expression d'une protéine recombinante
TRANSCRIPT
Qu’est-ce que c’est une protéine ?
Des molécules biologiques
De faible masse moléculaire
Macromolécules
Acides gras sucres nucléotides Acidesaminés
Protéines Acides nucléiques
polysaccharides
toutes formées d'un squelette carboné
ADN, ARN
AmidonGlycogène
Primaire
Secondaire
Tertiaire
Quaternaire
Acides aminés
Hélice alphaFeuillet bêta
Fonctions des protéines
Structurale Le collagène. C’est une protéine qui forme des fibres.Celles-ci se trouvent dans tous les animaux. Elles sontsecrétées par les cellules le tissu conjonctif comme lesfibroblastes, ainsi que par d’autres types des cellules. Lecollagène est le composant le plus abondante de la peaules tendons et les os. Le collagène représente le 25% dela masse totale de protéines chez les mammifères.
Fonctions des protéines
Immunitaire Les anticorps
Groupe A
Groupe B
Groupe AB
Groupe O
Globules rouges
Anticorps
AntigènesA B A et B Aucun
AucunAnti-B Anti-A Anti-A Anti-B
Paratope
Fonctions des protéines
Catalytique Les enzymes. Ces protéines ont lapropriété de catalyser ou accélérerles réactions chimiques qui ont lieudans les cellules et dans les milieuxextracellulaires. Si les enzymesn’étaient pas présents, les réactionschimiques se feraient à une vitessesi faible que la vie ne serait paspossible.
Biosynthèse de protéines
Le code génétique universel
Production de protéines thérapeutiquesLa déficit de production de certaines protéinesou la production de certaines protéines nonfonctionnelles dans l’organisme amènefréquemment à des maladies qui peuvent êtregraves.
Ces maladies peuvent parfois être traitées parl'administration clinique de la protéineprovenant de sources externes.
Cependant, de nombreuses protéineshumaines ayant une valeurpharmaceutique importante sontobtenues difficilement à partir de leursource naturelle.
La technologie de protéinesrecombinantes, apparue à la fin desannées 70, offre une plateformetechnique très puissante pour laproduction contrôlée de protéinesd'intérêt par des procéduresrelativement bon marché.
Recombinaison génétiqueLes protéines recombinantes sont desprotéines produites par des cellules dont l'ADNa été modifié par recombinaison génétique.
Un gène codant uneprotéine d'intérêt estintroduit dans le génomede l'espèce productrice.
Les protéines recombinantes peuvent être purifiéeset utilisées à des fins thérapeutiques, industriellesou bien encore dans les activités de recherche.
La recombinaison génétique est un échange d‘information génétique entre deux génomes différents.
Production de protéines recombinantes
Construction d’une molécule recombinante
Plasmide recombinant
Gène de PqsD
Gène de PqsD provenant dePseudomonas aeruginosa
Plasmide d’expression
Notre plasmide d’expression
PqsD
KanOri
pET28
6His
Transformation de notre souche d’expression
E. Coli BL21
Étapes pour la production de notre protéine recombinante
Pré-culture Culture CentrifugerCulot : Cellules
Milieu
Inoculer notre bactérie (souche d’expression) dans 5 ml de milieu LB ou TSB + kan 30 µg/ml
Incuber à 37°C/over night/sous agitation
Inoculer 100 ml de milieu LBavec notre pré-culture defaçon à obtenir une D0600
initiale de 0,05.
Incuber à 37°C/240rpm
Lors qu’une DO600 de 0,6 estatteinte, induire avec 1 mMd’IPTG final
Incuber 2h de plus
Collecter les cellules parcentrifugation à 7000rpm/15min/4°C
Laver le culot cellulaire avec70ml de tampon de lavage.
Recollecter les cellules parcentrifugation à 7000rpm/15min/4°C
Garder le culot cellulaire à-20°C jusqu'au jour de lalyse.
Culot : Cellules Lyse cellulaire
Fraction Cytoplasmique (surnageant)Fraction
Membranaire (culot)
Séparation de fractions cellulaires
Étapes pour la purification de notre protéine recombinante
Lyse: Resuspendre le culot cellulairecongelé à 20°C dans 6ml de tamponde lyse Bugbuster®.
Vortexer pour détacher le culot desparois du tube en plastique.
Incuber sous agitation douce àtempérature pièce pendant 20minutes.
Séparation des fractions cellulaires:Centrifuger à 20000xg/30min/4°Cpour décanter la fractionmembranaire.
Diluer le surnageant obtenu avec 6ml de tampon d’imidazole 10mM.
Filtrer avec un filtre de 0,2µm pouréliminer les débris cellulaires ensuspension.
Étant donné que notre protéinerecombinante se trouve solubledans le cytoplasme, on purifieradonc notre protéine à partir decette fraction.
Chromatographie d’absorption ou d’affinité
Les chromatographies d'adsorption est un méthode de séparation où lamolécule d'intérêt d'un mélange complexe est isolée des autres constituantsparce qu'elle se lie spécifiquement à la résine ou matrice sur laquelle on fait lachromatographie.
FPLC Fast protein liquidchromatography
Beaucoup d’affinité
Peu d’affinité
Mélange complexe
Élimination de protéines non-spécifiques du mélange
Élution de la protéine d’intérêt pure
Étapes de la chromatographie d’affinité
1. Lavage de la colonne de nickel. Laver la colonne en passant 25ml del’eau distillée à débit de 5ml/miné. Cette étape permet d’éliminerl’éthanol qui est présente dans la colonne.
2. Équilibration de la colonne: Équilibrer la colonne en passant 25ml d’unesolution d’imidazole 10mM à débit de 5ml/min.
3. Injecter l’échantillon contenant notre protéine à débit de 1ml/min.
Imidazole
5. Lavage de la colonne: Laver la colonne avec une solutiond’imidazole 10mM pour éliminer les protéines nonspécifiques liées à la colonne. Débit 2ml/min pendant7,5 minutes.
6. Élution: Éluer notre protéine recombinante en faisant ungradient linéaire d’imidazole de 10mM à 250mM. Débit2ml/min pendant 50 minutes.
Fractions d’élution collectées de 2ml
Étape d’élution. Concentration croissante
d’imidazole (Gradient)
Imidazole 250mM
Étape d’injection et lavage. Concentration constante
d’imidazole (10mM)
Collecte le volume mort
Électrophorèse de protéines en conditions dénaturantes ou SDS-PAGE
L'électrophorèse a pour but de séparer des molécules chargées au travers d'un gel (un polymère) sous l'effet d'un champ électrique.
On fait bouillir un mélange de protéines en présence :
•d'un agent réducteur : le β-mercaptoéthanolqui réduit les ponts disulfure.
•d'un détergent anionique fort : le SDS qui enveloppe les chaînes polypeptidiques des protéines de charges négatives.
Ces charges se repoussent et déplient les chaînes polypeptidiques.
En conséquence : •les protéines sont dénaturées : elles ont perdu leur structure tridimensionnelle native
•les protéines n'ont plus de ponts disulfure : elles sont sous une forme monomérique
Électrophorèse SDS-PAGE
Fractions à analyser:Volume mort, fraction 10, 15, 20, 25, 30,35, 40, 45, 50, contrôle positif.
Préparation des échantillons:Volume de fraction: 80µlVolume de loading buffer (5x) 20µlVolume final: 100µl
Chauffer l’échantillon préparé à95°C/5min.
Déposer entre 60 à 80µl dans les puits.
Migrer à 70 volts/over night
Lorsque le gel aura migré complètement,colorer à l’argent
Vérifier le présence d’une bandecorrespondant à notre protéine d’intérêt.
Direction de l’électrophorèse