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Bi 231: Ingénierie des Protéines
cours 5
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Plan Général
• I. Introduction et rappels.• II. Purification des protéines.• III. Surexpression d'une protéine.• IV. Mutagenèse: techniques et applications. • V. L'insuline : exemple d'une stratégie.• VI. Analyse d'articles.
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V. L'insuline : exemple d'une stratégie.
• 51 –Introduction
• 52 –Historique : de Banting à Sanger
• 53 –Les stratégies utilisées.
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51 –Introduction : Rôles, fonctionnement, structure et enjeux
médicaux.
Insuline : • hormone sécrétée par le pancréas. • sécrétée dans le sang après
ingestion de sucres.• provoque absorption du sucre par
les cellules (médiée par des récepteurs spé).
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Régulation de la glycémie chez les
mammifères :
Rôle + du glucagon relargage par le foie
Rôle – de l'insuline Absorption cellulaire du glucose notamment
par adipocytes
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Diabète :déficience en insuline
• sans insuline problèmes majeurs d'assimilation du glucose au niveau cellulaire.
• Diabète de type I : déficit de production de l'insuline.
• Diabète de type II : problème de transduction du signal sur cellules réceptrices.
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Diabète de type I
• Due à réaction auto-immune :
Ac ilôts de Langerhans
hyperglycémie
coma
mort
• 10% des diabétiques• Apparition favorisée
par infection par certains virus (EBV,...), traitement médicaux,
chirurgicaux.
Traitement : injection régulière d'insuline.
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Diabète de type II• Due à mauvaise
alimentation + terrain génétique.
hyperglycémie chronique
problèmes cardiaques,
visuels,rénaux, neurologiques, ...
• 90% des diabétiques.•Chez sujets adultes,
agés• Apparition
multifactorielle :génétique, alimentaire,
autoimmune (Ac insuline-recepteur),...
Traitement : régime alimentaire, hygiène de vie +traitement médicamenteux.
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Les différents types d'insuline disponibles : Analogues d'insuline :
action rapide action prolongée Biphasique
Onset: 10-20 minutesMaximum effect: 1-3 hoursDuration: 3-5 hours
Onset: 1 hourDuration: 24 hours
Onset: 10-20 minutesMaximum effect: 1-4 hoursDuration: up to 24 hours
Insuline humaine:action rapide action intermédiaire prémixée
Onset: within 30 minutesMaximum effect: 1-3 hoursDuration: 8 hours indication : 30 min after meal
Onset: within 1.5 hoursMaximum effect: 4-12 hoursDuration: 24 hours
Onset: within 30 minutesMaximum effect: 2-8 hoursDuration: 24 hours composition : 30% rapid, 70% isophane
http://www.novonordisk.com/diabetes/public/diabetestools/insulins/default.asphttp://www.novonordisk.com/diabetes/public/diabetestools/handsoninsulin/default.asp
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Structure de l'insuline
• Formée de 2 chaînes, A et B
• synthétisée sous forme de proinsuline
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Séquence de l'insuline Préproinsuline humaine
peptide B :31 aa peptide A : 20 aapeptide signal peptide C
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT D fSL
RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRHL
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN L
accumulation de proinsuline (FS diabète de type II)
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Comparaison avec autres insulines animales
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V. L'insuline : exemple d'une stratégie.
• 51 –Introduction sur Insuline : Rôles, fonctionnement, structure, enjeux médicaux.
• 52 –Historique : de Banting à Sanger
• 53 –Les stratégies utilisées.
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52 –Historique : de Banting à Sanger.
• 1889 : Ablation du pancréas induit un diabète chez le chien.
• 1908 : Restauration de la glycémie par injection d'extrait de pancréas chez chien sans pancréas.
• 1921 : Extraction d'une hormone antidiabétique simultanément par 2 équipes : Bucarest (Paulesco)
Toronto (Banting & Macleod).• 1922 : premiers patients traités et sauvés à Toronto• 1923 : Banting & Macleod : prix Nobel de médecine• 1925-1970 : amélioration de la pureté et des formulations
(1ère insuline retard par ajout de Zn, protamine)
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52 –Historique : de Banting à Sanger.
• 1926 :cristallisation de l'insuline• 1958 : détermination de la structure chimique de
l'insuline (1ère protéine séquencée): prix Nobel de chimie pour Sanger.
• 1967 : Séquence de la proinsuline.• 1969 : Structure 3D de l'insuline.• 197n : "humanisation" de l'insuline porcine.• 1982 : production d'insuline recombinante.• 1983 Amélioration du procédé
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V. L'insuline : exemple d'une stratégie.
• 51 –Introduction sur Insuline : Rôles, fonctionnement, structure, enjeux médicaux.
• 52 –Historique : de Banting à Sanger
• 53 –Les stratégies utilisées.
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53 –Les stratégies de purifications utilisées.
• A partir de pancréas : extraction acide dans éthanol et précipitation / sels.
• Conversion d'insuline porcine.
• Surproduction d'insuline.
• Surproduction de proinsuline.
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A partir de pancréas
• Le pancréas est découpé en morceaux,• Suspendu dans ethanol à pH 2 (inactivation de
la trypsine),
• neutralisation / CaCO3,
• précipitation par sels (KCl, NaCl, SO4(NH4)2, ...),
• resuspension dans eau et précipitation par acidification
• + chromatographie : Gel filtration et/ou échangeuse d'ions
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Conversion d'insuline porcine.
= remplacement AlaThr
• purification insuline (cf précédent),• conversion : insuline (porc) + Trypsine +
thréonine ester dans eau+solvant organique (diminue activité peptidase de trypsine et favorise la réaction inverse),
rendement <97 %• Purification par chromatographie(s)
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Surproduction d'insuline.
• Production séparée des chaînes A et B chez E. coli. Les peptides étaient co-exprimés avec autre protéine (-gal, TrpE, ...).
• séparation /protéolyse
• 2A +1B sulfoné (cys-SO2) + mercaptoethanol, 24H
60 % rendemment.• purification / chromatographie
phase inverse
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Surproduction de proinsuline.sur expression chez E. coli (1982)• insertion du cDNA de la préproinsuline dans une
vecteur bactérien.• surproduction avec protéine de fusion (idem).• coupure / protéase proinsuline• oxydation des cystéines• repliement de la protéine en présence de
réducteurs.• coupure par protéase spécifique• purification par chromatographie
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Surproduction de proinsuline.
sur expression chez S. cerevisiae (1988)• insertion du cDNA de la préproinsuline dans une
vecteur de levure.• surproduction avec protéine de fusion (idem).• coupure / protéase proinsuline insuline• purification par chromatographies