bc cn enz hoan chinh
TRANSCRIPT
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
MỤC LỤC
MUC LUC________________________________________________________1
Chương 1: GIƠI THIÊU_____________________________________________3
Chương 2: TÔNG QUAN____________________________________________4
2.1 Enzyme cellulase____________________________________________4
2.2 Aspergillus Niger ___________________________________________4
2.3 Giới thiệu cơ chất___________________________________________5
2.4 Cơ chế xúc tác______________________________________________6
2.5 Tâm hoat đông______________________________________________8
2.6 Các thông sô cân xác đinh_____________________________________9
Chương 3: QUY TRINH LÊN MEN, THU NHÂN VA TINH SACH ENZYME
CELLULASE____________________________________________________10
3.1 Sơ lươc quy trinh lên men____________________________________10
3.1.1 Môi trương nuôi cấy___________________________________11
3.1.2 Giông______________________________________________12
3.1.3 Lên men____________________________________________12
3.1.4 Các yếu tô ảnh hưởng đến sinh tổng hơp enzyme cellulase____12
3.2 Quy trinh thu nhân va tinh sach________________________________13
3.2.1 Thu nhân enzyme cellulase_____________________________13
3.2.2 Tinh sach enzyme cellulase_____________________________14
3.3 Phương pháp xác đinh hoat tinh_______________________________15
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 1
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
Chương 4: ƯNG DUNG CUA ENZYME CELLULASE TRONG SAN XUÂT NHIÊN
LIÊU SINH HOC ETHANOL________________________________________17
4.1 Giới thiệu vê nhiên liệu sinh hoc ethanol________________________17
4.2 Sơ đô sản xuất ethanol va thuyết minh quy trinh sản xuất___________20
4.2.1 Sơ đô quy trinh sản xuất________________________________20
4.2.2 Thuyết minh quy trinh_________________________________21
4.2.2.1 Tiên xử lý_____________________________________21
4.2.2.2 Thuy phân_____________________________________22
4.2.2.3 Lên men______________________________________23
4.2.2.4 Chưng cất- khử nước____________________________24
4.3 Các thông sô ky thuât cua hệ enzyme cellulase___________________24
4.4 Phương pháp xác đinh đương glucose sinh ra_____________________25
Chương 5: KÊT LUÂN_____________________________________________26
PHU LUC_______________________________________________________27
1. Phương pháp xác đinh ham lương enzyme cellulase bằng phương pháp
Bradford________________________________________________________27
2. Phương pháp xác đinh ham lương đương khử bằng phương pháp
DNS____________________________________________________________28
3. Phương pháp tinh sach enzyme cellulase bằng phương pháp sắc ki loc
gel_____________________________________________________________30
TAI LIÊU THAM KHAO___________________________________________32
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 2
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
Chương 1: GIƠI THIÊU
Enzyme cellulase la môt trong những enzyme thương mai hóa lớn nhất hiện nay
đươc sử dụng chu yếu trong công nghiệp dệt như lam mêm sơi bông, tẩy hay giữ mau,
chông kết tua…; dùng để tách chiết trong thực phẩm hay công nghiệp giấy va bôt giấy.
Thi trương cellulase dùng để tiên xử lý nguyên liệu cellulose sản xuất hang hóa
như bioethanol va các sản phẩm sinh hoc cơ bản khác trên quy mô lớn đã tăng đôt
ngôt. Vi dụ như thi trương cellulase tiêm năng đươc ước đoán trên 400 triệu USD mỗi
năm, chỉ riêng sử dụng thuy phân bắp va rơm khô va trong tương lai sẽ chiếm khoảng
33% tổng giá tri công nghiệp enzyme cua My. Sự tiêm năng cua thi trương enzyme
cellulase có vai trò quan trong cua nổi bât trong công nghiệp năng lương sinh hoc va
các sản phẩm cơ bản cua sinh hoc, la môt đông lực to lớn để phát triển công nghệ
cellulase thuy phân vách tế bao thực vât. Để phát triển công nghiệp cellulase đòi hỏi
cân phải có những đặc điểm như hiệu suất xúc tác phản ứng cơ chất cellulose cao trong
môi trương không hòa tan, tăng sự ổn đinh cua môi trương nhiệt đô cao, khi pH thay
đổi, va không bi ức chế nông đô sản phẩm cao.
Ngoai ra hệ enzyme cellulase trong Aspergillus niger cũng đươc nghiên cứu từ
lâu nhằm ứng dụng để sản xuất các chế phẩm sinh hoc nhằm phục vụ nhu câu chế biến
thực phẩm, trong nông nghiệp sử dụng dể xử lý đất nhằm tăng đô mau mỡ.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 3
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
Chương 2: TÔNG QUAN
2.1 Enzyme cellulase
Cellulase la enzyme thuôc nhóm thuy phân cellulose thanh glucose.
Enzyme cellulase đươc thu nhân từ các nguôn khác nhau:
Thực vât: trong hat ngũ côc nảy mâm như đai mach, yến mach, lúa mi mach
đen…
Đông vât: chu yếu la do các vi sinh vât sông công sinh trong ruôt cua đông vât
nhai lai hay môi
Vi sinh vât: các loai xa khuẩn, vi khuẩn, nấm sơi, nấm men…
Trong thực tế ngươi ta thương thu nhân enzyme cellulase từ vi sinh vât. Các chung vi
sinh vât thương sử dụng:
Nấm môc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus candidus,
Trichodesma reesei …
Xa khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli…
Vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacillus Subtilis, Bacillus pumilis…
Trong đó nấm môc va vi khuẩn la 2 nguôn tao cellulase chu yếu, ở mức đô it hơn
la mâm malt va hat cây.
Trong ky thuât, cellulase đươc sản xuất chu yếu từ nấm Trichodesma reesei,
Aspergillus niger va vi khuẩn Cellulomonas.
2.2 Aspergillus Niger
Aspergillus niger thuôc giới Eukaryota, lớp Eurotiomycetes, bô Eurotiales, ho
Trichocomaceae, la môt dang nấm phổ biến nhất trong chi nấm môc Aspergillus.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 4
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
Nấm Aspergillus còn goi la môc tương. Sơi nấm có vách ngăn, cuông mang bao
tử bụi phông lên ở ngon. Các chuỗi bao tử bụi từ đâu phông moc tỏa khắp moi hướng.
Bao tử bụi cua Aspergillus niger có mau đen.
Asp. niger la nguyên nhân gây bệnh môc đen ở môt sô loai thực vât nhưng lai it
có khả năng gây bệnh cho ngươi, nó chỉ có thể gây hai cho ngươi khi hit vao với môt
lương lớn, từ đó có thể gây ra các bệnh vê phổi va hô hấp, nó cũng có thể gây nhiêm
trùng tai. Nó đươc nuôi cấy trong nhiêu nganh công nghiệp như sản xuất acid citric,
acid gluconic, hoặc thu các chế phẩm enzyme amylase, cellulase, α-galactosidase.
2.3 Giới thiệu cơ chất
Enzyme cellulase có khả năng sử dụng nhiêu loai cơ chất. Ngươi ta phân ra lam
2 loai chu yếu sau:
Cơ chất tự nhiên: gôm các nguôn phụ phẩm cua các nganh nông nghiệp
như bã mia, bã ca phê, rơm ra, sơi bông, cong khoai mi, dây đâu sau thu
hoach…Chẳng han như cellulose la homopolymer mach thẳng, đươc cấu
tao khoảng vai ngan gôc glucose nôi với nhau bằng liên kết β-1,4-
glucoside. Cellulose có cấu tao sơi, cấu trúc không đông nhất gôm vùng
kết tinh va vùng vô đinh hinh. Khoảng 40 sơi liên kết lai với nhau tao
thanh liên kết microfibrin. Nhiêu sơi microfibrin tâp hơp lai thanh sơi
macrofibrin có đương kinh mặt cắt khoảng 0,5nm.
Cơ chất nhân tạo: gôm các cơ chất dùng để phân tich hoat tinh enzyme
cellulase như CMC (carboxulmethyl cellulose), HEC (hydroxyethyl
cellulose… CMC (Carboxymethylcellulose) la môt dẫn xuất cua
cellulose. Cấu trúc cua CMC dựa trên liên kết β-(1 4)-D-
glucopyranose, có thanh phân tương tự nhưng chỉ có liên kết cua phân vô
đinh va ngắn hơn so với cellulose.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 5
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
Bang: Các loai cơ chất tan va không tan dùng đêt nuôi cấy va cô đinh hoat tinh enzyme.
Cơ chất tan Cơ chất không tan
Radio-labeled cellodextrin
Dẫn xuất cellodextrin
β-methyllumbelliferul-
oligosaccharides
p-nitophenol-oligosaccharides
Cacboxymethyl cellulose (CMC),
hydroxyethyl cellulose (HEC)
Cellulose kết tinh như:
Cellulose kết tinh
Valonia cellulose
Cellulose vô đinh hinh-PASC, RAC
Cellulose nhuôm
Cellulose phát huỳnh quang
Dẫn xuất sinh mau
Trinotrophenyl-
carboxymethylcellulose (TNP-CMC)
Fluram-cellulose
2.4 Cơ chế xúc tác
Enzyme cellulase la môt phức hệ gôm nhiêu enzyme tham gia vao quá trinh
chuyển hóa cellulose.
Enzyme endogluconase (endo-1,4- β-D-glucanase (EC 3.2.1.4)) hay Cx: tên
khác la CMCase- goi tên theo cơ chất nhân tao sử dụng để xác đinh hoat tinh
cua enzyme. EG bắt đâu thuy phân cellulose trên các vi tri vô đinh hinh trên
bê mặt sơi microfibrin ở các vi tri ngẫu nhiên lam xuất hiện các đuôi khác
nhau trên phân chất vô đinh hinh, từ cellulose tao thanh các cellobiose, tiên đê
cho xúc tác cua cellobiosehydrolase trên các đâu mút cua chuỗi tự do. Điêu
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 6
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
nay cho biết ảnh hưởng cua enzyme trên phân carboxymethylcellulose va
cellulose kết tinh. Enyme endoglucanase cua nấm thương la môt monomer, có
pH hoat đông trong khoảng pH=4-5 va nhiệt đô t= 50 -70oC.
Enzyme exoglucanase (cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91)) hay C1 : sẽ cắt va
giải phóng các cellobiose từ đâu không khử (đâu mút cua chuỗi) tao thanh
trong bước đâu tiên. Exocellulase chiếm khoảng 40-70% thanh phân hệ
enzyme cellulase cua nấm, xúc tác bằng cách tao ra các câu liên kết giữa cơ
chất với enzyme. Với Exocellulase pH hoat đông từ 4-5, nhưng khoảng nhiệt
đô rông hơn so với endocellulase khoảng 37-60oC.
Enzyme β-glucanase (1,4- β - D -glucosidase(EC 3.2.1.21) ): thuy phân liên
kết β-1,4-glucoside, cắt va giải phóng glucose tự do. β –glucosidase thuy phân
cellobiose, môt sô trương hơp cellodextrin thanh glucose. Enzyme β-
glucanase cũng bi ức chế canh tranh bởi glucose, enzyme nay có pH tôi ưu
dựa vao nơi hoat đông cua nó va có nhiệt đô tôi ưu khoảng 45-75oC.
Cơ chế xúc tác của enzyme CMCase cơ chất CMC: Do cơ chất CMC chỉ có
vât chất vô đinh hinh trong phân tử nên phức hơp 3 enzyme cua cellulose chỉ
có enzyme endoglucanase hoat đông. Do đó CMC đươc dùng chu yếu để xác
đinh hoat tinh endoglucanase (Cx) nên đươc goi la CMCase.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 7
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
Hình: Sơ đồ các bước thủy phân cellulose bởi enzyme cellulase
2.5 Tâm hoạt đông
Trung tâm hoat đông cua enzyme la phân cua phân tử enzyme trực tiếp kết hơp
với cơ chất, tham gia trực tiếp trong việc tao thanh va chuyển hóa phức chất trung gian
giữa enzyme va cơ chất để tao thanh sản phẩm phản ứng. Trung tâm hoat đông bao
gôm nhiêu nhóm chức năng khác nhau cua amino acid, phân tử nước liên kết va nhiêu
khi có cả cofactor hữu cơ (coenzyme) va vô cơ.
Ở các enzyme một thành phần, trung tâm hoạt động thường bao
gồm một tổ hợp các nhóm chức năng của acid amin không tham gia
tạo thành trục chính của sợi polypeptide.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 8
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
Giữa cơ chất va trung tâm hoat đông tao thanh nhiêu tương tác yếu, do đó có thể
dê dang bi cắt đứt trong quá tr.nh phản ứng để giải phóng enzyme va sản phẩm phản
ứng.
Trung tâm hoat đông cua các enzyme có cấu trúc bâc 4 có thể nằm trên môt phân
dưới đơn vi hoặc bao gôm các nhóm chức năng thuôc các phân dưới đơn vi khác nhau.
Đôi với cellulase, tâm hoat đông la acid amin va không có cofactor cũng như
coenzyme.
2.6 Các thông sô cân xác đinh
Trong quy trinh lên men, thu nhân va tinh sach enzyme cellulase từ Asp. niger, ta
cân chú ý các thông sô đặc tinh cua enzyme như sau:
Khôi lương phân tử [Asp. niger]: 26000 Da
Chất nên: carboxymethylcellulose + H2O
Nhiệt đô cất giữ: -15oC trong khoảng thơi gian dai hoặc 4oC trong 3 ngay.
Khoảng nhiệt đô hoat đông: nhiệt đô quá cao hay quá thấp thương dê lam biến
tinh enzyme do enzyme có bản chất la protein do đó enzyme hoat đông trong khoảng
20oC – 60oC.
Nhiệt đô tôi ưu: 45 oC
Khoảng pH : pH có vai trò quan trong trong việc tao môi trương cho hoat đông
enzyme, mỗi enzyme có môt vùng hoat đông tôt nhất riêng cho minh nên khi pH thay
đổi sẽ ảnh hưởng tới đô phân ly các nhóm chức cấu trúc nên trung tâm hoat đông cua
enzym như OH, SH.. hoat đông cua hệ enzyme trong nấm môc Aspergillus niger
thương có môi trương axit: 3 – 8.
pH tôi ưu: 3.8 – 4.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 9
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
Nông đô cơ chất: cơ chất vừa có vai trò la chất cảm ứng vừa có vai trò la chất ức
chế sự sinh tổng hơp enzyme khi môi trương dinh dưỡng can kiệt.
Chất ức chế : Ag+
Chương 3: QUY TRINH LÊN MEN, THU NHÂN VA TINH SACH
ENZYME CELLULASE
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 10
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
3.1 Sơ lươc quy trinh lên men
Quy trinh lên men giông nấm môc Asp. niger thuôc dang lên men bê mặt va đươc
thực hiện theo sơ đô sau:
3.1.1 Môi trương nuôi cây
Môi trương bán rắn có các thanh phân gôm bã mia va cám mi theo tỉ lệ 4:6, đô ẩm
40 – 50%.
Sau khi trôn đêu môi trương ta cho vao các binh tam giác thể tich 250ml, sau đó
hấp khử trùng ở 121oC/30 phút.
Lam nguôi môi trương va chuẩn bi cấy giông.
3.1.2 Giông
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 11
Môi trương nuôi cấy
Lên men
Khử trùng
Giông
Chế phẩm enzyme thô
Khoáng va chất tăng trưởng (nếu có)
Canh trương
Nước + đệm
Ly tâm va tua bằng côn lanh
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
Giông Asp. niger đươc cung cấp bởi phòng thi nghiệm trương ĐH Ky thuât công
nghệ TP.HCM.
Cấy dich huyên phù tế bao vao môi trương nuôi cấy với mât đô 106 bao tử/g môi
trương.
3.1.3 Lên men
Lên men bán rắn bê mặt trong các khay.
Nuôi cấy Asp. Niger trong 2 ngay, sau đó bắt đâu thu nhân enzyme thô.
3.1.4 Các yếu tô ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme cellulase
Đô thoáng môi trường
Bã mia, cám mi tác nhân lam cho môi trương thoáng xôp, tao điêu kiện cho nấm
môc phát triển tôt. Ban đâu nấm môc sẽ tân dụng những chất dê tiêu trong môi trương
như các loai đương nhưng khi môi trương dinh dưỡng bi can kiệt thi nấm môc phải tiết
ra những enzyme để phân huy cơ chất khác thanh đương để tiếp tục tôn tai va phát
triển. Tuy nhiên, cũng tùy thuôc vao nông đô cua cơ chất nhiêu hay it ma nấm môc sẽ
tiết ra lương enzyme khác nhau.
Đô ẩm
Đô ẩm la khoảng 40 -50 %, đây la yếu tô quan trong trong môi trương. Nếu đô
ẩm quá thấp thi xảy ra hiện tương loai nước ra khỏi tế bao nấm môc va lam cho tế bao
bi chết. Điêu nay sẽ lam han chế sự sinh trưởng va phát triển cua nấm môc. Nếu đô ẩm
quá cao thi cũng không tôt cho sự sinh trưởng va phát triển.
Yếu tô khác
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 12
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
Sự tổng hơp cua enzyme còn phụ thuôc vao khả năng tiết tôi đa cua từng loai vi
sinh vât có nghĩa la nếu tăng ham lương cơ chất vươt quá môt giới han nhất đinh thi
Hoat tinh enzyme sẽ giảm do 2 nguyên nhân, thứ nhất do cơ chất tao áp lực lam
giảm quá trinh sinh tổng hơp, thứ hai do cơ chất tăng trong khi năng lực tiết tôi đa
không đổi lam hoat tinh enzyme giảm.
Khi cấy nấm môc vao môi trương, chúng sẽ không tiết ngay ra enzyme ma sẽ tiết
kiệm năng lương đến mức tôi đa va sử dụng ngay những chất dê sử dụng nhất la các
đương đơn, khoáng chất có sẵn. Sau đó chúng sẽ tiết ra enzyme tùy vao thanh phân các
chất có trong môi trương.
Nấm môc phát triển đươc chia ra thanh 4 giai đoan như sau: thich nghi, phát triển,
cân bằng va tử vong. Ở giai đoan thich nghi va phát triển, nấm môc sẽ tim cách thich
nghi va tiết ra loai enzyme nao va sô lương bao nhiêu để có thể tôn tai va phát triển.
Theo thơi gian thi lương enzyme tiết ra sẽ tăng dân va đến môt mức đô ổn đinh, sau đó
sẽ giảm đi khi môi trương Minh dưỡng can kiệt dân.
3.2 Quy trinh thu nhân va tinh sạch
3.2.1 Thu nhân enzyme cellulase
Mẫu: enzyme cellulase từ nấm môc Asp. Niger.
Cân 5g chế phẩm ezyme thô pha với nước ty lệ 1:5 (5g enzyme với 25 ml
nước), dùng đũa thuy tinh khuấy đêu trong 20 phút rôi loc qua bông .
Đem dich loc ly tâm với tôc đô 3000 vòng/phút trong vòng 10 phút.
Thu dich chiết nằm ở phia trên, bỏ phân cặn phia dưới.
- Lấy 25ml dich chiết tua bằng côn lanh 96oC ty lệ 1:3 (25ml dich : 75 ml côn).
(Không sử dụng côn ở nhiệt đô thương vi có thể lam biến tinh va giảm hoat lực cua
enzyme).
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 13
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
- Lam lanh 30 phút.
- Dich chiết đươc ly tâm lân 2 cũng ở 3000 vòng/phút trong vòng 10 phút. Sau
ly tâm thu tua phia dưới (la protein) va tách bỏ lớp dung dich phia trên. Pha dich
enzyme thu đươc trong dung dich đệm acetate pH= 5=> nhằm đảm bảo quá trinh
biến tinh cua protein không xảy ra.
3.2.2 Tinh sach enzyme cellulase
Tinh sach enzyme nay bằng sắc ký loc gel. (chuẩn bi gel xem phụ lục).
Nguyên tắc: Sắc ký loc gel la ky thuât dùng để tách những phân tử có kich
thước, trong lương phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua côt gel.
Những phân tử kich thước đu nhỏ để lot vao bên trong lỗ gel sẽ bi tri hoãn va di
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 14
Lọc qua bôngThu dich chiết
Tủa bằng cồn (1:3)
Thu cặn tủa protein
Ly tâm 3000 vòng/phút (10’)
Lam lạnh 30phút
Pha với nước (tỷ lệ 1:5)
Chế phẩm enzyme
Khuấy 20 phút
Ly tâm 3000 vòng/phút (10’)
Chế phẩm enzyme thô
Côt sắc ký
Dung dich đệm pH=5
Chế phẩm enzyme
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
chuyển châm qua côt, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoai các
hat gel nên sẽ di chuyển nhanh va đươc giải hấp (thôi) ra khỏi côt sớm hơn các
phân tử nhỏ.
3.3 Phương pháp xác đinh hoạt tinh
Cơ chất dùng để xác đinh hoat đông cua hệ enzyme cellulase la cellulose không
tan như giấy loc, bôt cellulose tinh khiết… Tuy nhiên, do lương đương khử sinh ra
không tuyến tinh với lương enzyme trong phản ứng, nghĩa la lương enzyme tăng gấp
đôi sẽ không sinh ra lương đương khử gấp đôi trong cùng thơi gian phản ứng. Do đó ta
sử dụng cơ chất la dãn xuất cua cellulose tan trong nước như CMC, hay HEC để xác
đinh hoat tinh cua CMCase.
Với các cơ chất khác như giấy loc dùng xác đinh hoat tinh enzyme exocellulose.
Đơn vi đo hoạt tinh riêng cua cellulase la CU/mg (cellulase units)
Xác đinh ham lương protein theo phương pháp Bradford:
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 15
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
Các protein khi phản ứng với xanh Coomassie (Coomassie Brilliant Blue-CBB)
sẽ hinh thanh hơp chất mau có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm, cương
đô mau ty lệ với nông đô protein trong dung dich.
Xác đinh ham lương đường khử theo phương pháp DNS:
Phương pháp dựa vao sự thuy phân cơ chất carboxymethyl cellulose bởi enzyme carboxymethyl cellulase ở pH 5.0 va 40oC. Lương đương khử sinh ra đươc cho phản ứng với acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS), mau sinh ra sau phản ứng đươc xác đinh bằng phương pháp so mau trên quang phổ kế ở bước sóng 540nm.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 16
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
Chương 4: ƯNG DUNG CUA ENZYME CELLULASE TRONG SAN
XUÂT NHIÊN LIÊU SINH HOC BIOETHANOL
4.1 Giới thiệu vê nhiên liệu sinh học ethanol
Nhiên liệu sinh hoc (Biofuel hay Agrofuel) la sản phẩm cua quá trinh lên men
ki khi từ nấm men, đây la loai chất đôt tái tao sản xuất từ nguyên liệu đông thực vât.
Xăng-Ethanol (E) thông dụng nhất hiện nay trên thế giới vi dê dang biến chế từ
đương va tinh bôt.
Tất cả thực vât quang tổng hơp đêu có thể biến chế thanh xăng sinh hoc.
Cây nông phẩm chứa đương gôm mia, cu cải đương, sorgho-đương; nông
phẩm chứa tinh bôt gôm hat ngu côc như lúa mi, lúa, bắp, sorgho…; cu như khoai
tây, khoai mi, khoai lang.
Mia có hiệu quả kinh tế nhất vi cho năng xuất thân (khoảng 170-200 t/ha ở
Brazil, 80-100 t/ha ở Úc, Việt Nam khoảng 35-50 t/ha), biến chế ethanol thẳng từ
nước ép, bả mia dùng lam năng lương chay máy ép va chưng cất ethanol. Mia sản
xuất trung binh 15,500 lit ethanol/ha/năm, va cứ 1 tấn chất khô mia sản xuất đươc
438 lit ethanol. Brazil sản xuất ethanol chinh từ mia. Sorgho-đương hiện đươc ưa
chuông hơn mia ở môt sô vùng nhiệt đới khô han, có hiệu quả kinh tế hơn mia.
Sorgho-đương canh tác ở Hoa Kỳ cho 28,500 lit ethanol/ha/vụ 4 tháng.
Ngoai ra còn có các nguôn nguyên liệu khác để sản xuất xăng sinh hoc như:
Thực vât hoang dai: tảo (algae) nước ngot, tảo biển, lục binh (Eichornia
crassipes), cỏ Vetiver, cỏ voi (Elephant grass, Pennisetum purpureum, sản xuất
13,700 lit ethanol/ha/năm), lác (Cyperus), cỏ tranh (Imperata cylindrica),…
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 17
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
Phó sản thực vât từ sản xuất cây nông phẩm va cây ky nghệ: rơm ra, bả
mia, thân, gổ, mat cưa, trấu, hat cao su (sản xuất 217 kg dâu/ha/năm), hat bông vải
(sản xuất 273 kg dâu/ha/năm).
Giấy phế thải: 1 tấn giấy cu sản xuất khoảng 416 lit ethanol.
Rác thanh phô: 1 tấn rác sản xuất khoảng 227 lit ethanol.
Phế thải chuông trai gia súc: phân chuông (tao methane sinh hoc rôi chế
methanol).
Xăng sinh hoc ethanol (C2H5OH) 99.9% có thể chay đông cơ xe hơi chay bằng
xăng. Khi cháy, môt phân tử ethanol sinh môt nhiệt lương 1409 kJ.
Xăng pha với ethanol thải it khi nha kinh hơn xăng thương. Chẳng hang E85
thải 1 ppm khi NO2 trong khi xăng-cổ-sinh thải 9 ppm.
Trên nguyên tắc, bất cứ chất vât liệu sinh hoc nao chứa nhiêu Carbon, hoặc
dưới dang đương, tinh bôt, cellulose đêu có thể chế biến thanh ethanol, hoặc chứa
nhiêu acid béo đêu có thể chế biến diesel sinh hoc đươc. Thông thương nhất la từ
thực vât có khả năng quang tổng hơp – biến CO2 cua khi quyển thanh chất đương,
tinh bôt, cellulose, rôi protides, lipids, v.v. Trung binh cứ mỗi phân tử CO2 cây hấp
thụ va biến chế qua quang tổng hơp thanh sinh khôi chứa 114 kilocalories. Khó khăn
ky thuât hiện tai la lam sao biến toan thể năng lương C chứa trong sinh khôi thanh
xăng sinh hoc. Với ky thuât hiện nay (cổ điển), có 2 phương thức hữu hiệu:
Cho lên men (nhơ men va enzymes trong điêu kiện yếm khi) chất đương
(từ mia, cu cải đương, v.v.), tinh bôt [từ hat ngũ côc (bắp, lúa, lúa mi, v.v.) va cu
(khoai tây, khoai mi, v.v.)], hay cellulose để tao ra rươu Ethanol (CH3OH), Propanol
[CH3CH2CH2OH; (CH3)2CHOH] va Butanol (C4H10O).
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 18
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
Trich dâu từ thực vât giau chất dâu, hay mỡ từ đông vât (ép với áp suất
cao va nhiệt, hay bằng dung môi, hay phôi hơp cả hai).
Vê phương diện ky thuât (va kinh tế), chia lam 3 loai nguyên liệu:
Công nghệ xăng-sinh-hoc thế hệ 1: chế biến từ đương (mia, cu cải đương,
sorgho-đương) va tinh bôt cua nông phẩm (từ hat cua bắp, lúa mi, lúa, v.v., hay từ cu
như khoai tây, khoai mi, v.v.) để tao ethanol; hay từ dâu (cua hat dừa-dâu, đâu nanh,
đâu phông, v.v.) để biến chế diesel-sinh-hoc. Ky thuât đơn giản va kinh tế nhất.
Công nghệ xăng-sinh-hoc thế hệ 2: từ cellulose, chất xơ cua dư thừa thực
vât (rơm, ra, thân bắp, gổ, mat cưa, bả mia, v.v.), hay thực-vât-hoang (non-crop)
(như cỏ voi, vetiver, lục binh). Chẳng han, môt ha mia cho khoảng 25 tấn bả mia
(bagasse, xác mia sau khi ép), va mỗi tấn bả mia sản xuất 285 lit ethanol. Ky thuât
hiện nay chưa hoan hảo, hiệu năng còn kém, con men chưa hữu hiệu va giá đắt, chỉ
môt phân cellulose va lignin biến thanh ethanol, nên giá thanh sản xuất còn cao.
Công nghệ xăng-sinh-hoc thế hệ 3: từ tảo (algae), ky thuât đang phát triển.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 19
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
4.2 Sơ đồ san xuất ethanol va thuyết minh quy trinh san xuất
4.2.1 Sơ đô quy trinh sản xuât
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 20
Phế phẩm nông nghiệp
Cellulose Hemicellulose Lignin
Tiên xử lý
Thuy phân
Hemicellulases
Cellulases
Đường hexoses va pentoses
Lignin
Hệ thông quản lý chất thải
Sản xuất năng lương
Năng lương điện
Cung cấp cho quá trinh tiên xử lý
Lên men
Bioethanol thô
S.cerevisiae
Bioethanol
Chưng cất và cho bay hơi
Cải tiến môi trương nuôi cấy
Tác nhân gây đôt biếnSinh vât chuyển gen
SSF
CBP
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
SSF: quá trinh thuy phân thanh các đương đơn giản va lên men đươc tiến hanh
trong môt thiết bi.
SHF: quá trinh thuy phân thanh các đương đơn giản va lên men đươc tiến hanh
đôc lâp trong những thiết bi khác nhau.
CBP: đông nhất bằng quá trinh sinh hoc
4.2.2 Thuyết minh quy trinh
Quy trinh đươc tiến hanh theo 4 bước:
Xử lý cơ hoc nguyên liệu.
Thuy phân cellulose thanh glucose.
Lên men glucose thanh ethanol.
Tách va tinh chế sản phẩm
4.2.2.1 Tiền xử lý
Bã mia la nguôn phế thải cua nganh công nghiệp sản xuất đương. Thanh phân cua
bã mia gôm 41% cellulose (C6H10O5)n, ngoai ra còn có lignin, pectin, hemicellulose va
phân đương còn dư.
Tiên xử lý lignocelluloses rất cân thiết vi nguyên liệu thuy phân không có quá
trinh tiên xử lý xảy ra rất châm va kết quả la cho hiệu suất tao ra sản phẩm không cao.
Môt vai phương pháp nhằm lam giảm kich thước nguyên liệu va giảm phân cellulose
kết tinh. Tiên xử lý nâng cao mức đô tiếp xúc giữa cellulose với enzyme, lam giảm
lương enzyme sử dụng do đó giảm vê giá thanh cua quy trinh. Có nhiêu phương pháp
tiên xử lý khác nhau có thể phân chia thanh 3 loai: hóa hoc (dùng axit hoặc kiêm),vât
lý kết hơp với hóa hoc (bằng cách xay xát kết hơp với sử dụng hơi nước) va tiên xử lý
bằng phương pháp sinh hoc sử dụng vi sinh vât. Trong tiên xử lý bằng phương pháp
hóa hoc sử dụng axit, hemicellulose sẽ la đôi tương tương tác chinh, ngươc lai quá
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 21
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
trinh tiên xử lý sử dụng kiêm chu yếu để loai bỏ lignin. Vi thế không nhất thiết chỉ sử
dụng môt phương pháp cho quá trinh tiên xử lý ma dựa vao thanh phân cua nguyên vât
liệu ma có môt phương pháp xử lý thich hơp.Nhiêu enzyme thuy phân cellulose từ nấm
lam việc ở pH axit yếu (4-5).
Tiên xử lý bằng phương pháp sinh hoc sử dụng vi sinh vât như dụng loai nấm như
Cyathus sp, Streptomyces viridosporus, Phelebia tremellosus, Pleurotus florida va
enzyme cua chúng dùng để khử lignin trong lignocelluloses nhằm giảm năng lương sử
dụng, tôi thiểu sản phẩm thải ra va tác đông đến môi trương.
Môt sô loai nấm đảm trắng có khả năng sử dụng lignin nhưng không lam giảm
lương mannan peroxide va laccase.
Trong bước xử lý cơ hoc, cân loai lignin trong nguyên liệu, chỉ còn lai thanh phân
cellulose, vi ligin la chất khó phân huy. Nếu còn sót lai trong nguyên liệu sẽ ảnh hưởng
năng suất cua quá trinh.
4.2.2.2 Thuy phân
Quá trinh nay gây tiêu tôn nhiêu chi phi trong giai đoan sản xuất côn. Sau
quá trinh tiên xử lý, cellulose va hemicelluloses đươc thuy phân tao ra các đương đơn
sử dụng enzyme cellulase va hemicellulase. Nhiêu loai nấm như Tricoderma,
Aspergillus, Penicilium… có thể sản xuất ra môt lương lớn cellulase ngoai bao va
hemicellulase. Những enzyme chiu nhiệt đô cao va pH thấp đươc ưu tiên sử dụng do
quá trinh tiên xử lý thương dùng axit va nhiệt đô. Hơn nữa, các enzyme chiu nhiệt có
vai đặc điểm thuân lơi như hoat tinh riêng cao va mức đô ổn đinh cao dùng cải tiến quá
trinh thuy phân. Cuôi cùng, nâng cao hiệu suất xúc tác cua enzyme tức la giảm lương
enzyme sử dụng. Những chung chiu nhiệt có enzyme hoat đông ở nhiệt đô rất cao trên
60oC va nhiệt đo phát triển tôi ưu la 35-55 oC. Hiện nay, bằng ky thuât di truyên, các
nha nghiên cứu đang hướng đến tao ra môt tổ hơp enzyme có thể thuy phân nguôn
nguyên liệu lignocellulose hiệu quả nhất. Bao gôm quá trinh:
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 22
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
Chuyển đổi cellulose: Cellulose la loai polysaccharide đông hinh đươc cấu -(1-
4) glycoside.-D-glucose thông qua liên kết thanh từ các đơn phân. Quá trinh thuy
phân bằng tổ hơp enzyme cellulase bao gôm -glucosidase tao ra -cellobiohydrolase
(exoglucanase), endoglucase va sản phẩm cuôi cùng la glucose.
Chuyển đổi hemicellulose: hemicellulose la thanh phân dôi dao nhất thứ 2 trong
nguôn nguyên liệu lignocellulose (25-30%). Hemicellulose la môt loai polymer di hinh
đươc tao bằng các đơn phân pentose (D-xylose, D-arabinose), đơn phân hexose (D-
mannose, D-glucose, D-galactose) va các acid đương. Xylan la thanh phân thương thấy
trong các thân gỗ cứng, tuy nhiên glucomanan lai la thanh phân chinh trong các loai
thực vât thân mêm. Tổ hơp enzyme để thuy phân hemicellulose cũng rất phức tap. Vi
dụ -xylanse, để thuy phân xylan thi tổ hơp enzyme cân thiết la endo-1,4-β -L-
arabinofuranosidase.-glucuronidase va -xylosidase.
Nguôn enzyme đươc sử dụng phổ biến hiện nay la từ Trichoderma reesei va
Aspergillus niger. Hiện nay, ngươi ta đang thay thế dân các hệ enzyme chiu nhiệt, chiu
các điêu kiện hóa hoc quá han. Hơn hết la các nghiên cứu vê phức hơp cellulosome cua
các vi khuẩn kỵ khi đang dân mở ra môt con đương mới nhằm tăng hiệu quả thuy phân
cua tổ hơp trên các loai nguyên liệu lignocellulose.
4.2.2.3 Lên men
Trong quá trinh lên men, sản phẩm sau quá trinh thuy phân bao gôm các monomer hexose ( glucose, mannose, galactose) hay pentose (xylan, arabinose) sẽ đươc lên men để tao ra các sản phẩm có giá tri như ethanol. Trong sô các sản phẩm thuy phân, glucose có ham lương cao nhất sau đó đến xylose va mannose va những đương khác có ty lệ thấp hơn.
S.cerevisiae la vi sinh vât lên men truyên thông sử dụng lên men ethanol từ tinh bôt trong quy mô công nghiệp. S.cerevisiae có nhiêu thuân lơi như đươc nghiên cứu từ lâu, hiệu suất lên men cao tuy nhiên S.cerevisiae có nhươc điểm la không thể sử dụng xylose lam nguôn cacbon để sinh trưởng hay len men. Do đó S.cerevisiae đươc cải tiến để có thể sử dụng cả 2 đương glucose va xylose. Hiện tai môt sô loai như S. Cerevisiea hay S. unvarum la giông có khả năng tao đô côn cao (12-13%), hay đặc biệt S. oviformis có khả năng tao đô côn 18% đặc biệt loai nấm men nay có khả năng lên men đươc rất nhiêu đương khác nhau như glucose, manose, saccharose, maltose va rafinose, tuy nhiên không có khả năng lên men galactose. Ngoai ra còn có Zymononas mobilis cũng thương đươc sử dụng trong quá trinh rươu hóa. Tuy nhiên cả Saccharomyces va
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 23
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
Zymononas sp đêu thiếu hoan toan khả năng chuyển hóa các loai đương pentose. Khuynh hướng biến đổi gen cua 2 giông nay nhằm giúp biểu hiện khả năng chuyển hóa 2 loai đương pentose phổ biến nhất la D-xylose, va L – arabinose cũng đã đươc phát triển nhiêu.
Gân đây, ngươi ta phát hiện thấy có môt sô loai nấm men như Pichia stipitis,
Candida shehatae va Pachyhysolen tannophillus la những chung có khả năng chuyển
hóa xylose manh va đã đươc dùng trong sản xuất ethanol. Trong đó P. stipilis lai nổi
bât bởi khả năng sản xuất ham lương côn cao va nhu câu dinh dưỡng cua chúng không
quá phức tap so với các giông nấm men khác.
Ngoai ra, các chung chiu nhiệt đô cao như G. thermoglucosidasius, T.mathranii
va T. saccharolyticum cũng đang đươc sử dụng. Quá trinh lên men côn cua chúng có
nhiêu lơi ich hơn các quá trinh chuyển hóa xảy ra ở nhiệt đô trung binh. Chúng có khả
năng lên men không chỉ đương pentose, hexose ma còn có khả năng lên men
cellobiose, thâm chi trong môt sô trương hơp những cơ chất polycarbonhydrate phức
tap như cellulose. Quá trinh lên men ở nhiệt đô cao giúp quá trinh thu hôi sản phẩm dê
dang hơn, bởi vi ethanol có chứa nước (aqueous ethanol) sẽ bôc hơi tai nhiệt đô 500C,
đông thơi giảm nông đô côn trong bôn lên men nhằm giảm thiểu ảnh hưởng ngươc lai
cua nông đô côn đến sự phát triển cua tế bao, từ đó giảm đươc chi phi sản xuất.
4.2.2.4 Chưng cât- khử nước
Quá trinh tách nước va tinh sach ethanol để đáp ứng đặc điểm ky thuât cua nhiên liệu.
4.3 Các thông sô ky thuât của hệ enzyme cellulase
Nhiệt đô: enzyme cellulase hoat đông trong khoảng nhiệt đô từ 45 đến 50oC,
nhiệt đô tôi ưu la 48oC.
pH: môi trương kiêm hoặc phosphoric acid, ở môi trương nay, cân quan sát pH
để tao môi trương thich hơp, cellulose đươc nở ra do đó sẽ bi phân giải rất nhanh.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 24
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
4.4 Phương pháp xác đinh đường glucose sinh ra
Cân theo doi lương glucose sinh ra sau phản ứng. Glucose sau phản ứng có thể
xác đinh bằng phương pháp đo Iode theo ky thuât chuẩn đô ngươc.
Cách tiến hanh như sau:
Cho 1 thể tich chinh xác glucose tác dụng với 1 thể tich chinh xác (lấy dư) dung
dich I2 trong môi trương kiêm. Quá trinh oxy hoá diên ra theo phương trinh:
I2 + 2NaOH NaI + NaIO + H2O
CH2OH(CHOH)4-CHO +IO- CH2OH(CHOH)4-COOH + I-
Sau khi phản ứng xảy ra hoan toan, acid hoá môi trương bằng H2SO4 để Iode dư
dưới dang IO- chuyển vê lai I2. sau đó đinh lương I2 dư bằng dung dich chuẩn Na2S2O3.
Tinh kết quả % glucose như sau:
Trong đó:%G la glucose.
f: la hệ sô pha loãng dd C6H12O6 trước khi đinh lương.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 25
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
Chương 5: KÊT LUÂN
Sự biến đổi phế liệu nông nghiệp thanh các nguôn nhiên liệu cụ thể la ethanol còn
la thách thức lớn cho các nha nghiên cứu va nha sản xuất. Các chung cân đươc cải tiến
để tăng cương tổng hơp tổ hơp enzyme thuy phân hiệu quả hay tăng cương khả năng
chuyển hóa nhiêu dang đương thanh ethanol bằng các ky thuât biến đổi gen, biến đổi
quá trinh trao đổi chất nên cân đươc phát triển để tao ra nguôn năng lương chi phi thấp
ma vẫn không ảnh hưởng đến môi trương trong tương lai.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 26
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
PHỤ LỤC
1. Phương pháp xác đinh hoạt tinh enzyme cellulase bằng phương pháp
Bradford
1.1 Các bước tiến hành
Dung dich albumine 0.1mg/ml: cân chinh xác 10mg albumine pha trong 100ml
nước cất. Lắc đêu cho tan, giữ ở 20oC. Khi dùng pha loãng 100 lân, đươc dung dich
albumine có nông đô 0,01 mg/ml.
Dung dich thuôc thử Bradford:
o Coomassie Brilliant Blue: 0,001g
o Ethanol tuyệt đôi 4,7g
o Acid phosphoric 85%: 8,5g.
o Phẩm mau Coomassie Brilliant Blue đươc lam tan trong chai đựng có nắp,
bổ sung acid phosphoric 85% va chỉnh tới 100 ml bằng nước cất.
1.2 Quy trinh thực hiện
Lâp đương đương chuẩn Albumine(đương chuẩn protein):
Ham lương protein đươc khảo sát thông qua đương chuẩn albumin đươc lâp
trước với các nông đô từ 10-50µg/ml.
Để lâp đương chuẩn thi hoá chất đươc cho theo bảng sau (trong đó ông ĐC la
ông đôi chứng).
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 27
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
Bang: Các hoá chất dùng trong thi nghiệm lặp đương chuẩn Albumin
Ống ĐC 1 2 3 4 5
Nồng đô albumin (µg/ml) 0 10 20 30 40 50
Dung dich albumin (ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Nước cất (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5
Thuôc thử Comassie(ml) 2 2 2 2 2 2
Đo đô hấp thụ cua ông đôi chứng ở bước sóng 595nm, đưa vê 0. Sau đó đo đô
hấp thụ cua các ông còn lai. Từ đó xây dựng đươc đương chuẩn.
• Tiến hanh tương tự với mẫu, dựa vao đương chuẩn xác đinh lương protein có
trong mẫu.
2. Xác đinh lương đường khử đươc tạo ra bằng phương pháp DNS
2.1 Hóa chất Côn 96o
Sodium acetate(dùng lam chất đệm)CMC(dùng lam cơ chất)DNS(thuôc thử)Dung dich enzymeThiết bi: máy quang phổ.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 28
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
2.2 Tiến hành thí nghiệm
Thực hiện môt loat 6 ông nghiệm theo bảng sau đây:
Ống nghiệm1 2 3 4 5
Đôi
chứng
Nồngđô glucose (mg/ml) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0
Vml Glucose (ml) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0
VH2O (ml) 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 1
CMC 1% pH5 (ml) 1ml
Thuôc thử DNS (ml) 2ml
Lắc đêu các ông nghiệm nay, đem đun sôi cách thuy trong vòng 15 phút, lam
nguôi rôi đo ở bước sóng 540nm. Từ đó xây dựng đươc đương chuẩn.
Tiến hanh tương tự với mẫu, dựa vao đương chuẩn xác đinh lương protein có
trong mẫu.
Tinh toán:
Xác đinh hoat tinh cua enzyme:
CMCase CU =
Trong đó
+AT: đô hấp thụ cua dung dich có phản ứng enzyme.
+AB : đô hấp thụ cua dung dich không có phản ứng enzyme.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 29
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
+1000: chuyển mg sang µg.
+Mglucose=180
+10: thơi gian phản ứng
+1: Thể tich dung dich enzyme( ml )
+V: thể tich dung dich mẫu (ml )
+F: đô tuyến tinh đươc tinh dựa vao đương chuẩn glucose.
F=(0,1/A1D1+0,2/A0D2+…+0,5/A0D5 )/5
Xác đinh ham lương cua protein:
X= ham lương (µg/ml) x đô pha loãng x thể tich
Xác đinh hoat tinh riêng cua enzyme cellulase:
HTR= (CU/mg)
3. Phương pháp tinh sạch enzyme cellulase bằng phương pháp sắc ki lọc gel
2.1 Chuẩn bi gel
Cân 4.4g gel khô (có thể nhiêu hơn môt chút để trừ hao phân thất thoát) cho vao
dung dich đệm acetate 50mM, pH5 thể tich bằng gấp đôi thể tich lớp nên gel cân dùng
cho môt côt.
Sau khi thể huyên phù đông nhất cua các hat gel hinh thanh, không khuấy, để ổn
đinh trong suôt quá trinh hydrate hoá.
Sau khi quá trinh hydrate hoá diên ra hoan tất, gan lớp nổi trên bê mặt, chuyển
dung dich trên vao binh hút chân không, khử khi trong dung dich trong khoảng 5-10
phút, thỉnh thoảng lắc nhe binh nhưng không đươc khuấy.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 30
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
Thêm dung dich đệm để khử khi với thể tich gấp 2 lân thể tich lớp nên, lắc nhe.
Để gel ổn đinh cho đến khi 90-95% sô hat ổn đinh, gan hoặc loti lớp nổi trên bê mặt
bằng cách hút để loti các hat min. Lặp lai qua trinh 4 hoặc 5 lân để loai >90% hat min
lam cản trở quá trinh loc gel.
Đổ gel vao côt, đóng lỗ thoát cua côt va cho dung dich đệm lam đây 20% thể tich
côt. Tránh tao bot khi khi đổ gel vao va đảm bảo việc nhôi côt đêu.
Khi lớp nên trong côt đat từ 2-5cm, mở khoá đâu racha côt cho đến khi côt nap
đây gel. Khoá đâu ra cua côt va gắn flow adaptor. Mở khoá đâu ra cua côt va cho dung
dich đệm với thể tich gấp 2 lân thể tich lớp nên chảy qua môt lúc để diêu chỉnh tôc đô
dòng chảy.
Đóng đâu ra cua côt va điêu chỉnh flow adaptor xuông đến lớp nên gel.
Nap mẫu vao trên bê mặt lớp nên bằng cách bơm hoặc tiêm mẫu vao trên lớp nên
gel qua flow adaptor.
2.2 Chuẩn bi mâu
Mẫu chay sắc ký phải sach va hoa tan hoan toan trong dung dich.
2.3 Thu và xác đinh mâu tách được
Dich sau khi chay ra khỏi côt đươc cho vao 20 ông nghiệm, mỗi ông (phân đoan)
chứa 4ml. Tôc đô dòng chảy 4ml/6phút trong 1 ông.
Sau khi chay gel xong ta đem đi đo mât đô quang ở bước sóng 280 nm nhằm xác
đinh ông nao chứa ham lương cellulase cao va lam các bước xác đinh hoat tinh cua
enzyme cellulase đã đươc tinh sach trong các ông.
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 31
Đê tai: THU NHÂN ENZYME CELLULASE TRONG Aspergillus niger VA ƯNG
DUNG TRONG SAN XUÂT BIOETHANOL
GVHD: Ts. Nguyên Hoai Hương
TAI LIÊU THAM KHAO
[1] PGS TS Nguyên Tiến Thắng. Giáo trinh công nghệ enzyme. ĐH. KTCN TP.HCM,
2010.
[2] Pham Quôc Thăng. Enzyme hoc.
[3] PGS TS Nguyên Tiến Thắng. Tai liệu hướng dẫn thực tâp mônCông nghệ enzyme
va protein. Viện sinh hoc nhiệt đới, 2010.
Tai liệu tiếng nước ngoai
[1] R.A. Nieves, C.I. Ehrman, W.S. Adney, R.T. Elander, and M.E. Himmel. Technical Communication: Survey and analysis of commercial cellulase preparations suitable for biomass conversion to ethanol. 1998.[2] Y.-H. Percival Zhang, Michael E. Himmel, Jonathan R. Mielenz. Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies. 2006.Website:[1] http://en.wikipedia.org/wiki/Aspergillus_niger[2] http://cnx.org/content/m30247/latest/[3] http://cnx.org/content/m30247/latest/
Lớp 08DSH2 Khoa: MT-CNSH 32