bc ii nukleotidbiosynthese
DESCRIPTION
Biochemie der NukleotidsyntheseBiochemistry of Nucleotide SynthesisTRANSCRIPT
BiochemistrySixth Edition
Kap. 25Copyright © 2007 by W. H. Freeman and Company
Biochemie IIStephan Schwarzinger SS2008
Biosynthese der Nukleotide I
Literatur:Berg • Tymoczko • Stryer
Grundpraktikum BIOCHEMIE Modul II für Biochemiker BSc
• 02510, 10 SWS• 02.06. – 06.06.2008: Seminarwoche• 09.06. – 13.06.2008: Kolloquiumswoche• 16.06. – 04.07.2008: Praktikumswochen
• ANMELDUNG am LS Biochemie (graues Regal) bis 23.05.2008!!!
• Vorbesprechung (TEILNAHMEPFLICHT!)26.05.2008 um 14:00 (s.t.), 1.2.U1.04 (Seminarraum im BioMedTec Gebäude)
• Skripten: ca. 4 Wochen vor Praktikumsbeginn im grauen Regal
Nukleotide …
• Aktivierten Vorstufen der Nukleinsäuren• ATP universelle Energiewährung• GTP Energiequelle f. spezielle Prozesse• Nukleotidderivate sind an zB an Glykogen-
Biosynthese beteiligt (UDP-Glucose)• Signalübertragung: cAMP, cGMP• ATP ist Phosphatquelle für Kinasen
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= ACGTA5’ 3’
5’ 5’ 5’ 5’ 5’
3’3’ 3’ 3’ 3’
Primärstruktur der DNA
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A-T Basenpaar
G-C Basenpaar
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Wh: Schmid – Biochemie I
Präbiotische Synthese von Adenin
J. Oro (1960): NH3, HCN, H20 bei 70 °C, 14 Tage, Ausbeute < 1%Adenin ist formal ein Oligomer aus 5x HCN!HCN wurde im interstellaren Raum nachgewiesen!
Sehr harsche Bedingungen, sehr reaktive (giftige) Spezies!
Biosynthese kann auf zwei Wegen erfolgen
(Recycling-Pfad)
(5-Phosphoribosyl-1-pyrophosphat)
de novo Synthese
• Pyrimidinbasen
– Synthese der Base– Anbindung an Ribose
• Purinbasen
– Ribose als Grundstruktur
– Base wird schrittweise auf die Riboseaufgebaut
de novo Synthese des Pyrimidin-Rings:
aus: HydrogencarbonatGlutamin undAspartat
HCO3- wird durch ATP aktiviert
Glutamin liefert NH3
Synthese der CARBAMINSÄURE …
Phosophorylierung der CARBAMINSÄURE …
Reaktion muss enzymatisch katalysiert werden!
CSP:Carbamoylphosphat-Synthase
Besteht aus 2 homologenDomänen, von denen jede einen ATP-abhängigenSchritt katalysiert.
ATP-grasp fold: bindet (umgibt)ATP in der richtigen Orientierungfür einen nukleophilen AngriffAn der γ-Phorphorylgruppe.
CSP:Carbamoylphosphat-Synthase
Glutaminseitenkette wird zurGewinnung von NH3 hydrolisiert:es entstehen Glutamat und NH3.Reaktion wird von einer katalytischen Dyade katalysiert, die aus einem Cystein und einem Histidinrest besteht (vgl. Cysteinproteasen). Auch in Amidotransferasen zu finden, wie CTP- und GMP-Synthase.
ZWISCHENPRODUKTE„TUNNELN“ ZU DEN AKTIVEN ZENTREN
… und diffundieren so gerichtetzum Reaktionszentrum und sind des Weiteren vorvor Hydrolyse geschützt(Carbaminsäure ist nur 1 Sek.bei pH 7 stabil!).
Aspartat-Transcarbamoylase katalysiert Reaktion zu
Oxidation mit NAD+ zu OROTAT
Pyrimidin-Phosphoribosyltransferase:
Katalysiert Reaktion einer aktiviertenRiboseeinheit (PRPP) mit OROTAT.
Das gebildete OROTIDYLAT wird weiter zu URIDINYLAT (UMP)decarboxyliert.
OROTIDYLAT-DECARBOXYLASE
… beschleunigt die Reaktion ca. 1017-fach!!! Ohne Enzym nur ca. alle 78 Mio. Jahre, mit Enzym ~ 1 s-1.
Zur Synthese von CYTIDIN muss zuerst UTP vorliegen
Mono-, di-, und tri- sind ineinander umwandelbar:UMP zu UDP via UMP-Kinase (spezifische Nucleosid-MP-Kinase)UDP zu UTP via (unspezifische) Nucleosid-DP-Kinase
CTP: aus Aminierung von UTP
Glutamin ist wieder Quelle für die Aminogruppe (vgl. Carbamoylphos.)ein ATP wird benötigt: O-4 wird phosphoryliert (Aktivierung), Phosphorylgruppe wird durch NH3 substituiert.
Biosynthese der Purine:
Herkunft der Atome im Purin-Ring bei der de novoSynthese.
Inosinat (Inosin-MP)
Recycling von Purin-Basen spart Energie
… z.B. katalysiert Adenin-Phosphoribosyltransferase die Bindung von Adenin und PRPP zu Adenylat und PPi
während Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase sowohl die Bildung von Guanylat als auch von Inosinat katalysiert:
Inosinat (Inosinmono-phosphat, IMP) ist eine Vorstufe von Guanylatund Adenylat!
Die Purin-de novoSynthese wird am Ribosephosphat begonnen
1. Schritt ist der Austausch derPyrophosphatgruppe gegen eineAminfunktion. Es handelt sich hier um eine Schrittmacherreaktion.
Die Aminogruppe hat eine β-Konfiguration!
Der Purin-Ring Aufbau verläuft über aufeinander folgende Phosphorylierungen mit anschließenden Substitutionen
Die Phosophorylierung wirkt dabei immer als Aktivierung!
1) Phosphorylierung der Carboxyl-gruppe eines Glycinrestes,Verknüpfung mit dem Phospho-ribosylamin Entstehung einer neuen Amidbindung, Amin desGlycins frei (nucleophiler Rest)
2) Anfügen eines aktiviertenFormiats von N10-Formyl-THF.Enzymatische Reaktion: Formiatwird zum Formylphosphataktiviert.
3) Aktivierung der inneren Amid-funktion. Umwandlung in ein Amidin mit Aminogruppe ausGlutamin.
4) Produkt zyklisiert 5-Ring.ATP wird verbraucht um die Reaktion (wahrscheinlich ohnehinthermodynamisch begünstigt) irreversibel zu machen.
5) Aktivierung von Hydrogen-carbonat. Angriff durch die exo-zyclische Aminogruppe. Es folgteine Umlagerung: Carboxylatwird auf den Imidazolringübertragen.
6) Aktivierung der Carboxylgruppe.Substitution von Pidurch die Aminogruppeeines Aspartates.
Fumarat wird abgespalten, das N-Atom von Asp bleibt am Imidazol-ring gebunden. Auf das Amin wird eine Formyl-Gruppe übertragen. Es folgt der Ringschluss zur Inosinat-Bildung.
Adenylat: C´-O Atom Nr. 6 wird gegen Aminogruppe getauscht. Adenylosuccinat-Synthase: GTP kein ATP-grasp fold!
Gyanylat: Oxidation von Inosinat zu Xanthylat (XMP) und Einfügeneiner Aminogruppe am C-2.
Synthese von AMP und GMPausgehend von Inosinat
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Desoxyribonukleotide werden durch Ribonukleotid-Reduktase erzeugt:obwohl sehr unterschiedlich in versch. Organismen – gleicher Mechanismus
Ribonukleotid Reduktase aus E. coli:
87 kDa
43 kDa
Das Tyrosylradikal wird durch ein benachbartes Eisenzentrum erzeugt:
Ferri-Ionen(Fe3+)
aus: Lehninger – Principles of Biochemistry, 4th edition, 2005 W.H. Freeman and Company, Kaptiel 22
Strukturen der R2-Untereinheiten:zu sehen ist der Tyrosin-Rest unddas Di-Eisen-Zentrum.
aus: Lehninger – Principles of Biochemistry, 4th edition, 2005 W.H. Freeman and Company, Kaptiel 22
Das Tyrosyl-Radikal ist zu weit entfernt vom reaktiven Zentrum –das Radikal wird daher auf eine andere Aminosäure übertragen, In diesem Fall auf ein Cystein. So entsteht ein extrem reaktives Cysteinthiyl-Radikal.
Transfer eines Elektrons zum ungepaarten e- (Radikal) am Tyrosines resultiert ein CYSTEINTHIYL-Radikalhochreaktive Spezies
Cysteinthiyl-Radikal zieht ein Proton vom C-3´ der Ribose abes entsteht ein Kohlenstoff-Radikal am Zucker
Das C-3´ Radikal führt zur Ab-spaltung der Hydroxylgruppeam C-2´ Kohlenstoff.Das Radikal wandert auf C-2´.Die OH- Gruppe verlässt mit dem Proton eines Cysteinrestes dieReaktion als Wassermolekül.
Ein Hydridion (H-) wird zur vollständigen Reduktion an C-2´ benötigt:Es wird vom 3. Cysteinrest auf das C-2´ übertragenDabei bildet sich eine Disulfidbrücke aus. Das Radikal wandert wieder auf das C-3´ Atom.
Das Radikal am C-3´ fängt das gleiche Proton ein, das ursprünglichin Schritt 1 durch den 1. Cysteinrest vom C-3´ abgespalten wurde.
Somit ist das Desoxyribonukleotid fertig und kann das Enzym verlassen!
Regeneration des Enzyms:
Die R2-Untereinheit stellt ein Elektronzur Reduktion des Cysteinthiyl-radikals zur Verfügung.
Die Disulfidbrücke zwischen dem 2. und 3. Cysteinrest wird durch ein anderes disulfidhaltiges, spezfischesEnzym, z.B. Thioredoxin, reduziert.
Thioredoxin muss auch regeneriert werden:NADPH abhängige Reaktion, die durch Thioredoxin-Reduktase katalysiert wird.
aus: Lehninger – Principles of Biochemistry, 4th edition, 2005 W.H. Freeman and Company, Kaptiel 22
Elektronen werden entlang der blauenPfeile von letztendlich NADPH aufdas Enzym übertragen. Die Übertragungkann entweder via Thioredoxin oder via Glutarredoxin erfolgen.
GSH = GlutathionGSSG = oxidiertes Glutathion
Konservierung der Ribonukleotid-Reduktasen
• Ribonukleotid-Reduktion ist eine sehr schwierige Reaktion, die einen sehr effizienten Katalysator erfordert!
• Andere Radikalquellen in anderern Organismen, z.B. Adenosylcobalamin
• Gemeinsamer Mechanismus über Cysteinthiyl-Radikale, die sehr reaktiv sind
• Offenbar gibt es einen gemeinsamen Vorläufer für diese Enzyme
• Hinweis für die Beteiligung von Proteinen an der RNA-Welt, bevor DNA als genetische Speicherform sich etabliert hat
Thymidyliat entsteht durch Methylierung von Desoxyurdilylat
… katalysiert von der Thymidylat-Synthase. CH3 Gruppe kommt von N5,N10-Methylene-THF
Dihydrofolat-Reduktasen (DHFR) katalysiert THF-Regeneration
THF agiert als Überträger von C1-Einheiten (Formyl, Methyl)!NADPH dient wieder als Reduktionsmittel Hydridion wird aufden Pteridin-Ring von DHF übertragen.
Exkurs: THF und DHFR(nicht Prüfungsstoff)
DHFR katalysiert die Reduktion von DHF zu THF mittels NADPH
N
N
N
NN
NO H
H HH
H H
H
O
NOH
O
OHOH
O
N
N
N
NN
NO H
H H
H
HH
H H
H
O
NOH
O
OHOH
O
NN
NN
N
OO
O PiO
PiO Pi
OO
OO
N
ON
HH
NN
NN
N
OO
O PiO
PiO Pi
OO
OO
N+
ON
H
DHFR ist ein ca. 18 kDa großes Protein. Es muss zwei relativ große Kofaktoren aufnehmen,d.h. sie in entsprechendem Abstand in die richtigeOrientierung zueinander bringen.
E = Enzym
Der Reaktionszyklus von DHFR ist sehrkomplex: zuerst liegt DHFR mit NADPHbeladen vor. DHF bindet – es bildet sich derMichaelis-Komplex aus, die Reduktion von DHF zu THF findet statt. Danach liegt dasEnzym mit NADP+ und THF gebunden vor. NADP+ dissoziiert aus dem Protein ab, THFbleibt alleine gebunden. Es erhöht dieAffinität für NADPH, das nun wieder an das Enzym bindet. Dadurch wird die Affinität für THF erniedrigt und es dissoziiertab. Neues DHF kann aufgenommen werden.
DHFR-Ansicht von „oben“ und „unten“: Es sind spezifische Bindungstaschen für die Kofaktoren zu erkennen. Die reagierenden Teile ragen in eine Art „Tunnel“und stehen so für die Reaktion gegenüber.
Gekoppelte Beweglichkeit?
DHFR ist eines der am besten Untersuchten Enzyme betreffend seinen molekularen Mechanismus. Für die Bindung und dasEntlassen der Substrate / Produkte, wie auch für den katalytischen Schritt ist es erforderlich, dass die Proteine sich bewegen können – sie sind keine starren Einheiten! Kleine Konformationsänderungen sind z.B. wichtig, um die Affinität in Bindungs.taschen zu modulieren. In den letzten Jahren zeigten Untersuchungen mittels magnetischer Kernresonanzspektroskopie, das viele Enzyme auch in Abwesenheit von Substraten kleine interne Bewegungen durchführen, die charakteristisch fürdie Geschwindigkeit des katalytischen Umsatzes sind! Das bedeutet, das möglicherweise die interne Beweglichkeit von Enzymen ein wichtiger Faktor für ihre reaktionsbeschleunigende Wirkung ist.
ENDE EXKURS!
Nukleotid-Biosynthese ist …
• … wichtig für den Erhalt der genetischen Information
• … essentiell für die Biosynthese der Proteine und von Cofaktoren
• … ein wichtiger Angriffspunkt für Therapien, z.B. bei Krebs
Wirkstoffe, die in dieNukleotid-Biosyntheseeingreifen:
FluoruracilAminopterinMethotraxat
Fluoruracil wird im Körper in Fluordesoxyuridinylat umgewandelthemmt die Thymidylat-Synthase irreversibel! Dieser Synthese-
schritt hat eine Abspaltung eines Protons erfordert – das nun jedoch durch F ersetzt ist. Fluor kann nicht abgespalten werden, die Reaktionstoppt mit dem kovalenten Komplex aus F-dUMP und Methylen-THF.Beispiel für eine Suizidhemmung.
Die Mechanismen im Detail und im Vergleich zueinander:
… sind hochwirksame Inhibitoren (< 1 nM) von DHFR: M ist wirksam gegen schnell wachsende Tumore (akute Leukämie, Chorionkarzinom aus Plazentazellen). Kann aber nicht zwischen gut /böse unterscheiden starke Nebenwirkungen z.B. auf Knochenmark-Stammzellen (BMSC), Epithelzellen des Intestinaltraktes und Haar-folikel …
Zellen in Gegenwart von Methotrexat (DHFR-Hemmer) reagierenmit Vervielfachung des entsprechenden Gens.
… ist ein Theapeutikum im Kampf gegen Bakterien und Protzoen:Folat-Analogon: bindet 105-fach schwächer an Säuger-DHFR als an die von Mirkoorganismen.
Wie wird die Nukleotidsynthese reguliert?
… wichtige Schritte werden über einen Rückkopplungs-mechanismus reguliert (gehemmt).
Aspartat-Transcarbamoylase reguliert die Pyrimidinbiosynthese:Aktivierung durch ATPHemmung durch CTP (= Endprodukt der Pyrimidinbiosynthese)
Auch die Carbamoylphosphat-Synthase kann reguliert werden.
Regulation der Purinbiosynthese erfolgt an mehreren Stellen:
Hemmung der Schrittmacherreaktion (Glutamin-PRPP-Amidotransferase)durch Purinribonukleatide (AMP und GMP wirken hier synergistisch)
Hemmung der vom Inosinat ausgehenden Reaktionen: AMP hemmt Umwandlung von Inosinat in AdenylsuccinatGMP hemmt Umwandlung von Inosinat in Xanthylat
Verhältnis von AMP/GMP: GTP ist Substrat bei der AMP SyntheseATP ist Substrat bei der GMP Synthese
direkte Vorstufen
Desoxyribonukleotid-Reduktase wird allosterisch reguliert:
Jede R1-Untereinheit hat 2 allosterische Zentren
Kontrolle der GesamtreaktivitätBindung von dATP Hemmung(Überschuss von dNTPs)ATP-Bindung Aktivierung
Kontrolle der SubstratspezifitätBindung von dATP/ATP:begünstigt Reduktion vonUDP und CDPBindung von TTP: Reduktionvon GDP, ansteigende dGTP-Konzentration stimuliertdATP Synthese.
aus: Lehninger – Principles of Biochemistry, 4th edition, 2005 W.H. Freeman and Company, Kaptiel 22
Noch einmal aus einem etwas anderen Blickwinkel:
Krankheiten als Folge von Störungendes Nukleotidstoffwechsels
Severe combined immunedeficiency: Verlust der T-ZellenSchwächung der Immunabwehr („bubble boy disease“)
- ausgelöst durch Fehler im Abbau von Adenosin (A-Desaminase)
Abbau von Xanthin zu Urat: Hoher Urat-Spiegel im Serum löst Gicht aus.
NatriumuratkristalleschädigenNieren und Gelenke.
… Xanthin-Analogon, zuerst Substrat, dann Inhibitor derXanthin-Oxidase …
Weitere pathologische Konditionen:
Lesch-Nyhan-Syndrom:
Folge von Mutationen an Hypoxanthin-GuaninPhosphoribosyltransferase
geistige Behinderung, Selbstzerstörungszwang
Folsäuremangel fördert Geburtsdefekte:
fehlende oder unvollständige Ausbildung des Neuralrohres kann durch Gabe von Folsäureim 1. Schwangerschaftsdrittel reduziert werden.
aus: Lehninger – Principles of Biochemistry, 4th edition, 2005 W.H. Freeman and Company, Kaptiel 22
… und nochmals der Mechanismus der Ribonukleotid-Reduktase:
aus: Lehninger – Principles of Biochemistry, 4th edition, 2005 W.H. Freeman and Company, Kaptiel 22
aus: Lehninger – Principles of Biochemistry, 4th edition, 2005 W.H. Freeman and Company, Kaptiel 22
aus: Lehninger – Principles of Biochemistry, 4th edition, 2005 W.H. Freeman and Company, Kaptiel 22
aus: Lehninger – Principles of Biochemistry, 4th edition, 2005 W.H. Freeman and Company, Kaptiel 22
aus: Lehninger – Principles of Biochemistry, 4th edition, 2005 W.H. Freeman and Company, Kaptiel 22
aus: Lehninger – Principles of Biochemistry, 4th edition, 2005 W.H. Freeman and Company, Kaptiel 22
Lernhinweise:• Arbeiten Sie das Kapitel im Stryer durch.• Beantworten Sie die Fragen nach dem Kapitel!• Zeichnen Sie sich die chemischen Strukturen der Verbindungen auf.
Achten Sie auf die Stereochemie!• Versuchen Sie sich als „Elektronenschieber“ bei Reaktionen (wo
möglich)!• Nutzen Sie die Webseite mit zusätzlichen Aufgaben zum Stryer:
http://bcs.whfreeman.com/biochem6/default.asp?s=&n=&i=&v=&o=&ns=0&uid=0&rau=0
• Bilden Sie Lernpartnerschaften – gemeinsam Nachdenkenhilft!