BIOQUIMICA DE PROTEINAS BASES QUIMICAS DE LA ESTRUCTURA Y

PLEGADO DE PROTEINAS PROF. LUCIA CHEMES (LCHEMES@IIB.UNSAM.EDU.AR)

J.C. Kendrew, modelos de Mioglobina

BIBLIOGRAFIA

FERSHT, A. STRUCTURE AND MECHANISM IN PROTEIN SCIENCE (1999) FREEMAN PRESS, CAP 1, 11, 17 18 Y 19

BRANDEN AND TOOZE. INTRODUCTION TO PROTEIN STRUCTURE (1999) GARLAND PUBLISHING

BERG TYMOCZKO AND STRYER. BIOCHEMISTRY. EDITORIAL FREEMAN AND COMPANY

PROTEINAS

MIOGLOBINA

PROTEINAS

MIOGLOBINA

DONEC QUIS NUNC

LAS PROTEÍNAS NATURALES SON POLÍMEROS DE L -AMINOÁCIDOS

PROTEINAS

ISÓMERO L ISÓMERO D

Propiedades de aminoácidos: • Son moléculas quirales • Existen 20 variantes naturales de grupo R (cadena lateral)

PROTEINAS

TODAS LAS PROTEÍNAS TIENEN AMINOÁCIDOS L

LOS AMINOÁCIDOS ESTÁN UNIDOS POR EL ENLACE PEPTÍDICO

giro en sentido antihorario del substitutente de mayor a

menor rango

EL ENLACE PEPTÍDICO EN DETALLE QUÍMICO

• Planar • Configuración “Trans” • Carácter de doble enlace entre C-N (enlace acortado)

Simple 1.49 Aº Doble 1.27 Aº

C-N Enlace peptídico 1.33 Aº 18-21 kcal/mol

Enlace C-N

UNA CADENA POLIPEPTIDICA

PROTEINAS

DEFINICION DE ANGULOS TORSIONALES

R1

R2

R1 R2

180 TRANS

0 CIS

cadena lateral C N H O

GRAFICO DE RAMACHANDRAN

LA CONFORMACION DE LA CADENA POLIPEPTIDICA (ANGULOS TORSIONALES PHI-PSI) ES RESTRINGIDA

PROTEINAS

DISTRIBUCIÓN DE ÁNGULOS PHI PSI EN PROTEÍNAS

La gran mayoría de los ángulos Phi-Psi (un par define a cada aminoácido) caen dentro de dos grandes zonas del espacio

AMINOACIDOS CON CONFORMACIÓN ATÍPICA

GLICINA (GLY, G)

• No es quiral • Alta flexibilidad puebla zonas

“prohibidas” del Ramachandran

PROLINA (PRO, P)

AMINOACIDOS CON CONFORMACIÓN ATÍPICA

90% TRANS 10% CIS

PROTEINASALFA HELICE: 30% DE LOS RESIDUOS EN PROTEÍNAS

ALFA HELICE L. PAULING & R. COREY, 1951

ON THE NATURE OF THE CHEMICAL BOND CORNELL UNIVERSITY PRESS 1960

Experimentos de difracción de queratina

• Puentes H entre grupos carbonilo de residuo i y el grupo amida de i+4

• Estructura compacta de la cadena polipeptídica

CARACTERÍSTICAS DE ALFA HÉLICES

• Cadenas laterales apuntan hacia afuera • 3.6 residuos por vuelta, 1.5 Aº entre aminoácidos • Dipolo (Extremo C-terminal mas electronegativo)

cadena lateral C N H O

EL DIPOLO DE LA HÉLICE PROVIENE DE LA DIRECCIÓN DE LOS PUENTES HIDROGENO

C

O

N

H OXÍGENO: ACEPTOR DE HNITRÓGENO: DONOR DE H

PUENTE H

ALFA HELICES

HELICE ANFIPÁTICA

CONECTIVIDAD

HELICE HIDROFÓBICA

Ri R (i+4)

aminoácidos hidrofílicos

aminoácidos hidrofóbicos aminoácidos hidrofóbicos

aminoácidos hidrofóbicos

DOS O MAS HELICES PUEDEN FORMAR UNA ESTRUCTURA MUY ESTABLE DENOMINADA “COILED-COIL”

Miosina, tropomiosina (músculo), fibrina (coágulos) y queratina (pelo)

QUÉ FUERZAS ESTABILIZAN ESTA ESTRUCTURA?

COILED COILS

1- INTERACCIONES HIDROFÓBICAS ENTRE LOS AMINOÁCIDOS “A” Y “D” (D ES SIEMPRE LEUCINA, “A” FRECUENTEMENTE HIDROFÓBICO

2- PUENTES SALINOS ENTRE LAS POSICIONES “G” Y “E”

HOJAS BETA: ESTRUCTURAS ALTAMENTE EXTENDIDAS

• Estructura altamente extendida • 3.5 Aº entre residuos • Las cadenas laterales están orientadas cada una a 180º de la adyacente

R1

R2

R3

R4

R5

Carbonilo

Amida

VISTA LATERAL

cadena lateral C N H O

HOJA BETA ANTIPARALELA

cadena lateral C N H O

Carbonilo (aceptor)

Gr. Amido (donor)

VISTA SUPERIOR

NtCt

CtNt

LAS CADENAS R (VERDES) ENTRAN Y SALEN DEL PIZARRON

cadena lateral C N H O

CtNt

CtNt

HOJA BETA PARALELA

VISTA SUPERIOR

Carbonilo (aceptor)

Gr. Amida (donor)

LAS CADENAS R (VERDES) ENTRAN Y SALEN DEL PIZARRON

“GIROS” ESTRUCTURAS DE VARIOS TIPOS DE GIROS

• Carbonilo de residuo i (iZQ) unido a grupo amida de residuo i+3 (DER)

• En el Tipo II, X siempre es Gly (G)

ENLACE COVALENTE QUE ESTABILIZA LA ESTRUCTURA TERCIARIA DE LAS PROTEÍNAS

PUENTE DISULFURO

Enlace covalente que se forma mediante una reacción de

oxidación-reducción (REDOX)

Más común en proteínas extracelulares Puede formarse dentro de una cadena (intracatenario) o unir dos subunidades (intercatenario)

Frecuencia relativa con que se encuentran los aminoácidos en diferentes estructuras secundarias de las proteínas

Val, Ile, Thr: Aminoácidos con ramificaciones en el C beta

Desfavorecidos en alfa hélices por choques estéricos con la cadena. Se acomodan bien en hojas beta donde los R se alejan de la estructura de la hoja

Frecuencia relativa con que se encuentran los aminoácidos en diferentes estructuras secundarias de las proteínas

Ser, Asp, Asn: Aminoácidos con cadenas polares que pueden formar puentes H Desfavorecidos en alfa hélices por competir con los ptes H de cadena ppal. Son más abundantes en Giros

Pro: Tiene valor Phi fijo de ~60º: estructura restringida y no tiene NH donor de ptes H: tiende a desestabilizar tanto hélice como hoja beta Es abundante en Giros

Gly: Muy flexible, más abundante en Giros

ESTRUCTURA TERCIARIA DE PROTEÍNAS

CÓMO DEFINIMOS UN “DOMINIO” PROTEICO?

Estructura plegada de la mioglobina

ESTRUCTURAL

LO PODEMOS DEFINIR A VARIOS NIVELES

EVOLUTIVO

FUNCIONAL

UNA UNIDAD INDEPENDIENTE DE PLEGAMIENTO

UNA UNIDAD EVOLUTIVA

UN MODULO O UNIDAD FUNCIONAL

ESTRUCTURA TERCIARIA DE PROTEÍNAS

PROTEINA CD4

CONCEPTO DE DOMINIO COMO UNIDAD INDEPENDIENTE DE PLEGAMIENTO

FUERZAS MOLECULARES EN ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS(EN SISTEMAS ACUOSOS!!)

• FUERZAS ELECTROSTÁTICAS

• FUERZAS DE VAN DER WAALS

• PUENTES DE HIDRÓGENO

• EL ENLACE O “EFECTO” HIDROFÓBICO

INTERACCIONES ENTRE ÁTOMOS NO ENLAZADOS (INTERACCIONES NO COVALENTES)

QUÉ NOS DICEN LAS LEYES DE LA TERMODINÁMICA?

Segunda ley de la termodinámica: Para un proceso espontáneo, la entropía total del sistema siempre aumenta

UN PROCESO ES ESPONTANEO SI EL CAMBIO EN ENERGÍA LIBRE DE GIBBS ES MENOR A CERO

ENERGÍA LIBRE DE GIBBS

prestar atención a las MAGNITUDES de las energías de unión

FUERZAS ELECTROSTÁTICAS

FUERZA DE “LARGO” ALCANCE PORQUE LA ENERGÍA DECAE LENTAMENTE CON R (COMO 1/R PARA GRUPOS CARGADOS)

FUERZA QUE SE ESTABLECE ENTRE GRUPOS CARGADOS O DIPOLARES, TAMBIÉN LLAMADA PUENTE SALINO O UNIÓN IÓNICA

Q1

+

Q2

_

E =q1*q2D*R

R = distancia

D = constante dieléctricaD (agua) = 80

D (proteína) = 2

ENERGIAS DE UNIÓN ELECTROSTÁTICA MEDIDAS EN PROTEÍNAS

Cada unión individual se encuentra en el orden de 0.2-0.5 kcal/mol

FUERZAS DE VAN DER WAALS

También llamadas fuerzas no polares o fuerzas de dispersión de LondonINTERACCIONES ESTABLECIDAS ENTRE DOS NUCLEOS ATOMICOS

Repulsión entre las nubes electrónicas de ambos

átomos a distancias cortasAtracción generada por los dipolos de ambos átomos,

que decae rápidamente con la distancia (como 1/R6)

EL PUNTO DE MÍNIMA ENERGÍA CORRESPONDE AL RADIO DE VAN DER WAALS

CORTO ALCANCE

FUERZAS DE VAN DER WAALS

Cada unión individual se encuentra en el orden de 0.1-0.3 kcal/mol pero la sumatoria de interacciones de todos los átomos puede volverse grande

PUENTES DE HIDRÓGENO

ÁTOMO ACEPTOR

ÁTOMO DONOR

3.13.04 2.932.72.63 2.88Distancia (Amstrong)

UN TIPO DE ENLACE MUY IMPORTANTE EN SISTEMAS BIOLÓGICOS

Enlace covalente

menor a Van der Waals

DISTANCIA

NO covalente entre dos átomos electronegativos

• Un hidrógeno es parcialmente donado a otro átomo más electronegativo • El ángulo preferido es 180º • Las energías típicas de cada enlace son de 3-9 kcal/mol

Alfa hélice y Hoja Beta

INTERACCIONES MOLECULARES EN UN AMBIENTE ACUOSO

Las energías medidas en solución son aquellas determinadas por las interacciones entre moléculas en competencia con el agua

Los reactivos se unen entre sí, desplazando al agua asociada a ellos. Esto está acompañado por cambios importantes en la entropía del solvente (AGUA)

Grupo en N-Octanol

ENERGIAS DE TRANSFERENCIA DE GRUPOS QUIMICOS DE UN AMBIENTE APOLAR (N-OCTANOL) A UN AMBIENTE POLAR (AGUA)

Grupos alifáticos prefieren estar en un solvente no polar

Grupo en Agua

△G > 0 desfavorable

△G < 0 favorable

Grupos polares prefieren estar en un solvente polar

Bases moleculares del “Efecto Hidrofóbico”Interacción ligando-enzima Coalescencia de lípidos

La interacción entre moléculas no polares “libera” moléculas de agua al solvente, aumentando la entropía total del sistema

Agua en el solventeLos puentes Hidrógeno entre moléculas se rompen y reforman en forma dinámica

Entropía de agua

Agua en torno a las moléculas hidrofóbicas

s e e n c u e n t r a n ordenadas en torno a la molécula apolar

Entropía de agua

Una de las principales fuerzas que determina el plegamiento de las proteínas es el “EFECTO HIDROFÓBICO”

Aminoácidos hidrofóbicos nuclean agua “ordenada”

Proteína “desplegada” en agua

Plegamiento

Proteína “plegada” en agua

△G < 0 favorable

Aminoácidos hidrofóbicos interactúan entre sí y liberan agua “desordenada”

20-25 cal/mol/A2

LAS PROTEÍNAS PLEGADAS SE CARACTERIZAN

VISTA SUPERFICIAL CORTE TRANSVERSAL

MIOGLOBINA

POR UN CENTRO RICO EN AMINOÁCIDOS HIDROFÓBICOS

AA cargados AA hidrofóbicos AA polares

PROTEINAS

ESTRUCTURA CUATERNARIA DE PROTEÍNAS

COMBINACIONES DE SUBUNIDADES: UN DÍMERO PROTEINA CRO DE BACTERIOFAGO LAMBDA

PROTEINASESTRUCTURA CUATERNARIA DE PROTEÍNAS

COMBINACIONES DE SUBUNIDADES: LO MAS GRANDE?EL RIBOSOMA, EL PORO NUCLEAR

EL TETRÁMERO ALFA2/BETA2 DE HEMOGLOBINA

“AGENTES DESNATURALIZANTES”

CLORURO DE GUANIDINIO [Gdm:Cl] UREA

Son buenos solventes de las cadenas laterales y por ende estabilizan el estado desplegado de las proteínas

LA ESTRUCTURA NATIVA PUEDE SER DESNATURALIZADA POR AGENTES QUÍMICOS

Plegamiento (En agua)

Desplegamiento (En Gdm:Cl o Urea)

PROTEINA PLEGADAPROTEINA DESPLEGADA

DÓNDE ESTÁ CODIFICADA LA INFORMACIÓN PARA PLEGAR UNA PROTEÍNA?

EL EXPERIMENTO CENTRAL DE ANFINSEN, 1962

RNASA

Nativa, catalíticamente activa degrada RNA

4 Puentes Disulfuro

UREA MERCAPTOETANOL

RNASA

Desplegada, inactiva

Cisteínas reducidas

TODA LA INFORMACIÓN NECESARIA PARA PLEGAR ESTA PROTEÍNA ESTABA CODIFICADA

GENÉTICAMENTE EN SU SECUENCIA

RNASA

Desplegada, inactiva

Cisteínas reducidas

DIALISIS REMOVIO LENTAMENTE UREA y MERCAPTOETANOL

RNASA

Replegada Nativa Catalíticamente activa Puentes S-S correctos

ESTRUCTURA PLEGADA DE LA RIBONUCLEASA

SIN EMBARGO….LA RELACIÓN SECUENCIA -ESTRUCTURA, ES UNÍVOCA?

…VDLLKN…

🧐 NO !! La conformación que adquiere una secuencia depende a su vez del contexto estructural

EVOLUCIÓN MODULAR DE PROTEÍNAS

EL UNIVERSO DE DOMINIOS ES LIMITADO

CONCEPTO DE DOMINIO COMO UNIDAD EVOLUTIVA

EXISTE UNA CANTIDAD LIMITADA DE MOTIVOS ESTRUCTURALES

“BETA HAIRPIN”

FORMADOS POR ELEMENTOS PROXIMOS EN LA SECUENCIA PRIMARIA

“GREEK KEY”

VENENO DE SERPIENTE ERABUTOXIN

STAPHYLOCOCUS NUCLEASE

“HELIX -LOOP-HELIX”

EXISTE UNA CANTIDAD LIMITADA DE MOTIVOS ESTRUCTURALESMOTIVOS ESTRUCTURALES

PROTEINAS DE UNION A ADN FACTORES DE TRANSCRIPCION

PROTEINAS DE UNION A CA2+

CALMODULINA

LOS DOMINIOS SE FORMAN POR COMBINACION DE MOTIVOS

MOTIVO BETA -ALFA -BETA -ALFA EN LA TRIOSA FOSFATO ISOMERASA

LAS PROTEÍNAS SON MODULARESY SE FORMAN POR COMBINACIONES DE DOMINIOS

DOMINIO “EGF” 53 AA

DOMINIO “SERIN PROTEASA” 245 AA

DOMINIO “KRINGLE” 85 AA

DOMINIO “UNION A CA2+”

COMO SE GENERO LA DIVERSIDAD DE DOMINIOS?

SE ESTIMA QUE EXISTEN ~1000 TIPOS DE SUPERFAMILIAS DE DOMINIOS

LAS DIFERENTES PROTEINAS MODULARES PUDIERON HABERSE GENERADO POR EVENTOS DE DUPLICACION Y FUSION GENICA

EN EUCARIOTAS, LA APARICION DE INTRONES PUDO HABER AMPLIFICADO LAS COMBINATORIAS DE DOMINIOS

EVOLUCIÓN DE DOMINIOS DE UNIÓN A OXIGENO

Secuencias de Hemoglobina y Mioglobina humanas

Alineamiento23% IDENTIDAD

NARANJA: posiciones idénticas AMARILLO: sustituciones conservativas

LA ESTRUCTURA SE CONSERVA MAS QUE LA SECUENCIA

IDENTIDAD 15.6%

IDENTIDAD 23%

Una vez que un nuevo dominio funcional aparece, su estructura se conserva más que su secuencia. Esto indica que existe una alta presión selectiva sobre la estructura

Hemoglobina humana (sangre)

Mioglobina humana (músculo)

Leghemoglobina Plantas

ESTO SE CUMPLE PARA MUCHOS DOMINIOS CONOCIDOS

Proteínas de secuencia muy divergente presentan poca variación estructural

CHOTHIA & LESK, 1986

EVOLUCION DIVERGENTE

LA MISMA FUNCIÓN PUEDE ENCONTRARSE EN PROTEÍNAS CON PLEGAMIENTOS COMPLETAMENTE DIFERENTES

EVOLUCION CONVERGENTE EN PROTEASAS

SITIO ACTIVO

QUIMOTRIPSINA SUBTILISINA

TODAS LAS REGIONES DE LAS PROTEÍNAS SE PLIEGAN PARA FORMAR DOMINIOS?

NO!!

PROTEINAS “INTRINSECAMENTE DESORDENADAS” (IDPS) O “NATIVAMENTE DESPLEGADAS”

p53 tumor suppressor

Wells et al. PNAS 2008; 105: 5762

TAD DBD TD RD

disordered ordered disordered

NO ADQUIEREN ESTRUCTURA TERCIARIA ESTABLE

~30% DEL PROTEOMA EN EUCARIOTAS

PROPIEDADES DE SECUENCIA DE IDPS

RICAS EN AMINOÁCIDOS CARGADOS Y POLARES POBRES EN AMINOÁCIDOS HIDROFÓBICOS

RICAS EN PROLINA

Charge-hydropathy plot GRÁFICO DE CARGA-HIDROPATÍA

Proteínas desordenadas

Proteínas globulares

• FUNCIONES REGULATORIAS • FACTORES DE TRANSCRIPCION • PROTEINAS VIRALES

DONDE ENCONTRAR INFORMACION SOBRE PROTEINAS?

RCSB PDB: REPOSITORIO DE ESTRUCTURAS DE PROTEINAS

UNIPROT: BASE DE DATOS DE SECUENCIAS DE PROTEINAS

PFAM: BASE DE DATOS DE DOMINOS DE PROTEINAS

https://www.uniprot.org/

https://www.rcsb.org

https://pfam.xfam.org/

PLEGAMIENTO DE LAS PROTEINASLA PARADOJA DE LEVINTHAL

CUANTAS COMBINATORIAS DEBE EXPLORAR UNA SECUENCIA PARA PODER PLEGARSE? CUANTO TIEMPO LLEVARÍA?

Proteína “desplegada”

Plegamiento

Proteína “plegada”

PLEGAMIENTO DE LAS PROTEINASLA PARADOJA DE LEVINTHAL

Para una cadena de 100 aminoácidos…. Si hay sólo 3 conformaciones para cada aminoácidoCombinaciones azarosas que deben ser exploradas 3100

Si cada transición lleva 10-13 seg (muy poco!)

5 x 1047~

5 x 1034seg 1.6 x 1027 años!

CUANTAS COMBINATORIAS DEBE EXPLORAR UNA SECUENCIA PARA PODER PLEGARSE?

CUANTO TIEMPO LLEVA HACERLO?

EL PLEGAMIENTO DE LAS PROTEÍNAS NO OCURRE POR UN PROCESO DE EXPLORACIÓN AZAROSA DEL ESPACIO DE CONFORMACIONES !!!!!!

🤔

#ni corriendo se llega…no es compatible con la vida!

ENTONCES: CÓMO OCURRE?

LA ANALOGIA DEL MONO DE SHAKESPEARE

Hacen falta 1040 combinaciones!!!! para que un mono tipee el siguiente texto de Shakespeare al azar

Peeero….si se retienen las posiciones correctas

LA ESENCIA DEL PLEGAMIENTO DE PROTEINAS ES LA RETENCION DE INTERMEDIARIOS CORRECTOS DE PLEGADO

Sólo hacen falta ~3000 tipeosal azar = 2326 COMBINACIONES

TEORIA DE PAISAJES ENERGÉTICOS ONUCHIC & WOLYNES

LA ESENCIA DEL PLEGAMIENTO DE PROTEINAS ES LA RETENCION DE INTERMEDIARIOS CORRECTOS DE PLEGADO

Arriba del embudo representa estados “desplegados” de alta entropía (muchas conformaciones)

inestable (alta energía)

Abajo del embudo representa el estado nativo de baja

entropía conformacional y más estable (baja energía)

Estados intermedios de plegado menor entropía, más interacciones

nativas