder,

die zur Adoption freigegeben wurden. Keiner dieser Faktoren sollte Einfluss auf die

Inzidenz haben. 151

Wunderlich et al. beschrieben im Jahr 2000 für den Regierungsbezirk Dresden eine

Inzidenz von 1:5547. Ergebnisse des Neugeborenenscreenings in Ostsachsen für den

Zeitraum 01.06.1996 bis 31.12.2007 anhand der IRT/DNA (F508del, G551D, R553X)

Screeningstrategie zeigten eine Prävalenz von 1:4.228, für den Zeitraum 01.01.2008

bis 30.06.2009 anhand der IRT/PAP Screeningmethode eine Prävalenz von 1:4.523. 102, 136

Aus der vom Statistischen Bundesamt für den Zeitraum von 1981-2000 ermittelten

Anzahl von 16.476.098 Lebendgeburten und der im Mukoviszidoseregister 2005 für

diese Geburtsjahrgänge erfassten Anzahl von 4.100 Mukoviszidosepatienten

errechnet sich eine Prävalenz von 1:4.019. 102

Damit zeigen sich erhebliche Unterschiede in der Inzidenz beim Vergleich einzelner

Geburtsjahrgänge.

Die Inzidenz der CF in Europa variiert laut Zahlen aus dem Jahre 2007 von 1:2.250 bis

1:10.500 mit einem Median von 1:3.500. 127

Die mittlere Prävalenz in Europa lag 2008 bei 0,737 pro 100.000 und schwankte dabei

von 0,104 in Lettland bis 2,98 in Irland. 100

50

In den südlichen Provinzen Frankreichs betrug die Inzidenz 2004 1:8885, mit einer

Carrierfrequenz von 1 in 47 (2,12%). Diese Zahl ist geringer als die für das gesamte

Land Frankreich geschätzte Inzidenz von 1.3500. 154

Schaedel et al. nannten 1999 für Schweden eine Inzidenz der CF von 1:6500 und eine

Carrierfrequenz von 1:40. 155

In Polen beträgt die Inzidenz der CF laut einer Studie aus dem Jahr 2012 1:4394. 156

2004 beschrieben Strom et al. bei Menschen kaukasischen Ursprungs eine Inzidenz

der CF von 1:3.300-3.600, in der lateinamerikanischen Bevölkerung eine Inzidenz von

1:8.000-9.500, bei Afro-Amerikanern von 1:15.300 und bei Amerikanern asiatischer

Abstammung von 1:32.100. 157

Die Inzidenz, die in der Studie der Universität von Wisconcin 2001 ermittelt wurde,

betrug 1: 4.189, in Canada/Vancouver lag die Inzidenz 2008 bei 1:3.673. 31, 158

In Studien aus Italien, Frankreich und Australien wird eine sinkende Inzidenz der CF

beschrieben seitdem eine pränatale Diagnosestellung möglich ist. Häufig würde im

Falle eines positiven Testergebnisses ein Abbruch der Schwangerschaft durchgeführt. 159, 160, 161

In den Niederlanden wird eine sinkende Prävalenz auf die in den letzten Jahrzehnten

vermehrte Zuwanderung von Menschen aus Ländern mit einer geringeren

Carrierfrequenz für CFTR-Mutationen zurückgeführt. 162

Es gilt auch zu berücksichtigen, dass männliche CF-Patienten kaum

fortpflanzungsfähig sind und zudem heterozygote Männer mit nur einer CF-Mutation

im Gegensatz zur männlichen Allgemeinbevölkerung häufiger eine bilaterale Aplasie

des Vas deferens aufweisen. Bei bilateraler Aplasie des Vas deferens beim Vater liegt

das Risiko für ein erkranktes Kind mit 1:100 sehr hoch. Durch

reproduktionsmedizinische Maßnahmen steigt wiederum die Anzahl der Geburten und

somit die Zahl der vererbten defekten Gene. 75

51

6.2 Screening und Klinische Diagnose – eine Gegenüberstellung

Farrell definiert eine frühe Diagnose als eine Diagnose, die innerhalb der ersten zwei

Lebensmonate gestellt wird. 163

Eine klinische Diagnose nach zwei Monaten ist mit einem schlechteren Outcome

assoziiert. Patienten, die innerhalb der ersten zwei Monate diagnostiziert werden,

weisen eine bessere Größenentwicklung, reduzierte Morbidität und weniger benötigte

Therapien auf. Sie zeigen eine ähnliche Lungenfunktion wie später diagnostizierte

Patienten. Es besteht kein Unterschied im Outcome zwischen Patienten die durch ein

Screening oder auf Grund ihrer klinischen Symptomatik innerhalb der ersten zwei

Monate diagnostiziert wurden. 19

Eine frühe Diagnosestellung bietet die Möglichkeit präventiver Maßnahmen. 164

Eine Studie von Simpson et al. aus Großbritannien besagt, dass ein

Neugeborenenscreening zu einem späteren Auftreten von Symptomen und einer

verlängerten Lebenserwartung von elf Monaten führt. 165

Das Risiko der CF-Patienten, in den ersten zehn Lebensjahren zu versterben, liegt in

einer gescreenten Population bei bis zu 10 pro 100 Patienten niedriger als in

ungescreenten Kohorten, so Grosse et al.. 166

Festini et al. beschreiben in ihrer Langzeitstudie nach 15 Jahren eine Mortalitätsrate

von 2,9% in der gescreenten Gruppe im Vergleich zu 7,1% bei den klinisch

diagnostizierten Patienten. 167

Ohne Screening wird fast die Hälfte der CF-Patienten erst nach dem ersten

Lebensjahr diagnostiziert. Klinisch diagnostizierte Patienten haben ein durchschnittlich

1,73-fach höheres Risiko früh zu versterben, es sei denn sie fallen innerhalb des

ersten Lebensmonates auf. In diesen 5% der Fälle zeigen sie ähnliche

Überlebenskurven wie gescreente Patienten. 74% der gescreenten Patienten sind

zum Zeitpunkt der Diagnose symptomfrei. Die besten Überlebensraten haben

Patienten, die eine sehr frühe Diagnose durch ein pränatales Screening oder

Neugeborenenscreening erhalten haben. 168

52

In England konnte in den Regionen, in denen ein Neugeborenenscreening auf CF

eingeführt wurde, das mittlere Alter bei Diagnose von sechs Monaten auf einen Monat

reduziert werden. 169

Laut Accurso et al. liegt das mittlere Alter bei Diagnose der CF in den USA im Falle

eines Screenings bei 0,5 Monaten, bei einer klinisch gestellten Diagnose bei 14,5

Monaten. 79

Ein Neugeborenenscreening auf CF schützt die Patienten vor falschen Diagnosen wie

Lebensmittelallergie, Zöliakie, Asthma oder Bronchitis. Diese Fehldiagnosen

verzögern häufig die korrekte Diagnose und führen zu vielen unnötigen Arztbesuchen

und Krankenhausaufenthalten mit diagnostischen Tests, die Kosten produzieren und

Ängste der Familien schüren. 170

Zudem ist ein Neugeborenenscreening die einzige Möglichkeit, alle Kinder einer

Region zu erfassen. Es gibt Studien, die zeigen, dass Mädchen mit CF ohne

Screening signifikant später diagnostiziert werden als männliche Patienten.

Desweiteren werden Kinder mit CF aus Familien, die aus ökonomischen oder

geografischen Gründen einen unzureichenden Zugang zur medizinischen Versorgung

haben, häufig sehr spät erkannt. 32, 65

Neben den Vorteilen eines Neugeborenenscreenings auf CF gilt es auch mögliche

Risiken und Nachteile abzuwägen.

Eltern erleiden beispielsweise eine Situation höchsten emotionalen Stresses, während

sie nach einem auffälligen Screeningergebnis ihres Kindes auf einen Schweißtest

warten. Im Median beträgt die Wartezeit hierfür 7 Tage. Die Eltern beschreiben die

Ungewissheit während des Wartens als ihren größten Stressfaktor, sie wünschen

ausreichend Informationen über CF sowie einen schnellstmöglichen Schweißtest. 171

Die psychische Belastung betroffener Familien ist geringer je früher die Diagnose CF

gestellt wird. Mütter haben mehr Vertrauen in die medizinische Betreuung ihres

Kindes, wenn die prädiagnostische Phase kurz ist. Signifikant weniger Eltern in der

Gruppe der früh diagnostizierten Kinder empfinden diese Phase belastend im

Gegensatz zu Eltern, bei deren Kind die Diagnose spät gestellt wird (61,9% zu

53

85,2%). Letztere erhalten häufiger Fehldiagnosen bevor die CF erkannt wird (22,2%

zu 3,7%). 98% der Mütter von Kindern mit CF sprechen sich für ein Neonatalscreening

aus. Allerdings zeigen 77% der Mütter eines Kindes mit positivem Screening

depressive Symptome. 171, 172

Bei einem Screening besteht die Gefahr falsch-positiver Ergebnisse. Auch deshalb

sollte die Zeit von der Information über ein positives Screeningergebnis bis zur

definitiven Diagnosestellung durch einen Schweißtest so gering wie möglich gehalten

werden. Es könnte auch das Problem entstehen, dass bei Ärzten durch falsch-

negative Ergebnisse die Aufmerksamkeit sinkt. So könnte sich die Diagnose

verzögern, wenn sich ein Kind mit typischen CF-Symptomen vorstellt und ein falsch-

negatives Screening hat. 117

Es ist auch zu berücksichtigen, dass es für die betroffenen Familien schwerer sein

kann, eine Diagnose zu akzeptieren, die durch ein Neugeborenen-Screening gestellt

wurde, als im Falle einer Krankheit, die bereits offensichtliche klinische Symptome

zeigt. 120

Weiterhin werden durch ein Screening nicht erkrankte heterozygote Neugeborene

identifiziert. Für diese Fälle muss ein klares Vorgehen geplant sein. Für den

Betroffenen ist nicht von einer Beeinflussung seiner Gesundheit auszugehen, für sein

reproduktives Verhalten und das der Eltern mag es jedoch von Bedeutung sein. Teilt

man den Eltern also das Ergebnis mit, ist eine sehr sorgfältige Information wichtig.

Carrier einer CFTR-Mutation zeigen laut Parsons et al. keine veränderte Beziehung zu

ihren Familien. Es besteht keine vermehrte Ängstlichkeit der Eltern oder verminderte

Lebensqualität. Einige Familien empfinden allerdings Angst, wenn sie nicht

ausreichend genetisch beraten werden und im Ungewissen über die Folgen der

Heterozygotie des Neugeborenen gelassen werden. 173

Ein Neugeborenenscreening auf CF identifiziert auch asymptomatische Patienten und

solche mit einer milden Symptomatik, welche eine gute Prognose haben. 131

Zum Zeitpunkt eines Neugeborenscreenings ist noch nicht absehbar, ob sich eine

behandlungsbedürftige Erkrankung entwickelt. So ist es später u.U. schwierig zu

beurteilen, ob es sich bei einer milden Symptomatik um das Ergebnis einer

54

erfolgreichen Therapie oder den natürlichen Verlauf handelt. Auch ist es schwer, die

ohnehin durch verbesserte Therapiemöglichkeiten gesteigerte Lebenserwartung von

den Erfolgen eingeführter Screening-Maßnahmen zu trennen. 57, 97

Die Ergebnisse vieler Studien zum klinischen Vorteil einer frühen Diagnose der

Mukoviszidose sind vorsichtig zu bewerten. Es werden häufig ungescreente

Populationen aus der Vergangenheit mit derzeit gescreenten Patienten verglichen.

Hierbei muss beachtet werden, dass sich die Therapie und damit das Überleben der

Patienten über die Jahre deutlich gebessert hat.

Andere Studien betrachten zeitgleich gescreente und ungescreente Populationen in

verschiedenen Regionen, wobei wiederum Unterschiede in der Prävalenz und

genutzten Therapiemöglichkeiten das Outcome verändern können. 56

Die wohl aussagekräftigste Methode besteht in einer randomisierten Verteilung einer

Population in eine gescreente und eine ungescreente Gruppe, indem das Screening

alternierend durchgeführt und für eine bestimmte Zeit ausgesetzt wird. Die Therapie-

Protokolle müssen in beiden Gruppen übereinstimmen. So war z.B. das „Wisconsin

Cystic Fibrosis Neonatal Screening Project“ konzipiert, welches als randomisierte

kontrollierte Studie eingeführt wurde. Nachdem sich 1994 allerdings zeigte, dass

gescreente Patienten besser gediehen, wurde die Randomisierung beendet und das

Screening für alle Neugeborenen zugänglich gemacht. 174

55

6.3 Mögliche Screeningmethoden

Denkbar für ein Neugeborenenscreening auf CF in Deutschland wären verschiedene

Methoden, welche im Weiteren erläutert werden sollen.

In dieser Arbeit wurde ein Verfahren angewendet, mit dem Proben mittels PCR in zwei

Schritten auf die F508del-Mutation untersucht werden können. Es war im Jahr 2006

zum damaligen Stand der Wissenschaft denkbar, dies möglicherweise anschließend

an eine IRT-Testung im Rahmen eines Screnningprogrammes zu verwenden.

Für die Durchführung der PCR wurden laborübliche Microwell Platten für 96 Proben

genutzt. Abzüglich einer Positiv- und Negativkontrolle können also 94 Proben

zeitgleich untersucht werden. Verwendet man einen Pool von 5 Proben pro well, steigt

die Anzahl auf 470 Proben. Die Dauer für die Fertigstellung der Ansätze, die zwei

benötigten PCR-Reaktionen sowie die Gelelektrophorese und Auswertung beträgt

mindestens sieben Stunden. Somit können in etwa acht Stunden 470 Proben von

einer geschulten Laborkraft mit recht einfacher technischer Ausstattung untersucht

werden.

Die Suche allein nach der F508del-Mutation ist relativ einfach. Die Hinzunahme

weiterer Mutationen in die DNA-Analyse ist mit einem erheblich gesteigerten

technischen und zeitlichen Aufwand verbunden. Die Sensitivität wird von 94% für die

IRT/F508del-Methode auf ca. 99% bei 25 untersuchten Mutationen erhöht. 122

Der Grund für die geringe Erhöhung der Sensitivität liegt in der großen Heterogenität

der CF-Allele. Neben der F508del-Mutation zeigen weltweit nur fünf weitere

Mutationen eine Häufigkeit von mehr als 1%. 175

Empfehlungen zur Durchführung einer molekulargenetischen Diagnostik der CF in

Europa sehen vor, dass ein Mutationspanel alle CF-verursachenden Mutationen mit

einer Häufigkeit von mehr als 1% in der lokalen Population einschließen sollte. 176

In Deutschland gibt es neben der F508del-Mutation fünf Mutationen (R553X, N1303K,

G542X, R347P und CFTRdele2,3), welche mehr als 1% der CFTR-Mutationen

ausmachen. 17

Bei bereits eingesetzten Screeningprogrammen wird meist eine kombinierte Testung

vorgenommen:

56

a)

Mit zwei IRT-Bestimmungen lässt sich die Zahl der falsch-positiven Befunde im

Vergleich zu einer einmaligen Messung von etwa 0,2% auf 0,03% reduzieren. 28

Dies bedeutet allerdings eine erneute Blutentnahme, zudem vergeht einige Zeit bis zur

Diagnose, was eine hohe psychische Belastung für die Familien bedeutet. Wird im

Alter von 4-6 Wochen erneut ein erhöhter Trypsinogen-Wert gemessen, erfolgt zur

Sicherung bzw. zum Ausschluss der Diagnose ein Schweißtest. 117

b)

Eine andere mögliche Form eines Screenings ist der Nachweis einer erhöhten IRT-

Konzentration in Kombination mit einem Gentest auf eine oder mehrere CF-assoziierte

Mutationen. Hiermit erhöht sich die Spezifität. Die Anzahl der falsch-positiven Befunde

und somit der nötigen Schweißteste sinkt, die Re-Test Rate fällt von 500 auf 37 pro

100.000 im Vergleich zur IRT/IRT Methode, wenn nur nach der F508del-Mutation

gesucht wird. Schließt man die 20 häufigsten Mutationen in die Untersuchung ein,

reduziert sich die Zahl auf 24 pro 100.000. 28, 149

Das Kind muss bei einem initial erhöhten IRT-Wert nicht erneut einbestellt werden,

sondern es lässt sich direkt nach der Bestimmung des IRT-Wertes aus der

entnommenen Blutprobe oder mittels der Guthrie-Karte eine Gen-Analyse

durchführen. 127

Aufgrund der großen Anzahl von CFTR-Mutationen können in einem

Screeningverfahren nicht alle möglichen Mutationen erkannt werden, insbesondere in

Populationen mit Menschen verschiedener ethnischer Herkunft. Ein Standard-

Mutationspanel muss möglichst viele Mutationen aus der jeweiligen Population

erkennen und dennoch praktikabel und bezahlbar sein. In europäischen

Screeningprotokollen werden im Median 31 Mutationen untersucht. 17, 127

Es sind Fälle von falsch-positiven Ergebnissen beschrieben, bei denen seltene

Mutationen, die nicht zum üblichen amerikanischen bzw. westeuropäischen

Mutationspanel gehören wie die Compound-Genotypen (F508del/Val520Phe und

F508del/Gln493X) eine falsche Homozygotie für F508del aufzeigen. Beide Mutationen

verhindern die Bindung des Primers an das Wildtypallel an der Position der F508del-

Mutation.

57

Es ist derzeit nicht möglich, solche Interferenzen zu vermeiden. Es müsste dazu die

ethnische und geographische Herkunft jedes Patienten und seiner Familie genau

erforscht werden und alle infrage kommenden Mutationen in die Genanalyse

eingeschlossen werden. 177

Für die Detektion von CFTR-Mutationen in Europa besteht eine Qualitätskontrolle. 178

Es ist fraglich, ob die Hinzunahme von Mutationen der Klasse IV, V und VI in ein CF-

Neugeborenenscreening Patienten einen Vorteil oder gar einen Nachteil durch

unnötige Diagnostik und Therapien verschafft. Hierdurch kann eine Identifizierung von

zwei weiteren CF-Patienten, die eine asymptomatische oder milde Verlaufsform

zeigen, in 100.000 Neugeborenen erreicht werden. Es gilt abzuwägen, ob dies die

zusätzlich entstehenden Kosten rechtfertigt. 179, 180

Bei Vorliegen nur einer Mutation in Kombination mit einem negativen Schweißtest

werden heterozygote CFTR-Mutationsträger identifiziert. In diesen Fällen lässt sich

eine Heterozygotie eines Elternteils ableiten. Hier ist dann eine genetische Beratung

hinsichtlich der CF-Risiken bei einer erneuten Schwangerschaft angeraten. Etwa 12%

der gesunden Carrier einer CFTR-Mutation haben einen erhöhten IRT-Test. 181

Das Verhältnis der entdeckten Carrier zu erkrankten Neugeborenen liegt laut Rock et

al. bei einem IRT / 25 Mutationen-Test bei 9,5:1, für einen Test auf Galaktosämie bei

31:1, beim Hypothyreoidismus bei 9:1. 122

Ein sogenanntes „failsafe“-Protokoll sieht in manchen Screeningprogrammen vor,

dass Neugeborene mit einem initial stark erhöhten IRT-Wert und keiner detektierten

CFTR-Mutation dennoch einen Schweißtest erhalten. So wird die Sensitivität und

Spezifität des Tests und somit die Erkennungsrate der Krankheit in solchen

ethnischen Gruppen erhöht, in denen viele Mutationen nicht in den angewandten

Mutationspanels repräsentiert sind. Je homogener eine Population in Bezug auf die

Vielfalt der Mutationen ist, desto kleinere Mutationspanels sind nötig. Es kann durch

Hinzunahme mehrerer Mutationen und des „failsafe“-Protokolls in das Screening zu

einer Erhöhung der Prävalenz kommen. Der Grund hierfür liegt in der Chance,

Patienten mit nur einer oder keiner bisher bekannten Mutation zu identifizieren. 138, 148

58

c)

Desweiteren besteht auch die Möglichkeit der Testung von IRT und einem anderen

Pankreasenzym, dem PAP (pancreatitis-associated protein). Dieser biochemische

Marker zeigt eine akut entzündliche Pankreaserkrankung an. Auch hierbei ist keine

zweite Blutabnahme erforderlich. Diese Methode ist bei gleicher Sensitivität

kostengünstiger als die IRT/DNA-Methode und vermeidet die Detektion gesunder

Carrier und Borderline-Formen. 9, 182

Die Rate der nötigen Konfirmationsuntersuchungen mit Neueinbestellung der Kinder

und Beratung der Familien verdoppelt sich allerdings gegenüber dem IRT/DNA-

Protokoll. In Regionen mit einem hohen Anteil Neugeborener aus Migrantenfamilien,

die eine von der Population des Einwanderungslandes abweichende

Mutationsverteilung aufweisen, kann PAP als Zweitmarker der notwendigerweise

eingeschränkten Mutationsanalyse überlegen sein. 102

Protokoll Vorteile Nachteile a) IRT/IRT

– Keine unerwünschte Detektion von Heterozygoten und Patienten mit milden Mutationen – Kostengünstigstes Screeningprotokoll – Akzeptable Rate der nötigen Konfirmationsuntersuchungen

– Erneute Blutentnahme und 2. IRT-Bestimmung in der 4.–6. Lebenswoche – Erhöhte psychische Belastung der Eltern – Diagnostische Sensitivität: 89–95% – Verminderte Compliance für Zweitprobe

b) IRT/DNA

– Zweituntersuchung ohne erneute Blutentnahme – Diagnostische Sensitivität: 96–99% – Behandlung bei Homozygotie bzw. Compound-Heterozygotie oft in ersten 3 Wochen beginnend – Direkte Anbindung an spezialisierte CF-Ambulanz, frühe Arzt-Patienten-Bindung – Höchster positiver Vorhersagewert

– Indirektes Heterozygotenscreening – Auswirkung auf das Reproduktionsverhalten möglich – Vermehrter Nachweis atypischer CF-Erkrankungen – Erhöhter Aufwand durch notwendige Information der Eltern und genetische Beratung – Teuerstes Screeningprotokoll (abhängig vom Mutationsumfang)

c) IRT/PAP

– Zweituntersuchung ohne erneute Blutentnahme und ohne Probensplitting im selben Labor durchführbar – Keine unerwünschte Detektion von Heterozygoten und Patienten mit milden Mutationen – Reduzierte psychische Belastung der Eltern

– Spezifität gering – Analytik noch wenig automatisiert

Abb. 16 Vor- und Nachteile verschiedener Screeningmethoden (modifiziert nach 102)

DNA = Mutationsanalytik des CFTR-Gens IRT = immunreaktives Trypsinogen PAP = pankreatitisassoziiertes Protein

59

d)

Neben den bereits erwähnten Methoden ist die CFTR-Mutationsanalyse nach

auffälligem IRT/PAP-Screening eine weitere Option ohne erneute Blutentnahme mit

Verbesserung der Spezifität bei gleichbleibender Sensitivität. 102

e)

Eine weitere Möglichkeit ist die IRT/DNA/IRT-Methode. Im Gegensatz zur IRT/IRT-

Methode wird die Anzahl der nötigen Schweißteste hierbei um 80% reduziert. 110, 183

Soll eine große Anzahl von Patienten auf mehrere Mutationen getestet werden, wird

ein Programm benötigt, das präzise und kostengünstig ist, einen großen Durchlauf

ermöglicht und zumindest teilweise automatisierbar ist. 184

In der molekulargenetischen Diagnostik gibt es derzeit vielversprechende Ansätze,

welche sich in der Zukunft auch für Screeningzwecke eignen können. Hierbei werden

grundsätzlich zwei Methoden unterschieden, solche die nach bekannten Mutationen

suchen und „Scanningmethoden“, welche Abweichungen von der Standardsequenz

erkennen.

Bei der Mutationssuche ist laut den „Leitlinien zur Molekulargenetischen Diagnostik

der Cystischen Fibrose“ der Deutschen Gesellschaft für Humangenetik aus dem Jahr

2009 eine Stufendiagnostik sinnvoll.

Inzwischen ist bei der simultanen Testung mehrerer CFTR-Mutationen der Gebrauch

von kommerziell erhältlichen Diagnostik-Kits üblich, womit alle Mutationen mit einer

Häufigkeit von mindestens 1% erfasst werden und eine Detektionsrate von mehr als

85% erreicht werden kann. In Deutschland wird hierfür häufig der Oligonukleotid-

Ligation-Assay (OLA) eingesetzt, anhand dessen in etwa 2 Tagen eine DNA-Probe auf

31 Mutationen untersucht werden kann (Kosten 56€ + 5€ für DNA-Präparation). 185, 186

Gelegentlich ist eine weiterführende Suche nach solchen Mutationen, die nicht

routinemäßig untersucht werden oder noch nicht bekannt sind nötig. Hier sind

mögliche Methoden die „multiplex ligation dependent probe amplification“ (MLPA), die

„quantitative flourescent multiplex PCR“ oder eine Sequenzierung des gesamten

CFTR-Gens. 176

60

Vermutlich werden Sequenzanalysen in Zukunft noch besser automatisierbar,

schneller und günstiger, so dass sie Untersuchungen vieler Proben in kurzer Zeit

ermöglichen und im Rahmen eines Screenings eingesetzt werden könnten.

Auch wenn es regional unterschiedliche Vorgehensweisen bei der Realisierung des

CF-Neugeborenenscreenings gibt, eine endgültige Diagnose erfolgt immer über den

Schweißtest, der weiterhin als Goldstandard gilt.

Eine große Herausforderung des CF-Neugeborenenscreenings sind unklare Befunde

wie persistierende Hypertrypsinämie und ein Schweißtest mit 30-59mmol/l Chlorid

oder zwei entdeckte CFTR-Gen-Mutationen in Kombination mit einem normalen

Schweißtest. Für das Vorgehen in diesen Fällen ist 2009 in Europa ein Konsens

gefunden worden. Zunächst muss der Schweißtest wiederholt werden. Ist der Befund

weiterhin nicht eindeutig, sollten weitergehende Untersuchungen wie eine

umfangreiche Genanalyse und klinische Einschätzung inklusive einer

Röntgenuntersuchung des Thorax stattfinden. Weisen diese Anhaltspunkte auf die

Diagnose CF hin, sind regelmäßige Kontrolluntersuchungen in spezialisierten Zentren

notwendig. Gibt es keinen klinischen Hinweis auf eine CF sollten die Kinder nach 6-12

Monaten erneut einem Spezialisten vorgestellt werden und es sollte ein weiterer

Schweißtest durchgeführt werden. 187

61

6.3.1 Präkonzeptionelle / Pränatale Diagnostik

Eine pränatale Diagnostik in Form einer genetischen Testung der Eltern und einer

fetalen Untersuchung via Amniozentese oder Chorionzottenbiopsie sollte bei

bekannter Heterozygotie beider Elternteile oder bekannter Homozygotie eines

Elternteils sowie bei einem Feten mit auffallend echogenem Darm durchgeführt

werden. 185

Sind beide Partner als Carrier identifiziert, besteht formalgenetisch ein Risiko von

25%, dass das Kind an Mukoviszidose erkrankt. 188

Ein Carrier-Screening mit eingehender Beratung Betroffener kann helfen, die Inzidenz

der Mukoviszidose zu reduzieren. Es ist möglich, erst einen Partner zu testen und nur

im Falle eines positiven Ergebnisses den anderen Partner oder zeitgleich beide

Partner zu testen. Die erste Methode ist kosteneffektiver, benötigt aber mehr Zeit. 75, 189

Für die kaukasische Bevölkerung in Nordeuropa wird eine gleichzeitige Testung beider

Elternteile empfohlen, da die Frequenz der Merkmalsträger recht hoch ist. 190

Der Berufsverband Medizinische Genetik e.V. lehnt ein obligatorisches Heterozygoten-

Screnning auf CF z.B. als Bestandteil der Schwangerschafts-Routine-

Vorsorgeuntersuchungen ab, empfiehlt aber ein Testangebot bei positiver

Familienanamnese. 191

In Deutschland wird im Verein Mukoviszidose e.V. über die Nutzung der

Präimplantationsdiagnostik (PID) für die CF diskutiert. Die PID soll Paaren ermöglicht

werden, die eine Anlage für eine schwere Erbkrankheit in sich tragen. 192, 193

62

6.4 Kosten

Die jährlichen Ausgaben für einen CF-Patienten belaufen sich in Deutschland auf

durchschnittlich 23.989€, davon werden 47% auf die häusliche Medikation, wie

inhalative Antibiotika und Pankreasenzyme verwand. Die Kosten steigen mit dem Alter

der Patienten und verdoppeln sich im Laufe der ersten 18 Jahre. Dies erklärt sich

durch den steigenden Verbrauch an Medikamenten und die vermehrt nötigen und

länger andauernden Krankenhausaufenthalte. Der Anstieg der Therapiekosten steht in

einem direkten Zusammenhang mit dem Fortschreiten der Lungenerkrankung. Der

Prozentsatz der Patienten mit Pseudomonas aeruginosa Kolonisation nimmt mit dem

Alter zu. Die jährlichen Kosten eines chronisch mit Pseudomonas aeruginosa

besiedelten Patienten sind dreimal höher als die eines Patienten ohne Kolonisation

(36.421€ zu 10.861€). Könnten verbesserte Präventions- und Therapiemöglichkeiten

die Infektion mit Pseudomonas aeruginosa um ein Jahr verzögern, würden sich die

Kosten pro Patient um mehr als 25.000€ reduzieren. Insgesamt betragen die Kosten

für die Therapie in den ersten 18 Lebensjahren durchschnittlich 252.023€. Die Kosten

für alle CF-Patienten belaufen sich bundesweit pro Jahr auf etwa 105 Millionen €. 194

Die jährlichen Therapiekosten für einen Patienten, der durch ein

Neugeborenenscreening diagnostiziert wurde, belaufen sich laut Sims et al. in

Schottland durchschnittlich auf US$ 7.228, für einen klinisch diagnostizierten Patienten

auf US$ 12.008. Diese Mehrkosten sind vor allem auf den erhöhten Verbrauch

intravenöser Antibiotika zurückzuführen. Sims et al. nennen Screeningkosten für eine

31 Mutationen-Analyse von $ 4,44 pro Neugeborenem. Pro Jahr betragen die Kosten

für das Neugeborenenscreening in Schottland $ 227.808. Im Median können dadurch

Kosten von $ 1.001.326 gespart und somit die Ausgaben für das Screening mehr als

ausgleichen werden. 195, 196

Die Kosten bis zu einer klinischen Diagnose eines CF-Patienten betragen in den

Niederlanden durchschnittlich 9.096€. Die lebenslangen Kosten für die Versorgung

werden auf durchschnittlich 406.266€ veranschlagt. Bei einem durch ein Screening

diagnostizierten Patienten liegen die Kosten für die lebenslange Versorgung 10%

niedriger als bei den Patienten, die klinisch diagnostiziert wurden. Kosten für pränatale

Diagnostik und Schwangerschaftsabbrüche belaufen sich auf 26.500 bzw. 1.900€ im

63

Jahr, so van den Akker, als Resultat daraus fiele jedoch die Geburtenrate von CF-

Patienten. Bei Kosten eines CF-Neugeborenenscreenings von insgesamt etwa

320.000 bis 540.000€ pro Jahr, abhängig von der angewandten Screeningmethode,

könnten ca. 1,8 Millionen € eingespart werden. 197

Simpson et al. nennen Kosten von £ 5,39 pro durch ein Screening diagnostiziertem

Neugeborenen und £ 936 pro klinisch diagnostiziertem Fall. 165

Laut Rock et al. betragen die Kosten für eine Probe einer IRT/F508del-Analyse in

Wisconsin etwa $ 2,27, für die Untersuchung von 25 Mutationen $ 3,55. Damit

entsprechen die Laborkosten pro Neugeborenem für ein CF-Screening etwa denen

eines Screenings auf Phenylketonurie mit $ 3,64 und Hypothyreoidismus mit $ 4,42. 122

Lee et al. und Rosenberg et al. veranschlagen $ 2,66 bzw. $ 2,77 pro Fall für ein

IRT/F508del-Mutation Screening. 198, 199

Scotet et al. berechneten im Jahr 2000 die Kosten der IRT/F508del-Methode mit $

2,32 pro gescreentem Kind. 175

Eine genetische Beratung verursachte laut Konialis et al. im Jahr 2007 Kosten in Höhe

von etwa 50€, eine Chorionzottenbiopsie etwa 200€. 200

Laut Berechnungen unseres Labors aus dem Jahr 2008 wurden die Kosten für eine

PCR mit rund 5€ veranschlagt. Eingeschlossen sind hierbei Material für PCR,

Gelelektrophorese und Fotoauswertung. 201

Vermutlich lassen sich die Kosten eines genetischen Screenings in Zukunft durch

weiterentwickelte Technologien stetig senken. 180

64

7. Konklusion

Zahlreiche Studien belegen die große Bedeutung des Beginns therapeutischer

Interventionen bei CF-Patienten bereits in den ersten Lebensmonaten. Beste

Voraussetzungen hierfür wären durch ein bundesweites Neugeborenenscreening

geschaffen, es wäre also sinnvoll die CF in das bestehende Screeningprotokoll in

Deutschland aufzunehmen.

Folgende Ansprüche an ein Neugeborenenscreening auf CF müssen grundsätzlich

gewährleistet sein:

1. hohe Sensitivität der Methode

2. möglichst geringer Eingriff in das Leben gesunder Kinder und ihrer Familien

3. Akzeptanz der Bevölkerung für die Integration der CF in bestehende

Screeningprogramme

4. Unterstützung durch niedergelassene Kinderärzte, die mit dem

Screeningergebnis und den ängstlichen Eltern umgehen müssen

5. Regelung des Vorgehens für heterozygote Merkmalsträger. 202

In Deutschland wurden im Jahr 2010 laut Statistischem Bundesamt 677.947

Lebendgeburten verzeichnet, davon 14.386 Kinder in Mecklenburg-Vorpommern. 203, 204

Die Screeningrate beträgt in diesem Bundesland laut dem zuständigen

Neugeborenenscreening-Labor 99,99%. Somit errechnet sich die Anzahl der

erforderlichen Analysen in Mecklenburg-Vorpommern exemplarisch für das Jahr 2010

auf 14.371. 201

Für ein Neugeborenenscreening auf CF wird ein Analyseverfahren mit hoher

Sensitivität und Spezifität benötigt, welches automatisierbar ist und somit schnell und

preiswert den hohen Durchlauf von Proben untersuchen kann.

Die in dieser Studie genutzte Methode ist für eine Massenanalytik zu zeitaufwendig

und teuer. Es bestünde die Möglichkeit, eine der in anderen Ländern zum Screening

eingesetzten Techniken (s. Kapitel 6.3) anzuwenden.

Wenn allerdings, wie anzunehmen, in den nächsten Jahren Sequenzanalysen des

CFTR-Gens rascher und kostengünstiger durchgeführt werden können, wäre diese

65

Methode mit höchster Sensitivität und Spezifität noch besser für ein Screening

geeignet. In den Niederlanden wurde die Sequenzierung bereits in einer prospektiven

Studie zum Screening auf CF getestet. 205

Für eine genetische Testung ist ein „informiertes Einverständnis“ der Eltern notwendig,

sie müssen über den Ablauf, Inhalt und Sinn des Screenings aufgeklärt werden. Es ist

wichtig zu erfassen, wie viele Informationen die Eltern zum Neugeborenenscreening

und den gescreenten Krankheiten wünschen und ob ein Verständnis für den

Sachverhalt gegeben ist, um sie nicht zu verunsichern und Ängste zu schüren. 120

Als Goldstandard zur Diagnosesicherung sollte weiterhin der Schweißtest gelten. Die

Sensitivität muss optimiert werden, aber es sollten dabei möglichst wenig falsch-

positive Ergebnisse produziert werden. 206

Vor einer flächendeckenden Einführung eines Neugeborenenscreenings auf CF in

Deutschland muss das weitere Vorgehen nach auffälligen Befunden geregelt und die

Verfügbarkeit und Durchführung der Weiterbehandlung sichergestellt sein. Es müssen

nicht nur die analytischen Abläufe innerhalb des Screeninglabors, sondern auch die

Zusammenarbeit und Kommunikation mit den Einsendern der Screeningproben

einerseits und dem CF-Behandlungszentrum andererseits nach Prinzipien des

Qualitätsmanagements geregelt sein. 102

Der Zeitraum zwischen der Übermittlung des Screeningbefundes an die betroffenen

Familien und der Einbestellung zur weiteren Diagnostik sollte möglichst kurz sein, um

die psychische Belastung der Betroffenen zu minimieren. Die endgültige

Diagnosestellung sollte innerhalb der ersten 2 Lebensmonate erfolgen, um auch

langfristig einen Vorteil aus der frühen Diagnosestellung ziehen zu können. Ideal ist

die direkte Diagnostik in einer CF-Ambulanz, um bei pathologischem Befund direkt die

Familie beraten und weitere Schritte einleiten zu können. 19

Patienten mit CF sollten von Geburt an bis ins Erwachsenenalter regelmäßig in

spezialisierten Zentren betreut werden. Hier sollten Pädiater, Psychologen,

Sozialarbeiter, Genetiker, Mikrobiologen, Physiotherapeuten, Endokrinologen,

Radiologen, Hygieniker, Pharmakologen, spezialisierte Krankenschwestern und

Ernährungsberater interdisziplinär zusammenarbeiten. Nur durch eine optimale

66

Betreuung können die Vorteile eines Neugeborenenscreenings für die Patienten mit

CF voll ausgeschöpft werden. 47, 120

Es muss auch weiterhin viel Arbeit und Geld in die Erforschung besserer

diagnostischer Verfahren und neuer Therapien investiert und einheitliche Richtlinien

geschaffen werden. Die Therapieansätze der CF-Zentren sind derzeit unterschiedlich

und schwer zu vergleichen. Die Erfassung aller erhobenen Daten der verschiedenen

Zentren erlaubt eine Evaluierung und Optimierung der Methoden und Protokolle. Die

Direktoren aller CF-Zentren sollten in Zusammenarbeit mit den Verantwortlichen des

Neugeborenenscreenings gemeinsame Richtlinien festlegen über die zu

verwendenden Screening-Algorithmen, die Auswertung und Nachbereitung. Ihre

Aufgabe sollte es auch sein, die Kapazitäten der Laboratorien und Mitarbeiter zu

prüfen, um die hohe Anzahl diagnostischer Tests und genetischer Beratungen

gewährleisten zu können. 179, 207

67

8. Zusammenfassung

Im Rahmen dieser Arbeit wurden 1530 DNA-Proben einer Neugeborenenkohorte aus

Ostvorpommern auf die F508del-Mutation untersucht. Der Nachweis erfolgte in zwei

Schritten, jeweils mittels einer PCR. Diese Reaktionen können auch mit getrockneten

Blutproben aus dem Neugeborenenscreening (Guthrie-Karten) durchgeführt werden.

Es fanden sich 32 Heterozygote für die F508del-Mutation. Unter Berücksichtigung der

Verteilung der CF-Chromosomen und mit Hilfe des Hardy-Weinberg-Gleichgewichtes

ließ sich eine Inzidenz der CF in Ostvorpommern von 1:4.216 errechnen. Dieses

Ergebnis ist niedriger als die bisher für Deutschland angenommene Inzidenz, der

Grund dafür liegt vermutlich in einem anderen Genpool.

Die hier angewandte Methode eignet sich prinzipiell zur Verwendung im Rahmen

eines Neugeborenenscreenings auf CF in Deutschland. Es stehen jedoch inzwischen

deutlich verbesserte, schnellere und günstigere Methoden zur Verfügung.

Anhand der Sequenzierung des CFTR-Gens werden vermutlich in absehbarer Zukunft

DNA-Proben sicher, effektiv und preiswert auf CF zu untersuchen sein, so könnte

diese Methode im Rahmen eines Screenings angewandt werden.

Ein Neugeborenenscreening auf Mukoviszidose ermöglicht einen frühestmöglichen

Therapiebeginn und damit eine bessere Lebensqualität und längere Lebensdauer der

Patienten. Der Behandlungs- und Pflegeaufwand wird verringert, die Patienten fallen

durch seltenere Krankenhausaufenthalte weniger im Arbeitsleben aus und die Dauer

ihrer Erwerbstätigkeit kann verlängert werden. Somit können die Kosten für ein

Screening mehr als ausgeglichen werden, die Einführung kann auch ökonomisch ein

Gewinn sein.

Desweiteren wird durch eine frühe Diagnose eine genetische Beratung der Eltern über

das Risiko bei weiteren Schwangerschaften möglich.

Ein Screening schützt auch vor Fehldiagnosen und ist zudem die einzige Möglichkeit,

alle Neugeborenen zu erfassen. Es besteht nicht die Gefahr, dass Kinder aus

sozioökonomischen, ethnischen oder geographischen Gründen erst spät oder nie

diagnostiziert werden. Gerade in Vorpommern, einem Bundesland mit einem

68

Ärztemangel in dünn besiedelten Gebieten, würden Neugeborene von einem

Screening profitieren.

Dagegen gilt es die Möglichkeit der Entdeckung eines Carrier-Status abzuwägen,

auch besteht die Gefahr falsch-negativer oder falsch-positiver Testergebnisse.

Letztendlich scheinen die Argumente, die für ein Neugeborenenscreening auf CF

sprechen, zu überwiegen.

Um dies zu etablieren und einen größtmöglichen Benefit zu erreichen ist es nötig,

klare Richtlinien zur Durchführung des Screenings sowie zur Versorgung der

Patienten zu schaffen, Labore entsprechend den Anforderungen auszustatten und

geschultes Personal zu beschäftigen.

Es liegt auf nationaler Ebene ein Antrag zur Aufnahme der Mukoviszidose als weitere

Zielkrankheit des allgemeinen Neugeborenenscreenings beim Gemeinsamen

Bundesausschuss der Krankenkassen und Ärzte vor. 102

69

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10. Danksagungen

Herrn Prof. Dr. med. J.-P. Haas möchte ich ganz herzlich für die Überlassung des

Themas, die Betreuung dieser Promotion sowie für die Durchsicht und Korrektur des

Manuskriptes danken.

Besonderer Dank gilt auch Herrn Prof. Dr. med. W. Hoffmann für die Fortführung der

Betreuung meiner Arbeit, nachdem Prof. Dr. med. J.-P. Haas im April 2009 die Leitung

des Deutschen Zentrums für Kinder- und Jugendrheumatologie in Garmisch-

Partenkirchen übernommen hatte.

Bei Herrn Dr. S. Beck bedanke ich mich für die Unterstützung bei der Durchführung

der Studie und für die zahlreichen wertvollen Anregungen bei der Bearbeitung des

Themas.

Weiterhin danke ich Frau Dr. C. Müller aus dem Forschungslabor der Kinderklinik

Greifswald für die Bereitstellung von Arbeitsplätzen und Geräten sowie ihre hilfreiche

Betreuung während der Durchführung des laborpraktischen Teils der Arbeit.

Dabei gilt mein ausdrücklicher Dank auch den MTA Frau U. Glawe und Frau K. Raber

für die Einarbeitung in die Methodik der PCR sowie ihre freundliche Unterstützung bei

Fragen und Problemen.

Ich bedanke mich ebenfalls bei den Kollegen des Institutes für Community Medicine

Greifswald, die im Rahmen der SNiP-Studie an der Erhebung der Daten und der

Probensammlung mitgewirkt haben.

Hier ist auch das Bundesministerium für Bildung und Forschung zu erwähnen. Durch

Fördermittel aus dem Programm zur Förderung der Qualität der klinischen Forschung

in den Neuen Bundesländern wurde diese Studie finanziert.

Von Herzen gilt mein Dank meinen Eltern, die mich auf meinem Weg stets mit

Unterstützung und Vertrauen begleitet haben. Ohne sie wären mein Studium und

diese Promotion nicht möglich gewesen.

Zum Schluss möchte ich meinem Mann für seine Motivation und Hilfe bei der

Erstellung dieser Arbeit danken.

aus der abteilung versorgungsepidemiologie und ...aus der abteilung neonatologie / pädiatrische...

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