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Producción de embriones

La producción de embriones bovinosin vitro se aplica, hoy en día, no sólo eninvestigación y como modelo para obte-ner embriones en otras especies, incluidala humana, sino también para obtenerdescendencia a partir de vacas de altovalor genético. También es útil para un últi-mo aprovechamiento de hembras sacrifi-

cadas por motivos sanitarios, accidentes oreposición. En la actualidad, la recupera-ción de ovocitos de hembras vivas porpunción transvaginal guiada ecográfica-mente (Ovum Pick-Up; OPU) y su posteriormaduración, fecundación y cultivo in vitropermite la producción de embriones quepueden ser criopreservados o bien trans-feridos a hembras receptoras (Kruip et al.,1994; Hasler et al., 1995).

INFORMACIÓN GANADERA

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Biotecnologías reproductivas:Producción y criopreservaciónde embriones bovinosin vitroCARMEN DÍEZ MONFORTE. Área de Genética y Reproducción. Centro de Biotecnología Animal. SERIDA. [email protected]

MARTA MUÑOZ LLAMOSAS. Área de Genética y Reproducción. Centro de Biotecnología Animal. SERIDA. [email protected]

JOSÉ NÉSTOR CAAMAÑO GUALDONI. Área de Genética y Reproducción. Centro de Biotecnología Animal. SERIDA. [email protected]

ENRIQUE GÓMEZ PIÑEIRO. Jefe del Área de Genética y Reproducción. Centro de Biotecnología Animal. SERIDA. [email protected]

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Los avances más recientes permiten,además, producir in vitro embriones desexo conocido mediante la utilización deespermatozoides sexados procedentesde semen separado por técnicas de aná-lisis celular como la citometría de flujo, loque posibilita una racionalización de laexplotación de los rebaños.

Criopreservación

Un complemento indispensable paraconsolidar las técnicas de reproducciónasistida es la posibilidad de criopreservarlos embriones producidos.

La criopreservación es un procesoque consiste en mantener células, tejidos

u organismos a muy bajas temperaturascon el fin de reducir o suspender sus fun-ciones vitales y preservarlos vivosdurante largos periodos de tiempo.

La criopreservación de embrionespresenta numerosas ventajas, tantodesde el punto de vista biológico comodel comercial. Entre ellas cabe destacar:

• Permite reducir costes

• Evita la dependencia de la actividadreproductiva cíclica y del estado fisi-ológico de los animales (hembrasreceptoras, por ejemplo)

• Limita la deriva genética (cambios enlas caracteristicas de una poblacióndebido a la variación en la frecuenciade los genes)


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Figura 1.-Zigotos bovinosproducidos in vitro 1 díapost-fecundación(post-FIV).

Figura 2.-Embrionesbovinos producidos in vitroen día 3 post-FIV.

Figura 3.-Embrionesbovinos producidos in vitroen día 6 post-FIV

Figura 4.-Embrionesbovinos producidos in vitroen día 8 post-FIV.

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• Elimina las patologías que normal-mente se asocian al mantenimientode animales vivos y

• Hace posible la conservación derazas o especies en riesgo de extin-ción mediante la creación de bancosde embriones y/o gametos congela-dos.

En el ámbito del ganado vacuno, y enel marco de la Unión Europea, las estadís-ticas más recientes muestran que el 58%de los embriones transferidos son conge-lados (AETE, 2009).

El mayor obstáculo asociado a la difu-sión de la tecnología reproductiva in vitroes la falta de métodos eficaces para con-servar a largo plazo los embriones produ-cidos in vitro.

El campo de la criobiología de losembriones bovinos empezó a explorarsedurante la década de los 70, cuando sedemostró que los embriones bovinospodían sobrevivir a la congelación(Wilmut y Rowson, 1973). Desde enton-ces, la investigación ha permitido simplifi-car los procedimientos de congelación ydescongelación, con el fin de hacer posi-ble el uso rutinario de estas técnicas,aumentando la viabilidad embrionariatras la descongelación.

Sin embargo, los sistemas de produc-ción in vitro dan lugar a embriones concaracterísticas morfológicas y metabóli-cas diferentes a los que se obtienen invivo (por superovulación y posterior lava-do uterino de una hembra donante)(Lonergan et al., 2007; Wrenzycki et al.,2005). Los embriones producidos in vitropresentan citoplasmas (parte de la célulacomprendida entre la membrana y elnúcleo) más oscuros y con menor densi-dad, alteración en el número de células ysu distribución, distinta expresión génica(mecanismo por el que la informacióncodificada en un gen se traduce enestructuras y funciones de la célula) ymayor incidencia de anomalías cromosó-micas. Estas diferencias se traducen enun menor rendimiento de los embrionesproducidos in vitro frente a los produci-dos in vivo (Leibo y Loskutoff, 1993;Leibo et al., 1996).

La eficacia de los sistemas de pro-ducción de embriones bovinos in vitrooscila entre un 30 y un 40% de blasto-cistos (fase del desarrollo embrionariotemprano) con calidad suficiente paraser transferidos, sobre el total de los ovo-citos puestos en cultivo (Gómez et al.,2008). Aunque hay grandes evidenciasde que las condiciones de cultivo post-fecundación son determinantes para lacalidad de los embriones obtenidos(Lonergan et al., 2001), hay que señalarque la eficiencia de la producción deembriones in vitro está ligada no sólo alsistema de cultivo, sino a la calidad intrín-seca de los ovocitos (Rizos et al., 2008).Los índices de gestación tras la transfe-rencia de embriones frescos producidosin vitro oscilan en torno al 50%, cifrasque se reducen cuando los embrioneshan sido criopreservados. En general, seasume que cuanto más se prolonga eltratamiento in vitro, mayores son las dife-rencias entre los embriones producidosin vivo y los obtenidos in vitro (Rizos etal., 2008).

En el ganado bovino, la baja resisten-cia a la congelación de los embrionesproducidos in vitro condiciona la difusiónde esta tecnología. No obstante, la mani-pulación de los sistemas de cultivo puedepermitir mejorar la calidad de los embrio-nes, y aumentar la supervivencia in vitro ala vitrificación/desvitrificación. Así, la reti-rada del suero de los medios de cultivo yel incremento de las concentraciones dealbúmina sérica bovina, combinadas conla aplicación de protocolos de vitrifica-ción han demostrado incrementar lasupervivencia de los embriones produci-dos in vitro a la criopreservación (Gómezet al., 2008).

Estrategias para la conservación deembriones

Hoy en día, se dispone de tres técni-cas para la conservación de embriones:la congelación lenta (o clásica), la vitrifi-cación tradicional (en pajuela) y la vitrifi-cación ultrarrápida. Aunque la criopreser-vación de embriones producidos in vitrose puede abordar por técnicas de conge-lación lenta, se asume que la vitrificaciónes la herramienta de elección para estosembriones.




La congelación lenta (que utiliza bajasconcentraciones de agentes crioprotecto-res) de los embriones producidos in vitroreduce su supervivencia en comparacióncon los embriones obtenidos in vivo, debi-do principalmente a la mayor susceptibili-dad de aquéllos a la formación de crista-les de hielo que dañan la estructura de losórganos celulares.

La vitrificación permite mejorar lasupervivencia del embrión tras la desvitri-ficación (Vajta et al., 2000) al producirmenor estrés metabólico en los embrio-nes, dando lugar a mayores porcentajesde gestación tras su transferencia areceptoras. Estos efectos beneficiosos dela vitrificación se deben a una reducciónde los daños producidos por el frío, al uti-lizarse altas concentraciones de agentescrioprotectores y elevadas velocidadesde enfriamiento y calentamiento, con loque se evita la formación de cristales dehielo y se reducen los tiempos de exposi-ción de la célula al crioprotector (Rall andFahy, 1985).

Las técnicas de vitrificación ultrarrá-pida, desarrolladas recientemente, hanestimulado los avances en el campo de lacriopreservación de gametos y embrio-nes, con especial relevancia en el casode la preservación de especies en riesgode extinción, dados los resultados positi-vos obtenidos especialmente en el caso

de los embriones producidos in vitro y delos ovocitos.

Para que la vitrificación sea eficaz seprecisa que la exposición a la solucióncrioprotectora dure el menor tiempoposible (Gardner et al., 2007) y disponerel ovocito o el embrión en volúmenesmuy reducidos de medio (0,5-2µL demedio). Así, técnicas como Open PulledStraw (OPS), Solid Surface Vitrification(SSV), cryoloop, cryotop, Vitmaster, ofiberplugs (ver revisión por Gardner et al.,2007) se usan rutinariamente en muchoslaboratorios de fecundación in vitro. Sinembargo, la técnica de vitrificación pre-senta dos limitaciones importantes:

La desvitrificación requiere diluir y reti-rar el agente crioprotector antes de trans-ferir el embrión. Las condiciones de ma-nipulación (temperatura ambiental -39ºC,temperatura de las soluciones de desvitri-ficación -41ºC-, dilución en solucionescon concentraciones decrecientes desacarosa) son difíciles de establecer enlas granjas, extremo muy importante en elcaso del ganado vacuno.

La técnica no es sanitariamente segu-ra. Debe tenerse en cuenta el riesgopotencial de que se produzcan contami-naciones cruzadas, especialmente si sealmacenan conjuntamente embriones y/ogametos de diferentes especies. Este

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Vitrificación deembriones.




aspecto cobra especial importancia, tam-bién, en el caso de los Bancos de Recur-sos Zoogenéticos. Sin embargo, en laactualidad se han modificado algunos delos protocolos y se están utilizando reci-pientes estancos capaces de albergar yaislar perfectamente el embrión u ovocito.

Biotecnologías reproductivasdesarrolladas en el SERIDA

El Área de Genética y ReproducciónAnimal del SERIDA realiza, desde hacecasi dos décadas, una intensa actividadinvestigadora en el campo de las nuevasbiotecnologías reproductivas.

Los proyectos de investigación desar-rollados han permitido la puesta a puntode la técnica de Ovum Pick-Up (OPU), asícomo la de vitrificación (sistema clásicoen pajuela) de los embriones. Estos tra-bajos cristalizaron en la obtención de losprimeros terneros nacidos en España,tras la transferencia de embriones pro-ducidos in vitro y conservados por vitrifi-cación. Así, Pelayo y Cova fueron losprimeros terneros nacidos tras aplicar latécnica OPU y Xicu y Marina, los primerosque se obtuvieron tras aplicar la técnicade vitrificación.

Además, se abordó el estudio de larepercusión de los sistemas de produc-

ción de embriones in vitro sobre sus car-acterísticas criobiológicas con el fin dediseñar un sistema de cultivo capaz depermitir un óptimo desarrollo embri-onario y que, combinado con un adecua-do sistema de vitrificación nos permitieraobtener embriones in vitro que sobre-vivieran a la criopreservación en por-centajes superiores al 50%. En la actuali-dad, el método de vitrificación clásico hasido sustituido por métodos de mínimovolumen, y los embriones producidos invitro son vitrificados por la técnica OPS oen Fiberplugs, con elevados porcentajesde supervivencia in vitro.

El mejor índice de calidad embrionariaes la constatación de que la transferenciade los embriones a las receptoras se tra-duzca en gestaciones, lo cual es una con-dición necesaria para lograr una comple-ta expansión de las tecnologías in vitro.Para ello, durante el último semestre de2010 se están realizando transferenciasde embriones producidos in vitro, consemen sexado, en fresco o tras vitrifica-ción, y que servirán para comprobar si losresultados de supervivencia in vitro obte-nidos permiten aplicar adecuadamente latécnica en la granja.

Las líneas de investigación actuales encriobiología, pasan por mejorar la calidadembrionaria ,previa a la vitrificación juntocon la utilización de semen sexado para

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Congelador programablepara embriones.




producir embriones de sexo conocido.Todo ello, se enmarca en un programa deinvestigación que estudia el desarrolloembrionario bovino in vitro e in vivo, conel fin de aumentar los índices de estable-cimiento de gestaciones del sexo desea-do y de mejorar la supervivencia y lasalud de los animales nacidos.

Además de la criopreservación deembriones bovinos producidos in vitro,línea que también se extiende a los ovo-citos bovinos, otras líneas de investiga-ción en curso son las siguientes:

• Identificación, aislamiento y análisisfuncional de proteínas del medio ute-rino para su incorporación a mediosde cultivo in vitro.

• Desarrollo de técnicas no invasivaspara predecir los índices de gesta-ción de embriones y receptoras, y elsexo de los embriones cultivados.

• Utilización de la microscopía de luzpolarizada como técnica no invasivapara evaluar la calidad de los ovocitosen especies domésticas.

• Caracterización de líneas celularespluripotentes en ganado bovino.

Agradecimientos

B. Trigal, CajAstur. E. Correia, Ministerio deCiencia e Innovación (MICIN). S. Carrocera, D.Martín MICIN-Fondo Social Europeo. InstitutoNacional de Investigación y Tecnología Agra-ria y Alimentaria (INIA) proyectos: RTA2008-0082 y RZ2008-0014.

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