biolmol2012 karta wynikowa cw3
TRANSCRIPT
5/17/2018 BiolMol2012 Karta Wynikowa Cw3 - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/biolmol2012-karta-wynikowa-cw3 1/15
Pracownia Biologii Molekularnej Karta Wynikowa Zastosowania Fizyki w Biologii i Medycynie: Biofizyka Molekularna, Projektowanie Molekularne i Bioinformatyka
ĆWICZENIE 3
Zajęcia 4-7
KLONOWANIE PRODUKTU PCR W E. coli NA WEKTORZE
pUC18Grupa ProwadzącyData oddania:
Ilość
punktówImię i nazwisko
1. Etapy klonowania fragmentu DNA na wektorze plazmidowym w E. coli
Celem ćwiczenia było klonowanie cDNA kodującego białko ……………………….. na
wektorze pUC18 w E. coli. Wektor pUC18 o wielkości …………… pz jest wektorem
plazmidowym posiadającym zmodyfikowany replikon naturalnie występującego plazmidu .
…………, gdzie pojedyncza mutacja w replikonie i brak genu rop powoduje, iż plazmidy z
serii pUC są wektorami ………………… kopiowymi. Wektor pUC18 posiada dwa markery
selekcyjne. Pierwszym z nich jest gen bla kodujący.................................................., co nadaje
transformantom oporność na antybiotyk - ………………………………… Drugim markerem
jest fragment genu lacZ (lacZ ’), kodujący N-końcowy fragment enzymu
………………………………………… W obręcie genu lacZ ’ umieszczone jest
……………………………………………………………………………. (MCS), co pozwala
na selekcję transformantów zawierających ………………………………. plazmidy na
podstawie ………………………………. kolonii.
1
5/17/2018 BiolMol2012 Karta Wynikowa Cw3 - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/biolmol2012-karta-wynikowa-cw3 2/15
Pracownia Biologii Molekularnej Karta Wynikowa Zastosowania Fizyki w Biologii i Medycynie: Biofizyka Molekularna, Projektowanie Molekularne i Bioinformatyka
Rys 1.1. Mapa wektora pUC18 zaczerpnięta z materiałów firmy Fermentas.
cDNA kodujące białko ……………………., amplifikowane metodą PCR, wprowadzane
zostało do wektora pUC18 w obręb wybranego jednego miejsca restrykcyjnego, którym była
sekwencja rozpoznawana przez enzym restykcyjne …………………. Poszczególne etapy
klonowania były następujące:
Wpisz w punktach etapy klonowania
2
5/17/2018 BiolMol2012 Karta Wynikowa Cw3 - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/biolmol2012-karta-wynikowa-cw3 3/15
Pracownia Biologii Molekularnej Karta Wynikowa Zastosowania Fizyki w Biologii i Medycynie: Biofizyka Molekularna, Projektowanie Molekularne i Bioinformatyka
2. Amplifikacja DNA metodą PCR
Technika reakcji łańcuchowej polimerazy PCR opracowana przez
…………………………………., za którą w roku ……………… otrzymał nagrodę
…………………….., pozwala na otrzymanie ………………… dużej liczby kopii określonego
fragmentu DNA. Metoda ta polega na przeprowadzeniu wielu cykli syntezy DNA z
wykorzystaniem ………………………………… polimerazy …………………….. i starterów
……………………………………............................................................................., a każdy
cykl reakcji składa się z trzech następujących etapów:
1. …………………………………………………………………………………………
2. ………………………………………………………………………………………….
3. ………………………………………………………………………………………….
2.1 Projektowanie starterów do reakcji PCR
Projektowane startery do amplifikacji określonego fragmentu DNA powinny w miarę
możliwości spełniać następujące warunki:
Tabela 2.1 Cechy, jakie powinieny posiadać startery stosowane w reakcji PCR.
Parametry OpisDługość
Temperatura
topnienia (T m)
Zawartość GC [%]
Cechy sekwencji
(komplementarność,
unikanie zasad na 3’
końcu, tworzenie
struktur
drugorzędowych)
Stężenie stosowane
w reakcji PCR
3
5/17/2018 BiolMol2012 Karta Wynikowa Cw3 - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/biolmol2012-karta-wynikowa-cw3 4/15
Pracownia Biologii Molekularnej Karta Wynikowa Zastosowania Fizyki w Biologii i Medycynie: Biofizyka Molekularna, Projektowanie Molekularne i Bioinformatyka
Do amplifikacji cDNA ………………….. zaprojektowano następującą parę starterów (starter
Forward (For) i strater Reverse (Rev)) wprowadzające dodatkowo na końcach amplifikowanego
fragmentu DNA miejsce restrykcyjne dla ………………………………….
Tabela 2.2 Parametry zastosowanych starterów do amplifikacji cDNA …………………..
metodą ……………… na matrycy ………………………………………..................................
Parametry …….…………For ……………….RevSekwencja
Długość ( N )
Temperaturatopnienia (T m)
% GC
Narysuj, w którym miejscu i do której nici matrycowego DNA przyłaczają się zaprojektowane
startery.
2.2 Przygotowanie mieszaniny reakcynej i profil termiczny reakcji PCR
Matrycą do amplifikacji cDNA ……………………, o wielkości ……….. pz, był wektor ……………………………………… Do reakcji PCR przygotowano trzy próbki, gdzie: próbki
oznaczone literą A, były to …………..………………………… i zawierały ……..
………………………….., próbka B była próbką ………………………………, która nie
zwierała …………………………….. Próbki przygotowano według następującego schematu:
5’
5’
3’
3’
cDNA……..matryca
4
5/17/2018 BiolMol2012 Karta Wynikowa Cw3 - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/biolmol2012-karta-wynikowa-cw3 5/15
Pracownia Biologii Molekularnej Karta Wynikowa Zastosowania Fizyki w Biologii i Medycynie: Biofizyka Molekularna, Projektowanie Molekularne i Bioinformatyka
Komponenty Stężeniewyjściowe
Ilość/Stężeniekońcowe w
próbce
PróbkaA1
PróbkaA2
PróbkaB
Starter For …… µM …… µM …… …… ……
Starter Rev …… µM …… µM …… …… ……
dNTPs …… mM …… mM …… …… ……Matryca …… ng/µl …… ng …… …… ……
H2O 14 µl 14 µl 16 µl
Mix:Bufor 10x DreamTag
Polimeraza DreamTag
10x
5 U/µl
1x
1,5 U
25 µl 25 µl 25 µl
Objętość końcowa 50 l 50 l 50 lMIX na 3 reakcje IlośćBufor 10x DreamTag …..
Polimeraza Dream Tag 1,05 µl
H2O …..Objętość końcowa 3,5 x 25 l
Do reakcji PCR użyto termostabilną polimerazę DNA ……………………….. firmy
Fermentas, której średnia szybkość syntezy wynosi ……………..kb/min, oraz posiada ona
następujące aktywności egzonukleazy ………………………………………………………….
Amplifikację DNA metodą PCR przeprowadzono według następującego profilu termicznego:
Segment Ilość cykli Temperatura Czas1 …. ….. …..
2
…..
…. ….
…. ….
…. ….
3 1 …. ….
4 1 …. ∞
2.3 Analiza produktów reakcji PCR na żelu agarozowym
Po zakończonej reakcji PCR produkt PCR z próbek …………….., oczyszczono od pozostałych
komponentów reakcji stosując zestaw ……………………………………………
……………………………….. firmy Qiagen. Oczyszczony produkt PCR jak i próbki
……………….. analizowano w ………% żelu ………………………………………
5
5/17/2018 BiolMol2012 Karta Wynikowa Cw3 - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/biolmol2012-karta-wynikowa-cw3 6/15
Pracownia Biologii Molekularnej Karta Wynikowa Zastosowania Fizyki w Biologii i Medycynie: Biofizyka Molekularna, Projektowanie Molekularne i Bioinformatyka
Wstaw zdjęcie żelu wraz z opisem
Analiza elektroforetyczna próbek po reakcji PCR pokazała ………………………………..
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
3. Trawienie produktu PCR i wektora pUC18 wybranym enzymem restrykcyjnym
W przeprowadzanym eksperymencie klonowania, otrzymany produkt PCR wprowadzano do
wektora pUC18 z użyciem tylko ………………………………………………………………..
6
5/17/2018 BiolMol2012 Karta Wynikowa Cw3 - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/biolmol2012-karta-wynikowa-cw3 7/15
Pracownia Biologii Molekularnej Karta Wynikowa Zastosowania Fizyki w Biologii i Medycynie: Biofizyka Molekularna, Projektowanie Molekularne i Bioinformatyka
Mieszaninę reakcyjną trawienia produktu PCR enzymem restrykcyjnym ………………………
przygotowano według następującego schematu:
Komponenty Stężenie końcowe PróbkaBufor do reakcji …… 10x 1x …..
Produkt PCR ……………… ..... µ g …..H2O ….
Enzym …………. …… U ….
Objętość końcowa 40 l
Hydrolizę DNA prowadzono w temperaturze ……..oC przez około ……………. h. Produkt
oczyszczono po reakcji za pomocą zestawu „Qiaquick Gel Extraction Purification Kit ” firmy
QIAGEN. DNA eluowano ze złoża krzemionkowego ………… µl ………..
Mieszaninę reakcyjną trawienia wektora pUC18 enzymem restrykcyjnym
……………………… przygotowano według następującego schematu:
Komponenty Stężenie końcowe PróbkaBufor do reakcji …… 10x 1x …
Wektor pUC18 ..... µ g ….
H2O ….
Enzym …………. ….. U ….
Objętość końcowa 40 l
Hydrolizę wektora prowadzono w temperaturze ……..oC przez około ……………. h.
Następnie w celu …………………………………………………………………. dodano
………..U ………………………….. FastAP i inkubowano przez ………….w ………….. oC.
Produkt oczyszczono po reakcji za pomocą zestawu „Qiaquick Gel Extraction Purification Kit ”
firmy QIAGEN. Zlinearyzowany wektor eluowano ze złoża krzemionkowego ………… µl
…………
Następnie przeprowadzono analizę elektroforetyczną strawionych i oczyszczonych próbek
wektora i produktu PCR. Analizę przeprowadzono w …………………………….....................
…………………………………………………………………………………………………..
Wstaw zdjęcie żelu wraz z opisem
7
5/17/2018 BiolMol2012 Karta Wynikowa Cw3 - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/biolmol2012-karta-wynikowa-cw3 8/15
Pracownia Biologii Molekularnej Karta Wynikowa Zastosowania Fizyki w Biologii i Medycynie: Biofizyka Molekularna, Projektowanie Molekularne i Bioinformatyka
(skomentuj wyniki)
…………………………………………………………………………....................................
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………..
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
4. Ligacja wektora ze wstawkąLigacja fragmentów DNA polega na tworzeniu wiązań fosfodiestrowych
………………………………………………… sąsiadujących nukleotydów. Najczęściej
stosowanym enzymem do ligacji fragmentu wstawki i wektora jest ………………………….
8
5/17/2018 BiolMol2012 Karta Wynikowa Cw3 - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/biolmol2012-karta-wynikowa-cw3 9/15
Pracownia Biologii Molekularnej Karta Wynikowa Zastosowania Fizyki w Biologii i Medycynie: Biofizyka Molekularna, Projektowanie Molekularne i Bioinformatyka
Mieszaninę ligacyjną wektora pUC18 i wstawki, które posiadają lepkie końce w wyniku
trawienia enzymem restrykcyjnym …………………………………….., przygotowano według
następującego schematu:
Komponenty Stężeniewyjściowe
Ilość/Stężeniekońcowe w próbce
Próbka A
Trawiony produkt PCR ….. ng/µl ……. ng …..
Liniowy wektor pUC18 ….. ng/µl …… ng ……
H2O …..
Mix zawierający:Bufor do reakcjiLigazę DNA T4
10x
5 U/µl
1x
3 U
10 µl
Objętość końcowa 30 l
Reakcję prowadzono w temperaturze ……………., przez ………….h. Nastepnie produktyligacji odczyszczono za pomocą zestawu „Qiaquick Gel Extraction Purification Kit ” firmy
QIAGEN. DNA eluowano ze złoża krzemionkowego ………… µl …………
Jako kontrolę przeprowadzono również recyrkulizację wektora pUC18 zlinearyzowanego
poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym …………………………..
W wyniku ligacji cDNA ……………. z wektorem pUC18 w klonowaniu na …………….
miejsce restrykcyjne mogą powstać następujące produkty:………………………………….....…………………………………………………………………………………………………..
…………………………………………………………………………………………………..
…………………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………….
…………………………………………………………………………………………………..
…………………………………………………………………………………………………..
5. Transformacja bakterii – szczep E. coli XL1-Blue
Stosując wektor pUC18 do klonowania, selekcja transformantów odbywa się poprzez
zastosowanie podłoża zawierającego ampicylinę, zaś selekcja transformantów zawierających
zrekombinowany plazmid, od tych, co posiadają pusty wektor, odbywa się za pomocą tzw. α-
komplementacji.
Opisz zasady selekcji metodą blue-white screnning
9
5/17/2018 BiolMol2012 Karta Wynikowa Cw3 - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/biolmol2012-karta-wynikowa-cw3 10/15
Pracownia Biologii Molekularnej Karta Wynikowa Zastosowania Fizyki w Biologii i Medycynie: Biofizyka Molekularna, Projektowanie Molekularne i Bioinformatyka
Elektrokompententne komórki bakteryjne E. coli szczep XL1-Blue transformowany był
mieszaniną ligacyjną metodą ……………………………… Do ………… µl. rozmrożonych na
lodzie komórek kompetentnych XL1-Blue dodano ……………. µl oczyszczonej mieszaniny
ligacyjnej. Mieszaninę przeniesiono do kuwet do elektroporacji i poddano działaniu impulsu
pola elektrycznego o parametrach: ……………………………………………………………..
Następnie dodano…………………………, przeniesiono komórki do 1,5 ml probówki i
inkubowano ……………………………… Następnie komórki wysiano na następujące
podłoża selekcyjne w następujących rozcieńczeniach:
1……………………………………
2…………………………………….
3……………………………………..
4……………………………………
6. Analiza rekombinowanych klonów pod względem obecności i orientacji wstawkiDo analizy obecności i orientacji wstawki zastosowano PCR kolonijny z następującymi parami
starterów:
1……………………………….
2……………………………….
3………………………………
10
5/17/2018 BiolMol2012 Karta Wynikowa Cw3 - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/biolmol2012-karta-wynikowa-cw3 11/15
Pracownia Biologii Molekularnej Karta Wynikowa Zastosowania Fizyki w Biologii i Medycynie: Biofizyka Molekularna, Projektowanie Molekularne i Bioinformatyka
Zastosowanie takich kombinacji starterów pozwala na analizę obecności oraz orientacji
wstawki w wektorze, gdyż…………………………………………………………………........
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
Analizę przeprowadzono w sposób następujący:
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
A mieszaniny reakcyjne przygotowano w następujący sposób:
Komponenty Stężeniewyjściowe
Ilość/Stężeniekońcowe w próbce
PróbkaA1
PróbkaA2
PróbkaA3
PróbkaB
Starter For dlawstawki
……….µM …… µM
Starter Rev dlawstawki
……… µM …… µM
M13For ………..µM ….. µM
dNTPs …….. mM ….. mMkoloniaKolonia-lizaddH2OMix zawierający:
Bufor Tag
Dream (10x)Pol Tag
Dream
10x
5 U/µl
1x
1,0 U10 µl 10 µl 10 µl 10 µl
Objętość końcowa 30 l 30 l 30 l 30 l
Reakcję PCR przeprowadzono według następującego profilu termicznego:
Segment Ilość cykli Temperatura Czas1 …. ….. …..
2
…..
…. ….
…. ….
…. ….
11
5/17/2018 BiolMol2012 Karta Wynikowa Cw3 - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/biolmol2012-karta-wynikowa-cw3 12/15
Pracownia Biologii Molekularnej Karta Wynikowa Zastosowania Fizyki w Biologii i Medycynie: Biofizyka Molekularna, Projektowanie Molekularne i Bioinformatyka
3 1 …. ….
4 1 …. ∞
Otrzymane produkty PCR analizowano …………………………………………………
Wstaw zdjęcie żelu wraz z opisem
W analizowanych klonach stwierdzono ………………………………………………………..
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………..
7. Izolacja DNA plazmidowego z komórek bakteryjnych
DNA plazmidowe izolowano z komórek bakteryjnych metodą lizy alkalicznej z zastosowaniem
zestawu do izolacji „QIAprep Spin Miniprep Kit ” firmy Qiagen.
12
5/17/2018 BiolMol2012 Karta Wynikowa Cw3 - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/biolmol2012-karta-wynikowa-cw3 13/15
Pracownia Biologii Molekularnej Karta Wynikowa Zastosowania Fizyki w Biologii i Medycynie: Biofizyka Molekularna, Projektowanie Molekularne i Bioinformatyka
Opisz metodę izolacji
Otrzymane DNA analizowano na …………….. żelu agarozowym.
Wstaw zdjęcie żelu wraz z opisem
13
5/17/2018 BiolMol2012 Karta Wynikowa Cw3 - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/biolmol2012-karta-wynikowa-cw3 14/15
Pracownia Biologii Molekularnej Karta Wynikowa Zastosowania Fizyki w Biologii i Medycynie: Biofizyka Molekularna, Projektowanie Molekularne i Bioinformatyka
Ocena jakości preparatu poprzez rozdział elektroforetyczny DNA w żelu agarozowym pokazała
………………………………………………………………………………………..
…………………………………………………………………………………………………..
…………………………………………………………………………………………………...
Ilość DNA oznaczono przez pomiar absorpcji w 260 nm
Parametry Badana próbkaIlość DNA ( X µl) dodana do 10 mM Tris-HCl
pH 8.0 V tot= 1ml
A260nm
A280nm
Stosunek A260nm/ A280nm
Stężenie wyjściowe plazmidu (ng/µl)
14
5/17/2018 BiolMol2012 Karta Wynikowa Cw3 - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/biolmol2012-karta-wynikowa-cw3 15/15
Pracownia Biologii Molekularnej Karta Wynikowa Zastosowania Fizyki w Biologii i Medycynie: Biofizyka Molekularna, Projektowanie Molekularne i Bioinformatyka
Stężenie DNA w otrzymanym preparacie wyniosło …………………………ng/µl. Całkowita
otrzymana ilość DNA wyniosła …………………… µg. Czystość preparatu oceniono na
podstawie ……………………………………, który wynosi ……………………, co świadczy
…………………………………………………………………………………………………...
PODSUMOWANIE:
..........................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................
..........................................................................................................
15