INSTITUTO DE BIOTECNOLOGiA

LINEA 1BIOlOGiA MOlECULAR Y BIOQuiMICA DE BACTERIAS

1.1 Caracterizaci6n de las protefnas de membrana extern a de Salmonella typhi1.2 Biologfa molecular del factor de adherencia localizada (BFP) de Escherichia coli

enteropat6gena (EPEe)1.3 Regulaci6n de la expresi6n del gene aprE de Bacillus subtilis

PROGRAMA 1.1Caracterizaci6n de las protefnas de membranaexterna de Salmonella thypi

S typhi es una bacteria gram-negativa, agente cau-sal de la fiebre tifoidea en humanos, la cual sigueprevaleciendo en los pafses en vfas de desarrollo.Preparaciones de protefnas de membrana externa(PME)de S typhi contienen tres componentes prin-cipales, los cuales son sintetizados en condicio-nes de crecimento dellaboratorio OmpC, OmpF y

eOmpA. En analogfa a Escherichia coli, OmpC y OmpFson protefnas formadoras de poros (porinas) yOmpA es una protefna estructural. Nuestro tra-bajo, asf como el de otros grupos, ha reveladoque las,PME pueden ser utilizadas con fines diag-n6sticos, demostrando a su vez su capacidad in-munogenica. Hemos aislado y caracterizado losgenes que codifican para las protefnas OmpC,OmpF, PhoE, OmpSl y OmpS2.

Nuestros estudios han revelado una gran con-servaci6n del gene ompC dentro del genero Salmo-nella; consistente con la noci6n de que este gene-ro bacteria no representa una sola especie, estoes, Salmonella enterica, y con la idea de que la porinaOmpC tiene un papel en la fisiologfa bacterianaque no Ie permite gran variabilidad. Por otro lado,hemos utilizado a OmpC como acarreadora de unepftope heter610go, definiendo asf dos regionesde OmpC expuestas a la superficie celular, utilespara la generaci6n de cepas vacunales multivalen-tes. Las protefnas OmpS 1 y OmpS2, constituyenPMEno.maypritarias en condiciones de Iaborato-

rio, las cuales conservan las caracterfsticas molecu-lares de la familia de las porinas, asf como se-cuencias particulares, principal mente en las re-giones expuestas. Nuestros experimentos noshan lIevado a definir una regi6n en el extremo 5'regulador de ompS 1 que esta involucrada en elcontrol negativo del gene. Por otro lado, hemosobservado que el regulador transcripcional OmpRse requiere para la expresi6n del gene y, posible-mente, tambien para su represi6n.

Nuestro objetivo es lograr una mejor compren-si6n del papel de las PMEen procesos inmunol6-gicos y de interacci6n con el huesped. Del mismomodo, estamos interesados en estudios de la re-laci6n estructura-funci6n, asf como de su regula-ci6n genetica.

El hecho de que una bacteria tenga genes quecodifican para porinas mayoritarias y minorita-rias, plantea una serie de cuestionamientos so-bre el papel que juega este repertorio de protef-nas en la adecuaci6n de S typhi a sus diferentesmicroambientes. Algunas de estas preguntas son:(,que tan inmunogenicas son las PMEno mayori-tarias?, (,cuales son las propiedades particularesde los poros que forman cada una de estas pro-tefnas?, (,tienen estas protefnas otra funci6n, ade-mas de formar poros?, (,Ios diferentes genes res-ponden a efectos ambientales diversos para serexpresados?, (,dependen estos genes del mismosistema regulador, por ejemplo de OmpR-EnvZ?,(,estan las PME implicadas en la interacci6n conentidades moleculares del huesped 0 en proce-sos patogenicos?

INFORME ANUAL ,0995

- Estudio sobre la expresi6n de los genes ompC,ompF, phoE, ompS I y ompS2 de S typhi

R. OROPEZA, M. FERNANDEZ, I. MARTINEZ, I. L. PUENTE Y

E. CALVA

I 994/P/S/DMM

-Clonaci6n, caracterizaci6n y analisis de una nue-va familia de genes (ompS) para PME de S typhi

M. FERNANDEZ, L GUTIERREZ, Y MARTfNEZ, I. L. PUENTE Y

E. CALVA

I 994/P/S/DMM

- Estudio del papel de las PME OmpC, OmpF,PhoE, OmpS I y OmpS2, asf como del oper6nompS, en la interacci6n de S typhi con celulas epi-teliales.

I. MARTINEZ, ). L. PUENTE, V. H. BUSTAMANTE Y E. CALVA

I 995/I/S/DMM

- Estudio sobre la variabilidad genetica de los ge-nes ompC, ompF, phoE, ompS I y ompS2 dentro delgenero Salmonella.

M. FERNANDEZ, G. ORDONEZ, R. OROPEZA, J. L. PUENTE Y

E. CALVA

I 995/I/S/DMM

-Caracterizaci6n de la respuesta inmune humo-ral hacia las PME OmpC, OmpF, PhoE, OmpS2 yOmpS2 de S typhi

I. MARTINEZ, J. L. PUENTE Y E. CALVA

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PROGRAMA 1.2Biologfa molecular del factor de adherencialocalizada (BFP) de Escherichia colienteropat6gena (EPEe)

Escherichia coli enteropat6gena (EPEC). es una causacomun de diarrea y malabsorci6n entre nifios quehabitan 10s pafses en vfas de desarollo. La infec-ci6n por EPEC se ha dividido en tres etapas prin-cipales: el primer paso consiste en la adherenciano fntima de la bacteria a la superficie de las ce-lulas epiteliales del huesped. La segunda etapainvolucra la transducci6n de sefiales de la bacte-ria a la celula epitelial. 10 que induce la destruc-ci6n de las microvellosidades. Durante la tercera

etapa ocurren importantes rearreglos del citoes-queleto, reflejados por la acumulaci6n de actinajusta debajo del sitio de interacci6n entre la bac-teria y la membrana de la celula epitelial Conesto, se promueve el establecimiento de un con-tacto fntimo y, por ultimo, la eventual internacio-nalizaci6n de la bacteria. Este fenotipo puede serproducido in vitro utilizando celulas epiteliales encultivo, alas cuales EPEC se adhiere en forma demicrocolonias, 10 cual se conoce como adheren-cia localizada (LA)

Diferentes estudios han pertimido definir quela entidad responsable de la formaci6n de micro-colonias, y del primer contacto entre la bacteriay la celula epitelial, es una fimbria denominadaBFP (del ingles, "bundle-forming pili") EI gene quecodifica para la subunidad estructural de estaFimbria, asf como los genes involucrados en subiogenesis y regulaci6n de 80 kb). caracterfsticode los serotipos pertenecientes a EPEe.

La expresi6n del gene bfpA es regulada a niveltranscripcional y se induce unicamente durantela fase exponencial de crecimiento. Asimismo, esinfluenciada por las concentraciones de calcio yamonio en el medio de crecimiento, y dependedel activador transcripcional BfpT, el cual tam-bien se encuentra codificado por el plasmido EAF

y comparte homologfa con los miembros de lafamilia AraC de reguladores transcripcionales

Estamos interesados en el estudio detalladode los mecanismos moleculares que controlan laexpresi6n de BFP, tanto in vivo como in vitro, toman-do como modelo inicial el gene bfpA, el cual co-difica para la subunidad principal de la fimbria.Asimismo, queremos definir si la expresi6n de BFP

forma parte de un sistema global de regulaci6n,que coordine la expresi6n de otros genes de viru-lencia de EPEe. probablemente a traves del regula-dor BfpT. Queremos, tambien, integrar el conoci-miento generado a partir de nuestros estudios, enun modelo que nos permita correlacionar nues-tras observaciones in vitro con el modo y mecanis-mo de infecci6n de EPEC, y con el ambiente fisio-16gico de los nichos que coloniza en el huesped.

Por otra parte, resulta interesante tomar comomodelo el regulador BfpT, para generar conoci-

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miento basico sobre los mecanismos molecularesque permiten a los reguladores, pertenecientes ala familia AraC, sensar y responder a seliales am-bientales para modular la expresi6n de genes re-gulados en forma coordinada.

• Caracterizaci6n de los mecanismos molecula-res que regulan la expresi6n del gene bfpA quecodifica para la subunidad estructural del fac-tor de adherencia localizada (BFP) de EPEe.

v H BUSTAMANTE, E. CALVA y I L. PUENTE

I 994/P/S/DMM

• Estudios sobre la regulaci6n del gene bfpA deEPEe.

Y MARTiNEZ, e. SANCHEZ, v H. BUSTAMANTE, E. CALVA Y

I L. PUENTE

I 995/I/S/DMM

.Caracterizaci6n funcional de BfpT, el activadortranscripcionaJ del gene bfpA de EPEC

e. SANCHEZ, v H. BUSTAMANTE, F J SANTANA, Y MARTI-

NEZ, E. CALVA Y I L. PUENTE

I 995/I/S/DMM

.Caracterizaci6n de la funci6n del producto delos genes bfpu, bfpv y bfoW, en la regulaci6n delgene bfpA de EPEC

v H. BUSTAMANTE. e. SANCHEZ, Y MARTINEZ, F I SANTA-

NA, E. CALVA Y J. L. PUENTE

I 995/I/S/DMM

• Estudio sobre la organizaci6n transcripcional delos genes bfpB-bfpM involucrados en la biogene-sis del factor de adherencia (BFP) de EPEe.

F J. SANTANA, V H. BUSTAMANTE, E. CALVA Y J. L. PUENTE

I 995/I/S/DMM

PROGRAMA 1.3Regulaci6n de la expresi6n del gene aprE deBacillus subtilis

EI gene aprE codifica para la sfntesis de la protea-sa alcalina de B. subtilis. Su expresi6n esta asocia-da al proceso de esporulaci6n y se produce enlas primeras dos horas despues de haber term i-nado la fase exponencial de crecimiento. Existen

numerosos circuitos que permiten la regulaci6nfina de este gene Por ejemplo, se sabe que el sis-tema de dos componentes DegS-DegU es capazde incrementar la expresi6n de aprE mas de 40veces ante una selial aun no identificada.

En nuestro laboratorio estamos interesadosen entender las interacciones entre algunos delos sistemas de regulaci6n identificados .

• Papel del regulador SinR en la expresi6n del ge-ne aprE de B. subtilis

J. OLMOS, F BOLiVAR Y F VALLE

I 993/P/DMM

• Relaci6n estructura-funci6n de la regi6n de con-trol del gene aprE de B. subtilis

I ROBLERO, E. MERINO Y F VALLE

I 994/P/DMM