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BIOCATALISI
A.A.
2008 -2009
Dr. Davide Tessaro
Lezione 4:Enzimi redox: ossidasi ed ossigenasi
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Enzimi redox
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Le flavine
Sono un gruppo prostetico che conferisce all’enzima un colore giallo.
Le flavine sono solitamente strettamente legate (anche covalentemente) all’enzima.
Possono effettuare redox monoelettroniche (il radicale semichinonico è stabile). Questo permette loro di reagire con l’ossigeno (che è un diradicale).
Hanno bisogno di essere rigenerate dopo la reazione.
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Rigenerazione con O2
Per esempio: D-ammino acido ossidasi (D-AAO)
R
NH2
COOH R
NH
COOHR
NH2
COOH R
O
COOH
O2 H2O2
+(L)D-AAO
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D-AAOEnzima per detossificazione D-AA sia endogeni che esogeni
Utile per deracemizzazione AAs:
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Ancora 7-ACA
Enzima: D-AAO da Trigonopsis variabilis, pH 7.3, 25°C200 t/annoTempo di residenza: 1.5 h
Il prodotto, in presenza del perossido di idrogeno prodotto, decarbossila spontaneamente dando glutaril-7-ACA
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Ancora 7-ACA
Ad altra fase del processo
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Ancora 7-ACA
Glutaril amidasi (o acilasi) da E. coli, pH 8.3, 30°C, immobilizzato su carrier sferico
200 t annueTempo di residenza 1.5 oreDownstream: cristallizzazione
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Ancora 7-ACAVantaggi biocatalisi:• no metalli pesanti (Zn)• no solv. clorurati• no composti infiammabili• condizioni blande• emissione gas 7.5 kg 1.0 kg• smaltimento acque madri: 29 t 0.3 t• Costo ambientale ridotto del 90%
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Le monoossigenasiCatalizzano reazioni del tipo:
Sub + DonH2 + O2 SubO + Don + H2O
È come se stabilizzassero e facessero reagire l’ossigeno monoatomico
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MO: ossidazione eteroatomiPrendiamo, ad esempio, i solfossidi chirali
modafinil
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MO tipo Baeyer-VilligerCatalizzano reazioni tipo Baeyer-Villiger su composti carbonilici, ne esistono di più tipi.Tipo 1: cofattore NADPH e gruppo prostetico FADH2
Intermedio tipo Criegee
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BV-MOs: il processo
Due enzimi consecutivi con riciclo cofattori:
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BV-MOs: prodotti
Lattoni “normali”
Lattoni “anormali”
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BV-MOs: un esempio
25%e.e. 74%
30%e.e. 95%
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MO per idrossilazione fenoli
OH OH
OH
E. coli JM101
30°C
Esempio: processo Fluka
Whole cells in ambiente acquoso
Substrato e prodotto sono molto tossici per le cellule: vanno mantenute basse conc. (processo fed-batch). Inoltre, il prodotto polimerizza spontaneamente.Si utilizza una resina adsorbente (XAD-4, polistirenica) in un “letto flluidizzato”.Il prodotto viene liberato dalla resina tramite lavaggio con etanolo acidificato per venire poi cristallizzato da n-esano.
Altri prodotti:
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MO per idrossilazione fenoli
Conv. 97%, resa 83%, selettività 85%, purezza 77% (98% dopo XX)
Capacità: 300 LTempo di residenza: 10 hLoop: 10 (Vreatt/h)
STY: 8 g/(L*d)
Catecoli 3-sostituiti: intermedi per farmaceutici e chimica supramolecolare
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MO CytP450 dipendentiCatalizzano C-H C-O-H
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CytP450-MO: esempi
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MO per epossidazione alcheni
R R
O*[O]
• Di solito non si usano enzimi isolati: sono delicati e richiedono NAD(P)H come cofattore (necessità riciclo)
• I prodotti sono altamente reattivi, e quindi tossici per la cellula
• La cellula, facilmente, esprime anche attività di epossido idrolasi
• È necessaria, quindi, molta accortezza nel design del sistema: si utilizza un’altra fase (solvente apolare) per mantenere basse le conc. delle sostanze e per controllare il decorso della reazione
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MO per epox: esempiR
R
O
[O](R)
Processo Nippon mining
Catalizzatore: whole cells di Nocardia corallina B276, T = 30°C
Range substrati:
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MO per epox: esempi
Conv: fino al 98%
Resa: fino al 92%
Selettività: fino al 94%
e.e.: 80-97%
STY: > 0.2 mol / (L*d)
Processo Nippon mining
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Processo Nippon mining
MO per epox: esempi
Uso dei prodotti:
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MO per epox: esempi
Processo Shell-BrocadesWhole cells di Pseudomonas oleovoransT = 37°CConc = 7 g/L
e.e.P > 99.9%
Precursori di beta bloccanti
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Diossigenasi
È come se stabilizzassero e facessero reagire la molecola di O2 in stato di singoletto
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Diossigenasi su aromatici
Pathway di degradazione aromatici nei procarioti. Gli eucarioti hanno monossigenasi seguita da epossido idrolasi (già visto).Per sfruttare il potenziale sintetico bisogna bloccare la deidrogenazione del diolo.
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Diossigenasi: esempioEsempio: produzione indaco
Isatis tinctoria Murex trunculus Indigofera tinctoria
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Diossigenasi: esempioIndaco: sintesi chimica
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Diossigenasi: esempioIndaco: sintesi biocatalitica (Genencor)
Enzima da P. putida
Alternativa: enzima da P. mendocina