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BIOTECNOLOGIAS REPRODUCTIVAS DE AVANZADA

Giselle del Carmen Gamarra LazoIng. Zootecnista, Responsable del Centro de Investigación y Enseñanza en

Transferencia de Embriones - CIETEConvenio Ministerio de Agricultura - Universidad Nacional Agraria La

Molina

Desarrollo generacional de la Desarrollo generacional de la biotecnologbiotecnologíía de la reproduccia de la reproduccióónn

5° 2000 TRANSGENESIS

4° 1990 CLONACION CON CELULAS SOMATICAS (97)

3° 1980 SEXADO DE EMBRIONES Y ESPERMATOZOIDES (83)PRODUCCION EMBRIONES in vitro (87)

2° 1970 CONTROL HORMONAL-SUPEROVULACIONTRANSFERENCIA, CONGELACION, DIVISION DE EMBRIONES

1° 1908 INSEMINACION ARTIFICIALGENERACI

ON

Palma & Gottfriend, 2001

Objetivo fundamental de las biotecnologObjetivo fundamental de las biotecnologíías as reproductivas de avanzadareproductivas de avanzada

Producción de crías de sexo y composición genética pre-determinada de acuerdo a las necesidades del mercado.Optimización de la eficiencia productiva (productividad) de los animales en explotación.Hacer viables la creación de nuevos y mas eficientes sistemas de producción Animal

Factores que determinan la Factores que determinan la productividad animalproductividad animal

Productividad animal = eficiencia de los animales para transformar los recursos ofrecidos por el hombre en productos animales para su beneficio Eficiencia de transformación depende de la composición genética del animal y su interacción con el ambienteLa proporción (frecuencia) de genes deseables para el carácter en particular determina la habilidad genética del animal para producir eficientemente el producto animal especifico

Progreso GenProgreso Genéético (PG)tico (PG)

El PG es el incremento en la producción anual debido a cambios en la composición genética de los animales Debemos incrementar la frecuencia de genes deseables para incrementar la productividad animal .La intensidad con la que podemos distribuir los genes deseables en la población depende de la tecnología reproductiva que usemos.

Factores que determina el Progreso Factores que determina el Progreso GenGenééticotico

Intensidad de selección: es la proporción de animales de la población total que son seleccionados como reproductores.

Precisión de selección: Es la medida del grado de coincidencia entre nuestra estimación del valor genético de un animal y su valor genético real.

Variabilidad genética: Si no hay variación no hay posibilidad de selección ya que todos los animales serían iguales.

Intervalo entre generaciones: Se define como la edad promedio de los padres al momento de producirse el nacimiento de la cría. Cuanto más avanzada la edad de los padres al momento del nacimiento de la cría menor será el ritmo del PG.

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InteracciInteraccióón de los Factores del PGn de los Factores del PG

PG = Intensidad de selección x Precisión de selección x Variabilidad genéticaIntervalo entre generaciones

La Fórmula del PG es la siguiente:

“Las biotecnologías reproductivas utilizadas para la reproducción animal, influyen en cada uno de los factores determinantes del ritmo del progeso genético del animal.”

Valor genValor genéético de la crtico de la crííaa

= Valor genético del padre + Valor genético de la madre2

MaximizaciMaximizacióón de progreso n de progreso gengenéético por generacitico por generacióónn

Selección deberá ser tan intensa en el lado paterno como en el materno.Normalmente 75 a 80% de las hembras de la población son potenciales madres de la futura generación mientras que solo el 3 a 4% de la población de machos son potenciales padres de la futura generación.En el bovino, una vaca solo produce en promedio 0.75 crías por año.La única forma de lograr una alta intensidad de selección en las madres es produciendo varias crías por madre por año.Para seleccionar solo el 10% superior como madres de la siguiente generación cada madre deberá producir 3 crías hembra por año para un sistema de reemplazo del 25%.

Uso de tecnologUso de tecnologíías reproductivas de as reproductivas de avanzada para optimizar el ritmo de avanzada para optimizar el ritmo de

Progreso GenProgreso Genééticotico

a) a) InseminaciInseminacióón artificialn artificial: basada en la maximizaci: basada en la maximizacióón del uso de machos de n del uso de machos de alto valor genalto valor genéético (incremento de la tasa reproductiva de los machos): tico (incremento de la tasa reproductiva de los machos): ganancia genganancia genéética 1.5% sobre el promedio de la poblacitica 1.5% sobre el promedio de la poblacióón por an por añño.o.

b) b) Incremento de la tasa reproductiva de las hembrasIncremento de la tasa reproductiva de las hembras: mas de una cr: mas de una críía por a por madre selecta:(Ganancia genmadre selecta:(Ganancia genéética 3.5%/atica 3.5%/añño):o):

1. 1. --SuperovulaciSuperovulacióón, coleccin, coleccióón y transferencia embrionaria.n y transferencia embrionaria.2.2.-- ColecciColeccióón de ovocitos, produccin de ovocitos, produccióón de embriones in vitro yn de embriones in vitro y

transferencia embrionaria.transferencia embrionaria.

c) c) ClonaciClonacióón de individuos selectosn de individuos selectos: 120 a 125% de ganancia gen: 120 a 125% de ganancia genéética en la tica en la primera serie.primera serie.

Fuente: Dr. William Vivanco Mackie

TECNICAS REPRODUCTIVASTECNICAS REPRODUCTIVAS

Las principales biotecnologías reproductivas desarrolladas en vacunos son:

Inseminación artificial y congelación de semen.

Superovulación, transferencia y congelación de embriones.

Micromanipulación de embriones para producir mellizos,homocitos y quimeras.

Determinación y selección del sexo de embriones y espermatozoides.

Producción in vitro de embriones.

Clonado de animales por medio de transferencia nuclear.

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InseminaciInseminacióón Artificialn Artificial

•Eliminación y disminución de enfermedades sexuales

•Aumento de la eficiencia de la estimación del valor genético (test deprogenie)

Correcta fijación cervical

• Maximiza el uso de machos de alto valor genético (incremento de la tasa reproductiva de los machos)

Ganancia genética 1.5% sobre el promedio de la población por año

TECNOLOGIAS DE AVANZADA PARA EL TECNOLOGIAS DE AVANZADA PARA EL INCREMENTO DE LA TASA REPRODUCTIVA EN INCREMENTO DE LA TASA REPRODUCTIVA EN

HEMBRASHEMBRAS

Superovulación, transferencia y congelación de embriones

Colección de ovocitos y producción de embriones in vitro

Producción y Transferencia de embriones in vivo(Técnica MOET)

VENTAJAS :Producción de crías selectas a mayor escala (para venta o incremento de la intensidad de selección).Bajos costos de transporte de material genético.Disminuye el intervalo de generación en la selección de núcleos de reproductores (Método MOET).Obtencion de crias de hembras con problemas de fertilidad.Disminuye la propagación de enfermedades de transmisión sexual.Recuperación más eficaz de individuos exóticos y razas enpeligro de extinción

Ganancia genGanancia genéética 3.5%/atica 3.5%/añño o

DESVENTAJAS :Requiere de técnicas avanzadas y complejas.Requiere investigación en las áreas de: alimentación, reproducción, mejoramiento, etc.Mayor costo comparado a la IA.Efectos adversos por el uso de hormonas (desarrollo de anticuerpos en algunos casos).Desviar la línea de crianza por mala selección.Registros complejos (inspecciones del tipo sanguíneo).

Tecnología de la producción de embriones in vivo

Vaca donadora y terneros quintillizos producidos en una sola colección embrionaria por lo especialistas del CIETE en el establo Monte Grande –

Puente Piedra.

Folículo Primordial

Folículo Primario Folículo Primario(multilayer)

Folículo antralFolículo de Graff

Ovocito (ovulación)

Cel Cumulus

Cel. Teca

Cel. Granulosa

zona pelucida

DESARROLLO FOLICULARDESARROLLO FOLICULAR celo celo

0 3 6 9 12 15 18 21

Eventos del ciclo estral con dos ondas foliculares en una hembra bovina

Foliculoovulatorio

Luteinizacion

Foliculo dominate Foliculo dominate en atresia

Cuerpo luteo en actividad

Foliculopotencial

Luteolisis

Foliculo en atresia

Dia del Ciclo

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Tecnología de la producción de embriones in vivo

Superovulación de la donadora

Inseminación

Colección de embriones

Congelación embrionaria

Transferencia de embrionesTasa de preñez: ~ 55%

Superovulación de la donadora

AM

Implante de Progesterona y estrogeno

FSH FSH FSH FSH IA (detección

de celo)

PMFSH

FSH, aplicación a receptoras

PG

FSH , PGF , se retira el implante

FSH IA (detección

de celo)

Día 1 … Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 … Día 16

Colección de embriones de acuerdo al día

de IA

Implante de ProgesteronaCIDR-B

Hormona FSH FOLLTROPIN VRespuesta superovulatoria

Inseminación

2 - 3 Inseminaciones cada 8 -12 horas según la duración del celo

Colección de embriones

Recolección de embriones por el método transcervical comúnmente usado.

Sistema cerrado: medio ingresa por gravedad y sale por sifonaje.

Intervalo de colección día 6 y 8 después del celo.

Optimo: Día 7 (Blastocisto, blastocisto expandido)

Proceso de colección de embriones

Brete a desnivel

Colección

Materiales necesarios y medio MDPBS + antibióticoAnestesia epidural

(antes Limpieza del recto y determinación de CL)

Búsqueda de embriones

Filtrado

ClasificaciClasificacióón de los embrionesn de los embriones•Excelente : blastómeros de color y tamaño uniforme.

•Bueno: escasa imperfecciones, exclusión de algún blastómero.

•Regular: leves alteraciones de la forma, degeneración en alguna célula o varios blastómeros excluidos.

•Pobre: Células degeneradas 30-50% numerosos blastómeros externos.

Blastocistoexcelente Blastocisto bueno

Mórula compacta

pobre

Mórula compacta regular

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No No UsarUsar

Estructuras no fertilizadas NFEstadios muy tempranos ETDegenerados Deg

NF ET Deg

Para TE o Para TE o congelamientocongelamiento

Congelación embrionaria

Sala de congelación embrionaria

Congelador de embrionesDuración del proceso aprox.

1 hora.

•Embriones son equilibrados con la solución de trabajo (crioprotector 1.5M Etilenglicol + 0.1 M Sucrosa en MDPBS al 0.4%).

•Luego se colocan en pajillas de 0.25, con al embrión en solución de trabajo y medio MDPBS 0.4% BSA).

•El congelador realiza un descenso controlado de la temperatura desde –6 C hasta –32C, a razón de –0.1 C/minuto y de –32C a –35C a razón de –0.3 C/minuto. El seeding se realiza a – 6C.

• Almacenamiento en tanques de N2 liquido.

Transferencia no quirúrgica de embriones

•La receptora ideal es la hembra joven libre de enfermedades que ha parido sin ayuda y ha destetado exitosamente sus propias crías y que aún es joven y capaz de gestar normalmente.

•Es recomendable programar dos receptoras por embrión disponible.

Materiales necesarios

POSICION DE LA POSICION DE LA TRANSFERENCIATRANSFERENCIA

VENTAJAS• Uso de hembras infértiles o que no

responden a tratamientos superovulatorios.

• Producción de embriones con ovarios de matadero.

• Eficiencia en la utilización de semen (1 dosis puede inseminar 200 ovocitos).

• Disminuye aun mas el intervalo generacional al trabajar con terneras > 5 meses de edad.

• Críopreservación de ovocitos.

• Se pueden utilizar vacas con preñeces tempranas.

DESVENTAJAS• Síndrome del ternero grande• Altos costos en la inversión inicial.• Capacitación especializada

ProducciProduccióón in vitro de embrionesn in vitro de embriones Tecnología de colección de ovocitos y producción de embriones in vitro

Obtención de ovocitos

Maduración in vitro

Fertilización in vitro

Cultivo in vitro

• Animales vivos por aspiración folicular (OPU)• Animales beneficiados (ovarios de camal)

40% de preñez(20 – 35% blastocistos)

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AspiraciAspiracióón y bn y búúsqueda de ovocitos de squeda de ovocitos de ovarios de camalovarios de camal

X

Transporte del ovario en solución salina a 25 oC

Búsqueda de ovocitos en estéreo microscopios y colocación a placas de 35 mm con medio MDPBS + Heparina

Aspiración del fluido folicular a placas de 90 mm

Agujas de 19 Gx11/2” bisel corto

Ovarios mantenidos a 25 CLavado de ovarios con alcohol 70% y solución salina

ColecciColeccióón Transvaginal en Vacunos n Transvaginal en Vacunos –– Ovum Ovum Pick Up (OPU)Pick Up (OPU)

guia aguja

Sonda

Colección Transvaginal de ovocitos (TVR -OPU)

Pared vaginal

Instrumento y ovario ultrasonografia

transductor multiangulo

A B CD

Ovocitos denudados Rodeado de fibrina

Parcialmente rodeado por células del cúmulos

Completamente rodeado por 4-5 capas de célulasdel cúmulo

* Descartar categoría C y D

BBúúsqueda y clasificacisqueda y clasificacióón de ovocitosn de ovocitos

MaduraciMaduracióón de ovocitosn de ovocitosOvocito maduro en fase de Metafase II

Tipos: Utilizando medios de maduración muy simples TCM 199 (tissue culture media 199 de Sigma)Utilizando medios complejos (TCM 199 + aditivos, factores de crecimiento, inductores de división celular, etc.)Maduración in vivo

Ambiente de maduraciAmbiente de maduracióón: n: Incubador de CO2Incubador de CO2

38.5 °C, 5% CO2, Humedad Alta

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Objetivo de la maduraciObjetivo de la maduracióónn

Ovocitos con vesícula germinal

Ovocitos en metafase II

Cultivo por 24 h

* Células del cúmulo muy importantes para el proceso de maduración

FertilizaciFertilizacióón in vitron in vitro

Ovocitos madurosOvocitos maduros

InseminaciInseminacióónnIngresos del espermatozoide y Ingresos del espermatozoide y formaciformacióón deln del segundo cuerpo polarsegundo cuerpo polar

Micro ambiente adecuadoMicro ambiente adecuado38.5 °C, 5% CO2, 98% Hd

Espermatozoides Espermatozoides capacitadoscapacitados

Pronúcleo (masculino y femenino

*Concentraciones bajas: Fallas de fertilización *Concentraciones altas: Polispermia

Cultivo de embrionesCultivo de embriones

Sistema de Co-cultivo: embriones se cultivan con celúlas somáticas.

Celulas preparadas en el laboratorio: Celulas epiteliales del oviducto, celulas de la granulosa ovárica (más usadas).

embriones

Tiene como objetivo continuar el proceso de desarrollo del embrión hasta el día 7 u 8.

Micro ambiente de CultivoMicro ambiente de Cultivo

Medio utilizado: SOFFaa (Sinthetic Oviduct Fluid)+ 5% SFBMezcla de gases: 5% CO2, 7% O2, 88% N2Temperatura: 38.5 °C

*Los embriones permanecen en las placas de co-cultivo hasta el día 7 u 8.

Incubador seco

Incubador modular

Incubador Seco

DESARROLLO EMBRIONARIO

Ovocitos maduros(1 cuerpo polar)

Ovocito fertilizado(2 cuerpos polares)

Embriones de 2 células(día 1-2)

Embriones de 4 células(día 3-4)

Embriones de 8 células(día 5)

Embriones de varios estadios(día 7-9)

Primeros embriones in vitro en el Primeros embriones in vitro en el PerPerúú

Embriones de varios estadios(día 7-9)

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337%100%236%100%Porcentaje de eficiencia en la producción de terneros (haciendo MOET = 100%)

6419135.5Numero de terneros producidos 40%55%40%55%Porcentaje de terneros nacidos

160353210Numero de embriones producidos en el periodo

807162Numero de colecciones embrionarias en el periodo

2525Numero de embriones producidos por colección embrionaria o por TVR

OPU-IVPMOETOPU-IVPMOET

Producción de embriones dedicando las donantes a producción embrionaria

todo el ano

Producción de embriones entre los

30 y 90 días post parto

Eficiencia comparativa entre MOET y OPUEficiencia comparativa entre MOET y OPU--TVRTVR

Fuente: Vivanco, 1997

Factores que determinan la adopciFactores que determinan la adopcióón n de la tecnologia de transferencia de la tecnologia de transferencia

embrionariaembrionaria

A. Relación Beneficio / CostoB. Existencia de Programas de Mej. GenéticoC. Grado de tecnificación de la granjaD. Acceso a servicios técnicosE. Tipo de tecnología a usarseF. Percepción del ganadero, consideraciones éticas,

opinión publica.

TecnologTecnologíías complementarias a as complementarias a la produccila produccióón de embrionesn de embriones

Aumentan la presión de selección en la población de madres debido a que se puede incrementar aun mas la producción de crías por madre selecta:– Sexado de embriones – Uso de espermatozoides sexados: aumento en numero

de crías del sexo requerido; utilización eficiente de ovocitos colectados.

– Clonación (multiplicación) de embriones sexados

• Obtencion de biopsia• Reaccion en cadena de polimerasa

(PCR) para determinar presencia de cromosoma “Y”

• Reacción enzimatica• Fluorescencia• 95% de muestras son sexadas

exitosamente• No se afecta la viabilidad

Sexado de embriones

Determinación del sexo de embriones por el Método PCR

ReacciReaccióón en cadena de n en cadena de polimerasapolimerasa(PCR)(PCR)

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MultiplicaciMultiplicacióón de embriones n de embriones sexadossexados por biseccipor biseccióón o clonado n o clonado

perfectoperfectoBISECCION DE EMBRIONESBISECCION DE EMBRIONES

MultiplicaciMultiplicacióón de embriones n de embriones sexados por disgregacisexados por disgregacióón de n de

blastblastóómerosmeros

Cel. Totipotentes

SeparaciSeparacióón de espermatozoides n de espermatozoides ““XX”” e e ““YY””para la produccion de crias de sexo para la produccion de crias de sexo

predeterminadopredeterminadoMétodo comprobado: Citometria de flujoPrecisión de sorteo: 85% (Y) y 90% (X)Eficiencia: 350 mil a 12 millones por horaPreñez: Baja si se insemina por vía transcervial en bovinos. Aun en estudio los métodos de inseminaciónDisponibilidad comercial: Disponible en Argentina y próximamente en Brasil.

SeparaciSeparacióón de espermatozoides n de espermatozoides X e Y por citometria de flujoX e Y por citometria de flujo

Efecto genEfecto genéético de produccitico de produccióón de n de crcríías de sexo pre determinadoas de sexo pre determinado7% sobre la tasa de mejora genética anual obtenida con la técnica reproductiva en uso.

Producción de crías de sexo predeterminado tiene un efecto comercial de gran impacto económico: producción exclusiva de animales requeridos por el mercado.

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ClonaciClonacióón de individuosn de individuos

Efectos genéticos similares a la clonación embrionariaVentaja: multiplicación de animales de superioridad genética comprobadaDesventaja: incremento de intervalo generacional

MMéétodo de clonacitodo de clonacióón de n de individuosindividuos

Enucleación de ovocitos y construcción de embriones mediante Transferencia Nuclear (TN) de células somáticas reprogramadas para comportarse como células embrionarias totipotentes:– Células fetales– Células de animales jóvenes– Células de animales adultos– Células de animales muertos

TRANSFERENCIA NUCLEARTRANSFERENCIA NUCLEAR

Aspiración de folículos pequeños.Aislamiento de ovocitos y maduración in vitro por 24 horas en medios especiales (FSH+LH+Estradiol-17B).Remoción de células del cúmulos.Remoción del cuerpo polar + cromosomas

en metafase.

Inserción del núcleo donador en el ovocito receptor.Fusión eléctrica y activación celular.Transferencia del embrión a receptora del útero.

EnucleaciEnucleacióón y transferencia n y transferencia nuclearnuclear

Clonado de animales por medio de transferencia nuclearClonado de animales por medio de transferencia nuclear

120 a 125% de 120 a 125% de ganancia genganancia genéética tica en la primera en la primera serieserie

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Primer clon de mamPrimer clon de mamíífero adulto : Dolly fero adulto : Dolly (por el Roslin Institute, Escocia)(por el Roslin Institute, Escocia)

Primer vacuno clonado en el mundo: Primer vacuno clonado en el mundo: ClonaciClonacióón de Lady (Vivanco, Wells y n de Lady (Vivanco, Wells y

colaboradores, Ruakura NZ)colaboradores, Ruakura NZ)

Elizabeth, vaca con el mayor numero de copias nacidas Elizabeth, vaca con el mayor numero de copias nacidas (mas de 40 a la fecha, Vivanco, (mas de 40 a la fecha, Vivanco, WellsWells y colaboradores, y colaboradores,

RuakuraRuakura NZ)NZ)

VISION:Productores pecuarios competitivos, rentables y sostenibles económicamente, profesionales, alumnos y técnicos aplicando eficientemente biotecnologías reproductivas para el mejoramiento genético de la ganadería.

Centro de InvestigaciCentro de Investigacióón y Ensen y Enseññanza anza en Transferencia de Embriones en Transferencia de Embriones --

CIETECIETEConvenio MINAG Convenio MINAG -- UNALMUNALM

MISIONPromover la formación de núcleos genéticos élites en puntos estratégicos del ámbito nacional a fin de potenciar el mejoramiento genético de la ganadería en el país.

Capacitar y difundir el uso de biotecnologías reproductivas para su aplicación a nivel nacional por parte de ganaderos, profesionales, estudiantes y técnicos.

OBJETIVOS ESTRATOBJETIVOS ESTRATÉÉGICOS.GICOS.Desarrollar y mejorar la actividad ganadera del país (bovina, camélida, ovina y caprina) incrementando el potencial genético y productivo; mediante la aplicación de biotecnologías reproductivas de punta: inseminación artificial, ovulación múltiple – transferencia embrionaria (MOET) y fertilización in vitro.

Establecer núcleos de Reproductores de vacunos, ovinos, camélidos Sudamericanos y caprinos de alto potencial genético, generados por el CIETE, en regiones de importancia ganadera.

Fortalecer actividades de enseñanza, investigación y proyección social en la formación universitaria y en la capacitación de técnicos y ganaderos del país.

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Ganado genéticamente puros y seleccionados de la población nacional en base a características productivas)

NUCLEO GENETICO ELITE (NGE)

Aplicación de alta tecnología reproductiva y alta intensidad de

selección

Reemplazo

Crías macho Crías hembra

Reemplazo

Embriones y/o exceso de hembras

CamalBanco Nacional de Semen

Descartes

Reparto a productores y formación de nuevos NGE

ESQUEMA DE MEJORAMIENTO GENETICOCIETE

Establos lecheros participantes:

Huampani, UNALM, Los Patitos, Monte Grande,

El Sequión, Santa Maria -Puno.

Actualmente: Puno, Arequipa y Ucayali

MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIONMUCHAS GRACIAS POR SU ATENCION

Ing. Giselle del Carmen Gamarra Lazoggamarra@minag.gob.pe