i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn

khoa học của TS. Đỗ Hữu Nghị và PGS.TS. Tăng Thị Chính. Các số liệu và kết quả được

nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào

khác.

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả

Vũ Đình Giáp

ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Hữu Nghị, Viện Hóa học các hợp

chất thiên nhiên và PGS.TS. Tăng Thị Chính, Viện Công nghệ môi trường, Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, sửa

luận án và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành Bản luận án này.

Tôi xin cảm ơn Phòng Đào tạo Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Học viện

Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều

kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên

cứu.

Tôi xin cảm ơn tập thể Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất

thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chỉ bảo, giúp đỡ tận tình

cho tôi trong quá trình thực nghiệm cũng như chia sẻ những kinh nghiệm chuyên môn

quý báu.

Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ Đề tài Hợp tác song phương Việt Nam - Bỉ

(Mã số: FWO.104.2017.03) và Đề tài Nghị định thư Việt Nam - CHLB Đức (Mã số:

NĐT.45.GER/18) do TS. Đỗ Hữu Nghị làm chủ nhiệm.

Cuối cùng tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã giúp đỡ,

tạo điều kiện và động viên tôi trong suốt thời gian học tập.

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả

Vũ Đình Giáp

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN……………………………………………………………………...…I

LỜI CẢM ƠN……………………………………………………………………………II

MỤC LỤC .................................................................................................................... III

DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... VII

DANH MỤC HÌNH…...………………………………………………………………………VIII

DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT………………………………………………..XI

MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 5

1.1. Phụ phẩm công - nông nghiệp giàu lignocellulose .................................................... 5

1.1.1. Nguồn gốc và thành phần .................................................................................. 5

1.1.2. Nguồn nguyên liệu bã mía ............................................................................... 10

1.1.2.1. Nguồn gốc và hiện trạng sử dụng bã mía ở Việt Nam……………………...10

1.1.2.2. Các vấn đề môi trường từ bã mía ........................................................... 11

1.2. Chuyển hóa vật liệu giàu lignocellulose ................................................................. 12

1.2.1. Quá trình thủy phân vật liệu giàu lignocellulose .............................................. 12

1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến xúc tác sinh học...................................................... 15

1.2.3. Đa dạng nấm Việt Nam cho chuyển hóa vật liệu giàu lignocellulose ............... 18

1.2.4. Ứng dụng của enzyme trong quá trình thủy phân lignocellulose ...................... 20

1.2.5. Vai trò carbohydrat esterase trong thủy phân lignocellulose............................. 23

1.2.5.1. Acetyl esterase từ nấm ........................................................................... 24

1.2.5.2. Feruloyl esterase từ nấm ........................................................................ 25

1.3. Tình hình sản xuất bioethanol ................................................................................. 28

1.3.1. Hiện trạng sản xuất và sử dụng bioethanol ....................................................... 28

1.3.2. Nguồn sinh khối cho sản xuất bioethanol ......................................................... 33

1.3.3. Lên men sản xuất bioethanol ........................................................................... 35

1.4. Tình hình nghiên cứu bioethanol trong và ngoài nước ............................................ 38

1.4.1. Tình hình nghiên cứu bioethanol ngoài nước ................................................... 38

iv

1.4.2. Tình hình nghiên cứu bioethanol trong nước.................................................... 41

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 44

2.1. Vật liệu ................................................................................................................... 44

2.1.1. Vật liệu giàu lignocellulose ............................................................................. 44

2.1.2. Vi sinh vật…………………………………………. …………..……………...44

2.1.3. Thiết bị, hóa chất ............................................................................................. 45

2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 45

2.2.1. Phương pháp vi sinh vật .................................................................................. 45

2.2.1.1. Phân lập nấm ......................................................................................... 45

2.2.1.2. Nuôi cấy và bảo quản nấm men .............................................................. 46

2.2.1.3. Lên men bioethanol ................................................................................ 47

2.2.2. Định danh nấm ............................................................................................... 48

2.2.2.1. Định danh nấm bằng phương pháp hình thái giải phẫu .......................... 48

2.2.2.2. Định danh nấm bằng phương pháp sinh học phân tử ............................. 49

2.2.3. Sàng lọc hoạt tính esterase và lựa chọn chủng nấm ......................................... 50

2.2.3.1. Sàng lọc trên đĩa thạch .......................................................................... 50

2.2.3.2. Sàng lọc trên môi trường lên men bề mặt và dịch thể ............................ 50

2.2.4. Phương pháp đánh giá hoạt độ enzyme ........................................................... 51

2.2.4.1. Hoạt độ acetyl esterase .......................................................................... 51

2.2.4.2. Hoạt độ feruloyl esterase ....................................................................... 52

2.2.5. Xác định điều kiện thích hợp sinh tổng hợp esterase ....................................... 52

2.2.5.1. Xác định nguồn nitơ và cơ chất giàu lignocellulose................................ 52

2.2.5.2. Xác định nhiệt độ, pH thích hợp...............................................................52

2.2.6. Tinh sạch protein enzyme ................................................................................ 53

2.2.6.1. Tách chiết, tinh sạch protein enzyme ...................................................... 53

2.2.6.2. Xác định hàm lượng protein ................................................................... 53

2.2.6.3. Điện di trên gel polyacrylamide có SDS.....................................................54

2.2.6.4. Điện di điểm đẳng điện...............................................................................54

2.2.6.5. Xác định nhiệt độ và pH tối ưu của enzyme tinh sạch................................54

v

2.2.6.6. Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của enzyme tinh sạch ..................... 55

2.2.7. Phương pháp hóa sinh..................................................................................... 55

2.2.7.1. Sắc ký bản mỏng .................................................................................... 55

2.2.7.2. Sắc kí lỏng hiệu năng cao ....................................................................... 55

2.2.7.3. Xác định peptide bằng phổ khối sử dụng nguồn ion hóa mẫu ESI-MS…...56

2.2.7.4. Định lượng đường khử theo phương pháp axit dinitrosalicylic ............... 57

2.2.7.5. Xử lý nguyên liệu……………..………………………………………………….58

2.2.7.6. Xác định hàm lượng bioethanol .............................................................. 59

2.2.8. Xúc tác chuyển hóa sinh học các vật liệu giàu lignocellulose ........................... 60

2.2.9. Quy hoạch thực nghiệm ................................................................................... 61

2.2.10. Xử lý số liệu .................................................................................................. 63

2.3. Xây dựng sơ đồ nghiên cứu ................................................................................... 63

2.3.1. Sơ đồ xác định các điều kiện thích hợp cho mô hình tối ưu thực nghiệm ........ 63

2.3.2. Sơ đồ xử lý bã mía bằng phương pháp hóa lý kết hợp “enzyme cocktail” ....... 66

2.3.3. Sơ đồ lên men bioethanol từ dịch đường chuyển hóa ....................................... 68

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................... 70

3.1. Phân lập và sàng lọc nấm ....................................................................................... 70

3.1.1. Ngành nấm đảm Basidiomycota ...................................................................... 70

3.1.2. Ngành nấm túi Ascomycota ............................................................................. 70

3.2. Khả năng sinh tổng hợp esterase và lựa chọn chủng nấm ........................................ 70

3.3. Định danh các chủng phân lập hoạt tính cao .......................................................... 75

3.3.1. Định danh chủng SP66 .................................................................................... 75

3.3.2. Định danh chủng A35 ...................................................................................... 78

3.4. Nghiên cứu sinh tổng hợp esterase .......................................................................... 81

3.4.1. Nghiên cứu sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm X. polymorpha A35 ............... 81

3.4.2. Nghiên cứu sinh tổng hợp feruloyl esterase bởi nấm Alt. tenuissima SP66 ......... 86

3.5. Tinh sạch enzyme từ môi trường nuôi cấy nấm ....................................................... 91

3.5.1. Tinh sạch và đặc tính acetyl esterase bởi nấm X. polymorpha A35................... 91

3.5.2. Tinh sạch và đặc tính feruloyl esterase bởi nấm Alt. tenuissima SP66 .............. 95

vi

3.5.3. Quy trình lên men, chiết tách và tinh sạch enzyme esterase từ nấm.................100

3.5.3.1. Acetyl esterase từ nấm X. polymorpha A35 ...........................................100

3.5.3.2. Feruloyl esterase từ nấm Alt. tenuissima SP66 …………………….…….103

3.6. Sàng lọc nguồn cơ chất giàu lignocellulose cho chuyển hóa bằng xúc tác sinh học105

3.6.1. Sàng lọc cơ chất..............................................................................................105

3.6.2. Hàm lượng đường khử sau chuyển hóa sinh học .............................................106

3.7. Tối ưu hóa “enzyme cocktail” bằng mô hình quy hoạch thực nghiệm ....................107

3.8. Kết hợp xử lý hóa học nâng cao hiệu quả chuyển hóa ............................................115

3.8.1. Kết hợp thủy phân bã mía bằng kiềm và “enzyme cocktail” ............................115

3.8.2. Kết hợp thủy phân bã mía bằng axít và “enzyme cocktail”..............................117

3.8.3. Kết hợp thủy phân bã mía bằng thiết bị gia nhiệt và “enzyme cocktail” ..........119

3.8.4. Hàm lượng các đường đơn sau chuyển hóa .....................................................121

3.9. Nghiên cứu sản xuất bioethanol .............................................................................122

3.9.1. Ảnh hưởng thành phần môi trường .................................................................122

3.9.2. Ảnh hưởng thời gian lên men ..........................................................................124

3.9.3. Ảnh hưởng pH ................................................................................................127

3.9.4. Ảnh hưởng nhiệt độ ........................................................................................128

3.9.5. Ảnh hưởng tỷ lệ nấm men ...............................................................................130

3.9.6. Đề xuất quy trình sản xuất bioethanol từ bã mía .............................................133

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................136

KẾT LUẬN .................................................................................................................136

KIẾN NGHỊ ................................................................................................................137

DANH SÁCH CÔNG BỐ KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ..................138

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................139

vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần một số nguồn sinh khối giàu lignocellulose ................................. 6

Bảng 1.2. Một số dự án sản xuất bioethanol nhiên liệu tại Việt Nam ............................. 32

Bảng 2.1. Thành phần môi trường lên men.…………......................................................48

Bảng 3. 1. Hoạt tính feruloyl esterase và acetyl esterase của các chủng nấm .................. 71

Bảng 3. 2. Tinh sạch enzyme hoạt tính acetyl esterase (XpoAE) ................................... 93

Bảng 3. 3. Tinh sạch enzyme AltFAE từ dịch lên men nấm Alt. tenuissima SP66 .......... 96

Bảng 3. 4. Các đoạn peptide của enzyme AltFAE tinh sạch từ nấm Alt. tenuissima SP66

xác định bằng thủy phân với trypsin và LC-ESI-MS/MS ............................................... 99

Bảng 3. 5. Hoạt tính đặc hiệu của “enzyme cocktail” trong chuyển hóa sinh học ......... 100

Bảng 3. 6. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển hóa ......................................... 108

Bảng 3. 7. Kế hoạch trực giao bậc hai Box – Wilson ................................................... 111

Bảng 3. 8. Kết quả thí nghiệm theo kế hoạch trực giao bậc hai Box – Wilson .............. 111

Bảng 3. 9. Ma trận kế hoạch và kết quả thực nghiệm ................................................... 112

Bảng 3. 10. Các hệ số hồi quy và giá trị T ................................................................... 113

Bảng 3. 11. Kết quả thực nghiệm so sánh với kế hoạch trực giao Box – Wilson .......... 114

Bảng 3. 12. Tổng đường khử sau quá trình thủy phân bã mía bằng thiết bị gia nhiệt và

“enzyme cocktail” ....................................................................................................... 120

Bảng 3. 13. Hàm lượng một số các đường đơn trong dung dịch sau chuyển hóa ......... 121

Bảng 3. 14. Hiệu suất quá trình lên men trên môi trường BM và BM+ ........................ 123

Bảng 3. 15. Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất lên men .............................................. 124

Bảng 3. 16. Ảnh hưởng pH đến hiệu suất lên men ...................................................... 127

Bảng 3. 17. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất lên men .............................................. 128

Bảng 3. 18. Ảnh hưởng tỷ lệ nấm men đến hiệu suất lên men ...................................... 130

viii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc của lignocellulose .............................................................................. 6

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của cellulose ........................................................................ 7

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của xylan ............................................................................... 9

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của lignin .............................................................................. 9

Hình 1.5. Hiện trạng sản xuất mía đường các vùng của Việt Nam ................................. 11

Hình 1.6. Vai trò tiền xử lý trong chuyển đổi sinh khối thành nhiên liệu ........................ 15

Hình 1.7. Cấu trúc các enzyme tham gia vào quá trình chuyển hóa lignocellulose ......... 19

Hình 1.8. Hệ cellulase tham gia thủy phân mạch cellulose ............................................. 21

Hình 1.9. Cấu trúc xylan được tấn công bởi những enzyme thủy phân khác nhau ............ 23

Hình 1.10. Liên kết dạng cầu nối của axit ferulic và dimer với arabinoxylan và lignin ... 25

Hình 1.11. Nếp gấp đặc trưng α/β-hydrolase.................................................................. 27

Hình 1.12. Sản lượng nhiên liệu sinh học giai đoạn 2008 – 2022 ................................... 29

Hình 1.13. Sản lượng bioethanol tại một số quốc gia và khu vực trên thế giới ............... 30

Hình 1.14. Cấu trúc amylose ......................................................................................... 34

Hinh 2. 1. Đường chuẩn biểu thị liên hệ giữa mật độ quang và nồng độ ρ-Nitrophenol . 51

Hinh 2. 2 Hệ thống siêu lọc 10 kDa cut-off trên thiết bị amicon Ultra Centrifugal ........ 53

Hinh 2. 3. Phương trình phản ứng giữa đường khử và axít dinitrosalicylic .................... 57

Hinh 2. 4. Đường chuẩn glucose biểu thị giữa mật độ quang và nồng độ glucose ......... 58

Hinh 2. 5. Sơ đồ xác định các điều kiện thích hợp cho mô hình tối ưu thực nghiệm ....... 64

Hinh 2. 6. Sơ đồ xử lý bã mía theo phương pháp hóa lý kết hợp “enzyme cocktail” ...... 66

Hinh 2. 7. Sơ đồ lên men bioethanol từ dịch đường chuyển hóa.................................... 68

Hình 3. 1. Hoạt tính feruloyl esterase của chủng nấm phân lập Alt. tenuissima SP66 ..... 73

Hình 3. 2. Hình ảnh điện di ADN tổng số trên gel agarose 1% (A) và (B) Sản phẩm PCR

của hai chủng nấm (SP66 và A35) ................................................................................. 75

Hình 3. 3. Mối quan hệ họ hàng của chủng SP66 với các loài/dưới loài trong cùng chi . 77

Hình 3. 4. Chủng Alt. tenuissima SP66 phát triển trên MT thạch và hình thái bào tử....78

Hình 3. 5. Mối quan hệ họ hàng của chủng nấm A35 với các loài/thứ trong cùng chi .... 80

ix

Hình 3. 6. Động học sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm X. polymorpha A35 trên môi

trường rắn ……………………………………………………………………………......80

Hình 3. 7. Sự phát triển của nấm X. polymorpha A35 trên MT lỏng ở ngày thứ 10 ........ 82

Hình 3. 8. Động học sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm X. polymorpha A35 trên các

môi trường có bổ sung cơ chất ....................................................................................... 83

Hình 3. 9. Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau bởi nấm X. polymorpha A35.. 84

Hình 3. 10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm X.

polymorpha A35 trên môi trường lỏng .......................................................................... 85

Hình 3. 11. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh tổng hợp acetyl esterase ............................. 86

Hình 3. 12. Động học sinh tổng hợp feruloyl esterase (A) và hoạt tính enzyme cao nhất

(B) trên các môi trường khác nhau ................................................................................. 87

Hình 3. 13. Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau ……………………………89

Hình 3. 14. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh tổng hợp feruloyl esterase .................. 90

Hình 3. 15. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh tổng hợp feruloyl esterase ......................... 91

Hình 3. 16. Tinh sạch enzyme XpoAE từ X. polymorpha A35 qua các bước sắc ký lỏng 92

Hình 3. 17. Protein tinh sạch (1,3) biểu hiện hoạt tính acetyl esterase (XpoAE) trên gel

điện di SDS-PAGE (A) và IEF (B); (2,4) protein marker ............................................... 93

Hình 3. 18. Ảnh hưởng của pH (A) và nhiệt độ (B) đến hoạt tính của XpoAE tinh sạch 94

Hình 3. 19. Độ bền của enzyme XpoAE tinh sạch bởi nấm X. polymorpha A35 (XpoAE)

ở các điều kiện nhiệt độ (A) và pH (B) khác nhau ......................................................... 95

Hình 3. 20. Tinh sạch enzyme AltFAE từ nấm Alt.tenuissima SP66 qua cột sắc ký trao đổi

anion Q Sepharose® ....................................................................................................... 96

Hình 3. 21. Protein tinh sạch (1) biểu hiện hoạt tính AltFAE trên gel điện di SDS-PAGE

(A); (2) protein marker .................................................................................................. 97

Hình 3. 22. Ảnh hưởng của nhiệt độ (A) và pH (B) đến hoạt tính enzyme AltFAE từ nấm

Alt. tenuissima SP66 ...................................................................................................... 97

Hình 3. 23. Độ bền nhiệt của enzyme AltFAE từ nấm Alt. tenuissima SP66 ở nhiệt độ

khác nhau (A) và giá trị pH (B) phụ thuộc vào thời gian ................................................ 98

x

Hình 3. 24. Dữ liệu phổ ESI-MS/MS các đoạn peptide của enzyme AltFAE tinh sạch từ

nấm Alt. tenuissima SP66 .............................................................................................. 99

Hình 3. 25. Quy trình chiết tách và tinh sạch protein enzyme hoạt tính acetyl esterase từ

môi trường nuôi cấy nấm X. polymorpha A35 ............................................................. 102

Hình 3. 26. Quy trình chiết tách và tinh sạch enzyme hoạt tính feruloyl esterase từ môi

trường lên men nấm Alt. tenuissima SP66.................................................................... 104

Hình 3. 27. Vết chất đường đơn xuất hiện trên bản mỏng ............................................ 105

Hình 3. 28. Hàm lượng đường khử tạo thành sau quá trình thủy phân bã mía bằng các

đơn enzyme và “enzyme cocktail” ............................................................................... 107

Hình 3. 29. Đường khử sinh ra sau quá trình xử lý bã mía bằng kiềm và “enzyme

cocktail” ...................................................................................................................... 116

Hình 3. 30. Đường khử sinh ra sau quá trình thủy phân bã mía bằng axít và “enzyme

cocktail” ...................................................................................................................... 118

Hình 3. 31. Ảnh hưởng thành phần môi trường đến hiệu suất lên men ......................... 124

Hình 3. 32. Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất lên men ............................................... 126

Hình 3. 33. Ảnh hưởng pH đến hiệu suất lên men ........................................................ 128

Hình 3. 34. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất lên men ................................................ 129

Hình 3. 35. Ảnh hưởng tỷ lệ giống nấm men đến hiệu suất lên men............................. 131

Hình 3. 36. Quy trình sản xuất bioethanol từ bã mía .................................................... 134

xi

DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

BLAST Basic local alignment search tool Công cụ so sánh các chuỗi sinh học

bp Base pair Cặp bazơ nitơ M Marker Thang chuẩn CMC Carboxymethyl cellulose Carboxymethyl cellulose

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic kb Kilo base Kilo base

kDa Kilo Dalton Kilo Dalton ĐC Đối chứng OD Optical density Mật độ quang PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi tổng hợp SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate

polyacrylamide gel electrophoresis Điện di trên gel polyacrylamide có SDS

TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng

v/v Volume/volume Thể tích/thể tích w/v Weight/volume Khối lượng/thể tích DNS Acid dinitrosalicylic

HPLC High performance liquid chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

CE Carbohydrate esterase AE Enzyme acetyl esterase FAE Enzyme Feruloy esterase rpm Revolutions per minute Số vòng/phút

NLSH Nhiên liệu sinh học gds Gram dry sustrate Gam cơ chất khô IEF

Isoelectric focusing Điểm đẳng điện CT Công thức KXĐ Không xác định

1

MỞ ĐẦU

Hiện nay, nhu cầu năng lượng luôn là vấn đề nan giải của bất kì quốc gia nào trên

thế giới. Trong số các nguồn năng lượng thay thế dầu mỏ đang sử dụng hiện nay (năng

lượng gió, mặt trời, hạt nhân,…), năng lượng sinh học đang là xu thế phát triển tất yếu,

nhất là ở các nước nông nghiệp và nhập khẩu nhiên liệu. Dựa vào nguyên liệu sản xuất,

người ta chia NLSH thành 4 thế hệ: Thế hệ I (từ tinh bột như ngô, sắn, mía đường), thế

hệ II (từ sinh khối thực vật như thân cây lúa, ngô, lúa mỳ, bã mía), thế hệ thứ III (từ các

loài vi tảo) và thế hệ IV - nhiên liệu tiên tiến (dựa trên các chuyển hóa sinh - hóa, nhiệt –

hóa). Chúng phân thành ba nhóm là dầu sinh học (biodiesel), khí sinh học (biogas) và

bioethanol (ethanol sinh học). Trong đó, bioethanol đang rất được quan tâm do từ ngày

01/01/2018 chính phủ ban hành quyết định sử dụng xăng sinh học E5 (5% bioethanol)

thay thế xăng RON 92 trên toàn quốc. Do vậy, nhu cầu sản xuất và tiêu thụ bioethanol

ngày càng tăng cao.

Việc sản xuất nhiên liệu sinh học nói chung và bioethanol theo thế hệ I từ nguồn

tinh bột (sắn, bắp) và đường (mía) rất phổ biến. Bên cạnh đó, bioethanol còn được sản

xuất từ lignocellulose theo thế hệ thứ II. Nguồn nguyên liệu này chủ yếu bao gồm: gỗ,

rơm lúa, bã mía, thân cây ngô…là các sinh khối có thành phần lignocellulose phổ biến

nhất trong số các phụ phẩm công-nông nghiệp. Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu này sử

dụng chưa hiệu quả mà chủ yếu theo phương pháp truyền thống như làm cơ chất nuôi

nấm, thức ăn gia súc, ủ làm phân bón, đốt... Do vậy, việc tận dụng nguồn cơ chất này để

sản xuất bioethanol là một giải pháp thích hợp, đặc biệt là với các quốc gia với nền nông

nghiệp như Việt Nam. Mặc dù nguồn nguyên liệu giàu lignocellulose rất phổ biến nhưng

những khó khăn để có thể tận dụng hiệu quả nguồn sinh khối này cho sản xuất các sản

phẩm có giá trị cao hơn chủ yếu do lignocellulose có cấu trúc phức tạp, khó chuyển hóa

sinh học. Việc sản xuất bioethanol từ nguồn sinh khối phụ phẩm công - nông nghiệp một

mặt tận dụng nguồn nguyên liệu rồi rào thay thế nguồn nguyên liệu truyền thống, mặt

khác tạo thành nguồn năng lượng sạch giúp giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường do đốt

hoặc xử lý theo phương pháp truyền thống gây ra, đồng thời không ảnh hưởng tới an ninh

2

lượng thực quốc gia. Đây cũng chính là một trong những khâu then chốt trong công nghệ

lên men sản xuất bioethanol thế hệ II. Theo phương thức truyền thống có thể sử dụng

phương pháp hóa học (axít/bazơ) hoặc hóa lý (nghiền/nổ hơi). Tuy nhiên, một trong

những hướng đi mới để giải quyết nhiệm vụ này là sử dụng xúc tác sinh học (enzyme từ

các loài nấm), chúng được biết là có hệ enzyme xúc tác hiệu quả giúp chúng phân hủy tốt

lignocellulose để giải phóng các đơn vị đường cần thiết cho quá trình lên men bioethanol.

Nhìn chung các enzyme thủy phân lignocellulose hoạt động yếu khi sử dụng trực tiếp

trên cơ chất thô và việc xúc tác chuyển hóa hiệu quả cơ chất cần kết hợp nhiều enzyme

có tác dụng hiệp đồng. Do vậy, mục đích của đề tài luận án “Nghiên cứu phối hợp

esterase và hệ enzyme thủy phân từ nấm trong chuyển hóa phụ phẩm công-nông

nghiệp để thu nhận bioethanol” nhằm sử dụng hỗn hợp các enzyme phù hợp (“enzyme

cocktail”) bao gồm hệ enzyme esterase (acetyl esterase và feruloyl esterase), enzyme

thủy phân và/hoặc oxy hóa từ nấm để phân hủy các cấu trúc polymer phức tạp để lên men

thu nhận bioethanol.

Mục tiêu nghiên cứu:

Hiên nay, khả năng chuyển hóa các vật liệu thô từ sinh khối giàu lignocellulose

bằng các phương pháp truyền thống còn nhiều mặt hạn chế. Do vậy, mục tiêu của đề tài

luận án nhằm khai thác nguồn đa dạng xúc tác sinh học (enzyme thủy phân) từ nấm để

chuyển hóa hiệu quả sinh khối giàu lignocellulose từ các phụ phẩm công-nông nghiệp

thành các đường (C5 và C6) có khả năng lên men cho sản xuất bioethanol. Đặc biệt, luận

án sử dụng “enzyme cocktail” xúc tác hiệp đồng để tăng khả năng chuyển hóa sinh học.

Trong đó, nghiên cứu sử dụng carbohydrate esterase [feruloyl esterase (FAE), acetyl

esterase (AE)] nhằm phối hợp với các enzyme tấn công mạch chính (cellulase/xylanase)

và mạch nhánh để thủy phân cấu trúc lignocellulose. Mục tiêu tiếp theo là đánh giá khả

năng lên men nguồn dịch đường sau thủy phân bằng “enzyme cocktail” thành bioethanol.

Nội dung nghiên cứu:

Để đạt được mục tiêu trên, các nội dung nghiên cứu chính đã thực hiện:

- Phân lập, sàng lọc và tuyển chọn các chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp

enzyme carbohydrate esterase [feruloyl esterase (FAE), acetyl esterase (AE)];

3

- Sinh tổng hợp và tinh sạch protein enzyme hoạt tính FAE và AE từ môi trường

nuôi cấy nấm và xác định đặc tính của enzyme tinh sạch.

- Chuyển hóa vật liệu lignocellulose thành các đường đơn (hexose và pentose) có

khả năng lên men sử dụng đơn enzyme và “enzyme cocktail” hoạt tính

cellulase/xylanase và esterase xúc tác hiệp đồng.

- Tối ưu quy trình chuyển hóa và nghiên cứu sản xuất bioethanol từ dịch đường

chuyển hóa quy mô phòng thí nghiệm.

Những đóng góp mới của luận án:

- 44 chủng nấm thuộc 13 họ thuộc ngành nấm Túi (Ascomycota) và nấm Đảm

(Basidiomycota) được phân lập và sàng lọc khả năng sinh tổng hợp carbohydrate

esterase (feruloyl esterase và acetyl esterase).

- Lần đầu tiên, enzyme feruloyl esterase từ nấm Alternaria tenuissima và acetyl

esterase từ nấm Xylaria polymorpha được phân lập và tinh sạch từ môi trường nuôi

cấy giàu lignocellulose. Trong đó, feruloyl esterase từ Alt. tenuissima (AltFAE) có

trọng lượng phân tử Mw = 30,3 kDa với hoạt tính đặc hiệu 11,2 U/mg. Acetyl esterase

từ X. polymorpha (XpoAE) có trọng lượng phân tử Mw = 44 kDa với hoạt tính đặc

hiệu 13,1 U/mg. Hai enzyme này có độ bền cao trong khoảng nhiệt độ 40 đến 450C

và pH 5,0.

- Enzyme carbohydrate esterases tinh sạch kết hợp với enzyme thương mại (hỗn hợp

“enzyme cocktail” hoạt tính cellulase/xylanse (cell/xyl)) được tối ưu thành phần và sử

dụng để chuyển hóa sinh khối thực vật thô (vd. mía bã mía, rơm rạ, bột gỗ, rong

túi…) thành các đường đơn có khả năng lên men bioethanol. Trong đó, bã mía được

chọn làm cơ chất phù hợp để sản xuất các đường C5/C6 (vd: glucose, xylose).

- Bằng quy hoạch thực nghiệm đã xác định điều kiện tối ưu cho chuyển hóa bã mía

bằng “enzyme cocktail” là ở 400C, pH 5.0, trong 48 giờ và hoạt độ enzyme là

cell/xyl: 100 U/g, AltFAE: 7,56 U/g, XpoAE: 10,8 U/g sinh khối khô. Khi đó, tổng

các đường lên men là 251,86 mg/g. Kết hợp xử lý bã mía bằng “enzyme cocktail” và

axit H2SO4 loãng (0,1%) thì các đường lên men sinh ra là 319,5 mg/g, đạt hiệu suất

49,8%.

4

- Các đường đơn thu được bằng chuyển hóa enzyme đã được chứng minh có khả năng

lên men bioethanol (cồn sinh học) bởi chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae với

hàm bioethanol thu được 178ml/kg bã mía, đạt hiệu suất 79,8% so với lý thuyết.

Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án:

Bên cạnh sản xuất bioethanol từ nguồn tinh bột (sắn, bắp) và đường (mía),

bioethanol có thể được sản xuất từ lignocellulose. Lignocellulose là loại sinh khối

(biomass) phổ biến nhất trong sinh quyển. Sản xuất bioethanol từ nguồn sinh khối là một

giải pháp thích hợp, đặc biệt là với các quốc gia với nền nông nghiệp như Việt Nam.

Hàng năm sản xuất công-nông nghiệp trong nước sản sinh hàng trăm triệu tấn phụ phẩm

giàu lignocellulose là nguồn cung cấp nguyên liệu vô cùng dồi dào cho sản xuất năng

lượng sạch, mặt khác giải quyết vấn đề ô môi trường do không được xử lý hay loại bỏ

theo phương pháp truyền thống.

Theo các tài liệu công bố và kinh nghiệm nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, nhìn

chung các enzyme thủy phân lignocellulose hoạt động yếu khi sử dụng trực tiếp (không

qua tiền xử lý) trên cơ chất thô. Điều này có thể khắc phục bằng việc sử dụng hỗn hợp

các enzyme phù hợp (“enzyme cocktail”) bao gồm hệ enzyme thủy phân và/hoặc oxy hóa

để phân hủy các cấu trúc polymer phức tạp. Ngoài ra, sàng lọc enzyme bằng nuôi cấy vi

sinh vật có vai trò quan trọng trong việc tìm ra các enzyme mới với hoạt tính xúc tác thủy

phân cao và các đặc tính hữu ích.

Đề tài luận án không nhằm giải quyết được toàn bộ các bước từ chuyển hóa vật

liệu sinh khối thô thành bioethanol mà mục tiêu chính nhằm khai thác và sử dụng nguồn

xúc tác sinh học từ nấm và tối ưu hóa cho chuyển hóa sinh khối thành đường có khả năng

lên men. Đây cũng chính là một trong những khâu then chốt trong công nghệ lên men sản

xuất bioethanol thế hệ II.

5

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Phụ phẩm công - nông nghiệp giàu lignocellulose

1.1.1. Nguồn gốc và thành phần

Phụ phẩm công-nông nghiệp là một dạng sinh khối có thành phần lignocellulose

phổ biến nhất trong số các phụ phẩm công-nông nghiệp của Việt Nam. Hiện nay, mỗi

năm nguồn sinh khối này sản sinh ra hàng trăm triệu tấn từ quá trình sản xuất công-nông

nghiệp như: rơm rạ, bã cà phê, mùn gỗ, thân cây ngô, vỏ trấu và hàng chục triệu tấn bã

mía thường được sử dụng để đun nấu (lãng phí nhiệt trên 80%), cơ chất để trồng nấm,

thức ăn gia súc và phần lớn được đốt bỏ thu tro làm phân bón [1]. Việc đốt này gây ra

hiện tượng sương mù quang hóa rất độc hại là nguyên nhân gây nên một số bệnh về mắt,

phổi. Nguy hiểm hơn, chúng gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng ở vùng ven các thành

phố lớn và dọc các đường cao tốc làm giảm tầm nhìn dễ dẫn đến tai nạn giao thông. Đặc

biệt, gây lãng phí lượng lớn chất hữu cơ có giá trị, trong khi đó nếu khai thác sử dụng

hợp lý thì nguồn sinh khối này đem lại lợi ích vô cùng lớn [2,3].

Lignocellulose ngày càng có vai trò quan trọng về mặt kinh tế khi được sử dụng

như vật liệu thô cho các ứng dụng trong công nghệ sinh học và công nghiệp, hơn nữa

chúng chính là cơ sở để thúc đẩy việc nghiên cứu tận dụng sinh khối trong các mô hình

sản xuất tinh chế và chiến lược cho sự phát triển bền vững [4]. Các polymer sinh học này

có thể thấy ở tất cả các hệ sinh thái trên đất liền và đây là nguồn hợp chất hữu cơ tái tạo

lớn nhất trong sinh quyển. Xét về nguồn gốc, thành phần và mức độ polymer hóa, có thể

phân biệt các loại lignocellulose như: từ cây gỗ cứng, gỗ mềm cũng như từ cây trồng

hàng năm (đặc biệt là cây lúa, ngũ cốc, các loại cỏ, cây mía…) và thân cây thảo [5,6].

Lignocellulose là một phức hợp polyme thành tế bào ở thực vật, chiếm 60% tổng

sinh khối thực vật trên trái đất, bao gồm các thành phần chính là các polymer

carbohydrate (cellulose, hemicellulose) và một polymer thơm (lignin), trong đó cellulose

và hemicellulose chiếm tỉ lệ cao. Cellulose chiếm phần lớn, khoảng từ 40% - 50%, còn

hai hợp chất hemicellulose và lignin lần lượt chiếm khoảng 20 - 40% và 20 - 35% khối

6

lượng khô của cơ thể thực vật (Bảng 1.1) [1]. Ngoài các thành phần này, Lilholt còn cho

rằng pectin cũng là thành phần chính của lignocellulose thành tế bào, đặc biệt là ở các

cấu trúc sợi thực vật không phải thành phần gỗ [7].

Bảng 1.1. Thành phần một số nguồn sinh khối giàu lignocellulose [1]

Nguồn lignocellulose

Cellulose (%)

Hemicellulose (%)

Lignin (%)

Thành phần khác (%)

Gỗ cứng 45-47 25-40 20-25 0,8 Gỗ mềm 40-45 25-29 30-36 0,5

Cỏ 25-40 35-50 - - Bã mía 40 24 25 - Lõi ngô 45 35 15 Rơm rạ 35 25 12 Bột giấy 50-70 12-20 6-10 -

Rơm lúa mì 30 50 20 Phế thải nông nghiệp khác

37-50 35-50 5-15 12-16

Lignocellulose là một vật liệu khó thủy phân do chúng có các liên kết

polysaccharid (cellulose và hemicellulose), liên kết ester và ete (lignin) tạo nên cấu trúc

rất bền vững có độ cứng và độ bền cơ học cao (Hình 1.1). Xét về thành phần

lignocellulose bao gồm:

Hình 1.1. Cấu trúc của lignocellulose [8]

7

Cellulose:

Cellulose là một polymer mạch thẳng, có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n. Các

đơn phân hoàn toàn cấu tạo từ đường D-glucose liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4-

glucoside với số lượng lên tới hơn 10.000 đơn vị. Cấu trúc liên kết thẳng cho phép hình

thành liên kết hydro trong và giữa phân tử tạo ra các vi sợi từ 36 chuỗi cellulose xếp song

song, hay cấu trúc tinh thể của cellulose. Mức độ trùng hợp của cellulose tự nhiên có thể

đạt 10.000-14.000 đơn vị glucose trên phân tử, khối lượng tương ứng là 1,5 triệu dalton

với chiều dài phân tử có thể lớn hơn hoặc bằng 5µm [9].

Giữa các chuỗi cellulose có rất nhiều gốc -OH tạo nên rất nhiều liên kết hydro

giúp ổn định sợi cellulose, làm cho sợi cellulose rất bền vững, khó thủy phân.

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của cellulose [10] Sợi cellulose có thể kết hợp với nhau một cách chặt chẽ, có trật tự hình thành nên

vùng có cấu trúc tinh thể (Hình 1.2). Bên cạnh đó cũng có một số sợi cellulose kết hợp

một cách ngẫu nhiên hình thành nên vùng có cấu trúc vô định hình. Từ đó cho thấy các

dung môi và các chất hóa học rất khó xâm nhập vào vùng tinh thể, nhưng lại dễ dàng xâm

nhập vào vùng vô định hình [11].

Hemicellulose:

Hemicellulose là một loại polymer phức tạp và phân nhánh, độ trùng hợp khoảng

70 - 200 DP. Hemicellulose chứa cả đường 6 gồm D-glucose, D-mannose, D-galactose

và đường 5 gồm D-xylose và L-arabinose. Thành phần cơ bản của hemicellulose là β-D

xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β-(1,4). Cấu tạo của hemicellulose khá

phức tạp và đa dạng tùy vào nguyên liệu, tuy nhiên có một vài điểm chung bao gồm [12]:

8

Mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β-(1,4), xylose là thành

phần quan trọng nhất và nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl-O- liên kết với vị trí 2

hoặc 3.

Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là disaccharide hoặc

trisaccharide. Sự liên kết của hemicellulose với các polysaccharide khác và với lignin là

nhờ các mạch nhánh này. Cũng vì hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại ở dạng vô

định hình và vì thế dễ bị thủy phân. Tùy theo loại gỗ (gỗ cứng, gỗ mềm) mà chúng có đặc

điểm hemicellulose khác nhau:

Gỗ cứng chủ yếu có hai loại hemicellulose:

Acetyl-4-O-methyglucuronoxylan, là một loại polymer có mạch chính gồm β-D

xylopyranose liên kết với nhau bằng liên kết β-D(1,4). Trong đó 70% các nhóm -OH ở vị

trí C2 và C3 bị acetyl hóa, 10% các nhóm ở vị trí C2 liên kết với acid 4-O-methyl-D-

glucuronic. Gỗ cứng còn chứa glucomannan, polymer này chứa một tỉ lệ bằng nhau β-D-

glucopyranose và β-D-mannopyranose.

Loại thứ hai có mạch chính là β-D-galactopyranose, phân nhánh. Loại

hemicellulose này tạo liên kết -O tại nhóm OH ở vị trí C6 với α-L-arabinose, β-D-

galactose hoặc acid β-D-glucoronic [13].

Gỗ mềm cũng bao gồm hai loại hemicellulose chính:

Loại quan trọng nhất là galactoglucomannan, đây là polymer cấu thành từ các

phân tử D-mannopyranose liên kết với D-glucopyranose bằng liên kết β-(1,4) với tỉ lệ hai

monomer tương ứng là 3:1. Tuy nhiên, tỉ lệ này thay đổi tùy theo loại gỗ.

Arabino-4-O-methylglucuronoxylan, cấu tạo từ các D-xylopyranose, các monomer

này bị thế ở vị trí 2 bằng acid 4-O-methyl-glucuronic, ở vị trí 3 bằng α-L-

arabinofuranose.

Đối với cỏ, 20-40% hemicellulose là arabinoxylan. Polysaccharide này cấu tạo từ

các D-xylopyranose, OH ở C2 bị thế bởi acid 4-O-methylglucuronic. OH ở vị trí C3 sẽ tạo

mạch nhánh với α-L-arabinofuranose. Cấu tạo phức tạp của hemicellulose tạo nên nhiều

tính chất hóa sinh và lý sinh cho cây [13].

9

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của xylan [8]

Lignin: Lignin là một polyphenol có cấu trúc mở. Trong tự nhiên, lignin chủ yếu đóng vai

trò chất liên kết trong thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemicellulose. Rất khó để có thể tách lignin ra hoàn toàn. Lignin là polymer, được cấu thành từ các đơn vị phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình được đề nghị là: guaiacyl (G), chất gốc là rượu trans-coniferyl; syringly (S), chất gốc là rượu trans-sinapyl; p-hydroxylphenyl (H), chất gốc là rượu trans-p courmary. Lignin là một hợp chất cao phân tử có cấu trúc vô định hình khác với cellulose, lignin có chứa các nhóm hydroxyl (-OH), nhóm methoxyl (-OCH3) và nhân benzen bao gồm các đơn vị cơ bản: coniferyl alcohol, sinapyl alcohol và p-coumaryl alcohol, tỉ lệ ba loại rượu này trong các loại thực vật khác nhau thì khác nhau (Hình 1.4). Lignin đặc biệt khó phân hủy do các phân tử được nối với nhau bởi liên kết este và liên kết carbon, tạo thành một mạng lưới liên kết ngang rộng rãi trong các tế bào [13].

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của lignin [13]

10

Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng, lignin hoàn toàn không đồng nhất trong

cấu trúc. Lignin dường như bao gồm vùng vô định hình và các vùng có cấu trúc hình

thuôn hoặc hình cầu. Lignin có liên kết hóa học với thành phần hemicellulose và ngay cả

với cellulose (không nhiều) độ bền hóa học của những liên kết này phụ thuộc vào bản

chất liên kết và cấu trúc hóa học của lignin và những đơn vị đường tham gia liên kết.

Carbon alpha (Cα) trong cấu trúc phenyl propane là nơi có khả năng tạo liên kết cao nhất

với khối hemicellulose. Ngược lại, các đường nằm ở mạch nhánh như arabinose,

galactose, và acid 4-O-methylglucuronic là các nhóm thường liên kết với lignin. Các liên

kết có thể là ether, ester (liên kết với xylan qua axít 4-O-methyl-D-glucuronic) hay

glycoxit (phản ứng giữa nhóm khử của hemicellulose và nhóm OH phenolic của lignin).

Cấu trúc hóa học của lignin rất dễ bị thay đổi ở nhiệt độ cao và pH thấp, như quá trình

tiền xử lý bằng hơi nước hoặc trong môi trường axít/kiềm. Ở nhiệt độ phản ứng cao hơn

2000C, lignin bị kết khối thành những phần riêng biệt và tách ra khỏi cellulose [15,16].

1.1.2. Nguồn nguyên liệu bã mía

1.1.2.1 . Nguồn gốc và hiện trạng sử dụng bã mía ở Việt Nam

Về mặt tài nguyên tự nhiên như khí hậu, đất đai, Việt Nam được đánh giá là nước

có tiềm năng để phát triển cây mía. Việt Nam có đủ đất đồng bằng, lượng mưa nói chung

tốt (1400 mm đến 2000 mm/năm), nhiệt độ phù hợp, độ nắng thích hợp. Trên phạm vi cả

nước, các vùng tây nguyên và vùng Đông Nam Bộ, đặc biệt là vùng duyên hải Nam

Trung Bộ có khả năng rất tốt cho trồng mía đường.

Theo Hiệp hội Mía đường Việt Nam (VSSA), hiện nay mỗi năm các nhà máy

đường ép trên 15 triệu tấn mía, phát sinh ra 4,5 triệu tấn bã mía. Tại nhà máy đường

Bourbon (Tây Ninh) với công suất chế biến 8.000 tấn mía/ngày, thải ra khoảng 2.800 tấn

bã mía/ngày. Công ty đường Biên Hòa (Đồng Nai) có 3 nhà máy, trong đó 2 nhà máy sử

dụng mía làm nguyên liệu với tổng công suất 5.000 tấn mía/ngày. Mỗi năm, sản lượng

mía cây là 600.000 - 750.000 tấn, tương đương 174.000 - 217.500 tấn bã. Một phần bã

mía mang đốt tạo thành điện cho hoạt động của nhà máy, phần còn lại vẫn không sử dụng

hết, tồn dư rất lớn. Việc tận dụng toàn bộ lượng bã mía thải bỏ sẽ góp phần giảm bớt áp

lực cho các nguồn nguyên liệu sinh học khác như: cây bắp, khoai mì, gỗ...[17].

11

Hình 1.5. Hiện trạng sản xuất mía đường các vùng của Việt Nam [18]

Theo số liệu thống kê của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, niên vụ 2016 -

2017 diện tích mía cả nước chỉ đạt 268.300 ha, giảm 16.067 ha so với vụ trước. Trong đó,

diện tích ở vùng nguyên liệu tập trung của 25 tỉnh có nhà máy đường là 257.600 ha, giảm

15.205 ha. Đối với những diện tích có hợp đồng và tiêu thụ sản phẩm chỉ đạt 218.343 ha,

chiếm 80% tổng diện tích cả nước và giảm sâu so với kế hoạch đầu vụ.

Qua khảo sát đánh giá, Tây Nguyên là vùng có diện tích, năng suất ổn định nhất

(diện tích 56.700 ha, tăng 371ha; năng suất bình quân 62,6 tấn/ha). Trong khi đó, vùng

Duyên Hải Nam Trung bộ với điều kiện tự nhiên bất lợi, đất canh tác xấu, thường xuyên

đối mặt với hạn hán nên năng suất, chất lượng cho kết quả thấp nhất.

Theo số liệu tổng hợp của các nhà máy đường trên cả nước, vụ 2017 - 2018 tổng

diện tích đã được ký hợp đồng đầu tư và bao tiêu sản phẩm là 248.930 ha, tăng 30.587

ha. Sản lượng mía ép đạt 15,17 triệu tấn, sản lượng đường đạt 1,42 triệu tấn, trong đó

đường tinh luyện là 600.000 tấn [19].

1.1.2.2. Các vấn đề môi trường từ bã mía

Lượng sinh khối từ phụ phẩm công-nông nghiệp nói chung và bã mía nói riêng

phát sinh sau mỗi vụ thu hoạch là rất lớn, nếu không có biện pháp xử lý và quản lý hiệu

quả thì sẽ gây ô nhiễm môi trường, đồng thời lãng phí nguồn nguyên liệu phục vụ cho

sản xuất cũng như chăn nuôi [20].

Trong những năm gần đây, do không tận dụng hợp lý các nguồn phụ phẩm này

đúng cách, đồng thời áp dụng phương pháp xử lý tiêu cực đang gây vấn nạn to lớn tới

12

môi trường như việc chất đống để đốt hoặc ủ lưu trong thời gian dài. Sau mỗi vụ mùa, bã

mía thường được đốt ở khắp nơi, khói gây ô nhiễm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức

khỏe người dân và góp phần làm biến đổi khí hậu, phế phẩm ủ đống để lưu lâu ngày gây

hôi thối và ô nhiễm môi trường nước, không khí rất nghiêm trọng, đặc biệt là bã mía với

thành phần giàu đường Sucroza và mật rỉ đường. Bên cạnh đó, sự tiêu hủy và xử lý

không phù hợp nguồn sinh khối này gây lãng phí nguồn nguyên liệu tái sinh có thể sử

dụng lại phục vụ chính cho nông nghiệp [21].

Theo ước tính, nếu đốt 1 tấn bã mía khô thì sẽ thải ra 36,32 kg khí CO, 4,54 kg

hydrocarbon, 3,18 kg bụi tro và 56 kg CO2, các thành phần này góp phần gây hiệu ứng

nhà kính, gây ô nhiễm môi trường không khí. Từ những bất cập trên dẫn đến tình trạng ô

nhiễm môi trường do bã mía gây ra ở nước ta ngày càng diễn ra nghiêm trọng hơn [21,

22].

Bã mía là nguồn nguyên liệu phong phú cho việc sản xuất bioethanol nếu chúng ta

biết ứng dụng hợp lý tiến bộ khoa học công nghệ. Hiện nay có nhiều hướng tiếp cận,

trong đó có một giải pháp đầy tiềm năng là ứng dụng xúc tác sinh học sử dụng các

enzyme thủy phân từ vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn) để chuyển hóa chúng thành

những dạng năng lượng có ích với hiệu suất cao.

1.2. Chuyển hóa vật liệu giàu lignocellulose

1.2.1. Quá trình thủy phân vật liệu giàu lignocellulose

Quá trình thủy phân lignocellulose được thực hiện bởi axít, kiềm hoặc hỗn hợp

enzyme thủy phân. Vào cuối thế kỉ 19 và đầu thế kỉ 20, quá trình thủy phân được thực

hiện bởi phản ứng giữa cellulose với axít. Axít loãng được sử dụng dưới điều kiện nhiệt

độ và áp suất cao, còn axit đậm đặc được sử dụng ở nhiệt độ thấp và áp suất khí quyển.

Quá trình thủy phân bằng axít loãng xảy ra ở nhiệt độ và áp suất cao dẫn đến sự tạo thành

các chất độc hại có thể ảnh hưởng không tốt đến quá trình lên men như các axít hữu cơ có

trọng lượng phân tử thấp, dẫn xuất furan và các hợp chất vô cơ. Các mắt xích của

cellulose có thể bị phân cắt thành các phân tử đường glucose riêng lẻ bằng hệ cellulase.

Xét về bản chất quá trình thủy phân được thực hiện theo phương trình phản ứng:

(C6H10O5)n + nH2O nC6H12O6.

13

Ngày nay, người ta quan tâm nhiều theo hướng nghiên cứu ứng dụng kết hợp xử lý

hóa học và xúc tác sinh học để thủy phân nguồn vật liệu giàu lignocellulose thay cho các

phương pháp hóa lý truyền thống. Sự kết hợp này giúp cho quá trình thủy phân đạt hiệu

quả cao hơn.

Khi có sự tham gia xúc tác sinh học của enzyme thì cơ chất sẽ được hoạt hóa

mạnh. Cơ chất tương tác với enzyme do sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron, sự

biến dạng các liên kết. Từ đó làm thay đổi động năng, thế năng dẫn tới cơ chất trở nên dễ

dàng tham gia vào các phản ứng hơn. Quá trình xúc tác của enzyme xảy ra qua ba giai

đoạn [23].

E +S ES E + P

Trong đó: E - enzyme; S - cơ chất; P - sản phẩm

Giai đoạn thứ nhất: Enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu, nhờ

đó sẽ tạo ra phức hợp ES, phức này không bền. Giai đoạn thường này xảy ra rất nhanh và

đòi hỏi một ít năng lượng.

Giai đoạn thứ hai: Cơ chất bị biến đổi, dẫn tới làm căng, phá vỡ các liên kết đồng

hóa trị.

Giai đoạn thứ ba: Sản phẩm được tạo thành, tách ra khỏi enzyme, enzyme được

giải phóng và trở lại trạng thái tự do.

Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES là: tương

tác tĩnh điện, liên kết hydro, tương tác Van der Waals. Mỗi loại liên kết đòi hỏi những

điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước.

Cellulose và hemicellulose khó thủy phân hơn tinh bột do tinh bột chứa

amylopectin có cấu trúc phân nhánh nên dễ dàng tiếp xúc với enzyme. Trong khi

cellulose tinh thể tạo cấu trúc thẳng, khoảng cách giữa các phân tử thấp nên enzyme tiếp

xúc với các phân tử cellulose khó khăn hơn. Bên cạnh đó, việc thủy phân liên kết α - 1,4

– glycosidic trong tinh bột dễ dàng hơn liên kết β- 1,4- glycosidic trong cấu trúc của

cellulose [23].

Quá trình chuyển hóa bao gồm sự thủy phân các thành phần chính của

lignocellulose để tạo ra những loại đường (hexose – C6 và pentose – C5) có thể lên men

14

bioethanol. Giai đoạn tiền xử lý là cần thiết để nâng cao hiệu quả quá trình thủy phân

cellulose thành các đường đơn. Quá trình này thường được thực hiện bởi axít hoặc

enzyme cellulase và quá trình lên men được thực hiện bởi vi khuẩn hoặc nấm men [24].

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân cellulose bao gồm độ xốp của vật liệu,

kích thước vi sợi cellulose và sự có mặt của lignin, hemicellulose trong vật liệu [25]. Sự

hiện diện của lignin và hemicellulose làm cho hoạt động của cellulase trở nên khó khăn

hơn, do đó hiệu suất của quá trình thủy phân sẽ thấp. Quá trình tiền xử lý làm thay đổi

cấu trúc và kích thước của sinh khối, cũng như thành phần hóa học của nó, sao cho quá

trình thủy phân các hydrocarbon thành các loại đường đơn diễn ra nhanh chóng và đạt

hiệu quả cao. Quá trình thủy phân sẽ đạt hiệu quả cao bằng việc loại bỏ lignin, giảm kích

thước vi sợi cellulose, tăng cường độ xốp thông qua quá trình tiền xử lý [26]. Các loại

đường 6 carbon (hexoses) như D-glucose, D-galactose, và D-mannose dễ dàng lên men

thành bioethanol bởi hoạt động tự nhiên của nhiều sinh vật. Để chuyển hóa các

carbohydrate (cellulose và hemicellulose) trong lignocellulose thành bioethanol, các

polymer phải bị bẻ gãy thành những phân tử đường nhỏ hơn trước khi vi sinh vật có thể

hoàn tất quá trình chuyển hóa. Do vậy, bước tiền xử lý là bắt buộc để quá trình đường

hóa glucose có thể diễn ra hiệu quả [27]. Do vậy, mục đích quá trình tiền xử lý là:

- Phá vỡ cấu trúc tinh thể của cellulose vì trong tự nhiên hình thành cấu trúc tinh

thể chiếm khoảng 50-90%.

- Giảm sự bao bọc của lignin quanh cellulose do lignin cùng với hemicellulose tạo

thành cấu trúc mô vững chắc. Những mô được bền hóa với lignin trong đó lignin đóng

vai trò kết dính những sợi cellulose. Tuy nhiên việc loại bỏ lignin luôn kèm theo sự phân

hủy hemicellulose ngay cả trong phương pháp tiền xử lý nguyên liệu bằng kiềm và axít ở

nhiệt độ thấp [28], loại bỏ được 70% lignin thì cũng có 5% hemicellulose bị hòa tan .

- Tăng mức độ acetyl hóa của hemicellulose: Đây là yếu tố ít được quan tâm,

xylan – thành phần hemicellulose chính trong gỗ cứng và cây thân cỏ - bị acetyl hóa với

tỉ lệ rất cao. Tỉ lệ cellulose bị thủy phân tăng lên 2-3 lần [29, 30].

15

Hình 1.6. Vai trò tiền xử lý trong chuyển đổi sinh khối thành nhiên liệu [31] Có nhiều phương pháp tiền xử lý vật liệu giàu lignocellulose khác nhau như: Vật

lý (xay, nghiền và nhiệt phân), hóa lý (nổ hơi nước, amoniac, CO2), hóa học (kiềm, axit,

ozon, H2O2, dung môi hữu cơ) và xúc tác sinh học. Mỗi phương pháp có ưu và nhược

điểm riêng do vậy, để lựa chọn phương pháp nào phù hợp phụ thuộc vào thành phần cấu

tạo của sinh khối lignocellulose và sản phẩm phụ sinh ra trong quá trình tiền xử lý [32].

Ngoài ra yếu tố chi phí cũng ảnh hưởng rất lớn đến việc lựa chọn phương pháp phù hợp.

Quá trình tiền xử lý giúp tách loại lignin, tăng khả năng xúc tác trên cấu trúc phân

tử cellulose. Bên cạnh đó, quá trình tiền xử lý còn thủy phân hemicellulose có trong

thành phần của sinh khối. Hemicellulose có cấu trúc phân nhánh với những chuỗi mạch

ngắn hơn so với cellulose [33]. Do đó, thủy phân hemicellulose dễ dàng hơn thủy phân

cellulose. Hemicellulose bị thủy phân tạo điều kiện thuận lợi cho các tác nhân tiếp xúc

thủy phân cellulose ở quá trình kế tiếp. Đây là bước vô cùng quan trọng để nâng cao hiệu

quả cho các giai đoạn tiếp theo trong quá trình chuyển hóa sinh khối lignocellulose.

1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến xúc tác sinh học

Ảnh hưởng của cấu trúc nguyên liệu: Cấu trúc tự nhiên của lignocellulose tạo ra nhiều

cản trở đến quá trình tấn công của các tác nhân thủy phân. Ngay cả quá trình thủy phân

cellulose tinh khiết, tốc độ thủy phân cũng giảm theo thời gian vì một số lý do sau: sự ức

chế enzyme do sản phẩm, sự giảm của các phần cơ chất dễ thủy phân, enzyme bị bất hoạt

hoặc bị giữ lại trong các lỗ xốp của nguyên liệu.

Hiệu suất quá trình thủy phân bị ảnh hưởng mạnh bởi tính chất của nguồn nguyên

16

liệu. Thông thường, gỗ mềm thường khó thủy phân hơn gỗ cứng [34]. Cấu trúc của

nguyên liệu và cơ chế tác động của enzyme và cơ chất là hai yếu tố chính làm hạn chế

hiệu suất quá trình thủy phân. Khả năng tiếp cận vật liệu lignocellulosic của hệ cellulase

đóng vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân. lignocellulose có bề mặt trong và

ngoài, bề mặt ngoài bao gồm bề mặt bao quanh các xơ sợi, bề mặt trong là bề mặt do các

mao quản bên trong xơ sợi tạo thành. Nếu lignocellulose không được tiền xử lý, hiệu quả

thủy phân thấp. Kích thước của các lỗ xốp lại liên quan đến độ trương nở của vật liệu.

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, khi làm khô vật liệu lignocellulose, các mao quản sẽ bị mất

đi, điều này làm giảm kích thước lỗ xốp vì vậy hiệu suất quá trình thủy phân giảm rõ rệt.

Hàm lượng và sự phân bố của lignin trong cấu trúc vật liệu có ảnh hưởng tới khả năng

thủy phân của vật liệu đó. Hiệu suất thủy phân thu được khá cao đối với các nguyên liệu

đã được loại bỏ gần hết lignin [35].

Ảnh hưởng của nhiệt độ: Giống như nhiều phản ứng enzyme khác, phản ứng thủy phân

lignocellulose bằng hệ cellulase chịu ảnh hưởng lớn của nhiệt độ. Tốc độ phản ứng thủy

phân tăng theo nhiệt độ, tuy nhiên đến một nhiệt độ nhất định, tốc độ phản ứng sẽ giảm

dần và đến mức triệt tiêu. Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất được

gọi là nhiệt độ tối ưu. Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40 đến 500C và

cellulase cũng thế. Những enzyme khác nhau đều có nhiệt độ tối ưu khác nhau. Nếu nhiệt

độ cao hơn nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm do enzyme bị biến tính. Ngược

lại khi ở nhiệt độ 00C, enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt độ lên

từ từ, hoạt tính của enzyme sẽ tăng dần đều đến mức tối ưu. Phản ứng bất hoạt của

enzyme dưới tác dụng của nhiệt thường biểu diễn là phản ứng bậc một [35].

Trong đó: K - hằng số vận tốc phản ứng

E – nồng độ enzyme hoạt động ở thời điểm t

Eo – nồng độ ban đầu của enzyme hoạt động

Ảnh hưởng của pH: pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất,

enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất

17

mạnh đến phản ứng của enzyme. Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính, tuy

nhiên cũng có nhiều enzyme hoạt động ở môi trường axít yếu. Một số enzyme khác lại

hoạt động mạnh ở pH kiềm và cả pH axít. Đối với cellulase, khoảng pH thích hợp là 4-

5.5, trong đó tốt nhất là 4.8 [34].

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và cơ chất: Khi nồng độ enzyme tăng, tốc độ phản ứng

tăng theo đường thẳng. Tuy nhiên, khi nồng độ enzyme đạt đến một ngưỡng nào đó, nồng

độ cơ chất sẽ trở thành yếu tố hạn chế tốc độ phản ứng. Khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ

phản ứng enzyme tăng, sẽ có nhiều cơ chất va chạm với enzyme trong phản ứng chuyển

hóa. Khi nồng độ cơ chất đủ lớn, các enzyme bị bão hòa cơ chất. Vì vậy, tăng nồng độ cơ

chất thì tốc độ phản ứng sẽ không thay đổi đáng kể [34].

Ảnh hưởng của các chất kìm hãm: Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là

các chất có mặt trong các phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính enzyme nhưng lại không

bị enzyme làm thay đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng.

Các chất gây kìm hãm hoạt động của enzyme bao gồm các ion, các phần tử vô cơ, các

chất hữu cơ và cả protein. Các chất kìm hãm có ý nghĩa rất lớn trong điều khiển các quá

trình trao đổi ở tế bào sinh vật. Tùy thuộc vào bản chất phức, bản chất chất kìm hãm

người ta chia ra những chất kìm hãm:

• Chất kìm hãm cạnh tranh: là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của

cơ chất. Chúng thường là những chất kìm hãm thuận nghịch. Chúng có khả năng kết hợp

với trung tâm hoạt động của enzyme. Khi đó chúng sẽ chiếm vị trí của cơ chất trong

trung tâm hoạt động vì vậy cơ chất không còn cơ hội tiếp cận với trung tâm này. Cơ chế

loại trừ lẫn nhau của chất kìm hãm và trung tâm hoạt động làm giảm số lượng các

enzyme kết hợp với cơ chất. Kết quả là hoạt động của enzyme sẽ giảm.

• Chất kìm hãm không cạnh tranh: chất kìm hãm không chiếm trung tâm hoạt

động của enzyme mà là ở một vị trí ngoài trung tâm hoạt động của enzyme. Kết quả sự

kết hợp này, chất kìm hãm làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo

chiều hướng bất lợi cho hoạt động xúc tác. Vì thế các chất kìm hãm làm giảm hoạt động

của enzyme. Đối với cellulase, các sản phẩm của phản ứng thủy phân, gồm cellobiose và

glucose đều có tác động kìm hãm hoạt tính của cellulase, đặc biệt là cellobiose [34].

18

1.2.3. Đa dạng nấm Việt Nam cho chuyển hóa vật liệu giàu lignocellulose

Việt Nam là một trong những quốc gia có đa dạng sinh học cao trên thế giới với

khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao và 3.000 loài động vật có xương sống đã được miêu

tả, trong đó có nhiều loài đặc hữu. Cấu trúc địa độc đáo, khí hậu nhiệt đới và nhiều kiểu

sinh thái khác nhau đã góp phần tạo nên sự đa dạng của khu hệ nấm Việt Nam. Nếu ước

tính số loài nấm có thể có trên lãnh thổ Việt Nam gấp 6 lần số loài thực vật bậc cao thì số

loài nấm có thể lên tới 72.000 loài. Điều đó có nghĩa là hơn 90% số loài nấm có thể có

của Việt Nam còn chưa được định loài và nêu tên trong danh lục [36, 37]. Trong danh lục

thực vật Việt Nam phần nấm (2001), số lượng loài nấm chỉ có khoảng 2.250 loài, trong

đó các loài nấm Túi (Ascomycota) còn rất ít so với các loài nấm Đảm (Basidiomycota).

Trong khi đó, trên thế giới số lượng loài nấm Ascomycota ước tính chiếm 2/3 trong tổng

số các loài nấm đã được mô tả.

Sinh vật phân hủy lignocellulose đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì

vòng tuần hoàn carbon nhờ khả năng chuyển hóa hiệu quả các vật liệu thực vật bởi hệ

enzyme thủy phân. Trong số các sinh vật phân hủy lignocellulose, các loài nấm thuộc

nấm đảm Basidiomycota và nấm túi Ascomycota được biết là có hệ xúc tác sinh học hiệu

quả nhất và được chia thành 3 nhóm: nấm mục trắng, nấm mục nâu và nấm mục mềm.

Trong khi có nhiều nghiên cứu tập trung vào nhóm nấm mục trắng và mục nâu (chủ yếu

thuộc ngành Basidiomycota), có rất ít các nghiên cứu trên hệ enzyme chuyển hóa

lignocellulose bởi nhóm nấm mục mềm (phần lớn thuộc ngành Ascomycota). Các nấm

thuộc ngành nấm túi Ascomycota dường như thiếu các peroxidase chuyển hóa lignin

nhưng thay vào đó, chúng có các enzyme thủy phân và laccase cho phép chuyển hóa hiệu

quả lignocellulose [38].

Ngoài ra, sự quan trọng của enzyme này còn liên quan đến xúc tác giải phóng các

axít phenolic (axít ferulic, axít p-coumaric, axít cinnamic…) và các dimer của chúng từ

vật liệu lignocellulose [39]. Các axít phenolic từ phụ phẩm nông nghiệp được biết là các

chất chống oxi hóa mạnh, chống ung thư da, kháng virus [40]. Hiện nay, Việt Nam có rất

ít các công bố liên quan đến việc sử dụng carbohydrate esterase (feruloyl esterase, acetyl

esterase) từ nấm để thủy phân lignocellulose từ phụ phẩm công-nông nghiệp. Trên thế

19

giới, một số công bố về feruloyl esterase liên quan đến sự thủy phân lignocellulose đã

được tinh sạch và nghiên cứu đặc tính, chủ yếu là từ nguồn nấm và vi khuẩn (Clostridium

spp., Pseudomonas spp., Aspergillus spp, Paenibacillus terrae ME27-1 và Penicillium

spp) [41].

Gần đây, khi nghiên cứu chi Xylaria ở Vườn Quốc gia Cúc Phương của Việt Nam,

nhóm nghiên cứu thuộc trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã chỉ ra số loài mới ghi nhận

cho lãnh thổ Việt Nam là khá lớn (20 loài) và 17 loài có thể là mới cho khoa học [42].

Nhìn chung, nguồn tài nguyên nấm ứng dụng trong ngành hóa sinh và công nghệ sinh

học còn ít được khai thác sử dụng, do vậy, nước ta vẫn có tiềm năng lớn về các loài và

các chất xúc tác sinh học có hoạt tính hữu ích.

Hình 1.7. Cấu trúc các enzyme tham gia vào quá trình chuyển hóa lignocellulose [43]

Nghiên cứu ứng dụng enzyme như một nguồn xúc tác sinh học để thủy phân các

phụ phẩm công-nông nghiệp thành các đường đơn ngày càng được quan tâm. Giải pháp

này vừa không tiêu hao nguồn lương thực của con người vừa loại bỏ các phế phụ phẩm

20

nông nghiệp một cách thân thiện với môi trường mà có thể hy vọng sẽ sản xuất được

nhiên liệu sinh học với quy mô lớn, nhờ ưu điểm hiệu suất cao và giá thành giảm.

1.2.4. Ứng dụng của enzyme trong quá trình thủy phân lignocellulose

Các vi sinh vật có khả năng phân hủy lignocellulose là do chúng có thể tiết ra các

enzyme tạo thành một hệ enzyme gọi là hệ cellulase. Sự phân giải tiến hành trong điều

kiện môi trường kiềm, axít hoặc ở các nhiệt độ, pH khác nhau. Các cellulase xúc tác việc

phân giải cellulose thành cellobiose và glucose. Vi sinh vật dùng các sản phẩm thủy phân

này làm nguồn cacbon và nguồn năng lượng [44].

Các loài nấm sợi được biết là có hệ enzyme xúc tác hiệu quả đồng thời chúng tiết

vào môi trường lượng enzyme ngoại bào nhiều hơn vi khuẩn giúp chúng phân hủy tốt

lignocellulose [36]. Nấm bao gồm hai hệ enzyme ngoại bào, hệ enzyme thủy phân có vai

trò trong phân hủy polysaccharide và hệ enzyme oxy hóa phân giải lignin ngoại bào để

phân hủy lignin và xúc tác phản ứng mở vòng phenyl [45]. Các enzyme phân giải thành

tế bào nhận được nhiều sự quan tâm bởi chúng có thể giải phóng các đơn vị đường cần

thiết cho các quá trình lên men và sản xuất bioethanol từ các vật liệu thô giàu

lignocellulose. Đặc biệt, enzyme từ nấm lớn có khả năng thủy phân hiệu quả vật liệu

cellulose. Tuy nhiên, cấu trúc phức tạp của lignocellulose trong thành tế bào của chúng

làm hạn chế hoạt động của nhiều loại enzyme cần thiết cho sự tấn công mạch chính và

các mạch nhánh của polymer. Ngoài hệ enzme ngoại bào cellulase, quá trình thủy phân

lignocellulose còn cần các enzyme thủy phân khác bao gồm esterase (feruloyl esterase,

acetyl esterase hay acetyl xylan esterase), chúng hoạt động phối hợp với các enzyme tấn

công mạch chính (cellulase/xylanase) và mạch nhánh của cấu trúc polymer này [46,47].

Sự phân giải cellulose tự nhiên là một quá trình phức tạp đòi hỏi sự tham gia phối

hợp của nhiều enzyme khác nhau. Các enzyme này xúc tác quá trình thủy phân cắt ngắn

mạch cellulose. Nhiều tác giả cho rằng hệ cellulase gồm các enzyme chính sau đây [23,

48]:

Endo-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4), còn gọi là cellulase này tác động thuỷ phân lên

các liên kết phía trong mạch cellulose một cách tuỳ tiện làm trương phồng cellulose, dẫn

đến làm giảm nhanh chiều dài mạch và tăng chậm các nhóm khử. Enzyme này hoạt động

21

mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose, enzyme

này sẽ tấn công ngẫu nhiên vào các cơ chất 1,4-β-glucan cả tan và không tan.

Exo-1,4 - glucanase (EC 3.2.1.91), còn gọi là cellobiohydrolase. Enzyme này giải

phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose. Enzyme này tác động yếu

lên vùng vô định hình ở phía bên trong của mạch, nhưng tác động mạnh lên mạch bên

ngoài của cellulose kết tinh hoặc cellulose đã bị phân giải một phần. Hai enzyme exo và

endo - glucanase có tác dụng hiệp đồng cho hiệu quả rõ rệt.

β - 1,6 - glucosidase (EC 3.2.1.21), còn gọi là cellobiase. Enzyme này thuỷ phân

cellobiose và các cellodextrin hoà tan, chúng có hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của

mạch cellulose tăng lên. Tùy theo vị trí mà β - glucosidase được coi là nội bào, ngoại

bào hoặc liên kết với thành tế bào. Chức năng của β - glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự

tích luỹ các chất cảm ứng của cellulase. Người ta cho rằng tính đa hình của cellulase là

nhằm phù hợp với cấu trúc phức tạp của mạch phân tử cellulose, gồm nhiều vùng có hoạt

tính thủy phân khác nhau. Tuỳ thuộc vào các chủng vi sinh vật cũng như các điều kiện

môi trường nuôi cấy, tỷ lệ các thành phần trong hệ enzyme, hoạt lực phân giải cellulose

của các hệ cellulase là khác nhau, nhưng để phân giải hoàn toàn cellulose, cần có sự tác

dụng hiệp đồng của cả ba enzyme trong hệ cellulose [49].

Từ các nghiên cứu về ba enzyme trong hệ cellulase nhiều tác giả đều đưa ra kết

luận chung là các loại cellulase có tác dụng hiệp đồng sẽ thay phiên nhau thủy phân

cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là đường glucose [35].

Hình 1.8. Hệ cellulase tham gia thủy phân mạch cellulose [35]

22

Hemicellulose với thành phần chính là xylan chiếm khoảng 30% thành tế bào thực

vật sống lâu năm. Tùy theo loại gỗ mà thành phần xylan thay đổi từ 15-30% đối với gỗ

cứng và 7-10% đối với gỗ mềm. Để chuyển hóa chúng thì sự có mặt của hệ xylanase là rất

cần thiết. Xylanase thủy phân liên kết β-1,4 giữa các phân tử xylan với nhau, giải phóng

các phân tử ngắn xylooligomer gồm có endo-xylanase và exo-xylanase. Trong khi

endoxylanase phân cắt liên kết β-1,4-xyloside trong mạch xylan thì exo-xylanase thủy

phân liên kết β-1,4-xyloside ở các đầu tự do. Sản phẩm của các enzyme này là xylobiose

sẽ được tiếp tục thủy phân thành đường đơn xylose bằng enzyme β-xylosidase.

Các nhóm bên có mặt trong xylan được giải phóng bởi exo--mannosidase (EC

3.2.1.25), α-L arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55), α-D-glucuronidase (EC 3.2.1.1),

galactosidase (EC 3.2.1.139) và acetyl (xylan) esterase [50,51]. Enzyme α-

arabinofuranosidase thủy phân nhóm cuối cùng không khử α-L-arabinofuranosyl của

arabinan, arabinoxylan và arabinogalactan. Enzyme α-D-glucuronidase thủy phân liên kết

α-1,2-glycosidic giữa xylose và D-glucuronic axit hoặc liên kết ete với 4-O-methyl. Sự

thủy phân liên kết α-1,2 bền vững đóng vai trò quan trọng trong thủy phân xylan (Hình

1.9).

Ngoài ra, để thủy phân hiệu quả hemicellulose cần sự có mặt của endo-β-1,4-

mannanase (EC 3.2.1.78 ) và hệ enzyme thủy phân carbohydrate esterase (CE) với chức

năng khác nhau. Trong đó, endo-β-1,4-mannanase thủy phân liên kết 1,4-β-

manopyranozit trong mạch chính của mannan và heteropolysaccharide có chứa đường

mannanose. Sự thủy phân mannan từ polysaccharide bằng β-mannanase tạo ra các mano-

oligosaccharide và một chuỗi các oligosaccharide chứa D-manose, D-glucose và D-

galactose. β- mannanase phân cắt liên kết β-1,4-mannosit trong mạch mannan. Do vậy,

nó xúc tác thủy phân mannan, glucomannan, galactomannan và galatoglucomannan tạo

thành mannobiose, mannotriose và hỗn hợp các oligosaccarit khác. Cùng với đó, các

nhóm bên cũng sẽ bị phân cắt bởi một số hemicellulase khác như: α-L-

arabinofuranosidase, α-L-arabinanase, α-Dglucuronidase, xyloglucan hydrolase và

pectinase [52].

23

Hình 1.9. Cấu trúc xylan được tấn công bởi những enzyme thủy phân khác nhau [53] Tới nay, nhiều nghiên cứu đã được công bố về một số chủng vi sinh vật như nấm

sợi, nấm mục và một số loại vi khuẩn có khả năng sản xuất các enzyme phân giải lignin.

Trong đó, để phân giải lignin hiệu quả nhất đến nay được xác định thuộc họ nấm mục

trắng [52]. Taniguchi và cộng sự đã đánh giá hiệu quả tiền xử lý của rơm lúa bằng bốn

loại nấm mục trắng [54] (Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor,

Ceriporiopsis subvermispora và Pleurotus ostreatus) dựa trên những thay đổi về số

lượng và thành phần cấu trúc rơm rạ sau xử lý cũng như tính nhạy cảm với enzyme thủy

phân. Kết quả là P. ostreatus có khả năng thủy phân chọn lọc lignin và làm tăng hiệu quả

của cellulase và hemicellulase. Một số vi khuẩn cũng có thể được sử dụng cho tiền xử lý

nguyên liệu lignocellulose. Nhóm nghiên cứu của Kurakake đã cho thấy khả năng thu hồi

đường từ giấy văn phòng lên tới 94% khi tiền xử lý sinh học giấy văn phòng với hai

chủng vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis và Bacillus circulans ở điều kiện tối ưu [55].

1.2.5. Vai trò carbohydrat esterase trong thủy phân lignocellulose

Một mắt xích quan trọng thủy phân cấu trúc lignocelluloses là hệ carbohydrate

esterase (CE), đại diện cho một nhóm lớn các hydrolase xúc tác đặc biệt cho sự phân tách

hoặc hình thành các ester no và ester thơm. Trong đó, hai enzyme acetyl esterase (EC

3.1.1.6) và feruloyl esterase (EC 3.1.1.73) hoạt động trên các chuỗi nhánh của cấu trúc

polysaccharide thành tế bào để phân cắt liên kết cầu nối giữa các chuỗi xylan và giữa

24

xylan với lignin để tách riêng phần lignin ra khỏi cấu trúc lignocelluloses. Chúng đóng

một vai trò quan trọng ở giai đoạn đầu quá trình thủy phân lignocelluloses [39].

1.2.5.1. Acetyl esterase từ nấm

Quá trình chuyển hóa lignocellulose cần hỗn hợp các enzyme thủy phân bao gồm

các cellulase, xylanase, carbohydrate esterase… có thể hoạt động phối hợp với nhau để

tấn công cấu trúc polymer [22]. Một trong số các carbohydrate esterase tham gia vào

chuyển hóa lignocellulose là acetyl esterase.

Acetyl esterase là enzyme thủy phân xúc tác cho phản ứng giải phóng nhóm acetyl

từ các Polysaccharide acetyl hóa như pectin hay xylan của lignocellulose [56]. Acetyl

esterase cùng với hệ enzyme thủy phân cellulose và xylan đóng vai trò quan trọng trong

khả năng chuyển hóa các vật liệu thành tế bào thực vật, có thể loại bỏ các nhóm acetyl

ester từ vị trí C-2, C-3 của d-xylopyranosyl trong chuỗi xylan. Cùng với enzyme

cellulase, acetyl esterase là enzyme quan trọng tác động đến khả năng chuyển hóa các

dưỡng chất cần thiết của thành tế bào thực vật bằng cách thủy phân liên kết ester giữa

acetyl và xylose trong xylan. Quá trình deacetyl này làm các đơn vị xylopyranosyl của

mạch chính xylan dễ bị phân hủy hơn bởi endo-β-1,4-xylanases (EC 3.2.1.8). Các nhóm

acetyl nhánh có thể làm ảnh hưởng cách tiếp cận của các enzym phân cắt mạch chính bởi

trở ngại về không gian và sự bài tiết của enzyme, vì vậy hoạt động của endoxylanase sẽ

phân cắt các nhóm acetyl nhánh này, giúp enzyme phân cắt mạch chính được dễ dàng

hơn. Enzym này sẽ loại bỏ các nhóm O-acetyl ở các vị trí 2/3 trên β-D xylopyranosyl của

acetyl xylan.

Acetyl esterase có thể được tách chiết từ vi sinh vật như Bacillus subtilis, chủng vi

khuẩn ưa nhiệt Strain JW/SL-YS485. Acetyl esterase từ các vi khuẩn hoạt động ở các

điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau. Với chủng Bacillus pumilis, enzyme có trọng lượng

phân tử là 40 kDa, nhiệt độ tối ưu để enzyme hoạt động là 45ºC cùng với pH tối ưu là

6,0; còn với chủng B. subtilis enzyme trọng lượng phân tử là 31 kDa và hoạt động tối ưu

ở 500C với pH 6,5. Hoạt động của enzyme có thể được thúc đẩy bởi các ion Zn2+, Ni2+,

Fe2+ và bị ức chế bởi các ion Cu2+, Fe3+, Mn2+, Mg2+, Ca2+ và Co2+. Bên cạnh nguồn

enzyme từ vi sinh vật thì acetyl esterase cũng được tìm thấy từ một số nấm Ascomycota

25

đã được miêu tả, bao gồm Aspergillus awamori [57], Aspergillus niger [58], Fusarium

oxysporum [59]. Enzyme từ nấm Aspergillus awamori có trọng lượng phân tử là 31 kDa

và nhiệt độ tối ưu để enzyme hoạt động ở nhiệt độ 400C với pH 7,0.

1.2.5.2. Feruloyl esterase từ nấm

Feruloyl esteraza (EC 3.1.1.73) xúc tác thủy phân liên kết ester giữa xylan và

lignin qua phân tử đường arabinose và axit ferulic. Chúng là một loại enzyme từ vi sinh

vật có khả năng tác dụng lên thành tế bào thực vật, phá vỡ cấu trúc thành tế bào, tạo điều

kiện cho các enzyme khác tấn công, chuyển hóa các thành phần khác có trong tế bào thực

vật. Enzyme này thủy phân chủ yếu các liên kết este giữa polysaccarid thành tế bào và

axit hydroxycinnamic của lignin và giải phóng các axit ferulic và các dime của chúng từ

vật liệu lignocellulose [60].

Hình 1.10. Liên kết dạng cầu nối của axit ferulic và dimer với arabinoxylan và lignin (A): O-5-feruloyl lignin, (B) & (C): nhóm dimer O-5-diferuloyl dimer,

(D): nhóm O-3-acetyl [61] Hầu hết các feruloyl esterase là enzyme ngoại bào phân cắt liên kết ester trong

xylan và các oligosaccarid dẫn xuất từ xylan tạo thành các axit ferulic.

Các feruloyl esterase được phân loại thành bốn nhóm (A-D) dựa trên xác định trình

tự chuỗi protein và sự tương đồng về hoạt tính xúc tác thủy phân các methyl ester của các

axit hydroxycinnamic và dimer của chúng (methyl ferulate, methyl sinapate và methyl

caffeate) [62].

26

Loại B: Bao gồm MpCA, methyl caffeate (MCA), nhưng không bao gồm methyl

sinapate (MSA). Các enzyme này không giải phóng axit và cho thấy trình tự diferulic

tương đồng với nhóm cacboxylic esterase 1 - acetyl esterase xylan. Penicillium

funiculosum FAE-B và Neurospora crassa FAE-I cũng thuộc nhóm này.

Loại C và D: FAE hoạt động xúc tác cả bốn axit hydroxycinnamic metyl este.

Enzyme loại C không giải phóng axit diferulic, trong khi đó các enzyme loại D có khả

năng thủy phân các dimers. Loại D bao gồm Esta Piromyces và esterase D Celluvibrio

japonicus. Loại C gồm A. niger FAE-B và T. stipitatus FAE-C.

Trình tự chuỗi của feruloyl esterase loại A từ A. niger, A. tubingensis, và A.

awamori đã được công bố (theo dữ liệu Swiss-Prot lần lượt là O42807, O42815, và

Q9P979). Các enzyme feruloyl esterase từ A. niger là protein có tính axit, với pI = 3.3,

khối lượng phân tử tính toán là 28 kDa tính theo thành phần chuỗi axit amin) hoặc 36

kDa khi điện di SDS-PAGE, điều này cho thấy enzyme được glycosyl hóa. Enzyme từ A.

awamori gồm 281 amino acid, tương tự trình tự 96% với A. niger [63]. Enzyme này là

một glycoprotein có khối lượng phân tử 35 kDa và pI = 3.8. Các trình tự amino acid của

các enzyme FAE loại B có thể được tìm thấy ở N. crassa (Q9HGR3) và P. funiculosum

(Q9HE18). Các protein FAE-B từ N. crassa gồm 292 amino acid, trong đó có một trình

tự signal peptide gồm 18 amino acid. Trên gel SDS-PAGE cho kết quả khối lượng phân

tử ước tính cao hơn 6 kDa so với con số đã được tính toán là 29.29 kDa cho các protein

deglycosit. N-glycosyl hóa đã được xác định có khối chính là 3504 kDa. Các FAE-B từ

P.funiculosum gồm 353 axit amin, trong đó có một trình tự signal peptide có 18 gốc axit

amin. Các enzyme có cấu trúc mô-đun, bao gồm một miền N-terminal xúc tác và một

miền C-terminal liên kết carbohydrate [64]. Những enzyme loại B này có khoảng 60%

tương tự với các enzyme acetyl xylan esteraza từ A. ficuum, A. awamori, A. oryzae, và P.

purpurogenum.

Enzyme có hoạt tính feruloyl esterase gần đây nhận được nhiều sự quan tâm bởi

vai trò của chúng trong nhiều ngành công nghiệp như hóa chất, giấy và bột giấy, dệt và

nguyên liệu sinh học. Ngoài ra, enzyme này cũng có vai trò trong việc thu nhận các hợp

chất thơm hydroxycinnamic từ phụ phẩm nông nghiệp [65].

27

Hình 1.11. Nếp gấp đặc trưng α/β-hydrolase [65]

Cơ chế xúc tác thủy phân ester bởi esterases được biết đến gồm hai bước chính:

Bước đầu tiên là acetyl hóa - nguyên tử oxy của nhóm hydroxyl ở vùng hoạt động của

serine gắn vào nhóm carbon của liên kết ester, hiệu suất tứ diện trung gian ổn định bởi

xúc tác của His và Asp. Vòng His-imidazol trở thành proton và mang điện tích dương và

các điện tích dương này được ổn định bằng dư lượng axit amin mang điện tích âm. Các

trung gian tứ diện được ổn định bởi hai liên kết hydro được hình thành với các liên kết

amide của phần còn lại thuộc các lỗ oxyanion. Sau đó, các một nửa gốc alcol được giải

phóng và phức hệ acetyl-enzyme được hình thành. Tại bước deacyl hóa, nhóm hydroxyl

của một phân tử nước tấn công carbon của phức hệ acetyl-enzyme và tứ diện trung gian

thứ hai được hình thành. Cuối cùng, các thành phần acetyl được giải phóng và các

enzyme hoạt động được tái sinh. Các vi sinh vật được biết đến với khả năng sinh ra

feruloyl esterase đã được đề cập bao gồm: Clostridium sp., Pseudomonas sp., Aspergiluss

sp., Fusarium sp...[39].

Esterase phân bố rộng rãi ở động vật, thực vật và vi sinh vật. Nhờ đặc tính hữu ích

như tương đối ổn định trong dung môi hữu cơ, cơ chất đặc rộng, không có yêu cầu nhiều

đối với cofactors và các vùng phân cắt, esterase có vai trò quan trọng và ứng dụng rộng

rãi trong công nghệ sinh học và cả trong công nghiệp. Các enzyme CE liên quan đến

chuyển hóa xylan là công cụ quan trọng trong nghiên cứu cơ chế và cấu trúc thành tế bào

thực vật [65]. Các liên kết giữa lignin và polymer cacbohydrate tự nhiên trong cấu trúc

phức hợp thành tế bào vẫn đang được xác định và cần những nghiên cứu sâu hơn. Các

28

xylan acetyl-hóa là những dạng polymer khó chuyển hóa trong dạ dày và kìm hãm hoạt

động của các cellulose và hemicellulose tùy thuộc vào mức độ acetyl hóa. Khi sử dụng

phối hợp xúc tác của xylan và các enzyme thủy phân xylan khác trong sản xuất bột giấy

và tẩy trắng giấy, các esterase (feruloyl esterase, acetyl esterase) phá vỡ 1 phần cấu trúc

và loại bỏ một phần thành tế bào thực vật [66]. Do đó, phức hợp lignin - cacbohydrate có

thể trở nên dễ dàng bị tấn công bởi hoạt độ xúc tác của enzyme và sự hòa tan sản phẩm

chuyển hóa tốt hơn. Việc tăng hiệu quả chiết xuất lignin dẫn đến giảm được sử dụng

chlorin ở các bước tẩy trắng tiếp theo và tăng độ trắng sáng của bột giấy và giấy [67].

Chính vì vậy, nó là mắt xích quan trọng trong việc phân tách lignin ra khỏi

lignocelluloses.

1.3. Tình hình sản xuất bioethanol

1.3.1. Hiện trạng sản xuất và sử dụng bioethanol

Nhu cầu năng lượng luôn là vấn đề nan giải của bất kì quốc gia nào trên thế giới.

Trong số các nguồn năng lượng thay thế dầu mỏ đang sử dụng hiện nay (năng lượng gió,

mặt trời, hạt nhân,…), năng lượng sinh học đang là xu thế phát triển tất yếu, nhất là ở các

nước nông nghiệp và nhập khẩu nhiên liệu. Hiện nay, các dạng năng lượng sinh học đang

được quan tâm gồm ba nhóm là dầu sinh học (biodiesel), khí sinh học (biogas) và

bioethanol (ethanol sinh học) [68].

Bioethanol được sản xuất bằng quá trình thủy phân và lên men các phế thải nông

nghiệp chứa lignocellulose như rơm rạ, thân ngô, bã mía hoặc các cây năng lượng khác.

Sản phẩm cuối cùng cũng giống như bioethanol thông thường, dùng để pha trộn với

xăng. Năm 2014, Nhà máy sản xuất bioethanol từ sinh khối chứa cellulose lớn nhất mang

tên Liberty được đưa vào hoạt động tại Emmetsburg, bang Iowa do Liên doanh Poet-

DSM (giữa Poet LLC là doanh nghiệp sản xuất bioethanol lớn nhất Mỹ với một doanh

nghiệp sản xuất enzyme của Hà Lan) đầu tư [69]. Mỗi năm nhà máy này chế biến 285

nghìn tấn phế thải cây ngô (thân, lá, vỏ) để sản xuất ra khoảng 25 triệu gallons bioethanol

(tương đương gần 95 triệu lít). Bioethanol từ cellulose của Poet-DSM có các tính chất

giống bioethanol từ ngô, nhưng vì được tạo ra từ phế thải còn trên mặt đất sau khi thu

29

hoạch ngô nên hàng năm chu trình sản xuất này làm giảm được khoảng 210.000 tấn

carbon dioxide phát thải [70].

Hình 1.12. Sản lượng nhiên liệu sinh học giai đoạn 2008 – 2022 [71] Theo Bộ Năng lượng Mỹ [72], trước năm 2009 nhiên liệu sinh học chỉ có “dạng

truyền thống” (được hiểu là bioethanol và biodiesel chủ yếu được sản xuất từ các nguồn

lương thực - thực phẩm), sau đó, các dạng nhiên liệu sinh học tiên tiến bắt đầu xuất hiện,

từ năm 2015 sản lượng nhiên liệu sinh học truyền thống hàng năm gần như không tăng.

Hình 1.13 cho thấy từ năm 2015 trở đi, quy mô sản xuất nhiên liệu sinh học truyền thống

(bioethanol và biodiesel được sản xuất từ dầu thực vật và mỡ động vật) gần như không

tăng và sản lượng hàng năm chỉ duy trì ở mức khoảng 60 triệu tấn.

Ngành công nghiệp ethanol Hoa Kỳ là một cường quốc toàn cầu, dẫn đầu thế giới

về cung và cầu. Với sản lượng 16,1 tỷ gallon trong năm 2018, Hoa Kỳ đã sản xuất gấp

đôi sản lượng được tạo ra bởi Brazil. Trong khi đó xuất khẩu tăng 20% cao kỷ lục với

hơn 1,6 tỷ gallon. Brazil và Canada vẫn là khách hàng nhập khẩu hàng của Hoa Kỳ trong

nhiều năm liền, chiếm một nửa tổng xuất khẩu ethanol của Quốc gia này.

Tại Brazil, nước sản xuất bioethanol hàng đầu thế giới đã thành công trong việc

sản xuất bioethanol theo quy mô công nghiệp từ những năm 1970 khi nước này phụ

thuộc nặng nề vào dầu nhập khẩu. Lệnh cấm vận dầu mỏ của Trung Đông đã bắt buộc

Brazil phải tìm kiếm những những nguồn nhiên liệu vững bền hơn cho nhu cầu năng

30

lượng của đất nước [71]. Tuy rằng, có những vấn đề nảy sinh nhưng chương trình này

của Brazil được xem như một mô hình thành công trong việc phát triển bền vững [73].

Ngày nay, toàn bộ xe hơi ở Brazil sử dụng xăng có pha ít nhất 25% bioethanol và 60% số

xe có khả năng “linh động về nhiên liệu” (có thể sử dụng 100% bioethanol làm nhiên

liệu), mỗi năm tiết kiệm được trên 2 tỷ USD do không phải nhập dầu mỏ. Hiện tại, ở

nước này có 3 triệu ôtô sử dụng hoàn toàn bioethanol và trên 17 triệu ôtô sử dụng E25.

Brazil sản xuất bioethanol hầu như chỉ từ cây mía, loại nhiên liệu này có thể được tinh

lọc thêm để pha vào xăng, hoặc dùng làm nhiên liệu tinh [74].

(Đơn vị: tỷ gallons)

Hình 1.13. Sản lượng bioethanol tại một số quốc gia và khu vực trên thế giới [75]

Liên minh Châu Âu (EU) cũng đã tiến đến việc khuyến khích năng lượng tái sinh

cho tương lai với những đạo luật về điều khoản sử dụng phương tiện giao thông tối thiểu

cho các nước thành viên. Năm 2005, 721 nghìn tấn bioethanol được sản xuất nhằm phục

vụ nhu cầu nhiên liệu vận chuyển ở Châu Âu, tăng khoảng 50% so với năm 2004. EU

đang khuyến khích việc sử dụng bioethanol và hướng tới mục tiêu nhiên liệu này chiếm

5.75% trong tổng lượng xăng dầu bán ra vào năm 2010 [76].

Tại Brazin năm 2017, Theo Tập đoàn Unica, các cơ sở sản xuất mía đường tại

vùng trung phía nam, đây là khu vực sản xuất mía đường lớn nhất thế giới, đã tăng 56%

sản lượng mía dùng cho sản xuất ethanol từ đầu tháng mười, so với con số 53% kể từ

cuối tháng chín và 50% của cùng kỳ năm trước. Brazil là nước đứng đầu thế giới về xuất

khẩu ethanol từ mía.Trong nửa đầu tháng mười, sản lượng đường của Brazil đạt 1,97

31

triệu tấn, thấp hơn 12,2% so với cùng kỳ năm trước, trong khi đó, sản lượng ethanol tăng

11,6%, đạt 1,570 tỷ lít.

Ở Ấn Độ, một chương trình bioethanol đã kêu gọi người dân sử dụng xăng E5 trên

cả nước, tiến tới việc sử dụng xăng E10 và E20.

Mỹ cũng đang đầu tư nhiều cho việc tăng sản lượng bioethanol, hiện chiếm 5% khối lượng nhiên liệu bán ra ở Mỹ. Đồng thời, Mỹ hiện là quốc gia sản xuất bioethanol lớn nhất thế giới (năm 2006 đạt gần 19 tỷ lít, trong đó 15 tỷ lít dùng làm nhiên liệu - chiếm khoảng 3% thị trường xăng). Năm 2012 cung cấp trên 28 tỷ lít bioethanol và biodiesel, chiếm 3.5% lượng xăng dầu sử dụng. Năm 2016 Mỹ đã sản xuất trên 15 tỷ gallon và đến năm 2018 xuất khẩu trên 1,6 tỷ gallon [74].

Theo giáo sư trường đại học Georgia, Joy Peterson, đồng thời là Trưởng khoa Năng lượng sinh học cho biết: “Sản xuất bioethanol từ nguồn năng lượng sinh học tái sinh từ sinh khối thực vật là vô cùng cần thiết và hữu ích vì chúng rất dồi dào và sẵn có”. Công trình nghiên cứu trên đã được Quỹ Nghiên cứu khoa học của Trường Đại học Georgia cấp bằng sáng chế [77].

Tại Trung Quốc, đầu năm 2003, xăng E10 đã chính thức được sử dụng ở 5 thành phố lớn và đã được mở rộng thêm tại 9 tỉnh đông dân cư khác. Bioethanol nhiêu liệu sẽ tăng trên 2 tỷ lít năm 2010, khoảng 10 tỷ lít vào năm 2020 (năm 2005 là 1.2 tỷ lít) [74].

Ở Đông Nam Á, Thái Lan đã ban hành luật cho việc sử dụng xăng pha 10% bioethanol bắt đầu từ 2007.

Tại Việt Nam, ngày 20/11/2007 Thủ tướng Chính phủ đã ban hành Quyết định số 177/2007/QĐ-TT về việc phê duyệt đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025 nhằm mục tiêu: “Phát triển nhiên liệu sinh học, một dạng năng lượng mới tái tạo được để thay thế một phần nhiên liệu hóa thạch truyền thống, góp phần đảm bảo an ninh lương thực và bảo vệ môi trường”. Trong 2-3 năm gần đây, việc sản xuất bioethanol làm nhiên liệu đã được quan tâm với nhiều góc độ khác nhau về nghiên cứu cũng như sản xuất [78,79].

32

Bảng 1.2. Một số dự án tiêu biểu sản xuất bioethanol nhiên liệu tại Việt Nam [78] (Đơn vị triệu L)

Tên dự án Công suất

(triệu lít/năm)

Vốn đầu tư (tỷ đồng)

Nguyên liệu (nghìn tấn

sắn lát/năm)

Hiện trạng Hoạt động

Nhà máy Bioethanol Phú Thọ

100 2.484 220 Chưa hoạt động

Nhà máy Bioethanol Dung Quất (Quảng Ngãi)

100 1.850 220 Đang hoạt động

Nhà máy Bioethanol Bình Phước 100 >1.700 230 Đang

hoạt động Nhà máy Bioethanol Đại Tân (Quảng Nam)

125 575 300 Tạm dừng hoạt động

Nhà máy Bioethanol Đại Việt (Đắk Nông)

50 500 - Tạm dừng hoạt động

Nhà máy Bioethanol Đắk Tô (Kon Tum) 50 700 - Tạm dừng

hoạt động

Thông báo 255 của Văn phòng Chính phủ ban hành ngày 06/06/2017 nêu rõ, Bộ

Công thương cần tính toán lộ trình, bước đi phù hợp, khả thi để thay thế toàn bộ xăng

khoáng RON 92 bằng xăng E5 RON 92, tiếp tục triển khai xăng E10. Trước đó, mục tiêu

phát triển nhiên liệu sinh học đã trở thành nội dung của Quyết định 177 ban hành ngày

20/11/2007 của Thủ tướng Chính phủ.

Tính đến cuối năm 2012, lượng bioethanol nhiên liệu của cả nước đạt 535 triệu

lít/năm, đủ để phối trộn 8,35 triệu tấn xăng E5 (5% ethanol) đảm bảo đủ cung cấp cho thị

trường cả nước. Xăng sinh học E5 đã được phép pha trộn và tiêu thụ tại 7 tỉnh, thành phố

như Hà Nội, Hải Phòng, Thành phố Hồ Chí Minh, Cần Thơ, Đà Nẵng, Bà Rịa -Vũng Tàu

và Quảng Ngãi từ cuối năm 2014. Từ 1/12/2015 xăng E5 được tiêu thụ đại trà trên cả

nước. Điều này sẽ giúp các nhà sản xuất bioethanol có được đầu ra.

Tính đến năm 2019, Việt Nam có tới 7 nhà máy sản xuất cồn sinh học (ethanol –

E100) để phối trộn với xăng truyền thống (RON 92, RON 95) tạo ra xăng E5. Nhưng có

đến 5 nhà máy đã phải đóng cửa chỉ sau vài tháng hoạt động và chỉ còn 2 nhà máy

Bioethanol Dung Quất và Bình Phước đang hoạt động trở lại đưa năng lực sản xuất E100

33

của các nhà máy ethanol tại Việt Nam lên tới 400.000 m3/năm (gồm: 200.000 m3 từ

ethanol Bình Phước; 200.000 m3 từ ethanol Dung Quất).

Theo tính toán vào năm 2007, khi các dự án sản xuất nhiên liệu sinh học được lập,

giá sắn lát chỉ khoảng 1.200-1.500 đ/kg, đến năm 2011 giá sắn lát đã tăng lên 5.500-

5.800 đ/kg. Năm 2012 giá có giảm chút ít những vẫn khoảng 4.000-4.700 đ/kg. Nếu mỗi

lít bioethanol cần khoảng 2,4 kg sắn lát thì riêng giá vốn cho nguyên liệu chính đã là

11.280 đồng, cộng thêm các chi phí khác như: điện, phụ phẩm, lương lao động, khấu hao

máy móc, lãi vay... giá thành làm ra một lít bioethanol khoảng 18.000-19.000 đồng/lít.

Các công ty hiện nay chỉ đầu tư xây dựng các nhà máy sản xuất bioethanol sinh học thế

hệ I, sản xuất bioethanol từ lương thực sắn, mía đường. Như vậy, chúng ta chỉ đầu tư vào

những công nghệ đã lạc hậu trên thế giới. Điều này không chỉ lạc hậu về mặt khoa học

công nghệ và còn tác động xấu tới chiến lược an ninh lương thực Quốc gia [78].

1.3.2. Nguồn sinh khối cho sản xuất bioethanol

Bioethanol chất lỏng thế hệ đầu tiên được làm từ các loại cây trồng có hàm lượng

đường và tinh bột cao, dầu thực vật hoặc mỡ động vật, quy trình khá đơn giản [80]. Tuy

nhiên, nguồn nhiên liệu này ảnh hưởng tiêu cực đến vấn đề an ninh lương thực, bên cạnh

đó công nghệ truyền thống sử dụng để chuyển đổi các nguồn nguyên liệu này thành nhiêu

liệu sinh học còn chưa hiệu quả và phương pháp xử lý còn nhiều hạn chế. Nhiên liệu sinh

học chất lỏng thế hệ thứ hai được sản xuất bằng cách xử lý sinh học hoặc hóa nhiệt từ

lignoxenluloza, có nguồn gốc từ chất thải nông nghiệp, chất thải rừng, chất thải rắn đô

thị, các sản phẩm phụ từ quá trình chế biến thực phẩm hoặc loại cỏ sinh trưởng nhanh

như rơm, rạ, bã mía, vỏ trấu, cỏ… Nhiên liệu sinh học thế hệ thứ ba được chế tạo từ các

loài vi tảo trong nước, trên đất ẩm, sinh ra nhiều năng lượng (7-30 lần) hơn nhiên liệu

sinh học thế hệ trước trên cùng diện tích trồng. Tuy nhiên, nguồn nhiên liệu này đòi hỏi

quy trình hiện đại và một diện tích vô cùng lớn [81]. Do đó, các nhà sản xuất quan tâm

chủ yếu đến nguồn nhiên liệu sinh học thế hệ thứ hai, chính là nguồn phế liệu công -

nông nghiệp và lâm nghiệp có bản chất là lignocellulose. Đó là một nguồn nguyên liệu

dồi dào, không những giúp hạn chế được sự cạnh tranh nguồn đất dùng cho sản xuất thực

phẩm mà còn giúp cho việc tái sử dụng các nguồn phế liệu một cách hiệu quả nhất.

34

Hiện nay, với nhu cầu giải quyết nạn khan hiếm năng lượng xăng dầu và giảm

thiểu ô nhiễm môi trường, bioethanol quả thật là một nhu cầu cấp bách cho thế giới.

Ngoài ra, sự có mặt của bioethanol trong xăng không chỉ giảm thiểu được một phần

lượng xăng nhập khẩu mà còn góp phần không nhỏ vào việc giảm thiểu lượng lớn khí

thải độc hại ra môi trường, hạn chế ô nhiễm môi trường, góp phần tăng khả năng đảm bảo

an ninh năng lượng của một quốc gia, nhất là các quốc gia không có nguồn dầu mỏ [82].

Dựa vào nguyên liệu sản xuất, người ta chia bioethanol gồm 3 thế hệ:

Thế hệ I: Được sản xuất từ các nguồn tinh bột như ngô, sắn, mía đường trong đó chủ yếu

là tinh bột chứa amylose và một phần nhỏ là amylopectin. Tinh bột gồm amylose (10-

20%) và amylopectin (80-90%).

Hình 1.14. Cấu trúc amylose [83] Bioethanol thế hệ đầu gặp một số khó khăn như không đủ đất nông nghiệp để phục

vụ cho cây trồng, việc sử dụng nhiên liệu sinh học cũng làm tăng giá thức ăn động vật,

làm tăng chi phí của thực phẩm do đó làm cho giá của nhiên liệu tăng cao và không thân

thiện với môi trường.

Thế hệ II: Được sản xuất từ sinh khối thực vật như các phế thải nông nghiệp của các loại

thân cây lúa, ngô, lúa mỳ. Lignocellulose là thành phần chính cấu tạo nên sinh khối thực

vật, chủ yếu bao gồm cellulose, hemicellulose, lignin. Trong sinh khối của thực vật như

gỗ, cellulose có từ 30-50%, hemicellulose 23- 32% và lignin 15-25%. Hemicellulose gồm

có Xylan-polymer mạch thẳng của D-xylose với liên kết β-(1-4), Arabinoxylan

(hemicellulose B) có mạch phân nhánh [84]. Ưu điểm của nhiên liệu sinh học thế hệ thứ

hai là nguyên liệu phong phú và không can thiệp vào sản xuất thực phẩm.

Thế hệ thứ III: Được chế tạo từ các loài vi tảo, loài tảo bị thoái hóa sinh học không làm

hư hại môi trường xung quanh. Sinh khối và hàm lượng lipid có trong tế bào của vi tảo

được coi là “nguồn nguyên liệu tiềm năng” cho sản xuất nhiên liệu sinh học, bởi nó có

35

khả năng quang hợp cao, sản xuất lượng sinh khối lớn và tăng trưởng nhanh hơn so với

các loại cây trồng đã được dùng trong công nghiệp sản xuất năng lượng sinh học trước

đây. Mặt khác, vi tảo có khả năng sử dụng khí CO2 trong quá trình trao đổi chất, như vậy

có thể góp phần làm giảm hiệu ứng nhà kính. Theo ước tính của Bộ Năng Lượng Mỹ,

nước này cần một diện tích đất đai lớn độ 38.849 km2 để trồng loại tảo thay thế tất cả nhu

cầu dầu hỏa hiện nay trong nước.

Lựa chọn loại nguyên liệu nào phù hợp để sản xuất bioethanol tùy thuộc vào điều

kiện đất đai, khí hậu, chính sách phát triển của mỗi quốc gia. Tuy nhiên, hiện nay các nhà

sản xuất đang tập trung vào nghiên cứu và phát triển nguồn nhiên liệu sinh học thế hệ thứ

hai, vì những lợi ích mà chúng đem lại rất thiết thực, đặc biệt là vấn đề giải quyết ô

nhiễm môi trường và đảm bảo an ninh lương thực Quốc gia.

1.3.3. Lên men sản xuất bioethanol

Giai đoạn lên men bioethanol là quá trình lên men yếm khí của nấm men, chuyển

hóa đường thành rượu etylic và CO2. Lý thuyết quá trình lên men đã được nhiều nhà sinh

học nghiên cứu. Năm 1810, Gay-Lussac đưa ra phương trình tổng quát quá trình lên men:

C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 + Q

Bản chất của quá trình lên men là quá trình oxy hóa khử. Quá trình này diễn ra

trong cơ thể sinh vật dưới tác động của hệ thống enzyme. Vì vậy quá trình này còn gọi là

quá trình oxy hóa sinh học. Trong quá trình đó, các nguyên tử cacbon của cơ chất bị oxy

hóa đến CO2 còn các nguyên tử hydro tách ra khỏi cơ chất, đầu tiên được chuyển đến

NAD+, sau đó từ NADH2 trong điều kiện yếm khí, hydro có thể chuyển đến các sản phẩm

trung gian khác nhau hoặc để tái sinh NAD+. Chất tiếp nhận cuối cùng là chất hữu cơ

[85].

Lên men bioethanol gồm nhiều quá trình sinh hóa và sinh học rất phức tạp, dưới

tác dụng của nhiều enzyme. Đường và các chất dinh dưỡng được hấp thụ qua bề mặt tế

bào rồi thẩm thấu vào bên trong. Ở đó các enzyme sẽ xúc tác các phản ứng khác nhau để

cuối cùng tạo ra sản phẩm chính là rượu và khí carbonic. Hai chất này sau khi sinh ra sẽ

36

qua màng tế bào chất vào môi trường lên men [86,87]. Bioethanol rất linh động nên hòa

tan nhanh trong dịch lên men, còn khí carbonic hòa tan kém.

Trong quá trình lên men, ngoài sản phẩm chính là rượu và CO2, còn tạo ra các hợp

chất thứ cấp như: axít, este, aldehyl và rượu bậc cao hay rượu có số carbon lớn hơn hai.

Hệ vi sinh vật trong men rượu giữ vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất bioethanol,

ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng sản phẩm. Nấm mốc thực hiện quá trình

đường hoá và nấm men thực hiện quá trình lên men, là hai nhóm vi sinh vật chủ yếu có

trong men. Một số nấm men chính gồm có Saccharomyces cerevisiae, Hansenula spp.,

Endomycopsis spp.

Nấm men thích hợp cho quá trình lên men cần có một số tính chất sau: hiệu suất

lên men cao; chịu được bioethanol; chịu được các sản phẩm phụ của quá trình thuỷ phân;

lên men ở pH thấp, có thể tiêu thụ nhiều cơ chất khác nhau. Có hai chủng nấm men đang

được sử dụng phổ biến là:

+ Saccaromyces cerevisiae: Loại nấm men được sử dụng phổ biến cho lên men

glucose. S.cerevisiae có các ưu điểm như: chịu được nồng độ bioethanol cao, ít sản phẩm

phụ, tốc độ lên men cao trong môi trường axít, chịu được axít acetic. Tuy nhiên, nấm

men này không có khả năng lên men đường 5 cụ thể là không thể lên men xylose.

+ Pichia stipitis: Loại nấm men phổ biến nhất trong các chủng nấm men có thể lên

men đường 5. Pichia stipitis có các ưu điểm như cho hiệu suất tiêu thụ xylose cao, chịu

được nhiệt độ và nồng độ cơ chất cao. Tuy nhiên lại bị ức chế bởi bioethanol nồng độ

cao. Ngày nay, thế giới có xu hướng sử dụng công nghệ gene để kết hợp các chủng nấm

men vừa có khả năng lên men đường 6, vừa có khả năng lên men đường 5. Trong nghiên

cứu này liên quan đến quá trình lên men đường 6 (hexose) nên chủng nấm men

Saccharomyces cerevisiae SH1 được sử dụng để lên men. Hiệu suất của quá trình lên

men bị ảnh hưởng của các yếu tố sau [44]:

Nhiệt độ: Mỗi vi sinh vật đều có một khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của

chúng. Đối với nấm men Saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng 28-320C. Ở

nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men giảm nhanh nhưng chủ yếu là dễ bị nhiễm vi sinh vật

37

như vi khuẩn lactic và nấm men hoang dại. Mặt khác khi lên men ở nhiệt độ cao dễ tạo

nhiều sản phẩm phụ như ester, aldehyd và giảm lượng bioethanol tạo thành [87].

pH: Nồng độ ion H+ trong môi trường ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men.

Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ

thẩm thấu của các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men. Mỗi vi

sinh vật chỉ có thể hoạt động tốt trong một khoảng pH nhất định. Trong điều kiện lên men

bioethanol, pH tối ưu là 4.5-5.0. pH quá cao hoặc quá thấp đều ảnh hưởng đến hiệu suất

lên men [87].

Nồng độ dịch đường lên men: Nếu nồng độ dịch đường quá cao sẽ dẫn đến làm

tăng áp suất và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men. Kết quả là bioethanol

nhiều sẽ ức chế không những các tạp khuẩn mà cả nấm men. Mặt khác đường nhiều sẽ

dẫn đến hao tổn nguồn nguyên liệu và phải kéo dài thời gian lên men. Mặt khác nếu nồng

độ đường của dịch lên men thấp thì sẽ làm giảm năng suất thiết bị lên men và làm cho

nấm men không đủ chất dinh dưỡng để phát triển. Thông thường nồng độ dịch đường

được giới hạn tối đa là 22%.

Thời gian lên men: là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Thời

gian lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ, nồng độ đường, chủng nấm

men…Thời gian lên men được tính bắt đầu từ khi cấy chủng nấm men vào môi trường

lên men, nhưng thời gian kết thúc thì tùy thuộc vào từng môi trường lên men cụ thể và

mục đích của quá trình lên men.

Nồng độ CO2 trong môi trường: CO2 được hình thành trong quá trình lên men

rượu từ đường. Một phần sẽ tồn tại trong môi trường, một phần tách trên bề mặt môi

trường, phần còn lại tích tụ thành một lớp ngăn cách giữa không khí và môi trường. CO2

tích tụ trong môi trường chỉ làm giảm khả năng sinh sản của nấm men, nhưng không thể

làm cho khả năng lên men của nấm men yếu đi.

Trong môi trường có hàm lượng đường cao sẽ cản trở CO2 thoát ra ngoài, dẫn đến

ức chế sinh sản của nấm men và sự lên men có hiệu quả thấp. CO2 nằm trong khoảng

không giữa bề mặt môi trường và không khí có tác dụng kiềm chế sự phát triển của

những vi sinh vật hiếu khí gây hại.

38

Chất dinh dưỡng: Môi trường nuôi cấy cần phải có đầy đủ các thành phần dinh

dưỡng chủ yếu là glucid ở dạng monosaccharide và disacharide, nitơ ở dạng axít amin,

các muối vô cơ, trừ dạng muối nitrit, nitrat, các vitamin và muối khoáng.

Hàm lượng giống nấm men: Nấm men là nhân tố tạo ra quá trình lên men, chuyển

hóa đường thành bioethanol và khí carbonic. Mỗi loài nấm men có khả năng lên men

khác nhau. Việc bổ sung tỷ lệ giống lên men cũng phải được chọn lựa. Thông thường

lượng nấm men giống cấy vào khoảng 15 triệu tế bào/ml dịch lên men là đạt hiệu quả tốt

nhất [87].

1.4. Tình hình nghiên cứu bioethanol trong và ngoài nước

1.4.1. Tình hình nghiên cứu bioethanol ngoài nước

Trong những thập niên gần đây, trên thế giới có nhiều nghiên cứu về sản xuất

bioethanol từ sinh khối thực vật và đã thu được những thành công nhất định, tạo cơ sở

khoa học cần thiết cho sự phát triển của công nghệ sản xuất bioethanol từ sinh khối phụ

phẩm công - nông nghiệp giàu lignocellulose.

Liên quan đến nghiên cứu trên, theo Saha (2005) nghiên cứu sử dụng axít loãng H2SO4 (0,75%, v/v) để tiền xử lý rơm kết hợp thủy phân bằng “enzyme cocktail” (cellulase, β-glucosidase, xylanase và esterase) ở nhiệt độ 450C, pH 5,0, sau 72 giờ ủ, tổng hàm lượng đường khử thu được đạt 465 mg/g. Hiệu suất thu hồi bioethanol đạt 0,24 g/g cơ chất sau khi lên men bằng chủng tái tổ hợp Escherichia coli [88].

Theo nghiên cứu của Antonio (2004), bã mía được thủy phân bằng axít nitric ở

nồng độ từ 2% đến 6%, thời gian phản ứng từ 0-300 phút, ở 100-1280C. Áp dụng các mô

hình động học đã xác định được các điều kiện tối ưu để chuyển hóa bã mía thành các

đường đơn được thực hiện ở nhiệt độ 1220C, thời gian ủ 9,3 phút ngâm trong dung dịch

chứa 6% axít HNO3. Ở điều kiện trên, phản ứng chuyển hóa tạo thành 18,6 g/l xylose;

2,04 g/l arabinose và 2,87 g/l glucose. So sánh với kết quả thu được theo phương pháp sử

dụng kết hợp hai axít sulfuric và clohydric đã chứng minh rằng axít nitric thủy phân khá

tốt bã mía thành các đường đơn [89].

Theo Satriyo (2014), nghiên cứu tối ưu cellulase trong quá trình thủy phân và lên

men đồng thời từ bã mía. Bã mía được tiền xử lý bằng dung dịch NaOH và bổ sung

cellulase tinh sạch từ nấm Trichoderma reesei, đồng thời bổ sung chất dinh dưỡng cần

39

thiết và lên men đồng thời trong 5 ngày bởi nấm men Sacharomyches cereviceae thu

được hàm lượng bioethanol đạt 15,37 g/l [90].

Theo Rabelo (2011), nghiên cứu sản xuất bioethanol từ quá trình thủy phân bã mía

bằng cellulase kết hợp với xử lý bằng kiềm và hydrogen peroxide (H2O2) thu được hàm

lượng glucose tương đối cao đạt 391 mg/g sau 1 giờ ủ ở 250C [91].

Theo Maria Carolina (2013), nghiên cứu thủy phân bã mía (8% (w/v)) bằng kiềm

và thủy phân bằng enzyme thương mại cellulase (10 FPU/g). Sau quá trình xử lý hàm

lượng lignin giảm xuống còn 83% sau 120 giờ ủ, tiếp tục sử dụng dịch đường chuyển hóa

để lên men bioethanol với chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae UFPEDA 1238,

hàm lượng bioethanol tăng gấp bốn lần so với mẫu đối chứng không sử dụng cellulase

[92].

Tại Đài Loan, các nhà khoa đã thành công trong phòng thí nghiệm khi sản xuất

bioethanol từ rơm rạ. Kết quả thu được cứ 10kg rơm thì được 2 lít cồn 96,5% nhưng giá

thành đắt hơn xăng dầu mỏ khoảng 250USD/tấn [74].

Theo nghiên cứu Hamelinck và cộng sự (2005) kết luận việc tiền xử lý bã mía đã

phá vỡ cấu trúc lignocellulose nhằm giúp cho quá trình thủy phân tạo thành các

monosaccharide diễn ra nhanh và triệt để hơn, từ đó các enzyme có thể tiếp xúc tối đa với

cơ chất tương thích. Phương thức và hiệu quả của quá trình tiền xử lý thay đổi nhiều tùy

thuộc vào đặc tính cấu trúc của nguồn nguyên liệu được lựa chọn [93].

Nhóm nghiên cứu của Silverstein (2007) đã đánh giá hiệu quả quá trình chuyển

hóa thân cây bông bằng axít sunfuric, sodium hydroxide và ozon kết hợp với hỗn hợp

enzyme thương mại Celluclast 1.5 L và Novozym 188 thành bioethanol. Kết quả nghiên

cứu nhận thấy, việc tiền xử lý bằng axít H2SO4, NaOH đậm đặc cho thấy lignin bị phân

hủy một lượng đáng kể và tạo ra một lượng đường lớn, do đó quá trình thủy phân được

diễn ra nhanh chóng khi có mặt của 2 enzyme trên [32].

Theo nghiên cứu của Aderemi (2008) xác định động học của quá trình sản xuất

glucose từ rơm rạ bởi chủng nấm Aspergillus niger giúp năng suất glucose tăng từ 43%

lên 87% khi rơm được nghiền nhỏ, phản ứng chuyển hóa thực hiện ở nhiệt độ tối ưu 45-

500C và pH 4,5-5. Nồng độ và tốc độ giải phóng glucose phụ thuộc vào quá trình tiền xử

40

lý rơm, trong khi đó việc tiền xử lý rơm đa phần phụ thuộc vào phương pháp hóa học dẫn

đến nhiều hệ lụy về vấn đề môi trường [94].

Thủy phân riêng biệt enzyme và lên men gạo bằng chủng nấm Mucor indicus,

Rhizopus oryzae và Saccharomyces cerevisiae đã được nghiên cứu bởi Abedinifar và

cộng sự (2009). Nghiên cứu chỉ ra, chủng nấm Mucor indicus có thể sản xuất bioethanol

từ đường pentoses và việc sử dụng loài nấm này giúp tăng hiệu quả lên men, đặc biệt trên

đối tượng là rơm [95].

Theo Abdulkareem (2015), nghiên cứu sản xuất bioethanol từ bã mía như nguồn

năng lượng thay thế. Nghiên cứu này nhằm sản xuất bioethanol từ bã mía bằng cách sử

dụng 24 thí nhiệm khác nhau để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian, nồng độ chất

xúc tác và lượng cơ chất đối với năng suất bioethanol. Kết quả nghiên cứu xác định được

hàm lượng bioethanol đạt 76,5% ở 350C sau 72 giờ lên men. Các phân tích thống kê về

phương sai chỉ ra điều kiện lên men như nhiệt độ, thời gian, nồng độ chất xúc tác và

lượng cơ chất đã có ảnh hưởng đáng kể đến sản lượng bioethanol tạo thành. Tuy nhiên,

nhiệt độ ảnh hưởng cao nhất đến hiệu suất lên men chiếm 79,45%, trong khi thời gian,

nồng độ chất xúc tác và lượng cơ chất ảnh hưởng tương ứng là 12,63%, 3,23% và 0,32%

[96].

Tại trường đại học Michigan (Mỹ), quy trình thủy phân cellulose sử dụng amoni

đã được cấp bằng sáng chế về xử lý sơ bộ phế thải của ngô trước khi chuyển hóa thành

bioethanol có thể giúp làm giảm chi phí sản xuất bioethanol từ cellulose. Quy trình trên

sử dụng amoni để phân hủy cellulose và hemicellulose trong thực vật với hiệu quả cao

hơn 75% so với khi chỉ sử dụng các enzyme đơn lẻ truyền thống. Nghiên cứu chỉ ra, có

thể sử dụng quy trình thủy phân amoni để xử lý sơ bộ phế thải của cây ngô (lõi, thân và lá

ngô), sau đó thủy phân và lên men để tạo bioethanol mà không cần bổ sung các thành

phần dinh dưỡng vào phối liệu lên men [97].

Theo Harshvadan và cộng sự (2017), nghiên cứu chuyển hóa sinh học bã mía bằng

enzyme và axit thu hồi bioethanol. Nghiên cứu tập trung vào việc sử dụng enzyme thủy

phân để chuyển hóa hiệu quả hemicellulose từ bã mía thành đường lên men bioethanol.

41

Quá trình được tiền xử lý bằng axit H2SO4 (1,5%), sau đó thủy phân bằng enzyme

cellulase, kết quả thu được lượng đường khử đạt 110,4 mg/gam [98].

Như vậy, dựa trên những phân tích về kết quả nghiên cứu của nhiều nhóm tác giả

đã công bố cho thấy, sản xuất bioethanol từ bã mía có thể sử dụng nhiều phương pháp

thủy phân khác nhau để tạo ra các đường có khả năng lên men như: thủy phân bằng axít,

bằng kiềm hay enzyme. Các phương pháp trên nhìn chung đem lại hiệu quả chuyển hóa

khá cao, tuy nhiên hệ lụy về môi trường thì đáng báo động.

1.4.2. Tình hình nghiên cứu bioethanol trong nước

Ở Việt Nam, do nhu cầu về nguồn nhiên liệu nền công nghiệp sản xuất bioethanol

thế hệ I đã được hình thành từ rất lâu. Phần lớn bioethanol được sản xuất từ cây thực phẩm

như: cây bắp, sắn và rỉ đường mía dùng làm bioethanol cho thực phẩm và công nghiệp.

Hiện nay, do các chính sách từ chính phủ bioethanol bắt đầu được tiêu thụ mạnh trên thị

trường. Do vậy, các nhà khoa học cũng đã và đang bắt đầu có những nghiên cứu sản xuất

bioethanol thế hệ thứ II từ sinh khối nông nghiệp. Tuy nhiên, một số công trình nghiên

cứu còn đang gặp nhiều khó khăn. Dưới đây là một số nghiên cứu của một số tác giả trên

đối tượng là sinh khối từ nguồn phế thải nông nghiệp để sản xuất bioethanol [78]:

- “Sản xuất ethanol sinh học từ phế thải nông nghiệp”, Chủ nhiệm đề tài PGS. TS

Vũ Nguyên Thành, Viện Công nghiệp thực phẩm, Bộ Công thương (2009-2011).

- “Nghiên cứu công nghệ hiện đại để sản xuất ethanol nhiên liệu từ gỗ phế liệu”,

Thuộc Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025 của Bộ

Công thương. Chủ nhiệm đề tài PGS.TS. Doãn Thái Hòa, Đại học Bách khoa Hà Nội

(2009 - 2010).

Theo PGS.TS. Phan Đình Tuấn, nghiên cứu sản xuất bioethanol từ rơm rạ nếu tiến

hành quá trình thủy phân và lên men đồng thời 1 kg rơm thô sẽ thu được 113,72 g

bioethanol tương đương 144 ml. Thí nghiệm được tiến hành với rơm đã qua tiền xử lý

bằng axít yếu [79]. Cũng theo Karimi và cộng sự (2008), 1 kg rơm sẽ cho 127 g

bioethanol tương đương 160 ml [31].

Nghiên cứu của Yến và cộng sự sử dụng enzyme thô từ dịch nuôi cấy nấm dùng

để chuyển hóa vật liệu giàu lignocellulose (rơm dạ) thu hồi bioethanol, nghiên cứu này

42

chưa đi sâu vào các enzyme tinh sạch từ nấm mà sử dụng dịch enzyme thô từ quá trình

lên men nên hiệu quả thu được không cao [99].

Nhóm nghiên cứu của Lê Quang Diễn, Viện Kỹ thuật hóa học và PGS.TS. Tô Kim

Anh, Viện Công nghệ sinh học và thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà Nội (2015) với đề

tài: “Nghiên cứu công nghệ tiền xử lý bã mía thân thiện môi trường ứng dụng trong sản

xuất ethanol”, Bộ công thương trong giai đoạn 2013-2015. Trong nghiên cứu này, bã mía

được tiền xử lý qua 2 giai đoạn bằng hỗn hợp axít axetic kết hợp axit clohidric (99:1; v:v)

ở 800C trong 90 phút và dung dịch natri hydroxit (0,75-1,0% w/w) ở 80-900C, sau phản

ứng dịch chuyển hóa tiếp tục được thủy phân bằng enzyme thương mại Novozymes

Cellic®CTec2 với hoạt độ 45 FPU/g. Kết quả thu được, hàm lượng đường tăng trung

bình từ 36,2 lên 38,0% so với bã mía thô không qua tiền xử lý [18].

Theo Nguyễn Văn Vinh (2014), nghiên cứu “Đánh giá chất lượng một số loại sinh

khối thải từ bã mía, sắn và ảnh hưởng của kỹ thuật tiền xử lý nhằm chuyển hóa thành cồn

sinh học”. Nghiên cứu chỉ ra, kỹ thuật tiền xử lý popping đã làm tăng hiệu quả của quá

trình thủy phân bằng cellulase và hiệu quả nhất đối với nguyên liệu mía cứng, mía mềm

và bã sắn. Tuy nhiên, thân sắn tỏ ra chưa hiệu quả và hàm lượng các đường đơn tạo thành

bị mất khá nhiều đi do kỹ thuật xử lý poping được thực hiện ở nhiệt độ và áp suất cao

[100].

Trong khoảng thời gian tháng 04/2007 - 12/2009, PGS.TS Vũ Nguyên Thành thực

hiện đề tài: “Nghiên cứu công nghệ và hệ thống thiết bị sản xuất bioethanol nhiên liệu từ

phế phụ phẩm nông nghiệp (biomass)” với mục tiêu thiết kế được quy trình công nghệ

sản xuất bioethanol nhiên liệu từ phế phụ phẩm nông nghiệp (rơm rạ, lõi ngô, thân gỗ, bã

mía…) và mô hình hệ thống thiết bị sản xuất bioethanol nhiên liệu từ phế phụ phẩm nông

nghiệp nhằm triển khai áp dụng tại các cơ sở sản xuất [101].

Từ những phân tích trên nhận thấy, hầu hết nghiên cứu của các nhà khoa học trong

nước trên đối tượng là sinh khối từ nguồn phế phụ phẩm công-nông nghiệp giàu

lignocellulose thường sử dụng một số phương pháp truyền thống, mà thiếu đi những

nghiên cứu về các enzyme CE (feruloyl esterase, acetyl esterase) liên quan đến quá trình

chuyển hóa lignocellulose, đặc biệt là sử dụng hỗn hợp enzyme thủy phân có tác dụng

43

hiệp đồng hay “enzyme cocktail” tham gia vào quá trình chuyển hóa vật liệu giàu

lignocellulose thành các đường lên men. Hiện nay, ở nước ta chưa có nhiều tác giả

nghiên cứu sản xuất bioethanol từ bã mía sử dụng enzyme thủy phân CE. Năm 2015, có

duy nhất nhóm nghiên cứu của TS. Đỗ Hữu Nghị và cộng sự đề cập đến vai trò của acetyl

esterase và feruloyl esterase từ một số loài nấm đến hiệu quả phân hủy lignocellulose từ

nguồn phụ phẩm công-nông nghiệp [102.].

Liên quan đến sự phối hợp xúc tác sinh học với sự tham gia của nhiều enzyme

thủy phân khác nhau cho quá trình chuyển hóa sinh khối giàu lignocellulose thành đường,

trong nghiên cứu trước tác giả mới chỉ tập trung sử dụng phối hợp enzyme CE với các

enzyme oxy hóa để giải phóng các đường đơn [103]. Do vậy, cần có nghiên cứu thử

nghiệm kết hợp giữa thủy phân hóa học và “enzyme cocktail” phù hợp, trong đó sử dụng

các enzyme CE để chuyển hóa bã mía giải phóng các đường có khả năng lên men

bioethanol.

Một hướng nghiên cứu mới nhiều tiềm năng để khắc phục những tồn tại trên là

việc phối hợp giữa thủy phân hóa học kết hợp xúc tác sinh học bằng hỗn hợp enzyme

thủy phân hay “enzyme cocktail” để chuyển hóa bã mía thành các đường đơn có khả

năng lên men bioethanol đang là hướng đi mới, nhiều triển vọng. Hướng nghiên cứu này

sẽ giúp giảm lượng axít sử dụng, do vậy sẽ giảm những tác động tiêu cực đến môi trường

đồng thời làm tăng hiệu suất chuyển hóa. Đây cũng chính là một trong những khâu then

chốt trong công nghệ lên men sản xuất bioethanol thế hệ II.

44

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

2.1.1. Vật liệu giàu lignocellulose

Các vật liệu giàu lignocellulose như: bã mía (MIA), rơm rạ (RR), bã cà phê

(CAF), mùn gỗ (MG), rong túi (RT) được thu mẫu như sau:

+ Bã mía khô thuộc giống mía thân cứng được lấy tại Công ty cổ phần đường Lam

Sơn, Thanh Hóa có hàm lượng cellulose (44%); hemicellulose (20%), lignin (25%).

+ Bột gỗ cứng từ cây cao su và bã cà phê được thu thập từ cơ sở chế biến tại Quận

Bắc Từ Liêm, Hà Nội.

+ Mẫu rơm rạ thuộc giống HDT10 tại huyện Đông, mẫu lấy về được rửa sạch,

phơi khô, bảo quản tại nhiệt độ phòng từ 26 đến 320C.

+ Mẫu rong túi Sargassum swartzii sau khi thu hái, đem rửa bằng nước sạch loại

muối rồi phơi trong bóng râm.

Trước khi nghiền nhỏ, tiến hành xử lý cơ học mẫu bằng cách cắt nhỏ cho tới khi

có chiều dài < 0,5 cm. Mẫu được sấy khô, nghiền nhỏ bằng hệ thống nghiền bi (thiết bị

Fritsch, Oberstein, CHLB Đức, Viện Khoa học vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam) và lọc qua rây để đạt được kích thước khoảng 0,5 – 1,0 mm.

2.1.2. Vi sinh vật

+ Quả thể nấm tươi được thu lượm từ vườn Quốc gia Cúc Phương – Ninh Bình

được sử dụng để phân lập nấm, sàng lọc và tinh sạch enzyme thủy phân phục vụ cho

nghiên cứu.

+ Một số chủng nấm có sẵn được chọn lọc từ bộ chủng giống lưu giữ tại phòng

Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên.

+ Enzyme thương mại được tinh sạch từ nấm Trichoderma reesei (carboxymethyl cellulase and glucuronoxylanase với hoạt độ: 1-1,6 U/mg, Cell/Xyl, AB Enzyme, Darmstadt, Germany, hoạt động tối ưu ở pH 5.0, nhiệt độ tối ưu và bền nhiệt ở 400C.

45

+ Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae SH1 có điều kiện hoạt động từ 25 – 320C, pH: 5,0 – 5,5 được cung cấp bởi phòng Vi sinh môi trường, Viện Công nghệ môi trường. Nấm men được nuôi cấy trên môi trường hansen, giống gốc lưu giữ ở tủ lạnh 40C.

2.1.3. Thiết bị, hóa chất

Thiết bị:

Thiết bị được sử dụng: Tủ cấy vi sinh vật Box–Laminar (Đức), bể ổn nhiệt –

Memmert (Đức), tủ ấm CO2 (Deawoo – Hàn Quốc), cân điện tử AL300 (Thụy Sỹ), nồi

khử trùng Lequenx (Pháp), tủ lạnh Sanyo (Nhật Bản), máy li tâm Sigma (Mỹ), máy lắc

ngang (Đức), máy votex (Mỹ), máy đọc ELISA Bio-Rad Laboratories 10217 (Pháp), máy

đo pH (Đức), kính hiển vi Olympus (Đức), bình Erlenmeyer 1L, 2L, thiết bị lên men 5L

(AmAr, Mumbai, Ấn Độ), máy PCR model 9700 (GeneAmp PCR System 9700, Mỹ), hệ

thống siêu lọc 10 kDa cut-off, thiết bị amicon Ultra Centrifugal Filters (Millipore,

Bedford, USA)…

Hóa chất:

Hóa chất dùng cho thí nghiệm: peptone, glucose, muối khoáng, DNS, axít 3,5-

dinitrosalicylic, Na-K-tactarat, hồ tinh bột, KI, Na2S2O3, H2SO4, NaOH, axít acetic, n-

butanol, aceton xuất xứ từ Trung Quốc.

Các chất chuẩn để chạy sắc ký bản mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao

(HPLC): D-glucose, D-galactose, D-xylose, D-mannose và Carboxymethyl cellulose

(CMC) (Sigma-Aldrich, USA).

Các hóa chất phân tích DNA, protein: Sorbitol, Tris-HCl, EDTA, Natri

đihiđrophotphat (NaH2PO4), CTAB, NaCl, chloroform/isoamyl, isopropanol, agarose,

CH₃COONa.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp vi sinh vật

2.2.1.1. Phân lập nấm

Quả thể nấm tươi được thu từ vườn Quốc gia Cúc Phương – Ninh Bình được rửa

bằng nước sạch, ngâm trong cồn 70% trong 30 giây để khử trùng, sau đó rửa sạch bằng

nước cất vô trùng. Dùng dao nhọn đã được khử trùng tách bỏ phần mô phía ngoài, cắt lấy

46

phần mô bên trong thành những mảnh có kích thước khoảng 5-10 mm. Cấy các mảnh mô

đó vào môi trường thạch malt (maltose: 12,5 g/l, dextrin: 2,5 g/l, glycerol: 1,0 g/l,

peptocomplex 2,6: g/l, agar: 17,0 g/l) trên đĩa peptri có bổ sung các loại kháng sinh

(nystatin: 40 g/l, chloramhenical: 30 g/l, penicillin: 40 g/l, streptomycin: 40 g/l và

benomy: 50 g/L), ủ ở nhiệt độ 230C, sau khoảng 24-72 giờ hệ sợi bắt đầu mọc. Tách lấy

hệ sợi nấm sang ống nghiệm thạch nghiêng PDA (glucose: 20 g/l, khoai tây: 200: g/l,

agar: 20 g/l và pH 7), tiếp tục nuôi cấy trong 12 ngày, khi hệ sợi màu trắng bao phủ hết

bề mặt môi trường thì có thể sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo [104].

2.2.1.2. Nuôi cấy và bảo quản nấm men

Môi trường nuôi cấy nấm men:

Môi trường thường sử dụng để nuôi cấy nấm men là môi trường Hansen. Thành

phần môi trường bao gồm: Glucose: 50 g/l; Peptone: 10 g/l; KH2PO4: 3 g/l;

MgSO4.7H2O: 3 g/l; Agar: 20 g/l.

Nuôi cấy và bảo quản giống nấm men:

Chuẩn bị môi trường Hansen có chứa agar, được hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C,

áp suất 1atm trong 25 phút. Tiến hành cấy giống nấm men từ ống giống gốc lưu giữ ở tủ

lạnh 40C tại phòng thí nghiệm sang ống môi trường thạch nghiêng đã được chuẩn bị sẵn.

Giống nấm men sau khi được nuôi cấy sang môi trường thạch nghiêng được đặt vào tủ

ấm và giữ ở 300C, trong 48 giờ, giống đã phát triển tốt được bảo quản trong tủ lạnh 40C

[105].

Nhân giống:

Nhân giống cấp 1: Giống nấm men từ môi trường thạch nghiêng được cấy vào ống

nghiệm chứa 5 ml dịch môi trường Hansen dịch thể đã khử trùng, nuôi cấy ở 28-300C

trong 24 giờ.

Nhân giống cấp 2: Chuẩn bị bình tam giác dung tích 250 ml có chữa sẵn 100 ml

dịch môi trường Hansen đã hấp khử trùng, để nguội. Sau đó cho toàn bộ nấm men trong

ống nghiệm đã nuôi giống (nhân giống cấp 1) vào bình tam giác, tiến hành nuôi ở 300C,

trong tủ lắc với tốc độ 200 vòng/phút và kết thúc sau 24 giờ [105].

Đếm tế bào nấm men:

47

Phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu và được thực hiện như sau:

Đặt lá kính lên khu vực buồng đếm, lắc đều dịch tế bào nấm men và dùng pipet lấy một

giọt cho vào khe ở mép buồng đếm, tránh tạo bọt khí. Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng

đếm nhờ cơ chế mao dẫn. Sử dụng kính hiển vi với vật kính x40, tìm mạng ô đếm ở khu

vực buồng đếm và đếm số tế bào trong 5 ô vuông lớn đại diện cho 25 ô vuông lớn trong ô

trung tâm [105].

Cách tính: Số lượng tế bào trong 1 ml mẫu nghiên cứu được tính bằng công thức:

N = ( x .

) x 103 x 10n

Trong đó:

N: Số lượng tế bào trong 1 ml mẫu nghiên cứu

a: Số tế bào trong 5 ô vuông lớn (80 ô vuông nhỏ)

b: Số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn 400: Tổng số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm 0,1: Thể tích dịch tế bào chứa trong ô trung tâm 103: Số chuyển mm3 thành ml 10n: Độ pha loãng mẫu

2.2.1.3. Lên men bioethanol

Nấm men được nuôi cấy trong môi trường Hansen sau 24 giờ đến khi tế bào phát

triển ổn định tiến hành đếm tế bào bằng buồng đếm hồng cầu để xác định mật độ nấm

men (triệu tế bào/ml) trong bình nuôi cấy. Để tăng hiệu suất cho quá trình lên men

bioethanol, các nghiên cứu tiếp theo sẽ tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố: môi

trường, pH, nhiệt độ, thời gian và mật độ nấm men để tìm ra các điều kiện thích hợp để

lên men bioethanol.

Ảnh hưởng môi trường lên men: Quá trình lên men được tiến hành trên hai môi trường

với thành phần được trình bày trên bảng 2.1, dịch lên men được bổ sung 3% giống nấm

men (15x106 tế bào/ml), pH 4.8, ở 300C. Dịch lên men sau 12 và 24 giờ được xác định

hàm lượng bioethanol tạo thành và tổng đường khử còn lại trong dung dịch để đánh giá

hiệu suất và lựa chọn thành phần môi trường thích hợp cho quá trình lên men.

48

Bảng 2.1. Thành phần môi trường lên men

Môi trường BM Môi trường BM+

Dịch đường sau phản ứng chuyển hóa

Dịch đường sau phản ứng chuyển hóa được bổ sung thêm các thành phần từ môi trường Hansen bao gồm: peptone:10 g/l; KH2PO4: 3g/l; MgSO4.7H2O: 3g/l.

Ảnh hưởng thời gian và pH:

Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian và pH đến quá trình lên men

được tiến hành tại các thời điểm 6, 12, 24, 30, 36, 48, 54, 60, 72, 78, 81 giờ và pH tại

4.3; 4.6; 4.9; 5.2; 5.5, 6.0. Hiệu suất của quá trình lên men được đánh giá thông qua hàm

lượng bioethanol tạo thành và tổng đường khử còn lại trong dung dịch.

Ảnh hưởng nhiệt độ:

Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men được tiến

hành ở 230C, 250C, 280C, 300C, 350C và 370C. Nhiệt độ lên men thích hợp được đánh giá

thông qua hàm lượng bioethanol sinh ra trong các thí nghiệm.

Ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men:

Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae SH1 với mật độ 15 x 106 CFU/ml

được sử dụng để bổ sung vào môi trường lên men theo tỷ lệ: 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%,

8%, 9% và 10%. Tỷ lệ nấm men thích hợp được đánh giá thông qua hàm lượng

bioethanol sinh ra trong các thí nghiệm.

2.2.2. Định danh nấm

2.2.2.1. Định danh nấm bằng phương pháp hình thái giải phẫu

Đối với các chủng nấm mới phân lập sẽ được định tên theo hình thái giải phẫu so

sánh và các tài liệu của Roberts & Evans (2011) [36], Kiệt T.T. (2011) [37] và Jean

Polese (2000) [144]. Dựa trên các đặc điểm mũ, phiến và bào tử nấm nhờ: hình dáng,

kích thước, màu sắc và cấu tạo để định danh. Tai nấm được thu nhận quan sát hình thái

bên ngoài và hình thái cắt dọc để xem cách gắn mũ nấm và phiến vào thân, cấu trúc của

thân. Quan sát hình thái giải phẫu phiến (phiến cắt ngang) dưới kính hiển vi ở độ phóng

đại 100 lần (X10) và 400 lần (X40). Quan sát hình dạng, kích thước bào tử bằng kính

hiển vi ở độ phóng đại 400 (X40). Khảo sát khả năng phát sáng của tơ nấm theo thời gian

49

tiếp xúc với oxy không khí bằng cách cắt miếng thạch có tơ nấm cho vào dụng cụ đo là

máy Luminestor. Dựa vào chìa khóa phân loại của Jean Marie Polese (2000) để định

danh.

2.2.2.2. Định danh nấm bằng phương pháp sinh học phân tử

Tách chiết và tinh sạch ADN tổng số:

ADN tổng số được tách chiết theo protocol CTAB của Doyle (1987) [106] và điện

di trên gel agarose 0,8% (80 - 100 V). Kiểm tra độ sạch và hàm lượng ADN tổng số bằng

thiết bị đo quang phổ ở bước sóng λ = 260 nm và 280 nm. Tinh sạch ADN bằng bộ KIT

Fermentas (Thermo Fisher, Waltham, USA) và tiến hành quy trình theo hướng dẫn của

nhà sản xuất.

Nhân gen đích bằng kỹ thuật PCR:

Nhân vùng gen nhân (ITS) bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi ITS1:

TCCGTAGGTGAACCTGCGG; ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC [107]. Thành

phần mỗi phản ứng PCR có thể tích 25 µl gồm các thành phần: 13 µl d.H2O; 2,5 µl buffer

10X; 1 µl MgCl2 25 mM; 2,5 µl dNTPs 2,5 mM; 1,25 µl mồi xuôi (10 pmol/µl); 1,25 µl

mồi ngược (10 pmol/µl); 0,5 µl Taq polymerase (5 U µ/l); 3 µl ADN (10-20 ng).

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR gồm: 940C trong 3 phút; tiếp sau là 35 chu kỳ

nối tiếp nhau với các bước: 940C trong 45 giây, 550C trong 45 giây, 720C trong 45 giây;

kết thúc phản ứng nhân gen ở 720C trong 10 phút, giữ sản phẩm ở 40C.

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% và tinh sạch bằng Qiaquick Gel

Extraction KIT (Qiagen, CHLB Đức). Sản phẩm này được sử dụng làm khuôn cho phản

ứng giải trình tự trực tiếp hai chiều (mồi xuôi và mồi ngược) với mồi ITS1/ITS4, sử dụng

BigDye Terminator Cycler v3.1 và đọc kết quả trên hệ thống ABI 3100 Avant Genetic

Analyzer (Applied Biosystems, USA). Trình tự ADN sau khi đọc được hiệu chỉnh bằng

phần mền ChromasPro1.7.6 (Technelysium Pty Ltd., Australia) để loại bỏ các vùng tín

hiệu nhiễu. Các trình tự phân tích được sắp xếp thẳng hàng bằng phần mền Bioedit

v7.0.5.2 [108], geneDoc 2.7 [109]. Trình tự nucleotide ITS của các chủng nấm được so

sánh với các trình tự đã có trên GenBank, sử dụng phần mền BLAST trong NCBI [110].

Xác lập mô hình tiến hóa:

50

Dữ liệu trình tự nucleotide sẽ được khảo sát phân bố nucleotide, kiểm tra các giả

thuyết và xác định mô hình tiến hóa tối ưu bằng cách sử dụng chuẩn thông tin Akaie

được hiệu chỉnh (corrected AICc-Akaike Information Criterion) trong phần mền

Modeltest v3.7 (Posada 2005). Kết quả khảo sát sẽ được sử dụng làm tham số đầu vào để

tính toán ma trận khoảng cách di truyền và xây dựng cây phát sinh chủng loại theo các

phương pháp: MP (Maximum Parsimony), ML (Maximum Likelihood) và NJ (Neighbor

Joining).

Xây dựng cây tiến hóa:

Để xây dựng cây tiến hóa theo phương pháp ML, MP và NJ, dữ liệu ADN được

chuyển vào phần mềm Bioedit v7.0.5.2, lustal W [108] , geneDoc 2.7 [109] với các thông

số tiến hóa (giá thị thông số gamma, giá trị tỷ lệ các điểm không biến thiên, giá trị mô

hình tiến hóa,...) được lấy từ kết quả phân tích của mô hình tiến hóa Modeltest v3.7. Tất

cả cây tiến hóa theo 3 phương pháp trên đều được phân tích bằng phần mềm PAUP*4.0

b10 (Swofford, 2003), Mega 6.0.6 [111]. Phần mềm Treview được dùng để hiệu chỉnh hình

ảnh cây tiến hóa.

2.2.3. Sàng lọc hoạt tính esterase và lựa chọn chủng nấm

2.2.3.1. Sàng lọc trên đĩa thạch

Dưới các điều kiện vô trùng, khoanh thạch (Ø 1cm) được cắt từ môi trường nuôi

cấy đã có sự phát triển của các sợi nấm và cấy chuyển lên đĩa thạch có môi trường Kirk

[114] bổ sung cơ chất chỉ thị ethyl ferulate (0,1%; w/v) cho hoạt tính feruloyl esterase,

thời gian nuôi cấy từ 3-7 ngày. Hoạt độ của esterase được xác định dựa trên vòng phân

giải được tạo thành.

2.2.3.2. Sàng lọc trên môi trường lên men bề mặt và dịch thể

Các chủng nấm lựa chọn được đánh giá khả năng sinh esterase trên môi trường

nuôi cấy bề mặt trong bình Erlenmeyer 100 mL có cơ chất giàu lignocellulose (rơm, mùn

gỗ…) [113]. Môi trường lên men cơ bản bao gồm các thành phần cần thiết cho sự phát

triển của nấm (MgSO4 0,5 g/l; KH2PO4 1,5 g/l; cao nấm men 2,0 g/l và dịch vi lượng

0,01 L). Bổ sung các cơ chất cảm ứng giàu lignocellulose (rơm rạ, cà chua, khoai tây).

51

Chia đều lượng V=400 ml môi trường lên men cơ bản cho mỗi bình các bình tam giác

Erlenmeyer-1000 ml.

Khoanh thạch (∅ 1cm) có khuẩn ty nấm được cắt và đặt trên đĩa thạch môi trường

Kirk [114] cải tiến. Ủ 23-300C cho tới khi khuẩn ty của nấm mọc kín bề mặt đĩa thạch.

Kiểm tra sự tinh sạch, khi đó các đĩa thạch có sự phát triển của nấm có thể sử dụng cho

nuôi cấy lên men thu enzyme ở bước tiếp theo. Mỗi bình môi trường được cấy với 3

khoanh thạch (Ø 1cm; đối với môi trường rắn) hoặc 5-10% (đối với môi trường dịch thể)

từ môi trường nuôi cấy đã có sự phát triển của các sợi nấm và ủ ở 22-250C trong 25 ngày.

Sau mỗi 3-5 ngày, dịch chiết thô từ môi trường nuôi cấy bề mặt hoặc dịch môi trường

nuôi cấy lỏng được lấy để đánh giá hoạt tính acetyl esterase và feruloyl esterase (mỗi

thực nghiệm được lặp lại 3 lần). Hoạt tính cao nhất trong suốt quá trình nuôi cấy được so

sánh giữa các chủng nấm với nhau để lựa chọn được chủng sinh hoạt tính enzyme cao.

2.2.4. Phương pháp đánh giá hoạt độ enzyme

2.2.4.1. Hoạt độ acetyl esterase

Hoạt tính acetyl esterase được xác định bằng phương pháp đo quang ở bước sóng

λ=405 nm dựa trên sự tạo thành p-nitrophenol từ p-nitrophenyl acetate. Nồng độ cuối của

cơ chất là 1 mM trong đệm phosphate (100mM). Phản ứng diễn ra ở 370C trên phiến vi

lượng 96 giếng trong 10 phút. ρ-Nitrophenol được tính toán dựa trên đường chuẩn, trong

cùng một loại đệm. Một đơn vị hoạt độ acetyl esterase (U/ml) là lượng enzyme cần thiết

để giải phóng 1 µmol ρ-nitrophenol trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm [115].

Hinh 2.1. Đường chuẩn biểu thị liên hệ giữa mật độ quang và nồng độ ρ-Nitrophenol

y = 0.0012x + 0.3532R² = 0.9966

0.4

0.45

0.5

0.55

0.6

0.65

0 50 100 150 200 250

Mật

độ

quan

g (O

D)

Nồng độ ρ-Nitrophenol (μM)

52

2.2.4.2. Hoạt độ feruloyl esterase

Hoạt tính feruloyl esterase được xác định dựa trên khả năng đề methyl hóa methyl

ferulate (MFA; 1mM) thành axít ferulic trong đệm MOPS (3-(N-morpholino)

propanesulfonic axít). Đây là phương pháp chuẩn để xác định hoạt tính feruloyl esterase

trong quá trình nghiên cứu. Phản ứng được bắt đầu bằng ủ hỗn hợp enzyme trong thời

gian thích hợp (10-30 phút, phụ thuộc vào mẫu enzyme), sau đó dừng phản ứng bằng

thêm acetic/acetonitrile (11,3%) với thể tích tương đương. Sau khi ly tâm, sản phẩm phản

ứng là axít ferulic được phân tích bằng HPLC sử dụng cột pha đảo C18 và sử dụng đầu dò

DAD (=323 nm) Một đơn vị hoạt độ enzyme (U/ml) là lượng feruloyl esterase cần thiết

để giải phóng 1 µmol axít ferulic trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm [60].

2.2.5. Xác định điều kiện thích hợp sinh tổng hợp esterase

2.2.5.1. Xác định nguồn nitơ và cơ chất giàu lignocellulose

Môi trường cơ bản bao gồm các thành phần: MgSO4 0,5 g/l; KH2PO4 1,5 g/l; cao

nấm men 3,0 g/l; dịch vi lượng 0,01 L và bổ sung 2% (w/v) cơ chất giàu lignocellulose

và cơ chất ester khác nhau như: cà chua (CC), bã ngô (BN), đậu tương (ĐT), rơm (RR),

khoai tây (KT) và mùn gỗ. Các cơ chất trên đều được rửa sạch, nghiền nhỏ (kích thước

dài 0,5-0,7 cm), sấy khô, trước khi bổ sung vào bình nón (250 mL) chứa môi trường cơ

bản và khử trùng (1210C trong 30 phút).

Sử dụng môi trường với thành phần như trên, tuy nhiên cao nấm men được thay

bằng các nguồn nitơ khác nhau: KNO3 3,0 g/l, (NH4)2SO4 3,0 g/l, pepton 3,0 g/l, NaNO3

3,0 g/l để xác định khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau.

Nấm được nuôi cấy ở điều kiện thích hợp trong các bình Erlenmeyer 1000 mL

hoặc trên thiết bị lên men 2,5 L (Mumbai, Ấn Độ) trong điều kiện có sục khí 1 lít/phút và

lắc khuấy liên tục (200 v/ph). Cứ 3 ngày lấy 1 ml mẫu để xác định hoạt tính enzyme và

sự thay đổi pH môi trường, thực nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả thể hiện là giá trị

trung bình của các lần thực nghiệm lặp lại.

2.2.5.2. Xác định nhiệt độ, pH thích hợp

Chủng nấm được nuôi cấy trên môi trường cơ bản (pH 6,5) bổ sung cơ chất (2%)

và nguồn nitơ thích hợp. Nhiệt độ và pH tối ưu của esterase được xác định bằng

53

cách đo hoạt tính enzyme theo phương pháp đã mô tả ở trên sử dụng đệm acetate 100

mM (pH 5,0-5,5) và đệm phosphate 100 mM (pH 5,5-8,0), nhiệt độ thay đổi từ 23-

370C và pH từ 5,0-8,0.

2.2.6. Tinh sạch protein enzyme

2.2.6.1. Tách chiết, tinh sạch protein enzyme

Sau khi nuôi cấy ở các điều kiện tối ưu, enzyme sẽ được tách chiết bằng nước cất

(đối với môi trường rắn) qua đêm và lọc sơ bộ qua vải thô và giấy lọc. Dịch chiết có hoạt

tính esterase được loại khuẩn ty nấm và cơ chất bằng thiết bị ly tâm 5000-10.000 v/ph và

hệ thống siêu lọc 10 kDa cut-off (LongerPump K235 với màng UFP 10MW, Amersham

BioScience, Westborough, Mỹ, hoặc amicon Ultra Centrifugal Filters, Millipore,

Bedford, Mỹ) ở 110C.

Dịch enzym thô biểu hiện hoạt tính esterase được tinh sạch qua các bước sắc ký

trao đổi ion và sắc ký lọc gel sử dụng cột DEAE Sepharose, Q sepharose (GE Healthcare,

Freiburg, CHLB Đức) với đệm Na-acetate 10mM và nồng độ NaCl từ 0-2,5 M hoặc cột

Superdex 75, đệm Na-acetate 50 mM. Protein rửa giải được xác định sử dụng đầu dò ở

bước sóng λ=280nm. Các phân đoạn có hoạt tính esterase được gộp chung, cô loại bớt

dịch và hòa lại với đệm Na-acetate 10mM, pH 6,0. Mẫu được lưu giữ ở -200C.

Hinh 2.2. Hệ thống siêu lọc 10 kDa cut-off trên thiết bị amicon Ultra Centrifugal Filters

2.2.6.2. Xác định hàm lượng protein

Nồng độ protein tổng trong dịch chiết và các phân đoạn tinh sạch được xác định

bằng phương pháp so màu theo quy trình của Bradforf (1976) [116] sử dụng Roti® -

Nanoquant Kit và protein chuẩn BSA (bovine serum albumin). Mẫu được nhỏ lên phiến

54

96 giếng, lặp lại 3 lần và đo ở bước sóng λ=590/450nm với thiết bị đo phiến vi lượng

NanoQuant (Tecan, Grӧdig, Austria).

Độ tinh sạch cũng như trọng lượng phân tử và điểm đẳng điện của protein enzyme

được đánh giá bằng phương pháp điện di SDS-PAGE và IEF.

2.2.6.3. Điện di trên gel polyacrylamide có SDS

Điện di SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)

được thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất với hệ điện di đứng (XCell SureLockTM

Mini-Cell, Invitrogen, Karlsruhe, CHLB Đức hoặc OmniPage Mini; Cleaver Scientific,

Warwickshire, Anh) và NuPAGE® 12% Bis Tris Gels (Invitrogen). Phương pháp này

được sử dụng để đánh giá độ tinh sạch của protein dưới điều kiện biến tính cũng như xác

định trọng lượng phân tử (MW) của protein enzym [117]. Hỗn hợp protein (MW 6,5-200

kDa; Serva, Heidelberg, CHLB Đức) được sử dụng làm protein chuẩn. Protein phân tách

điện di được quan sát sau khi nhuộm với Colloidal Blue Staining Kit (Invitrogen).

2.2.6.4. Điện di điểm đẳng điện

Các hệ điện di ở trên cũng được sử dụng để phân tách protein dựa trên điểm đẳng

điện (pI) của chúng. Điều kiện điện di được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất

với gel Novex® Pre-Cast Vertical IEF (gradient pH 3,0-7,0) và Liquid Mix IEF Marker

(pH 3.0-10.0; Serva, Heidelberg, CHLB Đức). Các dải protein trên gel polyacrylamide

sau đó được quan sát sử dụng nhuộm với Colloidal Blue Staining Kit (Invitrogen).

2.2.6.5. Xác định nhiệt độ và pH tối ưu của enzyme tinh sạch

Nhiệt độ và pH tối ưu của acetyl esterase tinh sạch được xác định bằng cách đo

hoạt tính enzyme theo phương pháp đã mô tả ở mục 2.2.4 sử dụng đệm acetate 100 mM

(pH 3,0-5,5) và đệm phosphate 100 mM (pH 5,5-8,0), nhiệt độ thay đổi trong khoảng 35-

700C tại pH 5 và pH từ 4,0-7,0 ở 400C.

pH tối ưu của feruloyl esterase tinh sạch được xác định trong bộ đệm MOPS (100

mM) ở pH từ 4 đến 9. Nhiệt độ tối ưu được xác định bằng cách thủy phân methyl ferulate

ở nhiệt độ khác nhau từ 30-800C trong đệm MOPS (100 mM, pH 6,0).

55

2.2.6.6. Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của enzyme tinh sạch

Để đánh giá độ bền nhiệt và độ bền pH của acetyl esterase tinh sạch, dịch enzyme

(250 µl cho mỗi phản ứng) được ủ ở nhiệt độ 400C và 600C tại pH 5,0 và giá trị pH 3; pH

5 và pH 6 (pH 3,0-6,0 với đệm acetate; pH 6,0-8,0 với đệm phosphate) ở 400C, Xác định

hoạt tính sau khoảng thời gian ủ tại 2, 4, 6, và 8 giờ. Hoạt tính còn lại của enzyme acetyl

esterase tinh sạch cũng được xác định theo phương pháp ở mục 2.2.4.

Sự ổn định pH của feruloyl esterase đã tinh sạch được thử nghiệm trong dung dịch

citrate-phosphate (50 mM) ở pH 5.0, 7.0, 8.0 và 10.0 ở 400C. Ảnh hưởng của nhiệt độ

đến sự ổn định enzyme được nghiên cứu ở 400C và 600C trong đệm MOPS (100 mM, pH

6,0). Sau khoảng thời gian ủ tại 2, 4, 6 và 8 giờ các mẫu thử nghiệm được lấy ra và hoạt

động feruloyl esterase còn lại được đo như mô tả mục 2.2.4.

2.2.7. Phương pháp hóa sinh

2.2.7.1. Sắc ký bản mỏng

Sản phẩm của phản ứng chuyển hóa là các đường đơn được xác định bằng sắc ký

bản mỏng (TLC) sử dụng hệ dung môi: n-butanol: aceton: H2O (8:1:2). Thuốc thử là

H2SO4 (5-10%) được sử dụng để xác định vết chất đường trên bản mỏng [118].

Chất chuẩn là các đường D-glucose, D-galactose, D-xylose và D-mannose

(SigmaAldrich- Mỹ) pha trong nước cất với nồng độ 0,1mg/ml. Mỗi chất được chấm lên

một điểm hoặc theo đường được đánh dấu vị trí trên bản sắc kí mỏng TLC để xác định vị

trí Rf.

2.2.7.2. Sắc kí lỏng hiệu năng cao

Để xác định thành phần và hàm lượng các đường đơn trong dung dịch chuyển hóa,

hỗn hợp phản ứng được ly tâm nhanh ở 12000 v/ph và chuyển sang các ống HPLC thể

tích 1,5 mL. Glucose được đo nồng độ bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử

dụng pha động là axít sulfuric 0,01 N. Mẫu và chất chuẩn được chạy ở nhiệt độ cột: 600C,

tốc độ pha động 1 ml/phút. Dựa trên khả năng phân bố khác nhau của các cấu tử khác

nhau trên cột, khi dung môi rửa giải đi qua, các cấu tử sẽ lần lượt được rửa giải ra khỏi

cột theo thứ tự tùy thuộc vào bản chất của các cấu tử. Những cấu tử như nhau (thuộc

cùng một chất) sẽ có thời gian lưu như nhau, nhờ vào đó máy HPLC có thể tách hỗn hợp

56

nhiều chất ra khỏi nhau. Do diện tích bề mặt tiếp xúc của pha tĩnh lớn, HPLC có độ phân

tách khá cao. Căn cứ vào thời gian lưu của từng chất và so sánh với chất chuẩn, có thể kết

luận về thành phần các chất có trong dung dịch mẫu. Nếu cần có thể xác định bằng cách

thêm chuẩn vào mẫu. Để phân tích các đường đơn (glucose, mannose, galactose) sử dụng

cột sắc ký ion-exclusion RezexTM (RPM-Monosaccharide Pb+2 (8%) 7.8 mm x 300 mm,

Phenomenex), cột này có thể đo đường, axít hữu cơ và cồn, sử dụng đầu dò chỉ số khúc

xạ (RI).

2.2.7.3. Xác định peptide bằng phương pháp phổ khối sử dụng nguồn ion hóa mẫu

ESI-MS

Kỹ thuật ESI-MS/MS là phương pháp ion hóa mẫu bằng phương pháp phun chùm

ion trong dung dịch tạo thành đám sương mù với các giọt nhỏ dễ bay hơi. Cơ chế hoạt

động của nguồn ESI khá đơn giản. Dưới áp lực dòng liên tục, đường kính cột bé và hiệu

điện thế cao (2500V), peptid sẽ được phun tơi thành các giọt nhỏ đa điện tích ra khỏi đầu

kim phun. Kim phun sẽ tạo thành các giọt nhỏ, như đám sương mù (đám mây khí ion), dễ

bay hơi, các giọt này chứa peptid và các thành phần dung môi khác. Quá trình bay hơi

được thực hiện bởi nhiệt độ hoặc màng chắn khí nitơ làm cho mẫu dễ bay hơi. Kết quả là

chỉ còn peptid tích điện và bay vào bộ phận phân tích khối của máy khối phổ liên tục

MS/MS. Peptid tồn tại ở dạng ion bởi vì chúng chứa các nhóm chức và điện tích của

chúng phụ thuộc vào pH của dung môi. Ở pH trong môi trường là axit (pH 3,5 hoặc thấp

hơn) protein/peptid sẽ mang điện tích dương và được phân tách bằng sắc ký nano đa

chiều tốt hơn. Do đó, nguồn ESI hay được kết nối trực tiếp với hệ sắc ký lỏng và thường

phân tích các peptid ở chế độ ion dương. Hệ ESI-MS/MS có khả năng ion hóa cao, có

khả năng kết nối linh động với sắc ký và khối phổ, peptid thường ở trạng thái đa điện tích

(+2, +3…). Hệ nanoLC-MS/MS có thể phân tách hỗn hợp protein phức tạp với hàng ngàn

protein được nhận dạng ion peptid sẽ bị phân mảnh thành các đoạn nhỏ hơn được đo và

ghi phổ tại detector.

Sau khi điện di, băng protein trên gel SDS-PAGE được chuyển lên màng PVDF và

gửi đi phân tích bởi Proteomics International (Broadway, Nedlands, Australia). Protein

được thủy phân bằng trypsin và phân tách các peptide theo phương pháp chuẩn của

57

Bringans và công sự (2008). Peptide được phân tích bằng phổ khối lượng ion hóa phun

mù điện tử (ESI-MS) với hệ Agilent 1260 Infinity HPLC [Agilent] kết nối thiết bị phổ

khối Agilent 6540 [Agilent]. Đoạn peptide sau thủy phân trypsin được nạp lên cột 18C

300 SB, 5 µm [Agilent] và phân tách với hệ gradient H2O/acetonitrile/0.1% formic axít

(v/v). Phổ được phân tích để xác định protein/peptide bằng phần mềm Mascot

[MatrixScience] với MSPnr100 database [119].

2.2.7.4. Định lượng đường khử theo phương pháp axit dinitrosalicylic

Nguyên lý

Glucose hay đường khử nói chung phản ứng tạo màu với thuốc thử là axit

dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ

đường glucose trong một phạm vi nhất định. Sản phẩm sau phản ứng được xác định bằng

phương pháp so màu ở bước sóng 540nm. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh

khiết với thuốc thử DNS ta sẽ dễ dàng tính được hàm lượng đường của mẫu nghiên cứu

[120].

Hinh 2.3. Phương trình phản ứng giữa đường khử và axít dinitrosalicylic

- Pha hóa chất

Cân 5g DNS cho vào 300 ml nước cất hòa tan ở 500C, sau đó cho thêm 5ml dung

dịch NaOH 4M. Cuối cùng cho thêm 150g muối tartrat kép hòa tan rồi cho vào bình định

mức và thêm nước cất đủ 500ml, đựng trong lọ thủy tinh sẫm màu. Chuẩn 3ml thuốc thử

DNS bằng HCl 0.1N với chỉ thị phenolphtalein, nếu hết 5-6ml HCl là được.

- Dựng đường chuẩn và xác định hàm lượng đường

Lần lượt hút chính xác 0.2µl các dung dịch chuẩn từ 0,1 – 0,6 mg/ml cho vào các

ống eppendorf, sau đó cho vào các ống mỗi ống 0.6µl dung dịch thuốc thử DNS, lập tức

lắc đều. Đun các ống eppendorf trong nước sôi 5 phút. Thuốc thử DNS sẽ phản ứng với

58

đường trong quá trình đun nóng cho sản phẩm có màu nâu đỏ đến màu đen đỏ tùy thuộc

hàm lượng đường có trong dung dịch. Làm lạnh nhanh và pha loãng 20 lần rồi đem đi đo.

- Chuẩn bị mẫu blank: bằng cách hút 0.2µl nước cất và thêm vào 0.6µl dung dịch

DNS, tiến hành các bước tiếp theo như các mẫu của thang chuẩn.

Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang (OD540nm), trục hoành là

nồng độ glucose. Tìm phương trình biểu diễn đường chuẩn dạng y = ax + b với y =

OD540nm; x = [glucose] (mg/ml) và hệ số tương quan R2 nhờ phần mềm Excel.

- Mẫu phân tích: Cũng tiến hành như với thang chuẩn. Hút 0.2µl dung dịch cần xác

định hàm lượng glucose cho vào ống nghiệm, cho thêm 0.6µl DNS và lắc đều, đun sôi

trong nước 5 phút, làm lạnh. Pha loãng 20 lần, khuấy đều và tiến hành đo.

- So màu thang chuẩn và mẫu phân tích ở bước sóng 540 nm.

Đồ thị đường chuẩn glucose được xây dựng từ mối liên hệ giữa mật độ quang OD

với nồng độ glucose tại các nồng độ: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 (mg/ml) (Hình 2.4). Từ

đồ thị đường chuẩn ta xác định được hàm lượng đường khử có trong mẫu nghiên cứu.

Hinh 2.4. Đường chuẩn glucose biểu thị liên hệ giữa mật độ quang và nồng độ glucose

2.2.7.5. Xử lý nguyên liệu

Xử lý bằng NAOH kết hợp “enzyme cocktail”:

Bã mía (10%; w/v) được tiền xử lý cơ học sau đó ngâm trong dung dịch NaOH ở các

nồng độ khác nhau: 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,45 và 0,5 M, hỗn hợp được

ủ ở nhiệt độ 850C trong 2,5 giờ, kết thúc thí nghiệm dung dịch chuyển hóa được làm

y = 1,359x + 0,106R² = 0,997

00.10.20.30.40.50.60.70.80.9

1

0 0.2 0.4 0.6 0.8

Mật

độ

quan

g (O

D)

Nồng độ glucose (mg/ml)

Độ hấp thụ (OD)

Linear (Độ hấp thụ (OD) )

59

nguội và điều chỉnh về pH 5 nhằm tạo điều kiện thích hợp cho quá trình chuyển hóa sinh

học bằng “enzyme cocktail”. Hỗn hợp tiếp tục được ủ ở 400C, sau 48 giờ trong điều kiện

có khuấy đảo liên tục (200 vòng/phút). Dịch sau chuyển hóa được bất hoạt enzyme bằng

cách đun cách thủy mẫu đã thủy phân ở 90oC trong 10 phút để dừng phản ứng chuyển

hóa. Cuối cùng, dịch chuyển hóa được lọc bỏ cặn bằng cách lọc và ly tâm rồi xác định

tổng hàm lượng đường khử theo phương pháp DNS để đánh giá hiệu suất chuyển hóa.

Xử lý bằng axít H2SO4 kết hợp “enzyme cocktail”:

Các bước xử lý bã mía bằng axít H2SO4 được thực hiện giống như với NAOH. Bã

mía (10%; w/v) ngâm trong dung dịch axít H2SO4 ở các nồng độ khác nhau: 0,05; 0,1;

0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,4; 0,5 và 0,6%, hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ 850C trong 2,5 giờ. Sau

phản ứng, dung dịch chuyển hóa được làm nguội và điều chỉnh về pH 5 và bổ sung hỗn

hợp “enzyme cocktail” theo tỉ lệ tối ưu, hỗn hợp tiếp tục được ủ ở 400C trong 48 giờ. Kết

thúc phản ứng tiến hành xác định tổng đường khử trong dung dịch trước và sau khi ủ với

hỗn hợp enzyme, từ đó đánh giá hiệu suất chuyển hóa.

Xử lý bằng thiết bị gia nhiệt kết hợp “enzyme cocktail”:

Nguyên liệu bã mía (10%; w/v) đặt trong bình chứa đưa vào thiết bị gia nhiệt ở 1210C, 1atm, trong 120 phút. Toàn bộ khối nguyên liệu ở nhiệt độ và áp suất cao, khi đó nước thấm trong nguyên liệu sẽ hóa hơi, tăng thể tích độ ngột. Chính điều này tạo lực xé vỡ xơ sợi, làm cho cấu trúc xơ sợi trở nên dễ dàng hơn cho enzyme tấn công. Kết thúc thí nghiệm, dịch chuyển hóa được làm nguội và điều chỉnh về pH 5. Sau đó cũng tiến hành theo các bước trung hòa pH, chuyển hóa sinh học, bất hoạt “enzyme cocktail” và xác định tổng hàm lượng đường khử để đánh giá hiệu suất quá trình chuyển hóa [121]. 2.2.7.6. Xác định hàm lượng bioethanol

Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên các phản ứng [122, 123]:

2Cr2O72- + 16H+ + 3C2H5OH 4Cr3+ + 11H2O + 3CH3COOH

Cr2O72- + 14 H+ + 6I- 2 Cr3+ + 3I2 + 7H2O

2 S2O32- + I2 S4O6

2- + 2 I-

Về bản chất phương pháp này dựa trên nguyên tắc chuẩn độ oxi hóa khử để tìm

nồng độ bioethanol trong dung dịch. Bioethanol bị oxi hóa thành axít acetic bằng phản

ứng với một lượng kali dicromat dư thừa trong dung dịch. Lượng dicromat không phản

60

ứng sau đó được xác định bằng cách thêm dung dịch KI, phản ứng oxy hóa xảy ra tạo

thành iốt. Sau đó, iốt được chuẩn độ bằng dung dịch chuẩn natri thiosulfat và các kết quả

chuẩn độ được sử dụng để tính hàm lượng bioethanol của dung dịch ban đầu.

Chuẩn bị: Dung dịch A – axít Dicromic: Cho 125 ml H2O vào bình dung tích 500 ml, thêm 70 ml H2SO4 đặc, làm lạnh. Sau đó thêm 0,75 g K2Cr2O7 và thêm 250 ml nước cất. Dung dịch B – Hồ tinh bột 1 %; dung dịch C – Na2S2O3 0,03 M; dung dịch D – KI 1,2 M. Chuẩn bị bình tam giác dung tích 250 ml có nắp cao su.

Cho 10 ml dung dịch A vào bình tam giác đã chuẩn bị, cho 1ml dịch mẫu (pha loãng 10 lần) vào bình, sau đó để tối khoảng 10 phút. Mở nắp cao su, lần lượt cho vào các bình 100 ml nước cất (lắc đều), 1 ml dung dịch D lắc đều và cuối cùng bổ sung 1 ml dung dịch B, thu được dung dịch màu xanh đen.

Chuẩn độ hỗn hợp trên bằng dung dịch C. Kết quả thu được thể tích dung dịch C tiêu tốn tại điểm tương đương, dung dịch từ xanh đen chuyển sang mất màu. Mẫu đối chứng: Tiến hành các thao tác như trên với mẫu sử dụng nước cất (1 ml), thực hiện 3 lần và lấy kết quả trung bình. Cách tính: Hàm lượng bioethanol thu được tính theo công thức sau:

Trong đó:

T: Hàm lượng bioethanol (mg/ml)

∆V: Thể tích Na2S2O3 tham gia phản ứng với mẫu

V: Thể tích Na2S2O3 đã sử dụng để chuẩn độ dung dịch mẫu

Vblank: Thể tích trung bình của 3 lần chuẩn độ với mẫu nước

0,03: Nồng độ ban đầu của Na2S2O3

d: Độ pha loãng

2.2.8. Xúc tác chuyển hóa sinh học các vật liệu giàu lignocellulose

Chuyển hóa các sinh khối giàu lignocellulose được thực hiện với sự có mặt của đơn

enzyme (XpoAE, Cell/xyl hoặc AltFAE) và phối hợp với hai enzyme hoặc tất cả các

enzyme thủy phân trong nghiên cứu [bao gồm XpoAE (13,1 U/mg) hoặc AltFAE (11,2

U/mg) và carboxymethyl cellulase/glucuronoxylanase (Cell/Xyl, 1-1,6 U/mg); từ T.

T = (∆V x 0.03) x 4 x 46 x d

∆V = V - Vblank

61

reesei (AB Enzyme, Darmstadt, CHLB Đức)]. Sinh khối được ủ với các enzyme trong 24

giờ ở 400C và thực hiện trong đệm 100 mM MOPS (pH 5,0-5,5), so sánh với mẫu đối

chứng được bất hoạt enzyme bằng cách đun sôi ở 950C trong 30 phút. Sản phẩm chuyển

hóa là các đường đơn được phân tích bằng phương pháp DNS để xác định tổng đường

khử và phương pháp sắc lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác định thành phần, hàm lượng

các đường đơn có khả năng lên men bioethanol. Xúc tác đơn enzyme hoặc hỗn hợp

“enzyme cocktail” được nghiên cứu với rong túi (RT), bã cà phê (CFA), bã mía (MIA),

rơm (RR) và mùn gỗ (MG) [124]. 2.2.9. Quy hoạch thực nghiệm

Quy hoạch thực nghiệm được thực hiện theo mô tả của Nguyễn Minh Tuyền, là

việc chọn số lượng thí nghiệm, các điều kiện tiến hành thí nghiệm cần và đủ để giải quyết

nhiệm vụ đặt ra với độ chính xác cần thiết, chọn các phương pháp toán học xử lý kết quả

thực nghiệm và thừa nhận kết quả đó. Theo định nghĩa trên, nhờ có vị trí tối ưu của các

điểm trong không gian yếu tố và phép biến đổi tuyến tính của tọa độ mà ta có thể khắc

phục được những nhược điểm của phương pháp phân tích hồi quy cổ điển (thực nghiệm

thụ động, thay đổi lần lượt từng biến số). Kết quả là số lượng thí nghiệm giảm đi đáng kể,

thông tin nhận được chính xác hơn, và do đó hiệu quả quá trình thực nghiệm cao hơn (tiết

kiệm thời gian, công sức, chi phí cho thí nghiệm). Trong phương pháp này sử dụng hai kế

hoạch sau [124,125]:

Kế hoạch bậc một 2k: Với k là số yếu tố ảnh hưởng (ví dụ: nhiệt độ, áp suất, thời

gian, nồng độ,…) và mỗi yếu tố Zj (j = k,1 ) thay đổi trong khoảng 2 mốc từ Z minj đến Z max

j

thì số thí nghiệm cần phải tiến hành là: N = 2k (1)

Với mỗi yếu tố ta có mức cơ bản: Zoj =

2

minmaxjj ZZ

(2)

Và khoảng biến thiên: jZ2

minmaxjj ZZ

(3)

Điểm với tọa độ là ( ok

oo ZZZ ,...,, 21 ) gọi là tâm kế họach.

Bằng phép biến đổi tuyến tính ta có thể chuyển từ hệ tọa độ Z1, Z2,…Zk về hệ tọa độ vô

thứ nguyên của x1 , x2 ,…xk

62

Xj = j

ojj

ZZZ

với j = 1,2,3…k (4)

Dễ dàng nhận thấy xj sẽ nhận các giá trị -1, 0, +1 ứng với maxmin ,, jojj ZZZ .

Ma trận kế hoạch thực nghiệm có tính chất trực giao nên việc xử lý số liệu thực

nghiệm tìm mô hình hồi quy dạng:

y = bo+

k

j 1bj xj +

k

ju 1,bujxuxj u j (5)

Trở nên dễ dàng bằng cách nhân các cột của ma trận X với vectơ kết quả Y (y1, y2,

y3,…y8), sau đó tiến hành phân tích thống kê mô hình nhận được (5) gồm: kiểm định ý

nghĩa của hệ số và tính tương hợp của mô hình với thực nghiệm theo các tiêu chuẩn t –

Student và F (Fisher) mà ta sẽ nói rõ hơn ở phần mô hình bậc 2.

Kế hoạch trực giao bậc hai Box – Wilson: Khi mô hình bậc 1 không phù hợp với

thực nghiệm, người ta tiến hành những thí nghiệm bổ sung tiến về vùng tối ưu (gần dừng)

hoặc trên cơ sở phân tích số liệu mà tiến hành kế hoạch trực giao bậc 2 Box – Wilson.

Phương trình hồi quy trong trường hợp này có dạng:

y = bo+

k

j 1bj xj +

k

ju 1,bujxuxj +

k

j 1bjj x 2

j (1) u j

Trong đó: bo – thành phần tự do bj – các hiệu ứng tuyến tính

buj– các hiệu ứng tương tác đôi bjj – các hiệu ứng bình phương

Để có được mô hình (1) phải tiến hành kế hoạch thực nghiệm với số thí nghiệm:

N = 2k + 2k + no

Trong đó: no – số thí nghiệm ở tâm kế hoạch

2k – các điểm sao (thí nghiệm thiến hành ở mức ∝ là cánh tay đón sao). Giá

trị của ∝ phụ thuộc vào k và no.

Tính tương hợp của mô hình sau đó được kiểm định theo tiêu chuẩn Fisher bằng

cách tính:2

2s

th

t

sFs

63

Phương tình hồi quy tương hợp nếu F <Fp(f1f2), trong đó Fp(f1f2) là giá trị tra bảng

ở p = 0.05, f1 = N – l là số bậc tự do của phương sai tương hợp , f2 là số bậc tự do của

phương sai tái sinh.

Sau khi nhận được phương trình hồi quy tương hợp với thực nghiệm có thể tiến

hành tìm điều kiện tối ưu cụ thể: max [ y = f(x1x2x3)]

Với điều kiện ràng buộc 1.215 1.215jx , j = 1, 2, 3 bằng một chương trình tối

ưu hóa của quy hoạch phi tuyến.

2.2.10. Xử lý số liệu

Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê, sử dụng một số phần mềm như:

Microsoft Excel, Mascot (xác định trình tự peptipe), Treview (xác định cây phân loại),

Bioedit, Clustal W, GeneDoc 2.7 (xác định trình tự nucleotide ITS)… Kết quả là trung

bình cộng của 3 lần thí nghiệm,

2.3. Xây dựng sơ đồ nghiên cứu

2.3.1. Sơ đồ xác định các điều kiện thích hợp cho mô hình tối ưu thực nghiệm

Sơ đồ xác định các thông số thích hợp cho mô hình tối ưu thực nghiệm trong

chuyển hóa bã mía.

64

Hình 2.5. Sơ đồ xác định các điều kiện thích hợp cho mô hình tối ưu thực nghiệm

Bất hoạt enzyme

Lọc, ly tâm loại cặn

Thu nhận đường đơn

Nghiền nhỏ đến kích thước 0,5 – 1 mm

Điều chỉnh pH: 4,5; 5,0; 5,5

Ủ mẫu ở nhiệt độ (0C): 35; 37; 40; 42,5; 45

Thời gian (giờ): 24; 36; 48; 60, …, 81

Bổ sung “enzyme cocktail” với hoạt độ (U) khác nhau

Bã mía (DS) (10% w/v)

Xác định pH thích hợp

Xác định nhiệt độ thích hợp

Xác định thời gian thích hợp

Sử dụng quy hoạch thực nghiệm tối ưu hỗn hợp “enzyme

cocktail”

65

Các bước tiến hành sử dụng quy hoạch thực nghiệm tối ưu hỗn hợp “enzyme

cocktail”: Quá trình thủy phân nguyên liệu giàu liglocellulose thành các đường lên men sử

dụng đơn enzyme thủy phân (AltFAE, XpoAE và Cell/Xyl) hoặc đa enzyme hay “enzyme

cocktail” với các yếu tố ảnh hưởng: thời gian (h), nhiệt độ phản ứng (0C), pH, lượng cơ

chất (%) và hoạt tính enzyme (U). Thông số tối ưu hóa được tổng hợp bằng hàm lượng

đường khử Y (mg/g cơ chất khô). Bằng cách khảo sát các thông số ảnh hưởng đến quá

trình chuyển hóa để tìm hiệu suất tối ưu (y) thông qua các điều kiện tối ưu cho hỗn hợp

“enzyme cocktail”. Do vậy, mục đích chính của quy hoạch thực nghiệm nhằm tìm ra các

giá trị tối ưu (nhiệt độ, pH, thời gian) và hoạt độ enzyme (U) của từng enzyme trong hỗn

hợp “enzyme cocktail” trong cùng một phản ứng. Bằng việc bố trí các thí nghiệm với

lượng cơ chất thay đổi 0,4 - 0,8 gram (tương đương 8% đến 16%) và sự thay đổi thể tích

tương ứng hoạt độ enzyme (U) của mỗi enzyme trong hỗn hợp “enzyme cocktail”

(Cell/Xyl: 0,45 ml – 1 ml; AltFAE: 0,12 - 0,7 ml; XpoAE: 0,14 – 0,6 ml). Đồng thời cũng

thay đổi các điều kiện như nhiệt độ (35 – 450C), pH (4,5 – 5,5) và thời gian (24 – 72 giờ)

trong phản ứng. Kết quả phân tích hàm lượng đường khử theo phương pháp DNS được

tính bằng trung bình của 3 lần thí nghiệm độc lập.

Sau khi sử dụng mô hình quy hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa các điều kiện của

“enzyme cocktail” cho quá trình thuỷ phân bã mía thành các đường lên men. Bước tiếp

theo, bã mía được tiền xử lý hóa học bằng axít H2SO4, NAOH và thiết bị gia nhiệt, kết

hợp với chuyển hóa sinh học bằng “enzyme cocktail” nhằm nâng cao hiệu suất chuyển

hóa thành các đường đơn có khả năng lên men bioethanol.

66

2.3.2. Sơ đồ xử lý bã mía bằng phương pháp hóa lý kết hợp “enzyme cocktail”

Hinh 2.6. Sơ đồ xử lý bã mía bằng phương pháp hóa lý kết hợp “enzyme cocktail”

Nghiền nhỏ kích thước khoảng 0,5 – 1,0 mm

Xử lý bằng: (H2SO4/NAOH/Gia nhiệt)

Điều chỉnh pH 5.0

Thủy phân: “enzyme cocktail”

H2SO4/NAOH: 850C, 2.5 giờ; Gia nhiệt: 1atm, 2 giờ

Bất hoạt enzyme cocktail

Ly tâm loại bã

Enzyme cocktail: (Cell/Xyl:100 -160 U/gds;AltFAE:7.56 U/gds; XpoAE:10.8 U/gds); 400C; pH: 5.0; 48 giờ ủ

Thu nhận các đường

đơn

Bã mía (DS) (10% w/v)

67

Các bước tiến hành:

Xử lý cơ học:

Bã mía sau thu hoạch được xử lý cơ học bằng cách xấy khô, nghiền nhỏ bằng hệ

thống nghiền bi (thiết bị Fritsch, Oberstein, CHLB Đức) và lọc qua rây để đạt được kích

thước khoảng 0,5 – 1,0 mm. Mẫu sau xử lý tiến hành trên ba thí nghiệm độc lập bằng axit

H2SO4, NaOH và thiết bị gia nhiệt nhằm tìm ra phương pháp thích hợp để tiếp tục chuyển

hóa sinh học bằng “enzyme cocktail”.

Xử lý bằng axit H2SO4/NAOH/Gia nhiệt:

Bã mía được xử lý bằng dung dịch NaOH ở nồng độ: 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25;

0,3; 0,35; 0,4; 0,45; 0,5 M và axít H2SO4 ở nồng độ: 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,4;

0,5, 0,6%. Sau đó, hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ 850C trong 2,5 giờ.

Bã mía được làm ẩm (60%) đưa vào thiệt bị gia nhiệt ở 1210C, áp suất 1atm, trong

120 phút. Toàn bộ khối nguyên liệu ở nhiệt độ và áp suất cao, nước thấm trong nguyên

liệu sẽ hóa hơi, tăng thể tích độ ngột. Chính điều này tạo lực xé vỡ xơ sợi, làm cho cấu

trúc xơ sợi trở nên dễ dàng hơn cho enzyme tấn công.

Xử lý bằng hỗn hợp “enzyme cocktail”:

Toàn bộ dịch chuyển hóa sau khi xử lý theo phương pháp hóa lý được làm nguội

và điều chỉnh về pH 5 nhằm tạo điều kiện thích hợp cho quá trình chuyển hóa sinh học

bằng enzyme. Hỗn hợp “enzyme cocktail” được sử dụng là Cell/Xyl = 100 U/gds,

AltFAE = 7,56 U/gds, XpoAE = 10,8 U/gds. Quá trình chuyển hóa sinh học diễn ra ở

400C, pH 5, thời gian chuyển hóa 48 giờ trong điều kiện có khuấy đảo liên tục (200

vòng/phút). Sau đó dịch chuyển hóa được bất hoạt enzyme bằng cách đun cách thủy mẫu

đã thủy phân ở 90oC trong 10 phút để dừng phản ứng. Cuối cùng, toàn bộ dịch chuyển

hóa được lọc bỏ cặn bằng cách lọc và ly tâm rồi đem đi xác định tổng hàm lượng đường

khử theo phương pháp DNS để đánh giá hiệu suất chuyển hóa.

68

2.3.3. Sơ đồ lên men bioethanol từ dịch đường chuyển hóa

Hình 2.7. Sơ đồ lên men bioethanol từ dịch đường chuyển hóa

Bổ sung thành phần dinh dưỡng

Điều chỉnh pH 5.2

Khử trùng 1210C, 1atm, 20 phút

Lên men bioethanol

Chưng cất

Điều kiện lên men: 280C; pH 5.2; 78 giờ; 5% nấm men

Thu nhận bioethanol

Nguồn dinh dưỡng Peptone: 10 (g/l); KH2PO4: 3(g/l); MgSO4.7H2O: 3(g/l)

Dịch đường thủy phân

69

Các bước tiến hành:

Bổ sung thành phần dinh dưỡng: Dịch đường sau chuyển hóa từ bã mía được bổ

sung thêm một số thành phần dinh dưỡng trong môi trường hanxen.

Điều chỉnh pH: Công đoạn này nhằm mục đích đưa pH trong môi trường lên men

về giá trị thích hợp để tạo điều kiện thuận lợi cho nấm men Saccharomyces cerevisiae

SH1 sinh trưởng và phát triển tăng sinh khối.

Lên men bioethanol: Tiến hành lên men bioethanol dưới các điều kiện thích hợp

đã được nghiên cứu (tỷ lệ nấm men, thời gian, pH và nhiệt độ).

Chưng cất thu nhận bioethanol: Sau khi kết thúc quá trình lên men, dung dịch thu

được đem đi chưng cất phân đoạn để làm tăng độ tinh khiết của bioethanol tạo thành

bằng thiết bị cô quay chân không với số vòng quay 30 vòng/phút, nhiệt độ 500C, áp suất

<100 mbar trong 30 phút. Đồng thời xác định hàm lượng đường khử còn lại trong dung

dịch để đánh giá hiệu suất lên men. Dung dịch bioethanol thu được sau chưng cất được

bảo quản trong bình kín, thoáng gió, tránh ánh sáng và các nguồn nhiệt.

70

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân lập và sàng lọc nấm

Từ các mẫu nấm thu từ rừng Quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình) đã phân lập được

44 chủng nấm thuộc 13 họ và định tên khoa học đến loài. Các taxon nấm phân lập được:

3.1.1. Ngành nấm đảm Basidiomycota

Họ Polyporaceae: Coriolus unicolor, Tyromyces lacteus, Trametes insularis, Tr.

consors, Tr. gibbosa, Hexagonia apiaria, Nigroporus aratus

Họ Ganodermataceae: Ganoderma komingshegii, G. applanatum, Ganoderma sp.

Họ Coriolaceae: Poria versipora

Họ Marasmiaceae: Campanella junghuhnii, Marasmius maximus

Họ Agaricaceae: Coprinus disseminates

Họ Mycenaceae: Mycena galericulata

Họ Auriculariaceae: Auricularia delicate

Họ Hymernochaetaceae: Inonotus substygius, Polystictus didrichsenii

Họ Hygrophoropsidaceaee: Hygrophoropsis aurantiaca

3.1.2. Ngành nấm túi Ascomycota

Họ Xylariaceae: Xylaria polymorpha, X. carpophila, Hypoxylon monticulosum

(CP629), Rosellinia sp. (CP564), Nodulisporium sp. (CP582).

Họ Helotiaceae: Bisporella citrine

Họ Pleosporaceae: Alternaria tenuissima (SP66)

Họ Bionectriaceae: Bionectria sp. (CP587)

Kết quả phân loại bằng sinh học phân tử của một số chủng nấm nghiên cứu được

miêu tả trong phần Phụ lục.

3.2. Khả năng sinh tổng hợp esterase và lựa chọn chủng nấm

Sự sinh tổng hợp feruloyl esterase của 44 chủng nấm lựa chọn được đánh giá qua

khả năng phân giải cơ chất ethyl ferulate (ethyl 4-hydroxy-3-methoxycinnamate) trên đĩa

thạch.

71

Bên cạnh đó, dịch lên men của 44 chủng nấm được ly tâm để loại bỏ sinh khối

cũng và các thành phần tạp cho xác định hoạt tính acetyl esterase (AE) qua khả năng thủy

phân cơ chất p-nitrophenyl acetate. Bảng 3.1 thể hiện kết quả đánh giá hoạt tính feruloyl

esterase và acetyl esterase của các chủng nấm.

Bảng 3.1. Hoạt tính feruloyl esterase và acetyl esterase của các chủng nấm

STT Tên chủng Hoạt tính feruloyl

esterase trên đĩa thạch (đường kính vòng phân

giải - mm)(*)

Hoạt độ enzyme acetyl esterase

(U/L)(*)

Nấm đảm (Basidiomycota)

1 Trametes consors G1 5,5 6,5 2 Trametes gibbosa SH3 10,8 0 3 Ganoderma applanatum CP800 3,2 7,4 4 Coprinus disseminates SH7 10,5 0

5 Tyromyces lacteus CP1 11,2 11,5

6 Trametes insularis CP2 10,8 15,3

7 Trametes palisoti CP3 9,6 7,3

8 Ganoderma oroflavum CP4 11,4 14,8

9 Ganoderma austral CP5 0 0

10 Coriolus unicolor SH1 0 4,6

11 Polystictus didrichsenii CP6 7,0 9,2

12 Campanella junghuhnii SH2 0 19,4

13 Coprinus disseminates SH7 10,3 0

14 Inonotus substygius SH9 0 0

15 Auricularia delicate SH18 2,1 6,3

16 Trametes gibbosa SH3 12,2 14,6

17 Marasmius maximus SH10 0 0

18 Ganoderma komingshegii SH11 0 21,4

19 Ganoderma sp. CP224 12,3 0

72

20 Hygrophoropsis aurantiaca SH19 0 4,7

21 Mycena galericulata. CP227 0 0

22 Nigroporus aratus CP552 0 19,2

23 Hexagonia apiaria CP702 0 0

24 Ganoderma applanatum CP800 3,6 0

25 Trametes consors G1 5,4 5,9

26 Poria versipora HL02 0 7,5

27 Phellinus sp. CP668 0 2,3

28 Bionectria sp. CP587 17,6 25,3

Nấm túi (Ascomycota)

29 Hypoxylon monticulosum CP629 16,1 34,2

30 Cladosporium spories SH01 14,6 19,8

31 Aureobasidium pullulans SH1 18,3 82,6

32 Hypoxylons deustrum SH01 4,3 4,8

33 Xylaria polymorpha A32 10,6 62,1

34 Xylaria polymorpha A34 5,7 50,3

35 Xylaria polymorpha A35 23,0 103,8

36 Morchela elata A30 4,3 2,5

37 Xylaria hypoxylon A38 6,5 9,4

38 Rosellinia sp. 5 7,3

39 Bisporella citrine A5 0 0

40 Nodulisporium sp. 0 6,3

41 Xylaria longipes A3 15 22,7

42 Daldinia concentrica A20 0 0

43 Daldinia vernicosa A31 0 5,6

44 Alternaria tenuissima SP66 25,0 62,5

73

* Hoạt tính sinh tổng hợp feruloyl esterase được xác định thông qua đường kính vòng

phân giải cơ chất ethyl ferulate của các chủng sau 3-5 ngày phát triển trên đĩa thạch.

* Hoạt tính acetyl esterase được xác định bằng phương pháp quang phổ (λ=405 nm;

α405= 2.5 mM-1 cm-1) qua khả năng thủy phân p-nitrophenyl acetate thành sản phẩm p-

nitrophenol. Kết quả biểu thị là giá trị trung bình của 3 thí nghiệm lặp lại.

Hình 3.1. Hoạt tính feruloyl esterase của chủng nấm phân lập Alt. tenuissima SP66

Kết quả sàng lọc hoạt tính cho thấy, enzyme FAE phổ biến ở nhiều loài nấm, đặc

biệt là nấm túi Ascomycota. Theo kết quả ở bảng 3.1, tỉ lệ nấm có hoạt tính feruloyl

esterase thuộc Ascomycota (12/16 loài, tương đương ~75%) cao hơn đáng kể so với các

chủng thuộc Basidiomycota (16/28 chủng, tương đương ~57%). Đường kính vòng phân

giải lớn nhất trên cơ chất ester được xác định được đối với các chủng thuộc ngành

Ascomycota là Alt. tenuissima SP66 (D = 25,0 mm). Hai chủng thuộc Basidiomycota có

khả năng sinh enzyme cao nhất là Bionectria sp. CP587 và Ganoderma sp. CP224 (D =

17,6 mm và 12,3 mm tương ứng).

Do biểu hiện hoạt tính sinh tổng hợp feruloyl esterase cao của nấm Alt. tenuissima

SP66 nên chủng nấm trên được lựa chọn cho những nghiên cứu tiếp theo để xác định các

điều kiện nuôi cấy như thời gian, cơ chất/nguồn carbon, nguồn nitơ, nhiệt độ và pH.

Kết quả trong bảng 3.1 cho thấy, 32/44 chủng nấm biểu hiện hoạt tính sinh tổng

hợp AE, trong đó có 14/16 chủng thuộc ngành Ascomycota và 19/28 chủng thuộc

Basidiomycota. Hoạt tính từ 2,3 U/l đến 103,8 U/l đối với cơ chất p-nitrophenyl acetate.

Một lần nữa chủng phân lập Alt. tenuissima SP66 cho thấy là chủng sinh tổng hợp tiềm

74

năng với hoạt tính AE 62,5 U/l. Trong khi đó hoạt tính cao nhất là chủng nấm túi X.

polymorpha A35 với hoạt tính AE đạt tới 103,8 U/l. Ngoài ra, các chủng sinh tổng hợp

AE mạnh là X. polymorpha A32 (62,1 U/l); Aureobasidium pullulans SH1 (82,6 U/l) và

X. Polymorpha A34 (40,3 U/l). Hoạt tính tương đối cao được thấy ở chủng nấm thuộc

nấm đảm là Bionectria sp. CP587 (25,3 U/l). Nhìn chung, xét theo tỉ lệ những chủng

nấm phân lập, sàng lọc hoạt tính AE trong nghiên cứu này thì số chủng biểu hiện hoạt

tính AE có sự khác biệt đáng kể giữa các loài nấm nghiên cứu thuộc ngành nấm túi

Ascomycota (87% nấm có hoạt tính AE) và ngành nấm đảm Basidiomycota (67%). Tuy

nhiên, hoạt độ enzyme này ở các loài nấm túi cao hơn rất nhiều so với loài nấm đảm

[hoạt độ cao nhất 103,8 U/l (loài X. polymorpha A35) so với 25,3 U/l (Bionectria sp.

CP587).

Như vậy, khi so sánh kết quả đánh giá hoạt tính sinh carbohydrate esterases

(feruloyl esterase và acetyl esterase) có thể nhận thấy sự khác biệt về khả năng sinh tổng

hợp hai enzyme thủy phân này giữa hai ngành nấm nghiên cứu. Theo đó, các loài thuộc

nấm túi Ascomycota cho thấy có khả năng sinh tổng hợp carbohydrate esterases cao hơn

đáng kể so với các loài thuộc nấm đảm Basidiomycota về cả tỷ lệ số loài có hoạt tính và

mức độ hoạt tính enzyme. Đáng chú ý, 3 loài (Alt.tenuissima SP66, X.polymorpha A35,

A.pullulans SH1) biểu hiện hoạt tính carbohydrate esterases cao là đều thuộc ngành nấm

túi Ascomycota. Một số chủng nấm biểu hiện hoạt tính sinh feruloyl esterase tương đối

tốt, như chủng nấm Coprinus disseminates SH7, Ganoderma sp. CP224 nhưng không

biểu hiện hoạt tính sinh acetyl esterase (Bảng 3.1). Đặc biệt trong nghiên cứu này, các

loài nấm thuộc ngành Ascomycota cho thấy có khả năng sinh tổng hợp carbohydrate

esterases cao hơn nhiều so với các loài thuộc ngành Basidiomycota dựa trên cả tỷ lệ số

loài có hoạt tính và mức độ hoạt tính enzyme (hoạt tính feruloyl esterase qua vòng phân

giải cơ chất cao nhất là 25 mm đối với chủng Alt. tenuissima SP66 so với 17,6 mm đối

với chủng Bionectria sp. CP587. Tương tự, hoạt tính acetyl esterase của chủng X.

polymorpha A35 là 103,8 U/l trong khi của chủng Bionectria sp. CP587 là 25,3 U/l).

Đối với chủng A.pullulans SH1 mặc dù hoạt tính AE cao nhưng quá trình tinh sạch tiếp theo cho thấy độ tinh sạch chưa đạt yêu cầu (kết quả không thể hiện ở đây). Do

75

vậy, chủng X.polymorpha A35 và Alt.tenuissima SP66 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo về khả năng sinh tổng hợp acetyl esterase và feruloyl esterase tương ứng. Sau đó các nghiên cứu về tối ưu các điều kiện lên men sinh tổng hợp enzyme, tinh sạch và đặc tính AE và FAE cũng như sử dụng enzyme cho xúc tác chuyển hóa sinh khối lignocellulose sẽ được thực hiện. 3.3. Định danh các chủng phân lập hoạt tính cao

Song song định danh bằng phương pháp hình thái, hai chủng nấm tuyển chọn có hoạt tính cao là Alt.tenuissima SP66 và X.polymorpha A35 được định tên bằng phương pháp sinh học phân tử. 3.3.1. Định danh chủng SP66

Kết quả điện di kiểm tra ADN trên gel agarose 0,9% cho thấy ADN không bị gãy và sạch (D260/OD280 trong khoảng 1,8 đến 2,0). Cặp mồi ITS1/ITS4 đã nhân bản thành công với ở nhiệt độ gắn mồi là 550C. Sản phẩm PCR có kích thước khoảng 550 bp. Chất lượng của sản phẩm PCR được thể hiện khi điện di trên gel agarose 0,9% chỉ có một băng duy nhất, sáng đậm, đủ tiêu chuẩn cho tách đoạn gen nhân để giải mã trình tự (Hình 3.2).

Hình 3.2. (A) Hình ảnh điện di ADN tổng số trên gel agarose 1% và (B) Sản phẩm PCR

của hai chủng nấm (SP66 và A35) Phân tích với cặp mồi ITS1/ITS4 điện di trên gel agarose 1,5%. (M: marker phân tử 1 kb)

Kết quả giải trình tự gen nhân (ITS) với chủng nấm SP66:

Kết quả xác định trình tự vùng gen nhân (ITS) cho ảnh điện di đồ với các đỉnh

huỳnh quang rõ nét, cường độ mạnh và rõ ràng. Sau khi loại bỏ trình tự mồi đã thu được

trình tự nucleotide của chủng nấm ký hiệu SP66 có độ dài là 572 nucleotide:

SP66 A35 M SP66 A35

A B

76

> SP66

GCGGGCTGGACCTCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTG

TCTTTTGGGGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAAA

CATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATTACAAC

TTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATG

CGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGC

ACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTA

CCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACT

CGCCTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGT

CGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCAATTAAGCCTTTTTTTCAACTT

TTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAAG

CGGAGGA

Trình tự nucleotide thu được của mẫu nấm SP66 được kiểm tra tính tương đồng

(similarity) với các trình tự sẵn có trên ngân hàng Genbank bằng công cụ BLAST. Kết

quả tìm kiếm cho thấy trình tự mẫu nấm SP66 tương đồng cao 99% với một số loài trong

chi Alternaria (Alternaria tenuissima JX523613, Alternaria compacta FR846405,

Alternaria tomatophila HE803347,..) thuộc họ Pleosporaceae. Khi so sánh trình tự mẫu

nấm SP66 với các loài trong chi khác thuộc họ Pleosporaceae thì mức độ tương đồng khá

thấp (90%) đối với một số loài trong chi Bipolaris (Bipolaris sacchari AB179836,

Bipolaris tetramera KF753950); Stemphylium (Stemphylium vesicarium JQ988103,

Stemphylium solani JF913269); Curvularia (Curvularia lunata KC462186, Curvularia

australiensis AY923860). Việc so sánh với cơ sở dữ liệu trên Genbank nhằm mục đích

cho một kết quả tham chiếu với nhóm loài tương đồng nhất với trình tự truy vấn.

Mô hình tiến hóa tối ưu theo tiêu chuẩn AICc được xác định cho khối dữ liệu phân

tích là TrN+G. các thông số cơ bản là -lnL = 2820.6282, AIC = 5653.2563, K = 6, freqA

= 0.2305, freqC = 0.2438, freqG = 0.2318, freqT = 0.2938, R(a) [A-C] = 1.0000,

R(b)[A-G] = 1.5207, R(c) [A-T] = 1.0000, R(d) [C-G] = 1.0000, R(e) [C-T] = 2.5482,

R(f) [G-T] = 1.0000, gamma Shape = 0.2442 được sử dụng để xây dựng cây phát sinh

chủng loài.

77

Dựa trên kết quả của BLAST và phương pháp dựng cây phát sinh chủng loài để xác định

tên khoa học cho chủng nấm SP66 (Hình 3.3).

Hình 3.3. Mối quan hệ họ hàng của chủng SP66 với các loài/dưới loài trong cùng chi

Song song với đó chủng nấm SP66 cũng được chụp hình thái bào từ trên kính hiển

vi. Kết quả thể hiện trên hình 3.4.

78

Hình 3.4. Chủng Alt. tenuissima [ký hiệu SP66; (A)] phát triển trên môi trường thạch và

hình thái bào tử [độ phóng đại x100; (B)]

Như vậy, từ kết quả phân loại bằng phương pháp sinh học phân tử và phân tích

hình thái bào tử (Hình 3.4) có thể kết luận mẫu nấm phân lập ký hiệu SP66 là loài nấm

túi Alternaria tenuissima SP66 thuộc họ Pleosporaceae.

3.3.2. Định danh chủng A35

Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch sử dụng làm ADN khuôn cho phản ứng

PCR đọc trình tự. Quá trình xác định trình tự được thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học

trên máy ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Phản ứng

đọc trình tự được thực hiện theo hai chiều bằng phương pháp giải trình tự trực tiếp.

Kết quả xác định trình tự vùng gen nhân (ITS-rADN) cho ảnh điện di đồ với các

đỉnh huỳnh quang rõ nét, cường độ mạnh và rõ ràng (kết quả không chỉ ra ở đây). Sau khi

loại bỏ trình tự mồi thu được trình tự nucleotide của chủng nấm A35 có độ dài là 600

nucleotide.

> A35

GAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCA

TTAAAGAGTTTTATAACTCCCAAACCCATGTGAACATACCGTACGTTGCCTCG

GCAGGCTGCATCTCCCTGTGAGGTCCTACCCTGTAGGATGTTACGCTGTAAGG

CTTAGCGGGAAGATGCATTAAAGCCTGCCGGCGGCCCATTAAACTCTGTTTA

TTTTTGAATTCTGAGGCTATAATAAATAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCT

CTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAA

TTGCAGAATTTAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCACTAGT

A B

79

ATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCCCTGTTG

CTTAGTGTTGGGAGCCTACGGTCAGCGTAGCTCCTCAAATGTAGTGGCGGAG

TTGGTTCACACTCTAGACGTAGTAATTTTTATCTCGCCTGTGAGTTGGACCGG

TCCCTCGCCGTAAAACCCCCAAAAATTTTAAAGGTTGACCTCGGATCAGGTA

GGAATACCCGCTGAACTTAAGCAT

Trình tự thu được từ chủng nấm A35 được kiểm tra tính tương đồng (similarity)

với các trình tự sẵn có trên ngân hàng Genbank bằng công cụ BLAST. Kết quả tìm kiếm

cho thấy trình tự mẫu nấm A35 tương đồng cao 99% với loài trong Xylaria polymorpha

FN689809). Tuy nhiên khi so sánh trình tự mẫu nấm A35 với các loài trong chi Xylaria

thì mức độ tương đồng khá thấp: Xylaria schweinitzii JX256828 (96%); Xylaria scruposa

KP133498 (92%); Xylaria grammica JQ341087 (90%); Xylaria laevis GU324746 (89%).

Việc so sánh với cơ sở dữ liệu trên Genbank nhằm mục đích cho một kết quả tham chiếu

với nhóm loài tương đồng nhất với trình tự truy vấn. Dựa trên kết quả BLAST không thể

kết luận chính xác về loài. Với những trường hợp BLAST có độ bao phủ và tương đồng

cao (99%) cũng không thể suy ngược lại tên loài bởi kết quả BLAST chỉ hiển thị trình tự

tương đồng nhất mà trên Genbank hiện có.

80

Hình 3.5. Mối quan hệ họ hàng của chủng A35 với các loài/thứ trong cùng chi

Dựa trên kết quả của BLAST và sử dụng phương pháp dựng cây phát sinh chủng

loại (Hình 3.5) đã xác định được tên khoa học cho chủng nấm A35 là Xylaria

polymorpha A35 thuộc họ Xylariaceae.

81

3.4. Nghiên cứu sinh tổng hợp esterase

3.4.1. Nghiên cứu sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm X. polymorpha A35

Thời gian lên men thích hợp trên môi trường rắn: Để thu được lượng dịch lên men có hoạt tính cao đủ lớn cho các nghiên cứu tiếp,

chủng X. polymorpha A35 được nghiên cứu lên men rắn với quy mô 2-3 kg/mẻ ở 230C. Vật liệu sử dụng là sinh khối lignocellulose (rơm) dùng làm cơ chất lên men rắn thu enzyme AE.

Kết quả thể hiện trên hình 3.6 cho thấy sinh tổng hợp enzyme bắt đầu ngay sau ngày thứ 5 với hoạt tính AE tương ứng là 88±7 mU/g (đơn vị hoạt tính trên mỗi gram cơ chất). Hoạt tính enzyme cao nhất (1039±12 mU/g) thu được sau 10 ngày nuôi cấy nấm. Ở thời gian nuôi cấy tiếp theo hoạt tính enzyme giảm đáng kể (giảm 20-40% so với hoạt tính cao nhất). Như vậy, để thu được enzyme với hoạt tính cao quá trình lên men có thể kết thúc trong khoảng 10 ngày đến 2 tuần nuôi cấy. pH môi trường có sự thay đổi không đáng kể từ pH trung tính ban đầu đến axit yếu (pH 6,2) sau 25 ngày nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu động học này cho khởi đầu sinh tổng hợp AE và FAE bởi nấm X. polymorpha A35 xảy ra đồng thời nhưng thời điểm cho hoạt tính cao nhất rất khác nhau. Theo đó, nấm X. polymorpha A35 biểu hiện hoạt tính AE trước (ngay sau 10 ngày nuôi cấy) so với FAE (sau 25 ngày).

Hình 3.6. Động học sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm X. polymorpha A35

trên môi trường rắn (●) Hoạt tính XpoAE (mU/g); (---): pH môi trường. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần

thể hiện độ lệch chuẩn (┴).

82

Thời gian lên men thích hợp trên môi trường lỏng:

Chủng X. polymorpha A35 do biểu hiện hoạt tính acetyl esterase trên môi trường

lên men rắn nên cũng được lựa chọn để xác định khả năng lên men trên môi trường lỏng

để khảo sát các điều kiện khác như: thời gian, cơ chất/nguồn carbon, nhiệt độ và pH

nhằm xác định điều kiện tối thích cho sự phát triển cũng như khả năng sinh enzyme của

chủng nấm túi này.

Nguồn carbohydrate có ảnh hưởng rất khác nhau đến sự sinh tổng hợp acetyl

esterase và feruloyl esterase bởi nấm thuộc ngành Ascomycota trong môi trường nuôi cấy

lỏng. Vì vậy, hoạt tính của acetyl esterase trên các nguồn cơ chất khác nhau đã được theo

dõi và so sánh, từ đó tìm ra nguồn cơ chất thích hợp nhất để tổng hợp enzyme.

Chủng X. polymorpha A35 được nuôi cấy ở điều kiện lắc 200 v/ph trong 28 ngày

ở 23-25oC trong môi trường lên men dịch thể bổ sung các cơ chất khác nhau. Cụ thể, hai

nguồn cơ chất rơm và cà chua được sử dụng trong quá trình lên men.

Sau mỗi 3 ngày, dịch enzyme được thu để xác định hoạt tính acetyl esterase qua

khả năng thủy phân p-nitrophenyl acetate.

Hình 3.7. Sự phát triển của nấm X. polymorpha A35 trên môi trường lỏng ở ngày thứ 10

Hình ảnh lên men chủng X. polymorpha A35 ở hình 3.7 cho thấy khả năng sinh

tổng hợp acetyl esterase mạnh trên môi trường bổ sung các cơ chất như cà chua (CC) và

rơm (R). Hoạt tính enzyme trong thời gian nuôi cấy (25 ngày) cao nhất lên đến 109,8 U/l

(trên môi trường cơ chất là rơm) tại ngày nuôi thứ 10 sau đó hoạt tính giảm dần theo thời

83

gian, tại ngày nuôi cấy thứ 25 hoạt tính enzyme còn 37,9 U/l. Nguồn cacbon khác nhau

ảnh hưởng lớn đến hoạt tính acetyl esterase của chủng X. polymorpha A35 theo đó hoạt

tính acetyl esterase cao nhất trên cơ chất cà chua là 75,9 U/l tại ngày nuôi thứ 5 sau đó

giảm dần và ổn định trong các ngày nuôi cấy tiếp theo với hoạt tính dao động trong

khoảng 60 U/l. Giá trị pH môi trường với mỗi cơ chất dao động khác nhau với cơ chất là

rơm với pH dao động từ pH 6 đến pH 7.5, môi trường với cơ chất là cà chua pH dao động

từ pH 5,5 đến pH 7. Kết quả này thấy rằng, chủng X. polymorpha A35 thích hợp với

nguồn cơ chất rơm sau 10 ngày nuôi cấy cho hoạt tính acetyl esterase cao nhất (109,8

U/l).

Hình 3.8. Động học sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm X. polymorpha A35 trên các

môi trường có bổ sung cơ chất

Cà chua (CC) và Rơm (R). pH: Cà chua: - -, Rơm: - ▪ -; Acetyl esterase: Cà chua - -,

Rơm -●-

Acetyl esterase là enzyme thủy phân xúc tác giải phóng nhóm acetyl từ các

polysaccharit acetyl hóa như pectin hay xylan. Enzyme này từ một số nấm túi

(ascomycetes) khác đã được miêu tả như Trichoderma reesei [126], A. niger [127], và

Fusarium oxysporum [59]. Ngoài ra, enzyme này từ một số loài nấm đảm

(basidiomycetes) cũng đã được nghiên cứu [128] công bố khả năng sinh acetyl esterase từ

nấm mục gỗ Coriolus versicolor trên môi trường có cơ chất mùn gỗ. Thời gian lên men

để sinh tổng hợp acetyl esterase của chủng này lâu hơn nhiều so với chủng Cladosporium

Thời gian (ngày)

84

spories SH01 và chủng X. polymorpha A35 (sinh enzyme mạnh sau 9 và 10 ngày nuôi

cấy so với 6 tuần ở chủng C. versicolor). Theo Basaran chủng Candida guilliermondii

sinh tổng hợp hoạt tính AE cao nhất 0.85U/mg sau 60 giờ lên men [129].

Những kết quả về hoạt tính acetyl esterase của chủng nấm X. polymorpha A35

trong nghiên cứu đã đăng trên tạp chí J. Korean Soci. Appl. Biolog. Chem (2015).

Như vậy, kết quả nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm X.

polymorpha A35 cho thấy đây là chủng rất tiềm năng với hoạt tính enzyme cao và thời

gian lên men sinh tổng hợp ngắn.

Nguồn nitơ thích hợp:

Cùng với nguồn cacbon, nitơ là một trong những yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng rất

lớn đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp acetyl esterase của nấm trong điều kiện

lên men lỏng. Do vậy, mẫu thí nghiệm sử dụng môi trường bổ sung các nguồn nitơ khác

nhau như: KNO3, (NH4)2SO4, NaNO3, pepton được bổ sung vào môi trường, trong khi

đó, mẫu đối chứng sử dụng môi trường không có các thành phần cung cấp nguồn nitơ

như trên. Nấm được nuôi cấy ở các điều kiện thích hợp sử dụng cơ chất là rơm nghiền

nhỏ (nguồn carbon) sau 10 ngày nuôi cấy.

Hình 3.9. Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau bởi nấm X. polymorpha A35

102.789.70 87.3

117.4

67.4

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

120.0

140.0

KNO3 (NH4)2SO4 NaNO3 Pepton Đ/C

Sinh

khố

i (g/

l)

Hoạ

t tín

h a

cety

l est

eras

e (U

L-1

)

Ảnh hưởng nguồn nitơ

Hoạt tính acetyl esterase (UL-1) Sinh khối (g/l)

85

Các nguồn nitơ khác nhau ảnh hưởng khá lớn lên khả năng sinh tổng hợp enzyme

của chủng nấm này. Thể hiện, nguồn nitơ từ KNO3, (NH4)2SO4, NaNO3 và pepton hoạt

độ enzyme tăng tương ứng là 87,3 đến 117,4 U/l so với đối chứng là 67,4 U/l. Riêng

nguồn nitơ từ pepton năng suất sinh tổng hợp acetyl esterase cao nhất (117,4 U/l) (Hình

3.9). Mặt khác với nguồn nitơ từ pepton và NaNO3 dùng cho lên men chủng X.

polymorpha A35 thu được sinh khối tương đương nhau (1,54 so với 1,5 g/L). Theo

nghiên cứu của Atta chủng nấm Penicillium notatum NRRL-1249 sinh tổng hợp enzyme

AE tốt nhất (760U/g) khi sử dụng nguồn nitơ từ urea [130]. Theo Degrassi Chủng B.

pumilus hoạt tính cao 0.66 U/mg sử dụng nguồn nitơ từ bột ngô [131].

Nhiệt độ lên men thích hợp: Để xác định nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển sinh khối và tổng hợp enzyme

acetyl esterase của chủng X. polymorpha A35. Thành phần môi trường nuôi cấy trên

được bổ sung nguồn cơ chất rơm, sử dụng pepton như nguồn cung cấp nitơ, pH được

điều chỉnh về 6,0. Nấm được nuôi cấy dưới điều kiện lắc 200 v/ph trong dải nhiệt độ khác

nhau: 23oC, 25oC, 28oC, 30oC và 37oC.

Hình 3. 10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm

X. polymorpha A35 trên môi trường lỏng Chủng X. polymorpha A35 hoạt tính acetyl esterase đạt cực đại 122,5 U/l tại 250C

và thấp nhất 67,9 U/l tại 370C (Hình 3.10). Trong khi đó, sinh khối thu được cao nhất tại

87.9

122.50 119.3

93.7

67.9

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

120.0

140.0

23 25 28 30 37

Sinh

khố

i (g/

l)

Hoạ

t tín

h a

cety

l est

eras

e (U

L-1

)

Nhiệt độ (0C)

Hoạt tính acetyl esterase (UL-1) Sinh khối (g/l)

86

300C là 5,0 g/l và thấp nhất 2,4 g/l tại 370C. Điều này có nghĩa nhiệt độ tối ưu cho sự sinh

tổng hợp acetyl esterase ngoại bào của chủng nấm X. polymorpha A35 tại 250C. Theo

Koseki nhiệt độ lên men thích hợp với chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp acetyl

esterase cao nhất là 400C [132].

pH thích hợp:

Hình 3.11. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm

X. polymorpha A35 trên môi trường lỏng

Kết quả hình 3.11 thể hiện, chủng nấm X. polymorpha A35 đều có khả năng sinh

trưởng phát triển trong khoảng pH từ 5 đến 8. Tuy nhiên, hoạt tính acetyl esterase và sinh

khối thu được đều giảm khi pH tại môi trường axit hay bazơ. Giá trị pH 7 thích hợp nhất,

khi đó hoạt tính acetyl esterase của chủng X. polymorpha A35 cao nhất đạt 135,4 U/l và

thấp nhất là 65,7 U/l tại pH 5. Theo nghiên cứu của Degrassi chủng Bacillus pumilis sinh

tổng hợp acetyl esterase cao nhất tại pH 8 [131]. Như vậy, pH 7 là thích hợp nhất để cho

chủng nấm nghiêm cứu sinh tổng hợp enzyme cao.

3.4.2. Nghiên cứu sinh tổng hợp feruloyl esterase bởi nấm Alt. tenuissima SP66

Thời gian và cơ chất thích hợp:

Kết quả trình bày ở hình 3.12-A cho thấy chủng Alt. tenuissima SP66 được nuôi

cấy trên môi trường cà chua (CC), khoai tây (KT), đậu tương (ĐT) cũng như môi trường

65.7

98.70

122.1135.4

102.3

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

120.0

140.0

160.0

5 5.5 6 7 8

Sinh

khố

i (g/

l)

Hoạ

t tín

h a

cety

l est

eras

e (U

L-1

)

Giá trị pH

Hoạt tính acetyl esterase (UL-1) Sinh khối (g/l)

87

cơ chất giàu lignocellulose như bã ngô (BN) rơm (RR) và mùn gỗ (MG). Nhìn chung

chủng Alt. tenuissima SP66 đều sinh tổng hợp feruloyl esterase mạnh với các môi trường

trên. Hoạt tính enzyme cao nhất trong thời gian nuôi cấy là từ 198,6 U/l (trên môi trường

khoai tây) đến 564,6 U/l (trên môi trường cơ chất rơm). Trong các môi trường này sự

sinh tổng hợp enzyme của nấm bắt đầu ngay sau 3 ngày nuôi cấy, sinh tổng hợp feruloyl

esterase mạnh sau từ ngày thứ 9 và suy giảm ở ngày thứ 21 (Hình 3.12-A). Hoạt tính

enzyme cao nhất thu được sau ngày nuôi cấy thứ 12 đối với cơ chất rơm và bã ngô, trong

khi ở môi trường có cơ chất khoai tây, mùn gỗ và cà chua ở ngày 15 và môi trường đậu

tương ở ngày 9 (Hình 3.12-B). Do vậy, rơm là nguồn cơ chất thích hợp cho sự sinh tổng

hợp feruloyl esterase ở ngày nuôi cấy thứ 12.

Hình 3.12. Động học sinh tổng hợp feruloyl esterase (A) và hoạt tính enzyme cao nhất (B) trên các môi trường khác nhau bởi nấm Alt. tenuissima SP66

CC: Cà chua, BN: bã ngô, ĐT: đậu tương, RR: rơm, KT: khoai tây, MG: mùn gỗ

Đa số các nguồn cacbon khảo sát đều làm tăng năng suất sinh tổng hợp

feruloyl esterase của chủng nấm. Điều này được giải thích là do trong các nguồn cacbon,

cellulose được tổng hợp bởi các đường đơn liên kết với nhau bằng các glycoside, để có

nguồn đường cung cấp cho quá trình trao đổi năng lượng nấm phải sinh tổng hợp

feruloyl esterase cao để thủy phân cơ chất trong môi trường lên men. Do đó, đa số các

88

nguồn cacbon có vai trò làm tăng năng suất sinh tổng hợp feruloyl esterase và rơm lúa là

nguồn cơ chất thích hợp cho sự sinh tổng hợp feruloyl esterase của hai chủng nấm trên.

Nguồn nitơ thích hợp:

Chủng nấm Alt. tenuissima SP66 được lên men trong môi trường có bổ sung các

nguồn nitơ khác nhau. Kết quả cho thấy, khả năng sinh tổng hợp feruloyl esterase của

mỗi chủng nấm là khác nhau và phụ thuộc khác nhau vào nguồn nitơ. Các nguồn

nitơ ảnh hưởng khá lớn lên khả năng sinh tổng hợp enzyme của chủng nấm này. Thể

hiện, nguồn nitơ từ KNO3, (NH4)2SO4 và NaNO3 hoạt độ enzyme tăng tương ứng là 1,52;

2,07 và 1,63 lần so với đối chứng. Riêng nguồn nitơ từ pepton năng suất sinh tổng hợp

feruloyl esterase tăng cao nhất (2,8 lần) (Hình 3.13).

So sánh khả năng sinh tổng hợp enzyme từ các nguồn nitơ khác nhau của chủng

nấm nghiên cứu nhận thấy chúng đều thích hợp với nguồn nitơ hữu cơ từ pepton hơn so

với các nguồn còn lại. Mặt khác, sử dụng nguồn nitơ từ pepton để lên men chủng Alt.

tenuissima SP66 thu được sinh khối cao nhất (1,7 g/l).

Theo nghiên cứu của Shiyi Ou và cộng sự (2011) [133] khả năng sinh tổng hợp

feruloyl esterase của nấm Aspergillus niger phụ thuộc khác nhau vào nguồn nitơ. Theo

đó, Chủng nấm Aspergillus niger sinh tổng hợp feruloyl esterase từ nguồn (NH4)2SO4

(6,23 mU/g) cao hơn so với KNO3 (4,84 mU/g) trên môi trường rắn. Do vậy, peptone là

nguồn nitơ thích hợp đối với chủng nấm trên.

89

Hình 3.13. Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau bởi nấm Alt. tenuissima SP66

Nhiệt độ lên men thích hợp:

Để xác định nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển sinh khối và sinh tổng hợp

feruloyl esterase của chủng nấm Alt. tenuissima SP66. Môi trường nuôi cấy được bổ sung

nguồn cơ chất rơm, nguồn nitơ pepton, pH được điều chỉnh 6,5. Nấm được nuôi cấy dưới

điều kiện lắc 200 v/ph trong dải nhiệt độ khác nhau: 23, 25, 28, 30 và 370C, thời gian lên

men 12 ngày.

Hoạt tính feruloyl esterase của chủng Alt. tenuissima SP66 trong dải nhiệt độ từ

230C đến 370C như sau: Tại 250C hoạt tính feruloyl esterase cao nhất đạt 989,5 U/l và

thấp nhất là 143,2 U/l, tại 370C (Hình 3.14). Tuy nhiên, sinh khối thu được cao nhất là

4,6 g/l tại 280C và thấp nhất là 2,1 g/l tại 370C.

323

434

342

589

209.4

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0

100

200

300

400

500

600

700

KNO3 (NH4)2SO4 NaNO3 Pepton Đ/C

Sinh

khố

i (g/

l)

Hoạ

t tín

h fe

rulo

yl e

ster

ase

(UL

-1)

Ảnh hưởng nguồn nitơ

Hoạt tính feruloyl esterase (UL-1) Sinh khối (g/l)

90

Hình 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh tổng hợp feruloyl esterase bởi nấm

Alt. tenuissima SP66 trên môi trường lỏng

Năm 2002 Asther và cộng sự đã xác định được hoạt tính feruloyl esterase từ

Aspergillus niger I-1472 trong điều kiện lên men lỏng, hoạt độ enzyme cao nhất tại 25°C

và khi nhiệt độ tăng lên 38°C thì hoạt tính giảm còn 50%, khi tăng nhiệt độ lên 45°C thì

hoạt độ còn 15% sau 8 ngày nuôi cấy [134].

Theo Donaghy và cộng sự (1995) nghiên cứu trên hai chủng Penicillium

expansum và Penicillium brevicompactum nhiệt độ tối ưu để tổng hợp feruloyl esterase là

25-30°C, chủng Aspergillus niger là 40°C [135].

Nhiệt độ phản ứng ảnh hưởng mạnh đến hoạt tính xúc tác của enzyme, mỗi

enzyme có một khoảng nhiệt độ phản ứng thích hợp. Trong khoảng giới hạn nhiệt độ

chưa làm biến tính enzyme. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng quá giới hạn thì hoạt tính

enzyme lại giảm. Nguyên nhân có thể khi nhiệt độ tăng cao đã làm đứt gẫy một số liên

kết yếu trong phân tử enzyme, làm thay đổi cấu trúc của phân tử này, đặc biệt là cấu

trúc trung tâm hoạt động của enzyme.

pH thích hợp:

Để xác định pH thích hợp, phản ứng được thực hiện trong đệm potassium

phosphate pH 5-8. Chủng Alt. tenuissima SP66 có khả năng sinh trưởng phát triển trong

615.0

989.50

856

432.0

143.2

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

0.0

200.0

400.0

600.0

800.0

1000.0

1200.0

23 25 28 30 37

Sinh

khố

i (g/

l)

Hoạ

t tín

h fe

rulo

yl e

ster

ase

(UL

-1)

Nhiệt độ (0C)

Hoạt tính feruloyl esterase (UL-1) Sinh khối (g/l)

91

dải pH từ 5 đến 8, tuy nhiên khả năng sinh feruloyl esterase và sinh khối của chúng đều

giảm khi pH môi trường là axít hay bazơ. Giá trị pH thích hợp nhất của hai chủng là pH

7.

pH môi trường lên men ảnh hưởng tới sinh tổng hợp enzyme. Ở pH 7, chủng nấm

trên sinh tổng hợp feruloyl esterase cao nhất đạt 1154,4 U/l và thấp nhất đạt 254,3 U/l tại

pH 5 sau 12 ngày lên men. Đồng thời tại pH 7 cho sinh khối cao nhất đạt 4,6 g/l (Hình

3.15). Do pH môi trường ảnh hưởng đến độ bền của enzyme nên việc lựa chọn đệm pH

thích hợp là rất quan trọng. Có những loại enzyme bền trong môi trường axít; trung tính

và kiềm. Như vậy, chủng nấm trên sinh feruloyl esterase cao nhất ở pH 7.

Hình 3.15. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh tổng hợp feruloyl esterase bởi nấm

Alt. tenuissima SP66 trên môi trường lỏng

3.5. Tinh sạch enzyme từ môi trường nuôi cấy nấm

3.5.1. Tinh sạch và đặc tính acetyl esterase bởi nấm X. polymorpha A35

Sau 3 tupharaseặc tính tịau 3 tupharaseặc tính trường nuôi cấhau 3 tupsiêu ltupharaseặc tính trườn-off). Sau đó, acetyl esterase bởi nấm X. polymorpha A35 (XpoAE) biểu hiện hoạt tính đối với cơ chất p-nitrophenyl acetate được tinh sạch bằng sắc ký lỏng. Bước đầu tiên của quá trình rửa giải protein được thực hiện qua cột sắc ký trao đổi anion DEAE Sepharose và kết quả đã thu được 3 phân đoạn hoạt tính enzyme XpoAE (ký hiệu phân đoạn I, II và III). Tổng thể tích rửa giải của phân đoạn hoạt tính

254.3

432.70

893

1154.41093.0

0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0

0.0

200.0

400.0

600.0

800.0

1000.0

1200.0

1400.0

5 5.5 6 7 8

Sinh

khố

i (g/

l)

Hoạ

t tín

h fe

rulo

yles

tera

se (U

L-1

)

Giá trị pH

Hoạt tính feruloyl esterase (UL-1) Sinh khối (g/l)

92

enzyme cao nhất (phân đoạn III) được nạp tiếp lên cột SuperdexTM 75. Sau bước sắc ký lọc gel này, một phân đoạn hoạt tính enzyme XpoAE được thu (Hình 3.16).

Hình 3.16. Tinh sạch enzyme XpoAE từ X. polymorpha A35 qua các bước sắc ký lỏng (A) sắc ký trao đổi anion DEAE Sepharose và (B) sắc ký lọc gel SuperdexTM 75; (─) độ hấp thụ ở λ=280 nm và (●) hoạt tính XpoAE trên cơ chất p-nitrophenyl acetate

Sau quá trình tinh sạch đã thu được lượng protein enzyme tinh sạch là 20,6 mg, tương đương 27 U và hiệu suất 26,8 % với độ tinh sạch 18,3 lần. Phân đoạn enzyme tinh sạch này được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo về đặc tính protein enzyme cũng như nghiên cứu chuyển hóa in vitro vật liệu giàu lignocellulose (Bảng 3.2).

0 50 100 150Elutionsvolumen (ml)

0

450

900

1350

1800

2250

2700

Abs

orpt

ion

(280

nm

)

0

1

2

3

4

5

Akt

ivitä

t (U

ml-1

)

0

0.2

0.4

0.6

NaC

l (M

)

III

II I

A

Hoạ

t tín

h Xp

oAE

(U) m

l-1)

Thể tích rửa giải (ml)

Độ

hấp

thụ

(280

nm

)

0 50 100 150Elutionsvolumen (ml)

0

700

1400

2100

2800

Abs

orpt

ion

(280

nm

)

0

0.4

0.8

1.2

1.6

Akt

ivitä

t (U

ml-1

)

B

Activ

ity (U

ml-1

) Elution volume (ml) Thể tích rửa giải (ml)

Hoạ

t tín

h Xp

oAE

(U) m

l-1)

Độ

hấp

thụ

(280

nm

)

93

Bảng 3.2. Tinh sạch enzyme hoạt tính acetyl esterase (XpoAE)

Các bước tinh sạch

Protein

tổng

(mg)

Hoạt tính

tổng

(U)

Hoạt tính

riêng

(U mg-1)

Hiệu

suất

(%)

Độ tinh

sạch

(lần)

Dịch chiết thô 1408,0 1009 0.7 100 1,0

Siêu lọc 30-10 kDa 872,1 944 1.1 93,6 1,5

DEAE Sepharose

(phân đoạn III)

86,0 432 5.0 42,8 7,0

SuperdexTM 75 20,6 270 13.1 26,8 18,3

Đặc tính hóa-lý của XpoAE: Điện di SDS-PAGE của phân đoạn III qua các bước tinh

sạch ở trên cho thấy vạch protein XpoAE sau khi nhộm với Colloidal Blue Staining Kit

với trọng lượng phân tử MW = 44 kDa. Trong khi đó điện di điểm đẳng điện IEF cho thấy

2 vạch protein gần kề có giá trị pI lần lượt là 3,5 và 3,6 (Hình 3.17). Đặc tính hóa-lý của

XpoAE tương ứng với đặc tính của các AE đã công bố (34-56 kDa [136].

Hình 3.17. Protein tinh sạch (1,3) biểu hiện hoạt tính acetyl esterase (XpoAE) trên gel điện di SDS-PAGE (A) và IEF (B); (2,4) protein marker

Nhiệt độ và pH tối ưu: Nhiệt độ tối ưu của phản ứng giữa enzyme XpoAE tinh sạch và cơ chất p-

nitrophenyl acetate được tiến hành trong khoảng nhiệt độ từ 35-700C. Kết quả cho thấy hoạt tính XpoAE tăng dần từ 40% ở nhiệt độ 350C lên cực đại ở 420C (100%). Sau khi

A B

94

tăng nhiệt độ thì hoạt tính của enzyme giảm dần chỉ còn 51% ở 610C (Hình 3.18-B). Giá trị pH xác định trong khoảng từ 5,0-5,5. Hoạt tính tương đối giảm dần từ 100% ở pH 6,5 xuống 57% ở pH 7.0 (Hình 3.18-A).

Hình 3.18. Ảnh hưởng của pH (A) và nhiệt độ (B) đến hoạt tính của XpoAE tinh sạch từ nấm X. polymorpha A35

Hoạt tính tương đối được xác định ở nhiệt độ từ 35-70°C và giá trị pH từ 4-7. Tất cả các

thí nghiệm được thực hiện bằng ba lần, độ lệch chuẩn (SD) <5%.

Độ bền nhiệt và pH của enzyme XpoAE:

Enzyme tương đối bền ở nhiệt độ 400C sau 3 giờ ủ, sau đó giảm hơn 50% hoạt

tính khi ủ thời gian 4 giờ và lâu hơn. Hoạt tính của enzyme giảm nhanh ở 600C và mất

hầu hết hoạt tính sau 1 giờ ủ ở nhiệt độ này. Enzyme tinh sạch cho thấy bền hoạt tính ở

pH 5,0 nhưng mất trên 90% hoạt tính trong thời gian ủ 1 giờ dưới điều kiện axít mạnh

(pH 3; Hình 3.19). Độ bền nhiệt và pH của XpoAE tương tự với enzyme AE tinh sạch từ

loài nấm tiếp hợp Absidia corymbifera [137]. Trong khi đó, enzyme AE từ nấm Candida

guilliermondii [129] và A. nidulans biểu hiện trong Pichia pastoris [49] bền ở nhiệt độ

tới 600C. Năm 2006, Wong D.W và cộng sự [39] đã xác định được XpoAE tinh sạch từ

chủng nấm đảm Cladosporium spories giữ được 50% hoạt tính tại 700C và 750C sau 15

giờ và 22 giờ xử lý. Enzyme XpoAE từ Trichoderma sp. có thể chịu được 60 phút ở 50°C

mà không mất hoạt tính. XpoAE tinh sạch từ Aspergillus terreus ổn định ở nhiệt độ 40 và

500C ở pH 3-5, nhưng mất 14,39 và 31% hoạt tính khi xử lý 1 giờ ở 600C trong đệm có

0

20

40

60

80

100

120

4 4,5 5 5,5 6 6,5 7

Hoạ

t tín

h tư

ơng

đối (

%)

Giá trị pH A

0

20

40

60

80

100

120

35 40 42 45 50 60 70

Hoạ

t tín

h tư

ơng

đối (

%)

Nhiệt độ (0C)B

95

pH 3, 4 và 5. Như vậy, XpoAE tinh sạch từ chủng X. polymorpha A35 tương đối bền ở

nhiệt độ 400C và pH 5.

Hình 3.19. Độ bền của enzyme XpoAE tinh sạch bởi nấm X. polymorpha A35 (XpoAE) ở

các điều kiện nhiệt độ (A) và pH (B) khác nhau

(A): ♦ 40 oC, ▲60 oC; (B): ▲ pH 3, ● pH 5, ♦ pH 6 3.5.2. Tinh sạch và đặc tính feruloyl esterase bởi nấm Alt. tenuissima SP66

Dịch enzyme thô từ môi trường nuôi cấy nấm Alt. tenuissima SP66 sau 2 tuần được siêu lọc 10 kDa cut-off, để loại các protein và tạp chất có trọng lượng phân tử nhỏ cũng được loại bỏ. Sau đó, protein biểu hiện hoạt tính feruloyl esterase từ nấm Alt. tenuissima SP66 (AltFAE) đối với cơ chất methyl ferulate được tinh sạch bằng sắc ký lỏng. Bước đầu tiên của quá trình rửa giải protein được thực hiện qua cột sắc ký trao đổi anion DEAE Sepharose. Sau bước sắc ký thứ nhất độ tinh sạch tăng không đáng kể (từ 1,4 lần) nhưng có thể loại phần lớn các chất mầu (có thể là các hợp chất polyphenolic) khỏi protein hoạt tính AltFAE đích. Tổng thể tích rửa giải của phân đoạn hoạt tính enzyme cao nhất được nạp tiếp lên cột SuperdexTM 75. Hiệu quả tinh sạch cao nhất ở bước sắc ký lọc gel này, thể hiện ở độ tinh sạch tăng từ ~12 lên ~30 lần với hiệu suất ~ 44%). Trong khi đó, sử dụng sắc ký trao đổi anion mạnh (Q Sepharose; Hình 3.20) ở bước tiếp theo độ tinh sạch tăng lên 35,8 lần nhưng lượng protein và tổng hoạt tính tương ứng với hiệu suất tinh sạch giảm tới gần ½ (hiệu suất cuối 28,9%; Bảng 3.3). Như vậy, bước tinh sạch cuối cùng cần thiết cho các nghiên cứu cơ bản (yêu cầu độ tinh sạch tối

96

đa), trong nghiên cứu ứng dụng enzyme AltFAE từ nấm Alt. tenuissima SP66 có thể sử dụng ngay sau bước sắc ký lọc gel để đảm bảo hiệu suất thu hồi cao và tiết kiệm thời gian, chi phí.

Hình 3.20. Tinh sạch enzyme AltFAE từ nấm Alt.tenuissima qua cột sắc ký trao đổi anion Q Sepharose®

(●) Hoạt tính AltFAE đối với cơ chất methyl ferulate; (─) protein hấp thụ ở λ=280 nm

Bảng 3.3. Tinh sạch enzyme AltFAE từ dịch lên men nấm Alt. tenuissima SP66

Các bước tinh sạch Protein

tổng (mg)

Hoạt tính tổng (U)

Hoạt tính riêng

(U mg-1)

Hiệu suất (%)

Độ tinh sạch (lần)

Dịch chiết thô 1673,2 523,7 0,3 100 1,0

Siêu lọc 10 kDa 259,5 421,7 1,6 80,5 5,2

DEAE Sepharose 79,1 305,4 3,9 58,3 12,3

SEC SuperdexTM 75 24,1 228,3 9,5 43,6 30,3

Q Sepharose® 13,5 151,2 11,2 28,9 35,8

Đặc tính hóa-lý của AltFAE: Điện di SDS-PAGE sau bước tinh sạch cuối cùng qua cột

Q Sepharose® cho thấy một băng protein biểu hiện hoạt tính AltFAE (cơ chất methyl

ferulate) sau khi nhộm với Colloidal Blue Staining Kit với trọng lượng phân tử MW=30,3

kDa (Hình 3.21).

97

Hình 3.21. Protein tinh sạch (1) biểu hiện hoạt tính AltFAE trên gel điện di SDS-PAGE (A); (2) protein marker

Nhiệt độ và pH tối ưu:

Nhiệt độ enzyme AltFAE được xác định trong khoảng từ 30-800C và pH từ 4,0-

9,0. Hoạt tính tương đối giảm dần từ 100% ở pH 7.0 xuống 84% ở pH 9.0. Enzyme được

tinh sạch ổn định trong suốt 2 giờ ủ ở pH trung hòa với hoạt tính còn lại là 97% ở pH 6.0

và 89% ở pH 8.0. Ngược lại, khi ủ ở môi trường axit (pH 4.0) làm mất hoạt độ enzyme

57% sau 2 giờ ủ. Khi ủ ở 600C làm cho hoạt tính mất hơn 50% trong vòng 2 giờ, trong

khi hơn một nửa hoạt độ ban đầu vẫn được xác định sau 8 giờ ủ ở 400C, khi nhiệt độ tăng

lên đến 700C hoạt tính enzyme giảm chỉ còn 30%. Do vậy, nhiệt độ tối ưu của enzyme

AltFAE là 42°C và pH 7 (Hình 3.22).

Hình 3.22. Ảnh hưởng của nhiệt độ (A) và pH (B) đến hoạt tính enzyme AltFAE từ nấm Alt. tenuissima SP66

98

Nhiệt độ tối ưu của enzyme AltFAE được xác định từ 30-800C và pH từ 4-9. Tất cả các

thí nghiệm được thực hiện bằng ba lần, độ lệch chuẩn (SD) <5%

Độ bền nhiệt và pH của enzyme AltFAE

Hình 3.23. Độ bền nhiệt của enzyme AltFAE từ nấm Alt. tenuissima SP66 ở nhiệt độ khác nhau (A) và giá trị pH (B) phụ thuộc vào thời gian

(A): 25°C (KH: kim cương), 40°C (KH: vòng tròn), 60°C (KH: tam giác); (B): pH 10

(KH: kim cương), pH 8.0 (KH: vòng tròn), pH 7.0 (KH: sao), pH 5.0 (KH: tam giác)

Enzyme tương đối bền ở nhiệt độ 250C và 400C sau 2 giờ ủ, sau đó giảm hơn 10%

hoạt tính sau 4 giờ ủ ở 250C và giảm 35% khi ủ lâu hơn 2 giờ ở 400C. Hoạt tính của

enzyme giảm nhanh ở 60oC và mất hầu hết hoạt tính sau 1 giờ ủ ở nhiệt độ này. Enzyme

tinh sạch cho thấy bền hoạt tính ở môi trường có pH 5 và pH 6 nhưng mất trên 75% hoạt

tính trong thời gian ủ 2 giờ dưới điều kiện môi trường pH 8 (Hình 3.23).

Kết quả phân tích peptide của AltFAE:

Trình tự chuỗi peptide của protein biểu hiện hoạt tính AltFAE từ Alt. tenuissima

SP66 được xác định thành công bằng phổ khối lượng ESI-MS (Hình 3.24 & Bảng 3.4) là

cơ sở phân loại ban đầu và có thể sử dụng dữ liệu cho thiết kế mồi (primer) xác định gen

mã hóa cho protein này. Nội dung này, trong khuôn khổ của luận án chưa thực hiện.

99

Hình 3.24. Dữ liệu phổ ESI-MS/MS các đoạn peptide của enzyme AltFAE tinh sạch từ

nấm Alt. tenuissima SP66

Bảng 3.4. Các đoạn peptide của enzyme AltFAE tinh sạch từ nấm Alt. tenuissima SP66 xác định bằng thủy phân với trypsin và LC-ESI-MS/MS

Peptide* Trọng lượng phân tử (Da)

GAYSLSLR 865,99

GFFLFVEGGR 1128,3

GSSIFGLAPGK 1033,19

GKVALDDLLTQR 1327,75

LNTLETEEWFFK 1556,75

LNTLETEEWFFK 1556,75

*Ký hiệu cho các axít amin theo quy định của IUPAC (International Union of Pure and

Applied Chemistry)

Bảng 3.5 tổng hợp hoạt tính đặc hiệu của hỗn hợp “enzyme cocktail” sử dụng để

chuyển hóa cơ chất giàu lignocellulose.

100

Bảng 3.5. Hoạt tính đặc hiệu của “enzyme cocktail” trong chuyển hóa sinh học

Enzyme Nguồn gốc Hoạt tính đặc hiệu (U/mg)

Nhiệt độ tối ưu (0C)

pH tối ưu

Độ bền nhiệt

Độ bền pH

AltFAE Alternaria tenuissima SP66 11,2 42 7,0 40 5,0

XpoAE Xylaria polymorpha A35 13,1 42 5,0 40 5,0

Cell/Xyl Trichoderma reesei

(AB Enzyme, Germany)

1-1,6 40 5,0 40 -

3.5.3. Quy trình lên men, chiết tách và tinh sạch enzyme esterase từ nấm

3.5.3.1. Acetyl esterase từ nấm X. polymorpha A35

Quy trình lên men sinh tổng hợp và tinh sạch enzyme esterase bao gồm các bước chính sau: Nuôi cấy nấm và sinh tổng hợp enzyme trên môi trường lên men dịch thể (5 L/mẻ): Chủng X. polymorpha A35 được lên men 5 lít/mẻ trong môi trường cơ bản (cho mỗi 1 lít) với thành phần như sau:

MgSO4 0,5 g KH2 PO4 1,5 g Cao nấm men 2,0 g Dịch nguyên tố vi lượng (vết) 1 mL

Môi trường cơ bản có bổ sung nguồn cơ chất rơm, nguồn nitơ là pepton, nhiệt độ 25oC, pH 7 trong điều kiện nuôi lắc 200 v/ph, thời gian lên men 10 ngày. Song song với quá trình lên men lỏng thì chủng nấm trên cũng được lên men rắn sử dụng 2-3 kg rơm khô được ngâm trong nước qua đêm sau đó cho vào các túi plastic chịu nhiệt và khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Sử dụng 2-3 hộp peptri môi trường thạch-malt có khuẩn ty nấm nghiền đồng thể. Tiếp theo, cấy chuyển toàn bộ dịch khuẩn ty vào mỗi túi plastic với cơ chất rơm, toàn bộ quá trình nuôi cấy được thực hiện ở điều kiện vô trùng. Khuẩn ty nấm được ủ ở 230C trong khoảng từ 10 - 14 ngày, sau đó môi trường lên men bề mặt được chiết với nước cất (d.H2O) qua đêm trên máy lắc. Chiết tách dịch enzyme thô bằng siêu lọc:

101

Sau khi nuôi cấy ở các điều kiện thích hợp trên môi trường rắn và lỏng, enzyme sẽ được lọc sơ bộ qua vải thô và giấy lọc (GF6 và RC 55, WhatmanTM, Trung Quốc). Dịch chiết có hoạt tính esterase được loại khuẩn ty nấm và cơ chất bằng ly tâm 5.000-10.000 v/ph và siêu lọc 10 và 30 kDa cut-off (hệ LongerPump K235 với màng UFP 30MW, Amersham BioScience, Westborough, MA, USA) ở 11oC. Tinh sạch protein enzyme bằng sắc ký:

Để thu acetyl esterase tinh sạch từ nấm X. Polymorpha A35 dịch enzyme thô biểu hiện hoạt tính esterase được tinh sạch qua các bước sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel sử dụng cột DEAE Sepharose và SuperdexTM 75.

Bước đầu tiên được thực hiện trên cột trao đổi ion DEAE Sepharose ở pH 4,5 với đệm Na-acetate 50 mM. Sau khi lọc rửa có thể thu được các phân đoạn hoạt tính với lượng 86,0 mg protein hoạt tính AE (43,2 U).

Bước tiếp theo sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel qua cột SuperdexTM 75 ở pH 6,5 với đệm Na-acetate 50 mM và nồng độ NaCl 100 mM, phân đoạn hoạt tính acetyl esterase (đối với cơ chất p-nitrophenyl acetate). Các phân đoạn hoạt tính enzyme được trộn lẫn, cô đặc và thẩm tách qua màng lọc kích thước 10 kDa như trên với đệm Na-acetate 10 mM (pH 6,0) và bảo quản ở -200C. Sau quá trình tinh sạch thu được 20,6 mg protein enzyme/mẻ tương đương hoạt tính enzyme tổng là 270 U.

Protein sau mỗi bước siêu lọc và sắc ký được đo hoạt độ, đánh giá độ tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử bằng điện di SDS-PAGE (Novex Xcell SureLock mini cell; Laemmli 1970) và Native-IEF (Novex IEF gel) (Hình 3.25).

102

Hình 3.25. Quy trình chiết tách và tinh sạch protein enzyme hoạt tính acetyl esterase từ môi trường nuôi cấy nấm X. polymorpha A35

Dịch chiết môi trường lên men X. polymorpha A35

(5 L/mẻ môi trường lỏng và 2-3 kg rắn, protein tổng 1408

Dịch sau ly tâm

- Lọc chân không (Whatman GF6) - Ly tâm 5000 v/ph trong 10 phút

Cặn ly tâm (Loại bỏ)

Siêu lọc 30kDa cut-off (cô đến 1000 ml)

Siêu lọc 10kDa cut-off (872 mg protein)

Sắc ký DEAE Sepharose

Sắc ký lọc gel SuperdexTM 75

Xác

địn

h ho

ạt đ

ộ en

zym

e; đ

ịnh

lượn

g pr

otei

n

Điệ

n di

SD

S-PA

GE

và IE

F

Acetyl esterase tinh sạch (20,6 mg

protein, 270 U enzyme)

103

3.5.3.2. Feruloyl esterase từ nấm Alt. tenuissima SP66

Quy trình lên men sinh tổng hợp và tinh sạch enzyme esterase bao gồm các bước

chính sau:

Nuôi cấy nấm và sinh tổng hợp enzyme trên môi trường lên men dịch thể (5 L/mẻ):

Nấm Alt. tenuissima SP66 được nuôi cấy trên môi trường cơ bản sau đó, bổ sung

nguồn cơ chất rơm, thời gian nuôi cấy 12 ngày, nhiệt độ 25oC, pH 7 trong các bình

Erlenmeyer 1000 ml hoặc trên thiết bị lên men AmAr (Mumbai, Ấn Độ) ở điều kiện có

sục khí và lắc liên tục 200 v/ph.

Chiết tách dịch enzyme thô bằng siêu lọc:

Sau khi nuôi cấy ở các điều kiện tối ưu, enzyme sẽ được lọc sơ bộ qua vải thô và

giấy lọc (GF6 và RC 55, WhatmanTM, Trung Quốc). Dịch chiết có hoạt tính enzyme

esterase được loại khuẩn ty nấm và cơ chất bằng ly tâm 5.000-10.000 v/ph và siêu lọc 10

và 30 kDa cut-off (hệ LongerPump K235 với màng UFP 30MW, Amersham BioScience,

Westborough, MA, USA) ở 110C.

Tinh sạch protein enzyme bằng sắc ký:

Dịch enzyme thô biểu hiện hoạt tính esterase được tinh sạch qua các bước sắc ký

trao đổi ion và sắc ký lọc gel sử dụng cột DEAE Sepharose, Q sepharose và SuperdexTM

75 (GE Healthcare, Freiburg, CHLB Đức) với đệm rửa giải Na-acetate (10mM; pH 4,5),

NaCl từ 0-1 M và cột Superdex 75, đệm Na-acetate (50mM; pH 6,5). Protein rửa giải

được xác định trực tiếp sử dụng đầu dò ở λ=280nm hoặc bằng phương pháp so màu theo

quy trình của Bradforf (1976) ở λ=590/450nm [116]. Các phân đoạn có hoạt tính esterase

được gộp chung, cô loại bớt dịch và hòa lại với đệm Na-acetate 10mM, pH 6,0. Mẫu

được lưu giữ ở -200C.

Bước tinh sạch cuối cùng được thực hiện với cột trao đổi anion ở pH 5,0 với đệm

Na-acetate 50 mM. Từ 5L dịch lên men sau quá trình tinh sạch có thể thu được 13,5 mg

protein enzyme FAE/mẻ tương đương hoạt tính enzyme tổng là 151,2 U.

Protein sau mỗi bước siêu lọc và sắc ký được đo hoạt độ, đánh giá độ tinh sạch và

xác định trọng lượng phân tử bằng điện di SDS-PAGE (Novex Xcell SureLock mini cell;

Laemmli 1970) (Hình 3.26).

104

Hình 3.26. Quy trình chiết tách và tinh sạch enzyme hoạt tính feruloyl esterase từ môi trường lên men nấm Alt. tenuissima SP66

Xác

địn

h ho

ạt đ

ộ en

zym

e; đ

ịnh

lượn

g pr

otei

n

Điệ

n di

SD

S-PA

GE

và IE

F

Dịch môi trường lên men Alt.tenuissima SP66

(5 L/mẻ; protein 1673 mg)

Dịch sau ly tâm

- Lọc chân không (Whatman GF6) - Ly tâm 5000 v/ph trong 10 phút

Cặn ly tâm (Loại bỏ) Siêu lọc 10 kDa cut-off

(cô đến 500 ml; 259,5 mg protein)

Sắc ký DEAE Sepharose

Sắc ký lọc gel SuperdexTM

75

Sắc ký Q Sepharose

Feruloyl esterase tinh sạch

(13,5 mg protein; 151,2 U enzyme)

105

3.6. Sàng lọc nguồn cơ chất giàu lignocellulose cho chuyển hóa bằng xúc tác sinh

học

3.6.1. Sàng lọc cơ chất

Tiến hành đánh giá sản phẩm đường khử sau chuyển hóa trên 5 cơ chất là rơm rạ

(RR), bã mía (MIA), bã cà phê (CAF), mùn gỗ (MG), rong túi (RT) bằng hỗn hợp

“enzyme cocktail” (Cell/Xyl = 50 U/gds, AltFAE = 5 U/gds và XpoAE = 5 U/gds) theo

các thí nghiệm khác nhau, phản ứng được ủ trong 24h, ở 400C, sản phẩm chuyển hóa

được xác định bằng sắc ký bản mỏng (TLC).

Kết quả thí nghiệm xác định được đối với cơ chất CAF, MG và RT không xuất

hiện vết chất biểu hiện sự có mặt của các đường đơn. Đối với cơ chất sử dụng rơm rạ và

bã mía, vết chất đường đơn xuất hiện rất rõ (Hình 3.27).

Hình 3.27. Vết chất đường đơn xuất hiện trên bản mỏng Rơm rạ (M1), bã mía (M2), bã cà phê (M3), mùn gỗ (M4) và rong túi (M5). Chất chuẩn là các đường khử có khả năng lên men như: glucose (Rf (Glu) = 0,34), galactose (Rf(Gla)= 0,28), xylose (Rf(Xyl) = 0,48) và mannose (Rf(Man) = 0,325).

Như vậy, nghiên cứu tiếp theo được tập trung trên 2 đối tượng là rơm và bã mía sử

dụng enzyme để chuyển hóa theo các công thức độc lập. Kết quả thể hiện ở CT1 (XpoAE

và cơ chất), CT2 (AltFAE và cơ chất), CT3 (hỗn hợp XpoAE, AltFAE và cơ chất) trên sắc

ký bản mỏng không xuất hiện các vết đường đơn. Ở CT4 (hỗn hợp AltFAE, Cell/Xyl và

cơ chất) và CT5 (hỗn hợp AltFAE, XpoAE, Cell/Xyl và cơ chất) sử dụng cơ chất rơm

xuất hiện vệt chất có Rf lần lượt là 0,34; 0,28 tương ứng với Rf của chất chuẩn glucose và

106

galactose. Đặc biệt, thí nghiệm sử dụng hồn hợp “enzyme cocktail” (XpoAE, AltFAE,

Cell/Xyl) trên sắc ký bản mỏng TLC xuất hiện vết chất đậm có Rf là 0,34 tương ứng Rf

của chất chuẩn glucose, các vết chất mờ hơn có Rf lần lượt là 0,28; 0,32; 0,48 tương ứng

với galactose, mannose, xylose.

Như vậy, sau khi xác định dấu hiệu sự có mặt của các đường đơn trong dung dịch

chuyển hóa bằng đơn và đa enzyme trên sắc ký bản mỏng, bước tiếp theo sẽ xác định

tổng đường khử trong dịch thủy phân bằng phương pháp DNS để đánh giá hiệu quả

chuyển hóa.

3.6.2. Hàm lượng đường khử sau chuyển hóa sinh học

Vật liệu bã mía được lựa chọn nghiên cứu sâu hơn sau khi đã sàng lọc, đánh giá

khả năng chuyển hóa thành các đường đơn bằng enzyme. Phản ứng chuyển hóa các vật

liệu giàu lignocellulose được thực hiện với sự có mặt của các enzyme đơn và hỗn hợp với

2 hoặc 3 enzyme thủy phân bao gồm: Cell/Xyl, XpoAE và AltFAE. Thành phần enzyme

thủy phân bao gồm: acetyl esterase (XpoAE) tinh sạch từ chủng nấm lớn X. polymorpha

A35, hỗn hợp enzyme thủy phân Cell/xyl tinh sạch từ chủng T.reesei của hãng AB

Enzyme (Darmstadt, CHLB Đức) và enzyme feruloyl esterase (AltFAE) tinh sạch từ

chủng Alt. tenuissima SP66. Kết quả thu được, ở công thức chỉ có đơn enzyme AltFAE

hoặc XpoAE, tổng đường khử sinh ra tương ứng là 11,3 mg/g và 5,7 mg/g cơ chất. Đặc

biệt, lượng đường tăng đáng kể khi sử dụng phối hợp tất cả các enzyme và tăng mạnh khi

ủ cơ chất với hỗn hợp hai hay ba enzyme thủy phân. Công thức sử dụng hỗn hợp hai

enzyme CE (AltFAE và XpoAE) lượng đường khử sinh ra tăng lên 18,6 mg/g. Tuy nhiên,

ở các thí nghiệm với sự tham gia của enzyme Cell/Xyl (AltFAE và Cell/Xyl) thì hàm

lượng glucose tăng lên đến 98,5 mg/g. Đặc biệt, hiệu quả phối hợp tấn công của các

enzyme nghiên cứu cũng được chứng minh bởi sự giải phóng nhóm đường hexonse và

pentone (5C và 6C) từ cơ chất bã mía khi có sự tăng lên đáng kể các sản phẩm tạo thành

sau khi ủ với hỗn hợp các enzyme thủy phân (XpoAE, AltFAE và Cell/xyl), khi đó lượng

glucose sinh ra cao nhất đạt 154,7 mg/g (Hình 3.28).

Kết quả này chứng minh cho vai trò của các enzyme liên quan trong quá trình tấn

công mạch liglocellulose bởi nấm, cũng như hiệu quả hoạt động phối hợp của hỗn hợp

107

“enzyme cocktail” xúc tác chuyển hóa các vật liệu giàu liglocellulose để giải phóng các

đường đơn so với thí nghiệm sử dụng các enzyme đơn lẻ.

Hình 3.28. Hàm lượng đường khử tạo thành sau quá trình thủy phân bã mía bằng các

đơn enzyme và “enzyme cocktail” Như vậy, việc sử dụng hỗn hợp “enzyme cocktail” có tác dụng hiệp đồng tốt hơn

so với đơn enzyme trong chuyển hóa lignocellulose giải phóng carbohydrat. Khả năng

xúc tác chuyển hóa vật liệu giàu lignocellulose bởi các carbohydrate esterase khi sử dụng

các enzyme đơn lẻ cũng như phối hợp với các enzyme thủy phân khác (Cell/xyl, XpoAE,

AltFAE) được chứng minh bởi các sản phẩm tạo thành sau phản ứng là các đường khử.

Do vậy, nhằm nâng cao hiệu suất chuyển hóa, trong nghiên cứu tiếp theo bã mía

được sử dụng làm cơ chất cho phản ứng chuyển hóa bằng hỗn hợp “enzyme cocktail”

(Cell/xyl, XpoAE, AltFAE) sử dụng mô hình tối ưu hóa thực nghiệm.

3.7. Tối ưu hóa “enzyme cocktail” bằng mô hình quy hoạch thực nghiệm

Tiến hành các thí nghiệm để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng như: thời gian, nhiệt

độ, pH đến quá trình chuyển hóa bã mía thành đường khử và chọn giá trị lớn nhất của

mỗi thí nghiệm độc lập. Kết quả thí nghiệm thể hiện ở bảng 3.6.

020406080

100120140160180

AltFAE XpoAE Cell/Xyl XpoAE +Cell/Xyl

AltFAE &XpoAE

AltFAE &Cell/Xyl

Cell/Xyl,AltFAE &

XpoAE

Hàm

lượn

g đư

ờng

khử

(mg/

g)

Thành phần đơn enzyme và "enzyme cocktail"

108

Bảng 3.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển hóa

Số TN

Thời gian (h)

pH Nhiệt độ (oC)

Cơ chất bã mía (gram)

Cell/Xyl (ml)

AltFAE ( ml)

XpoAE ( ml)

Tổng đường khử (mg/gram)

1 24 5 40 0,4 0,5 0,3 0,2 170,5

2 36 5 40 0,4 0,5 0,3 0,2 189,3

3 48 5 40 0,4 0,5 0,3 0,2 198,2

4 60 5 40 0,4 0,5 0,3 0,2 201,3

5 72 5 40 0,4 0,5 0,3 0,2 203,4

6 48 4,5 40 0,4 0,5 0,3 0,2 178,4

7 48 5 40 0,4 0,5 0,3 0,2 198,2

8 48 5,5 40 0,4 0,5 0,3 0,2 180,3

9 48 5 35 0,4 0,5 0,3 0,2 160,9

10 48 5 37 0,4 0,5 0,3 0,2 167,4

11 48 5 40 0,4 0,5 0,3 0,2 198,2

12 48 5 42,5 0,4 0,5 0,3 0,2 165,3

13 48 5 45 0,4 0,5 0,3 0,2 134,5

14 48 5 40 0,4 0,5 0,3 0,2 198,2

15 48 5 40 0,6 0,5 0,3 0,2 201,4

16 48 5 40 0,8 0,5 0,3 0,2 176,7

17 48 5 40 0,4 0,5 0,3 0,2 198,2

18 48 5 40 0,4 0,75 0,3 0,2 223,8

19 48 5 40 0,4 1,0 0,3 0,2 225,1

20 48 5 40 0,4 0,5 0,3 0,2 198,2

109

21 48 5 40 0,4 0,5 0,5 0,2 214,1

22 48 5 40 0,4 0,5 0,7 0,2 214,7

23 48 5 40 0,4 0,5 0,3 0,2 198,2

24 48 5 40 0,4 0,5 0,3 0,4 215,5

25 48 5 40 0,4 0,5 0,3 0,6 216,7

Kết quả bảng 3.6 thể hiện, thời gian từ lúc bắt đầu quá trình chuyển hóa đến 24 giờ

(thí nghiệm 1-5), tổng đường khử tạo thành trong khoảng từ 170,5 mg/gram cơ chất. Ở

giai đoạn này, tổng đường khử sau phản ứng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nguồn cơ

chất hay mức độ tấn công khác nhau vào cơ chất của từng enzyme đơn lẻ trong hỗn hợp

“enzyme cocktail”. Giai đoạn đầu, các cấu trúc dễ bị tấn công của cellulose còn nhiều và

không có chất ức chế hoạt tính của enzyme nên enzyme thủy phân (Cell/Xyl, AltFAE và

XpoAE) bắt đầu tiêu thụ cellulose mạnh nên đường khử tạo thành tăng mạnh. Đây là giai

đoạn glucose được sinh ra nhanh và nhiều nhất trong suốt quá trình phản ứng. Từ 24 đến

48 giờ tiếp theo, tốc độ phản ứng giảm dần nên hiệu suất tạo thành đường tăng chậm chỉ

đạt 198,2 mg/gram, do trong giai đoạn này glucose tích tụ trong dung dịch gây ức chế

enzyme và những phần cellulose dễ thủy phân còn ít hoặc đã hết. Mặt khác, hoạt tính

enzyme đã bị giảm nhiều sau một thời gian tiếp xúc với cơ chất và một số enzyme bị nhốt

trong cấu trúc xốp của cellulose.

Thời gian từ 48 đến 72 giờ, tổng đường khử tăng rất ít từ 198,2 – 203,4 mg/gram.

Hiệu suất phản ứng thủy phân không thể diễn ra hoàn toàn hay nói cách khác không thể

thủy phân tất cả cellulose có trong bã mía. Phản ứng thủy phân cellulose là một phản ứng

dị thể, vấn đề tiếp xúc pha đóng một vai trò quan trọng. Ngoài ra, cấu trúc cellulose có

những phần rất khó bị tấn công bởi enzyme, enzyme không thể tấn công vào để thủy

phân phần cơ chất này. Do vậy, thời gian chuyển hóa hiệu quả bã mía là 48 giờ.

Khi tăng nhiệt độ từ 35 lên 400C, tốc độ phản ứng ban đầu tăng (thí nghiệm 9-13)

tổng đường khử tăng từ 160,9 – 198,2 mg/gram. Ở 400C tốc độ chuyển hóa cao nhất do

lượng đường sinh ra lớn nhất. Khi nhiệt độ tiếp tục tăng từ 400C đến 450C, tốc độ phản

110

ứng ban đầu giảm. Do vậy, tổng đường khử sinh ra giảm chỉ còn 134,5 mg/gram. Ảnh

hưởng của nhiệt độ lên tốc độ chuyển hóa rất rõ rệt, khi nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng

tăng và ngược lại. Tuy nhiên, đến ngưỡng nhiệt độ nhất định tốc độ phản ứng sẽ giảm

dần đến mức triệt tiêu. Vì enzyme là protein nên hoạt tính phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ,

khi nhiệt độ tăng quá giới hạn enzyme sẽ bị bất hoạt và mất hoạt tính.

Khi pH tăng từ 4,5 đến 5,0 thì hàm lượng đường sinh ra tăng từ 178,4 đến 198,2

mg/gram (thí nghiệm 6-8), nhưng khi pH tăng từ 5,0 đến 5,5 thì hàm lượng đường sinh ra

lại giảm chỉ còn 180,3 mg/gram. Ảnh hưởng của pH lên quá trình thủy phân là rất lớn,

mỗi enzyme sẽ hoạt động tốt nhất ở một khoảng giá trị pH nhất định. Đối với enzyme

cell/xyl, khoảng pH này là từ 4,5 đến 5, đối với enzyme carbohydrate (AltFAE và

XpoAE) thì khoảng pH thích hợp từ 4,5 – 5,5. Do vậy, ở pH 5,0 hiệu suất chuyển hóa bã

mía thành đường thu được cao nhất.

Sử dụng kế hoạch trực giao bậc 2 Box – Wilson trong phản ứng chuyển hóa bằng

hỗn hợp “enzyme cocktail” với lượng cơ chất bổ sung 10%, (w/v) là mốc đảm bảo khi

hoạt độ của hỗn hợp enzyme (Cell/Xyl, AltFAE và XpoAE) có mặt cao trong phản ứng

(thí nghiệm 15). Do vậy, sau khi khảo sát điều kiện trong phản ứng chuyển hóa bã mía

thành đường đơn bằng “enzyme cocktail” đã xác định được thời gian ủ thích hợp là 48

giờ, ở 400C, pH 5,0 và lượng cơ chất bổ sung 10%. Tiếp theo, tiến hành tối ưu hóa theo

hoạt độ (U) của từng enzyme đơn trong hỗn hợp “enzyme cocktail” tham gia vào quá

trình thủy phân.

Mục đích của quy hoạch thực nghiệm nhằm tìm ra các giá trị tối ưu như: nhiệt độ,

pH, thời gian, lượng cơ chất và hoạt độ enzyme (U) của từng enzyme trong phản ứng

thủy phân dựa trên mô hình thực nghiệm thống kê mô tả tương hợp kết quả thực nghiệm.

Sử dụng kế hoạch trực giao bậc hai Box – Wilson khảo sát ảnh hưởng của hoạt độ

enzyme (U) trong hỗn hợp enzyme thủy phân, sau đó chọn khoảng biến thiên theo thể

tích (E) [Cell/Xyl (E1), AltFAE (E2), XpoAE (E3)] tương ứng với hoạt độ của mỗi

enzyme đơn. Kết quả trực giao được thể hiện trong bảng 3.7 và kế hoạch thực nghiệm ở

bảng 3.8.

111

Bảng 3.7. Kế hoạch trực giao bậc hai Box – Wilson

Mức mã hóa

Enzyme

-1,215 -1 0 +1 +1,215

E1 0,4 0,45 0,7 0,95 1,0

E2 0,1 0,12 0,25 0,38 0,4

E3 0,1 0,14 0,3 0,46 0,5

Bảng 3.8. Kết quả thí nghiệm theo kế hoạch trực giao bậc hai Box – Wilson

STT E1

(ml)

E2

(ml)

E3

(ml)

E1

(ml)

E2

(ml)

E3

(ml)

Tổng đường khử

(mg/gram)

1 0,45 0,12 0,14 - - - 153,6

2 0,95 0,12 0,14 + - - 219,5

3 0,45 0,38 0,14 - + - 160,4

4 0,95 0,38 0,14 + + - 224,2

5 0,45 0,12 0,46 - - + 164,8

6 0,95 0,12 0,46 + - + 226,8

7 0,45 0,38 0,46 - + + 181,7

8 0,95 0,38 0,46 + + + 239,7

9 0,4 0,25 0,3 -1,215 0 0 163,4

10 1 0,25 0,3 +1,215 0 0 227,9

11 0,7 0,1 0,3 0 -1,215 0 208,9

12 0,7 0,4 0,3 0 +1,215 0 211,5

13 0,7 0,25 0,1 0 0 -1,215 206,3

14 0,7 0,25 0,5 0 0 +1,215 212,8

15 0,7 0,25 0,3 0 0 0 210,2

Kết quả thử nghiệm theo kế hoạch trực giao bậc 2 Box – Wilson được đưa vào

bảng 3.9 với thành phần mỗi enzyme Cell/Xyl (x1), AltFAE (x2), XpoAE (x3) như sau:

112

Bảng 3.9. Ma trận kế hoạch và kết quả thực nghiệm Stt xo x1 x2 x3 x1x2 x1x3 x2x3 x '

1 x '2 x '

3 Y

(mg/g) y

1 + - - - + + + 0,27 0,27 0,27 153,6 159,44

2 + + - - - - + 0,27 0,27 0,27 219,5 219,35

3 + - + - - + - 0,27 0,27 0,27 160,4 165,87

4 + + + - + - - 0,27 0,27 0,27 224,2 225,78

5 + - - + + - - 0,27 0,27 0,27 164,8 169,52

6 + + - + - + - 0,27 0,27 0,27 226,8 229,42

7 + - + + - - + 0,27 0,27 0,27 181,7 185,09

8 + + + + + + + 0,27 0,27 0,27 239,7 245,00

9 + -1,215 0 0 0 0 0 0,74 -0,73 -0,73 163,4 163,54

10 + +1,215 0 0 0 0 0 0,74 -0,73 -0,73 227,9 236,33

11 + 0 -1,215 0 0 0 0 -0,73 0,745 -0,73 195,9 193,25

12 + 0 +1,215 0 0 0 0 -0,73 0,745 -0,73 211,5 206,62

13 + 0 0 -1,215 0 0 0 -0,73 -0,73 0,745 192,3 191,04

14 + 0 0 +1,215 0 0 0 -0,73 -0,73 0,745 212,8 208,83

15 + 0 0 0 0 0 0 -0,73 -0,73 -0,73 210,2 206,95

Thí nghiêm bổ sung để tính phương sai tái sinh được tiến hành ở thời gian t = 48

giờ, pH 5, ở 350C, lượng cơ chất sử dụng là 8%, thể tích/hoạt độ enzyme (U) tương ứng:

Cell/Xyl = 0,5 ml (50 U), AltFAE = 0,3 ml (4,53 U), XpoAE = 0,2 ml (5,4 U). Khi đó,

tổng đường khử sinh ra lần lượt là 162,2; 159,3; 161,2 mg/g. Sử dụng chương trình tính

bằng ngôn ngữ thuật toán FORTRAN đã nhận được: 2stS = 2,17 với f2 = 2

0bS = 0,3804; jbS = 0,4451;

ujbS = 0,5028; jjbS = 0,7054

113

Bảng 3.10. Các hệ số hồi quy và giá trị T

bj b0 b1 b2 b3 b12 b13 b23 b11 b22 b33

206,946 29,954 5,501 7,323 -0,762 -1,212 2,288 -7,011 -1,561 -2,34

tj t0 t1 t2 t3 t12 t13 t23 t11 t22 t33

544,02 67,2 12,36 16,45 1,46 2,33 4,39 9,94 2,21 3,32

Với tp(f) = t0,05(2) = 4,3 thì các hệ số có tj< 4,3 không có nghĩa, gồm t12, t13, t22, t33.

Sau khi loại bỏ các hệ số hồi quy không có nghĩa, ta có phương trình hồi quy sau:

y = 206,946 + 29,954x1 + 5,501x2 + 7,323x3 + 2,288x2x3 – 7,011 21x (1)

Giá trị tính toán y ở các điểm thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.10. Tính tương

hợp của mô hình (1) kiểm định theo tiêu chuẩn Fisher.

Phương sai dư: 15

2 2

2 1 1

( ) ( )

15 6

i i i ii i

du

y y y ys

N l

29,46

Khi đó: 2

2

29,46 13,582,17

du

ts

sFs

Chuẩn số Fisher tra bảng:

1 2 0,05(f ,f ) (9,2) 19,3pF F

Ta thấy:

F < 1 2(f ,f )pF

Nên phương trình hồi quy tương hợp với thực nghiệm.

Tiếp theo là giải bài toán tối ưu hóa, tức là tìm giá trị lớn nhất của hàm số y .

Max y (x1, x2, x3) ở các điều kiện ràng buộc:

1

2

3

1.215 1.2151.215 1.2151.215 1.215

xxx

114

Sử dụng thuật toán flexible quy hoạch phi tuyến với phương trình quy hồi mô tả hiệu

quả chuyển hóa biểu thị qua tổng hàm lượng đường khử sinh ra phụ thuộc vào thành

phần tham gia của mỗi enzyme đơn với hoạt độ enzyme (x) tương ứng: Cell/Xyl (x1),

AltFAE (x2), XpoAE (x3), phương trình có dạng: y = 206,946 + 29,954x1 + 5,501x2 + 7,323x3 + 2,288x2x3 – 7,011 2

1x , tương ứng hoạt độ

(U) “enzyme cocktail”/gram bã mía sử dụng tương ứng: Cell/Xyl = 100 U/gds, AltFAE =

7,56 U/gds, XpoAE = 10,8 U/gds với giá trị ymax = 251,86 mg/g.

Bảng 3.11. Kết quả thực nghiệm so sánh với kế hoạch trực giao bậc hai Box – Wilson

N0 Cell/Xyl (ml) XpoAE (ml) AltFAE (ml) Tổng đường khử (mg/gram cơ chất)

1 1 0,4 0,5 260,2

2 1,1 0,4 0,5 260,7

3 1,2 0,4 0,5 260,9

4 1 0,5 0,5 258,7

5 1 0,6 0,5 258,4

6 1 0,7 0,5 257,2

7 1 0,4 0,6 255,8

8 1 0,4 0,7 254,9

9 1 0,4 0,8 254,1

Kết quả thí nghiệm bảng 3.11 thể hiện mức độ tương đồng giữa pháp phân tích hồi

quy cổ điển (thực nghiệm thụ động, thay đổi lần lượt từng biến số) với phương pháp sử

dụng mô hình quy hoạch thực nghiệm trong phạm vi nghiên cứu. Sử dụng thuật toán quy

hoạch thực nghiệm xác định các điều kiện tối ưu cho phản ứng chuyển hóa bã mía thành

đường với thời gian ủ 48 giờ, ở 400C và pH 5. Hoạt độ của đơn enzyme trong hỗn hợp

“enzyme cocktail” bổ sung là: Cell/Xyl: 100 U/gds, AltFAE: 7,56 U/gds và XpoAE: 10,8

U/gds. Khi đó, tổng hàm lượng đường sinh ra đạt 251,86 mg/g. Kết quả thực nghiệm

kiểm chứng cũng xác định được tổng đường khử sinh ra đạt 260,2 mg/g. Từ kết quả trên

nhân thấy, khoảng biến thiên hoạt độ của “enzyme cocktail” trong phạm vi nghiên cứu

hàm lượng đường khử sinh ra không những không tăng mà giảm đi đáng kể. Khi lượng

115

enzyme tăng lên thì tốc độ phản ứng tăng, tuy nhiên khi lượng enzyme tăng đến một giới

hạn nhất định thì nồng độ cơ chất sẽ là yếu tố hạn chế tốc độ phản ứng, tại giá trị đó tốc

độ phản ứng sẽ không tăng mà sẽ giảm đi.

Theo nghiên cứu của Badal Saha (2005) sử dụng mô hình tối ưu thực nghiệm đã

xác định được các điều kiện tối ưu của hỗn hợp “enzyme cocktail” (cellulase, β-

glucosidase, xylanase và esterase) trên cơ chất rơm rạ ở 450C, pH 5.0, sau 72 giờ ủ. Tổng

hàm lượng đường khử sinh ra đạt 465 mg/g [88].

Cũng liên quan đến hướng nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu của Rossana Liguori

(2015) sử dụng quy hoạch thực nghiệm để xác định các điều kiện tối ưu cho hỗn hợp gồm

2 enzyme (cellulases, xylanases) tinh sạch từ T. reesei ATCC26921 sử dụng để chuyển

hóa cây sậy. Kết quả thí nghiệm đã xác định được điều kiện để chuyển hóa hiệu quả diễn

ra ở 450C, pH 3.5, sau 96 giờ ủ, tổng đường khử thu được đạt 480,1 mg/g [138].

Sau khi sử dụng mô hình quy hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa các điều kiện của

hỗn hợp “enzyme cocktail” cho quá trình chuyển hóa bã mía thành các đường có khả

năng lên men. Bước tiếp theo, nghiên cứu làm tăng hiệu suất chuyển hóa bằng cách kết

hợp giữa xử lý hóa học và chuyển hóa sinh học bằng “enzyme cocktail”.

3.8. Kết hợp xử lý hóa học nâng cao hiệu quả chuyển hóa

3.8.1. Kết hợp thủy phân bã mía bằng kiềm và “enzyme cocktail”

Để nâng cao hiệu quả cho quá trình chuyển hóa bã mía trước khi thủy phân bằng

“enzyme cocktail” ở điều kiện tối ưu, bã mía được xử lý bằng NaOH với các nồng độ

khác nhau để đánh giá hiệu quả chuyển hóa.

Kết quả hình 3.29 cho thấy, khi tiến hành xử lý bã mía bằng NaOH với nồng độ từ

0,1 - 0,5 M, tổng đường khử sinh ra cao nhất đạt 91,4 mg/g ở nồng độ 0,4 M. Khi tăng

nồng độ NAOH thì hàm lượng đường sinh ra cũng tăng cao và bắt đầu giảm còn 74,8

mg/g ở nồng độ 0,5M. Tuy nhiên, hàm lượng đường khử sau giai đoạn thủy phân bằng

“enzyme cocktail” sinh ra cao nhất đạt 287,4 mg/g ở nồng độ NAOH 0,3 M. Thí nghiệm

chỉ thủy phân bằng hỗn hợp “enzyme cocktail”, tổng đường sinh ra đạt 198,2 mg/g và

tăng mạnh khi mẫu được xử lý bằng kiềm với nồng độ tăng dần. Tổng đường khử bắt đầu

giảm khi nồng độ kiềm tăng lên 0,35 M. Điều này có thể giải thích, khi nồng độ kiềm

116

càng cao thì lượng cellulose bị thủy phân càng mạnh. Mặt khác, với cùng một lượng cơ

chất nhất định (10%, w/v) khi nồng độ kiềm tăng thì các mạch liên kết với lignin bị yếu

hoặc bị phá vỡ, do vậy tổng đường khử trong dịch thủy phân cũng tăng theo.

Tuy nhiên, khi nồng độ kiềm tăng quá cao thì chính lignocellulose sẽ bị hòa tan

một phần và đường tạo thành sẽ bị biến tính, khả năng tác động của enzyme vào cơ chất

sẽ giảm dần, dẫn tới lượng đường khử tạo thành cũng sẽ giảm vì quá trình khuyếch tán

của enzyme trong toàn khối nguyên liệu sẽ rất khó khăn, hiệu suất phản ứng thủy phân sẽ

giảm nên hàm lượng đường tạo thành không cao. Điều này đã giải thích vì sao ở các thí

nghiệm bã mía được xử lý bằng NaOH nồng độ thấp (0,1 - 0,25 M) đường khử sinh ra

không cao. Nồng độ kiềm đã tác động và thủy phân các liên kết lignin với cellulose tạo

điều kiện cho các enzyme thủy phân tiếp xúc với cellulose thực hiện nhiệm vụ của mình

[34].

Hình 3.29. Đường khử sinh ra sau quá trình xử lý bã mía bằng kiềm và

“enzyme cocktail” (*)Bã mía (10%; w/v) được nghiền nhỏ ngâm trong dung dịch NAOH, trong 2,5 giờ, ở 850C. Chuyển hóa sinh học sử dụng hỗn hợp “enzyme cocktail” (100U Cell/Xyl/gds, 7,56U AltFAE/gds và 10,8U XpoAE/gds), thời gian ủ 48 giờ, ở 400C, pH 5.0. Các dữ liệu được trình bày là trung bình của hai lần lặp lại.

-50

0

50

100

150

200

250

300

350

0 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.5

Tổn

g lư

ợng

đườn

g kh

ử (m

g/g)

Nồng độ NAOH (CM)

Xử lý bằng NAOH Xử lý bằng NAOH + "enzyme cocktail"

117

Quá trình chuyển hóa bã mía bằng kiềm ở nồng độ thấp giúp làm yếu hoặc bẻ gãy

một phần các liên kết phức tạp trong cấu trúc lignocellulose, chính điều này giúp cho các

enzyme CE (AltFAE, XpoAE) hoạt động trên các chuỗi nhánh của cấu trúc

polysaccharide thành tế bào thực vật dễ dàng phân cắt liên kết cầu nối giữa các chuỗi

xylan và giữa xylan với lignin để tách riêng phần lignin ra khỏi cấu trúc lignocelluloses.

Chúng phá vỡ một phần cấu trúc hoặc cắt đứt các mối liên kết giữa các chuỗi cellulose

với hemicellulose và lignin cũng như các liên kết glucosid trong từng chuỗi và loại bỏ

một phần thành tế bào thực vật [66]. Do đó, phức hợp lignin - cacbohydrate có thể trở

nên dễ bị tấn công bởi enzyme Cell/xyl thủy phân mạch chính cấu trúc lignocelluloses.

Liên quan đến hướng nghiên cứu này, Ruangmee và cộng sự (2013) sử dụng đối tượng là

loài cỏ nến, sau quá trình tiền xử lý bằng kiềm loãng kết hợp thủy phân bằng hỗn hợp

“enzyme cocktail” bao gồm: cellulase (13,50 FPU/g từ nấm Trichoderma reesei ATCC

26921) và β-glucosidase (16,50 U/g từ nấm Almonds lyophyl), tổng hàm lượng đường

glucose và xylose sinh ra đạt 296,4 mg/g [139].

3.8.2. Kết hợp thủy phân bã mía bằng axít và “enzyme cocktail”

Hiệu quả của quá trình chuyển hóa bã mía bằng axít H2SO4 ở nồng độ khác nhau

kết hợp thủy phân bằng “enzyme cocktail” được thể hiện trên hình 3.30.

Kết quả thí nghiệm nhận thấy, bã mía được xử lý bằng axít H2SO4 loãng ở các

nồng độ từ 0,05 đến 0,6% hàm lượng đường khử sinh ra khác nhau dao động từ 42,51

mg/g đến 97,32mg/g. Tuy nhiên, hàm lượng đường khử sinh ra cao nhất đạt 97,32 tại

nồng độ 0,2%. Trong các thí nghiệm xử lý bã mía bằng H2SO4 0,1% kết hợp với hỗn hợp

“enzyme cocktail” thì hiệu suất tạo thành đường cao hơn gấp hai đến ba lần so với mẫu

không thủy phân bẵng hỗn hợp “enzyme cocktail”. Khi đó, tổng đường khử sinh ra cao

nhất đạt 319,5 mg/g ở nồng độ H2SO40,1%. Khi nồng độ axít tăng đến 0,6% thì tổng

đường khử lại giảm xuống còn 156,8 mg/g. Nguyên nhân có thể do khi nồng độ axít tăng

cao cả hemicellulose và cellulose đều bị thủy phân tạo thành đường dẫn đến một lượng

lớn các đường này cũng bị phân hủy do tác động trực tiếp từ lượng axít dư trong dung

dịch chuyển hóa. Tuy nhiên, khi chuyển hóa bã mía ở nhiệt độ thấp (850C) bằng axít

loãng (0,1%) thì lượng cellulose cũng như hemicellulose bị thủy phân thành đường

118

hexose và pentose, trong đó hàm lượng glucose và xylose tương đối thấp. Quá trình này

chỉ thực hiện bẻ gãy các liên kết phức tạp trong cấu trúc của chúng, chính ở điều kiện này

phản ứng chuyển hóa sẽ không tạo ra các chất ức chế như furfural và hydroxymethyl. Hai

hợp chất trên được hình thành từ chính glucose và xylose sinh ra trong quá trình chuyển

hóa dưới tác động ở nhiệt độ và áp suất cao, chúng thường được xem là các chất ức chế

quá trình lên men theo nghiên cứu của Ilonna, 2004 [140]. Do vậy, việc chuyển hóa bã

mía bằng axít loãng ở nhiệt độ và áp suất thấp có nhiều ưu điểm, vừa tạo điều kiện thuận

lợi cho “enzyme cocktail” hoạt động, lại vừa tiết kiệm được chi phí hóa chất cũng như

không ảnh hưởng nhiều đến thiết bị. Đặc biệt, không thải ra môi trường các hóa chất độc

hại gây ra những tác động xấu đến môi trường sinh thái.

Hình 3.30. Đường khử sinh ra sau quá trình thủy phân bã mía bằng axít và

“enzyme cocktail” (*)Bã mía (10%; w/v) được nghiền nhỏ ngâm trong dung dịch H2SO4, trong 2,5 giờ, ở

850C. Chuyển hóa sinh học sử dụng hỗn hợp “enzyme cocktail” (100U Cell/Xyl/gds,

7,56U AltFAE/gds, 10,8U XpoAE/gds), thời gian ủ 48 giờ, ở 400C, pH 5.0. Các dữ liệu

được trình bày là trung bình của hai lần lặp lại.

Ở thí nghiệm bã mía được thủy phân bằng “enzyme cocktail”, không xử lý bằng

axít thì tổng đường khử sinh ra chỉ đạt 198,2 mg/g, thấp hơn nhiều so với thí nghiệm bã

mía được thủy phân bằng H2SO4 0,1% kết hợp “enzyme cocktail”, khi đó hàm lượng

-50

0

50

100

150

200

250

300

350

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

Tổn

g lư

ợng

đườn

g kh

ử (m

g/g)

Nồng độ H2SO4 (C%)

Xử lý bằng axít H2SO4Xử lý bằng axít H2SO4 + "enzyme cocktail"

119

đường khử sinh ra cao nhất đạt 319,5 mg/g (Hình 3.30). Điều này chứng minh, quá trình

xử lý hóa học đã làm thay đổi cấu trúc nguyên liệu, làm tăng diện tích tiếp xúc giữa

enzyme và cellulose giúp tăng hiệu quả chuyển hóa bã mía thành đường khi kết hợp với

hỗn hợp “enzyme cocktail”.

Theo nghiên cứu của Shatalo và H. Pereira (2012) khi kết hợp thủy phân cây sậy

bằng axít loãng và enzyme coktail (cellulases và β-glucosidases) ở các điều kiện tối ưu,

hàm lượng đường glucose và xylose sinh ra khá cao, tương ứng đạt 264 mg/mg và 217

mg/g [141]. Theo Badal và cộng sự (2005), nghiên cứu sử dụng axít H2SO4 loãng

(0,75%, v/v) kết hợp chuyển hóa bằng enzyme cocktail (cellulase, β-glucosidase,

xylanase và esterase) áp dụng trên đối tượng là rơm, phản ứng được thực hiện dưới điều

kiện tối ưu (450C, pH 5,0, 72 giờ), tổng hàm lượng đường khử sinh ra đạt 465 mg/g.

Trong điều kiện này, sản phẩm tạo thành không thấy xuất hiện furfural và hydroxymethyl

furfural [88].

Từ những đánh giá trên nhận thấy, ưu điểm nổi bật của quá trình chuyển hóa sử

dụng axít loãng ở nhiệt độ và áp suất thấp cho hiệu suất cao khi kết hợp thủy phân bã mía

bằng hỗn hợp “enzyme cocktail” mà lại không thải ra các hợp chất gây tổn hại đến môi

trường.

Việc tìm ra phương pháp chuyển hóa thích hợp với hiệu suất cao và chi phí thấp

rất quan trọng. Hiện nay tính chất phức tạp trong chuyển hóa vật liệu giàu lignocellulose

với chi phí xử lý cao đang làm cho vấn đề này đang là một trong những yếu tố nan giải

đối với việc khai thác hợp lý nguồn sinh khối giàu lignocellulose từ phụ phẩm công –

nông nghiệp ở quy mô công nghiệp.

3.8.3. Kết hợp thủy phân bã mía bằng thiết bị gia nhiệt và “enzyme cocktail”

Bã mía được xử lý hóa học hay bằng thiết bị gia nhiệt nhìn chung đều cho hiệu

quả chuyển hóa khá rõ rệt với nhiều ưu điểm. Xử lý bằng kiềm/axít ở nồng độ cao sẽ làm

phá vỡ thành cấu trúc tế bào vì chúng hòa tan hemicellulose và lignin, thủy phân liên kết

este của axít uronic và acetic, làm trương cellulose và giảm độ kết tinh của hemicellulose

cũng như cellulose [142]. Tuy nhiên, cũng có nhiều ảnh hưởng tiêu cực như giá thành để

xử lý khá cao, gây ăn mòn thiết bị, tiêu hao một lượng lớn cellulose/hemicellulose do bị

hòa tan vào axit/kiềm dẫn đến giảm hiệu suất chuyển hóa. Đặc biệt, gây ra những ảnh

120

hưởng tiêu cực đến môi trường sinh thái do những hóa chất dư thừa với nồng độ đậm đặc

thải ra môi trường.

Bảng 3.12. Tổng đường khử sinh ra sau quá trình thủy phân bã mía bằng thiết bị gia nhiệt kết hợp “enzyme cocktail”

Tổng hàm lượng đường khử (mg/g)

Thiết bị gia nhiệt Thiết bị gia nhiệt + “enzyme cocktail” (*)

32,18 221,73

(*)Bã mía (10%; w/v) nghiền nhỏ ngâm trong nước cất được thủy phân bằng thiết bị gia

nhiệt, ở 1210C trong 120 phút, áp suất 1 atm. Chuyển hóa sinh học sử dụng “enzyme

cocktail” (100U Cell/Xyl/gds, 7,56U AltFAE/gds, 10,8U XpoAE/gds), phản ứng được ủ

trong 48 giờ, ở 400C, pH 5.0. Các dữ liệu được trình bày là trung bình của hai lần lặp

lại.

Kết quả nghiên cứu nhận thấy, sử dụng thiết bị gia nhiệt để chuyển hóa bã mía

thành đường đơn đã tác động mạnh đến thành phần cũng như cấu trúc của vật liệu. Sau

quá trình xử lý, tổng đường khử sinh ra chỉ đạt 32,18 mg/g. Tuy nhiên, khi kết hợp với

hỗn hợp “enzyme cocktail” thì tổng đường khử tăng lên đến 221,73 mg/g (Bảng 3.12).

Kết quả này tương đối phù hợp với một số nghiên cứu trước đó. Theo Nguyễn

Văn Vinh và cộng sự (2014), khi thực hiện phản ứng ở nhiệt độ và áp suất cao, có thể

một lượng cellulose, hemicellulose và các chất khác trong thành phần cấu trúc của sinh

khối đã bị phân hủy thành các đơn phân (monomer). Cấu trúc bề mặt của các nguyên liệu

giàu lignocellulose sau khi được xử lý đều thay đổi khá rõ rệt so với ban đầu. Các

nguyên liệu cũng bị phá vỡ có các tiểu phần có kích thước nhỏ hơn và các thành phần

bao bọc cellulose như hemicellulose và lignin cũng đã bị phá vỡ tạo thuận lợi cho việc

thủy phân của enzyme ở giai đoạn sau [100].

Sử dụng thiết bị gia nhiệt đòi hỏi máy móc và thiết bị hiện đại. Thiết bị gia nhiệt

phải chịu được nhiệt độ và áp suất cao trong thời gian dài, đồng thời cần sử dụng năng

lượng lớn, điều này tương đối khó khăn. Mặt khác, ở nhiệt độ và áp suất cao, cellulose

cũng bị phân hủy, đồng thời tạo ra một số chất ảnh hưởng đến quá trình lên men. Do đó,

phương pháp này mới chỉ được áp dụng trên quy mô nhỏ hoặc quy mô phòng thí nghiệm.

121

Mục đích việc tiền xử lý nguyên liệu ở giai đoạn đầu giúp nâng cao hiệu suất thủy

phân khi kết hợp với “enzyme cocktail”. Trong nghiên cứu này, khi so sánh kết quả

nghiên cứu của ba phương pháp trên nhận thấy, việc sử dụng axít H2SO4 ở nồng độ thấp

(0,1%) kết hợp với hỗn hợp “enzyme cocktail” là phương pháp thích hợp, hiệu suất tạo

thành đường cao. Chuyển hóa bã mía bằng H2SO4 loãng ở nhiệt độ và áp suất thấp làm

giảm khả năng ăn mòn thiết bị và không tạo ra các chất ức chế quá trình lên men. Do đó,

phương pháp này được lựa chọn kết hợp với “enzyme cocktail” để chuyên hóa bã mía

thành các đường có khả năng lên men bioethanol.

3.8.4. Hàm lượng các đường đơn sau chuyển hóa Để phân tích chính xác thành phần cũng như hàm lượng các đường đơn hexose

(6C) hay pentose (5C) trong sản phẩm sau chuyển hóa bã mía bằng axit H2SO4 loãng

(0,1%) kết hợp “enzyme cocktail” với hàm lượng đường khử sinh ra cao đạt 319,5mg/g.

Bước tiếp theo, dịch đường sau chuyển hóa được phân tích thành phần và hàm lượng

bằng thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng cột RPM-Monosaccharide Pb+2

(8%) và đầu dò phổ hồng ngoại (IR).

Kết quả phân tích, xác định được hàm lượng glucose và xylose trong dịch chuyển

hóa tương ứng là 195,4 mg/g và 60,5 mg/g. Hàm lượng đường hexose (C6) chiếm 61,2%

cao hơn so với các đường pentose (C5) là 18,9%. Tổng hàm lượng carbohydrate trong

mẫu thí nghiệm thu được là 255,9 mg/g, chiếm 80,2% % (255,9 mg/g so với 319,5 mg/g)

(Bảng 3.13) so với kết quả phân tích tổng đường khử theo phương pháp DNS. Điều đó có

nghĩa, còn khoảng 18% các đường khử khác chưa phân tích có khả năng lên men có mặt

trong dịch chuyển hóa.

Bảng 3.13. Hàm lượng một số các đường đơn trong dung dịch sau chuyển hóa

Enzyme Sản phẩm phản ứng (Carbohydrat; mg/g)

Galactose Glucose Mannose Xylose Tổng Carbohydrat

Hỗn hợp enzyme cocktail (Cell/Xyl, AltFAE

& XpoAE) KXĐ 195,4 KXĐ 60,5 255,9

Kết quả trên chứng minh cho vai trò của các enzyme liên quan trong quá trình

thủy phân cơ chất là sinh khối từ vật liệu công-nông nghiệp giàu liglocellulose bởi nấm

122

cũng như hiệu quả chuyển hóa khi phối hợp giữa xử lý hóa học và xúc tác sinh học bằng

“enzyme cocktail” giải phóng carbohydrate.

Theo nghiên cứu Saha và cộng sự (2005), áp dụng mô hình tối ưu thực nghiệm chuyển hóa rơm rạ bằng chế phẩm enzyme thương mại, sau 72 giờ ủ ở 450C, lượng D-glucose tạo thành lên tới 465 mg/g [88]. Hiệu quả thủy phân các vật liệu giàu lignocellulose phụ thuộc các điều kiện tối ưu (nhiệt độ, pH, thời gian), hoạt độ enzyme và lượng cơ chất. Do đó, khi xử lý vật liệu thô với đơn enzyme AltFAE/XpoAE hay “enzyme cocktail” có thể sử dụng mô hình quy hoạch thực nghiệm để tối ưu các điều kiện của enzyme thủy phân nhằm tăng hiệu suất chuyển hóa. Dựa trên các kết quả trong nghiên cứu này, một lần nữa khẳng định enzyme CE (AltFAE & XpoAE ) xúc tác thủy phân các liên kết ester giữa các thành phần chính của lignocellulose là các monolignol của lignin và cấu tử hemicellulose. Hơn thế, enzyme này giúp cho quá trình thủy phân polysaccharide thành các mono và dimer xảy ra dễ dàng hơn, trong khi đó nhờ có các enzyme tiên phong (AltFAE & XpoAE) mà enzyme chính Cell/Xyl dễ dàng bẻ gãy các polymer thành những phân tử oligosaccharide có mức độ trùng hợp nhỏ hơn trước khi Cell/Xyl hoàn tất quá trình chuyển hóa.

Như vậy, bã mía có hàm lượng cellulose và lignocellulose chiếm khoảng 64% [91], sau quá trình chuyển hóa thu được 319,5 mg/g đường khử, đạt hiệu suất 49,8%. 3.9. Nghiên cứu sản xuất bioethanol 3.9.1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường

Nguồn dinh dưỡng là một trong số những nhân tố tác động trực tiếp đến quá trình sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật nói chung và nấm men Saccharomyces cerevisiae SH1 nói riêng. Do vậy, cần tiến hành nghiên cứu khảo sát để tìm ra môi trường lên men bioethanol thích hợp. Thí nghiệm được tiến hành trên hai môi trường BM (dịch đường sau chuyển hóa) và môi trường BM+ (dịch đường sau chuyển hóa bổ sung các thành phần từ môi trường hansen). Bổ sung 3% giống nấm men trên tổng thể tích dịch lên men, lên men ở 300C, pH = 4,8.

123

Bảng 3.14. Hiệu suất quá trình lên men trên môi trường BM và BM+

Thời gian Kết quả

12 giờ 24 giờ BM(1) BM+ (2) BM(1) BM+ (2)

Tổng đường khử còn lại (mg/g) 173,32 146,38 162,71 132,34

Hàm lượng bioethanol (g/l) 2,65 3,50 3,17 4,82

Hiệu suất (g/g) 0,026 0,035 0,031 0,048 (1)Môi trường lên men sử dụng dịch đường sau chuyển hóa (2)Môi trường lên men sử dụng dịch đường sau chuyển hóa bổ sung thêm các thành phần từ môi trường Hanxen

Kết quả thí nghiệm nhận thấy, thời điểm 12 giờ lên men tổng đường khử còn lại ở

hai thí nghiệm đều cao, tương ứng là 173,32 mg/g và 146,38 mg/g, hàm lượng bioethanol

tạo thành không cao chỉ đạt 2,65g/l. Khi đó, hàm lượng đường khử còn lại trong mẫu ở

môi trường BM+ chỉ còn 146,38 mg/g thấp hơn so với môi trường BM. Nguyên nhân do

trong giai đoạn này, nấm men bắt đầu thích nghi với môi trường và sử dụng đường là

nguồn cacbon để sinh trưởng và phát triển. Môi trường BM+ có nguồn dinh dưỡng dồi

dào tạo điều kiện thuận lợi cho nấm men sử dụng đường để tích lũy, tạo năng lượng và

tăng sinh khối. Do vậy, phản ứng lên men diễn ra tương đối chậm, hiệu suất lên men

không cao, hiệu suất tạo thành bioethanol tương đối thấp chỉ đạt 0,035 g/g. Có thể khẳng

định, giai đoạn này quá trình lên men tập trung chủ yếu theo chiều tăng sinh khối nấm

men vì môi trường giàu nguồn dinh dưỡng nên nấm men phát triển tốt hơn.

Thời điểm sau 24 giờ lên men, sinh khối nấm men tăng đáng kể, phản ứng lên men

diễn ra nhanh hơn. Tổng đường khử còn lại trong hai môi trường BM và BM+ giảm còn

162,71 mg/g và 132,34 mg/g. Hiệu suất tạo thành bioethanol trên hai môi trường cũng

cao hơn (0,031 g/g trên môi trường BM và 0,048 g/g trên môi trường BM+). Tại thời

điểm này, có sự khác biệt rõ rệt trong hiệu suất lên men ở hai công thức môi trường với

các thành phần môi trường riêng biệt.

Điều này có thể giải thích, nguồn dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới sự sinh

trưởng phát triển của nấm men. Các muối khoáng tham gia vào quá trình trao đổi chất

của nấm men như là chất hoạt hóa cho thấy việc bổ sung muối khoáng và các thành phần

dinh dưỡng làm tăng hiệu suất tạo thành bioethanol khi tăng thời gian lên men. Hàm

124

lượng bioethanol tại thời điểm 24h đạt 4,82 g/l cao hơn so với thời điểm 12h chỉ đạt 3,17

g/l (Hình 3.31). Kết quả này khá tương đồng so với nghiên cứu ảnh hưởng của các thành

phần môi trường lên men của tác giả Lương Đức Phẩm [143].

Hình 3.31. Ảnh hưởng thành phần môi trường đến hiệu suất lên men BM: Dịch đường sau chuyển hóa và BM+: Dịch đường sau chuyển hóa bổ sung thêm thành phần từ môi trường hanxen

Từ kết quả trên nhận thấy, dịch đường sau chuyển hóa được sử dụng để lên men

bioethanol, tuy nhiên cần phải bổ sung thêm một số các thành phần dinh dưỡng, muối

khoáng khác để tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm men trong giai đoạn

đầu.

3.9.2. Ảnh hưởng thời gian lên men

Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men được tiến hành ở 300C; pH

4,8, bổ sung 3% giống nấm men theo thể tích và sử dụng môi trường bổ sung các thành

phần dinh dưỡng của môi trường hansen.

Bảng 3.15. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất lên men

STT Thời gian (giờ)

OD620 Tổng đường khử còn lại (mg/g)

Hàm lượng bioethanol (g/l)

Hiệu suất (g/g)

1 6 0,243 187,9 2,016 0,020

2 12 0,440 146,5 2,709 0,027

3 24 0,960 119,0 4,704 0,047

0

1

2

3

4

5

6

020406080

100120140160180200

BM BM+ BM BM+

12 giờ 24 giờ

Hàm

lượn

g bi

oeth

anol

(g/

l)

Tổn

g đư

ờng

khử

còn

lại (

mg/

g)

Thành phần môi trường lên men

Tổng đường khử còn lại (mg/g) Hàm lượng bioethanol (g/l)

125

4 30 1,045 108,3 5,166 0,052

5 36 1,059 102,5 5,691 0,057

6 48 1,235 95,4 6,758 0,067

7 54 1,296 89,4 6,952 0,069

8 60 1,357 85,2 7,367 0,073

9 72 1,494 79,5 7,644 0,076

10 78 1,702 73,4 7,959 0,080 11 81 1,279 65,2 6,951 0,070

Kết quả thí nghiệm nhận thấy, trong 12 giờ đầu tổng đường khử còn lại khá cao

đạt 146,5 mg/g, hàm lượng bioethanol sinh ra tương đối thấp chỉ đạt 2,709 g/l. Thời điểm

24 giờ sau, lượng bioethanol tạo thành khá thấp đạt 4,704 g/l, trong khi đó tổng đường

khử còn lại tương đối cao là 119,0 mg/g. Trong khoảng thời gian này, hiệu suất lên men

không đáng kể vì đây là giai đoạn nấm men thích nghi với môi trường và bắt đầu quá

trình sinh trưởng phát triển để tăng sinh khối.

Từ 30 giờ đến 54 giờ tiếp theo, tổng đường khử còn lại giảm đều từ 108,3 mg/g

xuống 89,4mg/g. Trong giai đoạn này, nấm men đã thích ứng với môi trường và tích lũy

được một lượng sinh khối đáng kể nên quá trình lên men bioethanol diễn ra nhanh hơn.

Tuy nhiên, tốc độ lên men không cao dẫn đến hiệu suất lên men tương đối thấp chỉ đạt

0,066 mg/g.

Trong giai đoạn 72 đến 78 giờ, tổng đường khử còn lại giảm mạnh còn 79,5 mg/g

và vẫn đang tiếp tục giảm, hàm lượng bioethanol tạo thành tăng mạnh, cao nhất tại thời

điểm 78 giờ đạt 7,959 g/l, hiệu suất tạo thành bioethanol tại thời điểm này cao nhất đạt

0,08 gram/gram cơ chất và bắt đầu giảm sau 81 giờ lên men với hàm lượng bioethanol

tạo thành chỉ còn 6,951 g/l (Hình 3.32).

Điều này có thể giải thích, khi mật độ nấm men tăng cao, lượng sinh khối tích lũy

càng lớn thì quá trình lên men diễn ra càng nhanh và hàm lượng bioethanol tạo thành

càng cao. Tuy nhiên, sự phát triển này chỉ diễn ra trong một giới hạn nhất định. Giai đoạn

đầu, nấm men cần thời gian thích nghi và tăng mật độ tích lũy sinh khối. Tổng đường khử

trong dung dịch giảm do nấm men sử dụng cho quá trình sinh trưởng và tăng sinh tế bào

126

nên quá trình lên men chưa diễn ra hoặc diễn ra rất chậm nên lượng bioethanol tạo thành

không đáng kể. Khi sự sinh trưởng đạt giới hạn nhất định, sinh khối đủ lớn, quá trình lên

men bắt đầu diễn ra nhanh hơn. Lượng đường khử còn lại tỉ lệ nghịch với hàm lượng

bioethanol tạo thành. Nấm men bắt đầu lên men glucose tạo thành bioethanol và CO2.

Khi lượng bioethanol tạo thành quá nhiều thì chính chúng lại ức chế sự phát triển của tế

bào nấm men làm chết tế bào, tạo ra các sản phẩm phụ và thúc đẩy quá trình chuyển hóa

bioethanol tạo thành các hợp chất thứ cấp khác như axít, este, aldehyl và rượu bậc cao.

Do đó, hàm lượng bioethanol lại có xu hướng giảm.

Bên cạnh đó, mật độ tế bào cũng được xác định trên máy Elisa ở bước sóng 620

(OD620). Kết quả thể hiện, thời gian càng tăng thì mật độ tế bào càng lớn, chứng tỏ lượng

sinh khối càng cao và OD620 bắt đầu giảm ở thời điểm sau 81 giờ lên men. Điều này

chứng tỏ sau thời điểm đó nấm men đã sử dụng hết dinh dưỡng trong môi trường, mật độ

nấm men giảm dần do tế bào nấm men chết dần.

Theo nghiên cứu của tác giả Abdulkareem nghiên cứu sản xuất bioethanol từ dịch

đường chuyển hóa bã mía thì thời gian lên men thích hợp là 72 giờ, hiệu suất thu hồi

bioethanol đạt 76,5% ở 350C [96].

Do vậy, có thể kết luận rằng thời gian thích hợp để lên men thu nhận bioethanol là

78 giờ.

Hình 3.32. Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất lên men

0

12

34

56

789

0

50

100

150

200

250

6 12 24 30 36 48 54 60 72 78 81

Hàm

lượn

g bi

oeth

anol

(g/

l)

Tổn

g đư

ờng

khử

còn

lại (

mg/

g)

Thời gian lên men (giờ)

Tổng đường khử còn lại (mg/g) Hàm lượng bioethanol (g/l)

127

3.9.3. Ảnh hưởng pH

Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men được tiến hành

ở 300C; thời gian lên men 78 giờ và bổ sung 3% giống nấm men.

Bảng 3.16. Ảnh hưởng pH đến hiệu suất lên men STT pH OD620 Tổng đường khử

còn lại (mg/g) Hàm lượng

bioethanol (g/l) Hiệu suất

(g/g) 1 4 1,395 119,21 4,17 0,042

2 4,3 1,467 104,9 4,76 0,048

3 4,6 1,559 94,53 5,93 0,059

4 4,8 1,702 73,4 7,959 0,080

5 5,2 1,607 74,07 10,90 0,109

6 5,5 1,393 71,63 9,67 0,096

7 6 1,070 87,08 6,79 0,067

Kết quả bảng 3.16 nhận thấy, ở pH khác nhau lượng sinh khối tích lũy của nấm

men và tốc độ lên men tạo thành bioethanol khác nhau. Ở pH 5.2, tổng đường khử còn lại

là 74,07 mg/g nên hàm lượng bioethanol sinh ra và hiệu suất lên men tăng cao, tương ứng

đạt 10,90 g/l và 0,109 g/g. Tại pH này, mật độ sinh khối cao nhất với OD620 = 1,607. Khi

lên men trong môi trường axít (pH 4 và 4.3) thì khả năng tích lũy sinh khối của nấm men

cũng thấp nên hiệu suất không cao. Khi pH môi trường trung tính (pH 6) hàm lượng

bioethanol tạo thành cũng giảm còn 6,79 g/l nên hiệu suất chỉ đạt 0,067 g/g.

pH thích hợp cho quá trình lên men từ 4.8 – 5.5. Khi đó, lượng bioethanol tạo

thành và hiệu suất lên men tại pH 4.8 và pH 5.2 chênh lệch không quá nhiều. Điều này có

thể giải thích do hầu hết các enzyme trong tế bào nấm men đều hoạt động ở vùng pH axít,

mỗi enzyme đều có pH tối ưu riêng và enzyme alcohol dehydrogenase là enzyme xúc tác

phản ứng chuyển hóa glucose thành bioethanol trong tế bào nấm men, cũng có một giá trị

pH tối ưu. Khi pH ở bên ngoài môi trường chênh lệch nhiều so với pH tối ưu trong tế bào

lúc đó nấm men cần năng lượng để bơm ion H+ vào hay ra để giữ pH trong tế bào luôn ổn

định. Hơn nữa, tế bào nấm men rất khó giữ ổn định và khi đó enzyme không hoạt động

bình thường nữa. Một khi enzyme bị bất hoạt thì nấm men không thể phát triển và không

128

thể tạo ra bioethanol hiệu quả. Thông thường, quá trình lên men diễn ra tốt nhất trong

khoảng pH 4.8 – 5.5 (Hình 3.33). Khi pH cao sẽ tạo điều kiện thích hợp để giải phóng

các hợp chất phụ gây ức chế và làm giảm hiệu suất của quá trình lên men và ngược lại,

khi pH thấp ngăn cản hoạt động của nấm men. Do đó, có thể kết luận rằng pH 5,2 là thích

hợp cho quá trình lên men.

Hình 3.33. Ảnh hưởng pH đến hiệu suất lên men

3.9.4. Ảnh hưởng nhiệt độ

Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men được tiến

hành ở pH 5.2; thời gian lên men 78 giờ và tỷ lệ nấm men bổ sung là 3%.

Bảng 3.17. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất lên men

Stt Nhiệt độ OD620 Tổng đường khử

còn lại (mg/g) Hàm lượng

bioethanol (g/l) Hiệu suất

(g/g) 1 23 1,343 104,36 8,844 0,088

2 25 1,446 97,5 9,174 0,092

3 28 1,529 64,31 11,704 0,117

4 30 1,607 74,07 10,903 0,109

5 32 1,582 73,34 10,428 0,104

6 34 1,436 112,53 3,36 0,07

0

2

4

6

8

10

12

14

0

20

40

60

80

100

120

140

4 4.3 4.6 4.8 5.2 5.5 6

Hàm

lượn

g bi

oeth

anol

(g/

l)

Tổn

g đư

ờng

khử

còn

lại (

mg/

g)

Giá trị pH

Tổng đường khử còn lại (mg/g) Hàm lượng bioethanol (g/l)

129

Mỗi vi sinh vật đều có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng. Đối với nấm

men Saccharomyces cerevisiae SH1, nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng từ 28 đến 320C.

Tuy nhiên, nếu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng lên men kéo dài hơn. Do đó, tiến

hành khảo sát khả năng lên men chủng S.cerevisiae SH1 ở nhiệt độ từ 23 đến 340C để tìm

ra điều kiện thích hợp cho quá trình lên men.

Từ bảng 3.17 nhận thấy, mật độ tế bào nấm men tạo thành ở 300C cao nhất với

OD620 =1,607. Tuy nhiên, lên men ở 280C lượng bioethanol tạo thành và hiệu suất lên

men đạt hiệu quả cao, tương ứng là 11,704 g/l và 0,117g/g. Khi đó, tổng đường khử còn

lại cũng ít hơn chỉ còn 64,31 mg/g. Lên men ở 230C nấm men phát triển kém nên lượng

glucose sử dụng không nhiều, tổng đường khử còn lại khá cao đạt 104,36 mg/g. Do đó,

hàm lượng bioethanol tạo thành tương đối thấp đạt 8,844g/l. Lên men ở 320C và 340C,

hoạt động của nấm men giảm nhanh nên tạo điều kiện thuận lợi cho một số loại nấm men

hoang dại phát triển. Điều này hoàn toàn phù hợp để giải thích vì sao sinh khối lắng

xuống đáy bình lên men nhiều (Hình 3.34). Mặt khác, nhiệt độ cao thúc đẩy sự tạo thành

este aldehyl và gây tổn thất bioethanol. Vì vậy, hiệu suất bioethanol tạo thành ở nhiệt độ

này tương đối thấp chỉ đạt 0,07 đến 0,104 g/g. Như vậy, lên men bioethanol ở 280C là

thích hợp cho nấm men S.cerevisiae SH1.

Hình 3.34. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất lên men

0

2

4

6

8

10

12

14

0

20

40

60

80

100

120

140

23 25 28 30 32 34

Hàm

lượn

g bi

oeth

anol

(g/

l)

Tổn

g đư

ờng

khử

còn

lại (

mg/

g)

Nhiệt độ (0C)

Tổng đường khử còn lại (mg/g) Hàm lượng bioethanol (g/l)

130

3.9.5. Ảnh hưởng tỷ lệ nấm men

Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men được tiến hành ở 280C; pH

5.2; thời gian lên men 78 giờ và tỷ lệ nấm men (%) bổ sung. Kết quả thí nghiệm thể hiện

bảng 3.18.

Bảng 3.18. Ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men đến hiệu suất lên men Stt Tỷ lệ nấm men

(%) OD620 Tổng đường khử

còn lại (mg/g) Hàm lượng

bioethanol (g/l) Hiệu suất (g/g )

1 2 1,206 94,40 9,648 0,096

2 3 1,522 64,31 11,704 0,117

3 4 1,634 72,39 12,48 0,124

4 5 1,649 63,14 14,088 0,140

5 6 1,657 75,59 12,168 0,121

6 7 1,662 78,20 11,328 0,113

7 8 1,711 81,17 10,968 0,109

8 9 1,898 89,12 9,264 0,092

9 10 1,965 99,53 7,104 0,071

Kết quả bảng 3.18 nhận thấy, khi bổ sung 5% giống nấm men thì hiệu suất và hàm

lượng bioethanol tạo thành cao nhất, tương ứng là 0,140 g/g và 14,88 g/l. Khi nấm men

bổ sung <5%, quá trình lên men cần nhiều thời gian để tăng sinh khối. Mặt khác, lượng

đường ban đầu quá cao so với mật độ nấm men cũng là một trong những nguyên nhân

cản trở quá trình lên men. Có thể thấy, khi bổ sung 2% giống nấm men, mật độ tế bào

thấp (OD620 =1,206) nên lượng bioethanol tạo thành khá thấp chỉ đạt 9,648 g/l.

Khi tăng nấm men từ 6 đến 10%, lượng giống bổ sung càng lớn thì càng làm tiêu

tốn lượng chất dinh dưỡng trong môi trường lên men cho việc tăng sinh khối. Hiệu suất

bioethanol tạo thành giảm chỉ còn 0,071 g/g khi bổ sung 10% giống.

Như vậy, khi mật độ nấm men tăng lên thì hàm lượng đường khử còn lại giảm dần

đến một giới hạn nhất định và hiệu suất bioethanol tăng lên. Tuy nhiên, điều này chỉ đúng

khi tỷ lệ nấm men bổ sung không vượt quá giới hạn nhất định, còn nếu vượt quá giới hạn

thì nếu tăng mật độ nấm men thì cũng không làm tăng hiệu suất quá trình lên men. Khi

131

đó, mật độ nấm men lớn chúng sẽ chỉ sử dụng đường tạo thành trong quá trình thủy phân

để tăng sinh khối tế bào chứ không tăng hiệu suất lên men bioethanol. Do vậy, bổ sung

5% nấm men là thích hợp cho lên men bioethanol.

Hình 3.35. Ảnh hưởng tỷ lệ giống nấm men đến hiệu suất lên men Như vậy, hàm lượng bioethanol tạo thành cao nhất là 14,088 g/l. Khi đó, hiệu suất

chuyển hóa đạt 0,140 gram/cơ chất bã mía, tương ứng với lượng bioethanol thu được 178,0 ml/kg bã mía. Hiệu suất lên men bioethanol từ dịch đường sau chuyển hóa đạt 79,6% so với lý thuyết .

Liên quan đến hướng nghiên cứu trên, Saha nghiên cứu trên cơ chất là rơm sử dụng axít loãng H2SO4 (0,75%, v/v) kết hợp thủy phân bằng “enzyme cocktail” (cellulase, β-glucosidase, xylanase và esterase) ở 450C, pH 5.0 với thời gian lên men 72 giờ. Hàm lượng bioethanol thu được 0,24 g/g cơ chất sau khi lên men bằng chủng tái tổ hợp Escherichia coli [88].

Cũng theo hướng nghiên cứu này, kết quả từ luận án của Đỗ Trung Sĩ (2016) “Nghiên cứu sản xuất bioethanol từ cây rong biển”. Rong biển được tiền xử lý bằng axít sulfuric loãng ở nhiệt độ thấp kết hợp chuyển hóa sinh học bằng enzyme Cellic HTech2. Dịch đường sau chuyển hóa được lên men bioethanol bằng nấm S. cerevisiae để khảo sát các điều kiện lên men tối ưu. Kết quả thí nghiệm xác định được điều kiện tối ưu để thủy

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0

2

4

6

8

10

12

14

16

2 3 4 5 6 7 8 9 10

Hiệ

u su

ất t

hu h

ồi b

ioet

hano

l (g/

g)

Hàm

lượn

g bi

oeth

anol

(g/

l)

Phần trăm (%) nấm men bổ sung

Hàm lượng bioethanol (g/l) Hiệu suất thu hồi bioethanol (g/g )

132

phân rong biển ở 120oC, thời gian ủ 1 giờ bằng axít H2SO4 0,1%. Khi đó, hàm lượng bioethanol thu được đạt 0,128 L/kg [78].

Theo nghiên cứu PGS.TS. Phan Đình Tuấn nghiên cứu sản xuất bioethanol từ rơm rạ, rơm đã qua tiền xử lý bằng axít yếu kết hợp thủy phân và lên men đồng thời thì 1 kg rơm thô sẽ thu được 113,72 g bioethanol tương đương 144 ml bioethanol [72]. Theo Keikhosro Karimi và cộng sự, 1 kg rơm sẽ cho 127 g bioethanol tương đương 160ml [31].

Trong nghiên cứu này, hiệu suất chuyển hóa bã mía thành bioethanol thu được khá cao đạt 178 ml/kg. Do vậy, lựa chọn phụ phẩm nông nghiệp (bã mía) là nguồn sinh khối giàu lignocellulose để làm đối tượng sản xuất bioethanol là một hướng đi mới, có ý nghĩa thực tiễn cao. Việc sử dụng phế thải nông nghiệp có ưu điểm là hàm lượng cellulose trong phụ phẩm nông nghiệp cao khi thủy phân sẽ tạo ra lượng đường glucose lớn. Bã mía là một trong số nhiều nguồn sinh khối phổ biến và có nhiều tiềm năng ở Việt Nam với thành phần chính là cellulose, lignocellulose chiếm 64%, là nguồn nguyên liệu phong phú cho việc sản xuất bioethanol.

133

3.9.6. Đề xuất quy trình sản xuất bioethanol từ bã mía

Nghiền nhỏ kích thước khoảng 0,5 – 1,0 mm

Xử lý hóa học

Điều chỉnh pH 5

Thủy phân bằng “enzyme cocktail”

Dịch đường thủy phân

Bổ sung dinh dưỡng

Điều chỉnh pH môi trường

Khử trùng 1210C, 1atm, 20 phút

Lên men Bioethanol

Chưng cất

Bã mía (DS) (10% w/v)

H2SO4 0,1%, ở 850C, trong 2.5 giờ

Enzyme cocktail: Cell/Xyl:100-160 U/gds, AltFAE:7.56 U/gds, XpoAE:10.8 U/gds, 400C, pH 5, 48 giờ

Nguồn dinh dưỡng (g/l): Peptone: 10; KH2PO4: 3; MgSO4.7H2O: 3

Điều kiện lên men: ở 280C; pH 5.2; 78 giờ 5% nấm men

Thu nhận bioethanol

Hình 3.36. Quy trình sản xuất bioethanol từ bã mía

134

Các bước thực thiện:

Xử lý cơ học:

Bã mía sau thu hoạch được xử lý cơ học bằng cách xấy khô, xử lý bằng cách

nghiền nhỏ bằng hệ thống nghiền bi (thiết bị Fritsch, Oberstein, CHLB Đức) và lọc

qua rây để đạt được kích thước khoảng 0,5 – 1,0 mm. Việc nghiền nhỏ với mục đích

phá vỡ một phần cấu trúc của tế bào, tăng diện tích tiếp xúc giữa axít và cơ chất. Tạo

điều kiện cho quá trình thủy phân diễn ra với hiệu suất cao nhất.

Xử lý bằng axít H2SO4:

Bã mía (10%; w/v) được xử lý bằng cách ngâm trong dung dịch H2SO4 loãng ở

nồng độ 0,1% và ủ ở 850C trong 2,5 giờ. Mục đích quá trình xử lý này giúp tách loại một

phần lignin, phá vỡ cấu trúc phức tạp và tăng khả năng xúc tác trên cấu trúc phân tử

cellulose. Bên cạnh đó, quá trình xử lý hóa học còn thủy phân hemicellulose có trong

thành phần sinh khối. Hemicellulose có cấu trúc phân nhánh với những chuỗi mạch ngắn

hơn so với cellulose. Do đó, việc thủy phân hemicellulose dễ dàng hơn thủy phân

cellulose. Hemicellulose bị thủy phân tạo điều kiện thuận lợi cho các tác nhân tiếp xúc

thủy phân cellulose bằng “enzyme cocktail” ở quá trình kế tiếp.

Điều chỉnh pH:

Điều chỉnh dung dịch sau chuyển hóa về pH 5 nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho

hỗn hợp “enzyme cocktail” chuyển hóa sinh học.

Bổ sung hỗn hợp “enzyme cocktail”:

Dịch chuyển hóa sau khi điều chỉnh về pH 5 tiếp tục được thủy phân bằng hỗn hợp

“enzyme cocktail” với thành phần bao gồm: Cell/Xyl: 100-160 U/gds, AltFAE: 7,56

U/gds và XpoAE: 10,8 U/gds, hỗn hợp được ủ ở 400C, pH 5, thời gian ủ 48 giờ trong điều

kiện có khuấy đảo liên tục 200 vòng/phút.

Bất hoạt enzyme cocktail:

Dịch sau thủy phân được bất hoạt enzyme bằng cách đun cách thủy ở 90oC trong

10 phút để dừng phản ứng chuyển hóa.

Ly tâm, loại bã và xác định tổng hàm lượng đường khử:

135

Lọc bỏ cặn bã mía đã thủy phân bằng cách lọc và ly tâm. Dịch sau quá trình

chuyển hóa được đem đi xác định tổng hàm lượng đường khử bằng phương pháp DNS.

Bổ sung thành phần dinh dưỡng:

Sau quá trình chuyển hóa dịch đường thu được bổ sung thêm một số thành phần

dinh dưỡng trong môi trường Hansen.

Điều chỉnh pH môi trường lên men:

Điều chỉnh pH 5.2 trong môi trường lên men bioethanol, công đoạn này nhằm mục

đích tạo điều kiện thuận lợi cho nấm men Saccharomyces cerevisiae SH1 phát triển.

Lên men bioethanol:

Để lên men bioethanol hiệu quả, quá trình lên men được thực hiện ở nhiệt độ

280C, pH 5.2, thời gian lên men 78 giờ, tỷ lệ nấm men bổ sung 5%, môi trường lên men

là dịch đường sau chuyển hóa được bổ sung thêm các thành phần từ môi trường hansen.

Chưng cất thu nhận bioethanol:

Kết thúc quá trình lên men tiến hành đo nồng độ bioethanol tạo thành trong dung

dịch bằng hệ thống chưng cất phân đoạn nhằm nâng cao độ tinh khiết của sản phẩm

bioethanol tạo thành. Bioethanol được bảo quản trong bình kín, thoáng gió, tránh ánh

sáng và các nguồn nhiệt.

Xác định tổng hàm lượng đường khử còn lại trong dung dịch sau lên men:

Sau khi kết thúc quá trình lên men trong dung dịch sẽ còn một lượng nhất định

đường khử (nhóm đường pentose) mà nấm men chưa hoặc không tiêu thụ được. Để đánh

giá hiệu suất của quá trình lên men ngoài việc xác định hàm lượng bioethanol tạo thành

thì việc xác định hàm lượng đường còn lại (chưa lên men) là cần thiết.

136

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Từ những kết quả nghiên cứu trên rút ra những kết luận như sau:

1. Phân lập được 44 chủng nấm thuộc 13 họ thuộc ngành nấm Túi (Ascomycota) và

nấm Đảm (Basidiomycota). Từ đó, sàng lọc được chủng nấm Xylaria polymorpha

A35 (135,4 U/l) có khả năng sinh tổng hợp acetyl esterase và chủng Alternaria

tenuissima SP66 (1154,4 U/l) có khả năng sinh tổng hợp feruloyl esterase cao.

2. Feruloyl esterase tinh sạch từ nấm Alternaria tenuissima SP66 (AltFAE) có trọng

lượng phân tử Mw = 30,3 kDa, hoạt tính đặc hiệu đạt 11,2 U/mg, enzyme hoạt động

tối ưu ở 420C, pH 7,0 và bền ở pH 5,0. Acetyl esterase tinh sạch từ nấm Xylaria

polymorpha A35 (XpoAE) có trọng lượng phân tử Mw = 44 kDa, hoạt tính đặc hiệu

đạt 13,1 U/mg, enzyme hoạt động tối ưu ở 420C, bền ở pH 5.0.

3. Bã mía được lựa chọn là nguyên liệu nghiên cứu phù hợp khi sử dụng hỗn hợp

“enzyme cocktail” thủy phân. Áp dụng mô hình quy hoạch thực nghiệm đã xác định

được điều kiện tối ưu cho hỗn hợp “enzyme cocktail” để chuyển hóa bã mía (10%,

w/v) thành các đường lên men được thực hiện ở nhiệt độ 400C, pH 5,0, thời gian ủ 48

giờ. Sử dụng thuật toán flexible quy hoạch phi tuyến xác định được phương trình quy

hồi mô tả hiệu quả quá trình thủy phân biểu thị thông qua tổng hàm lượng đường khử

tạo thành phụ thuộc vào thành phần và hoạt độ (x) của các “enzyme cocktail”

[Cell/Xyl (x1), AltFAE (x2) và XpoAE (x3)] tham gia chuyển hóa có dạng:

y = 206,946 + 29,954x1 + 5,501x2 + 7,323x3 + 2,288x2x3 – 7,011 2

1x tương ứng với

hoạt độ (U) của “enzyme cocktail” trên 1 gram cơ chất bã mía sử dụng là Cell/Xyl:

100 U/gds, AltFAE: 7,56 U/gds và XpoAE: 10,8 U/gds với giá trị Ymax = 251,86

mg/g.

4. Quá trình chuyển hóa bã mía được thực hiện ở điều kiện tối ưu bằng cách kết hợp

giữa xử lý hóa học bằng acid H2SO4 loãng ở nồng độ 0,1%, ủ trong 2,5 giờ, ở 850C

và xúc tác sinh học bằng hỗn hợp “enzyme cocktail” . Khi đó, tổng hàm lượng đường

khử sinh ra đạt 319,5 mg/g cơ chất, hiệu suất chuyển hóa từ bã mía thành đường đạt

137

49,8%. Trong đó, nồng độ glucose và xylose tương ứng là 195,4 mg/g và 60,4 mg/g,

các đường lên men khác chiếm khoảng 18%.

5. Quá trình lên men bioethanol thích hợp ở nhiệt độ 280C, pH 5.2, thời gian lên men 78

giờ, tỷ lệ nấm men 5% trong môi trường với thành phần là dịch đường sau chuyển

hóa bổ sung thêm các chất dinh dưỡng trong môi trường Hansen. Trong điều kiện

này, hàm lượng bioethanol tạo thành là 14,088g/l, hiệu suất lên men bioethanol từ bã

mía đạt 0,141 gram/gram, tương ứng 178ml bioethanol/kg bã mía. Hiệu suất lên men

từ dịch đường chuyển hóa đạt 79,8% so với lý thuyết. Điều này chứng minh cho khả

năng chuyển hóa bã mía bằng xúc tác sinh học thành dịch đường có khả năng lên

men thành bioethanol.

KIẾN NGHỊ

Để ứng dụng sản xuất enzyme thủy phân nói chung, feruloyl esterase và acetyl

esterase nói riêng trên quy mô công nghiệp thì việc nghiên cứu tăng năng suất sinh

tổng hợp hai enzyme này là cần thiết. Do đó, với những kết quả về xác định một số

đoạn peptide của enzyme tinh sạch, chúng tôi kiến nghị hướng nghiên cứu tiếp theo

là biểu hiện gen mã hóa cho feruloyl esterase và acetyl esterase tinh sạch từ hai

chủng nấm Alternaria tenuissima SP66 và Xylaria polymorpha A35 để sản xuất

enzyme tái tổ hợp.

138

DANH SÁCH CÔNG BỐ KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

A. Tạp chí quốc tế (SCIE):

1. Do Huu Nghi , René Ullrich, Franco Moritz , Le Mai Huong, Vu Dinh Giap, Do Huu

Chi, Martin Hofrichter, Christiane Liers. The Ascomycete Xylaria

polymorpha Produces an Acetyl Esterase That Solubilises Beech Wood Material to

Release Water-soluble Lignin Fragments. Journal Korean Soci Appl Biol Chem,

2015, 58 (3), 415-521.

2. D.H. Chi, V.D. Giap, L.P.H. Anh, and D.H. Nghi. An feruloyl esterase from

Alternaria tenuissima that hydrolyses lignocellulosic material to release

hydroxycinnamic acids. Applied Biochemistry and Microbiology, 2017, 53, (6),

654:660.

B. Tạp chí chuyên ngành trong nước:

1. Đỗ Hữu Nghị, Vũ Đình Giáp và Đỗ Hữu Chí. .Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp

enzyme axetyl (xylan) esterase của nấm Aureobasidium pullulans Var melanigenum

SH1 trên cơ chất là các phụ phẩm công-nông nghiệp giàu-lignicellulose. Tạp chí

nông nghiệp và phát triển nông thôn – kỳ 2 tháng 3/2016, 56-62.

2. Vũ Đình Giáp, Đỗ Hữu Chí, Lê Mai Hương, Đỗ Hữu Nghị. Nghiên cứu sinh tổng hợp

feruloyl esteraza bởi nấm trên môi trường nuôi cấy lỏng với cơ chất giàu

lignoxelluloza. TC Nông nghiệp & PTNT, 2016, 12, 103:110.

3. Đỗ Hữu Nghị, Lê Mai Hương, Lê Thị Bích Thảo, Vũ Đình Giáp, Nguyễn Trung

Hiếu, Đỗ Hữu Chí. Feruloyl esterase từ chủng nấm Alternaria tenuissima và khảo sát

hoạt tính chống oxy hóa của sản phẩm phản ứng enzyme. Tạp chí Y học VN, 2016,

445, 143:148.

4. Vu Dinh Giap, Do Huu Chi, Pham Hong Hai, Tang Thi Chinh, Do Huu Nghi. Using

experimental planning to optimize the hydrolysis of sugar cane bagasse into

fermentable sugars for bioethanol production by fungal enzyme mixture. Vietnam

Journal of Science and Technology, 2017, 55 (4), 419:428.

139

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. P. Kumar, M. Diane, J.L. Delwiche and P. Stroeve. Methods for Pretreatment of

Lignocellulosic Biomass for Efficient Hydrolysis and Biofuel Production.

Industrial & Engineering Chemistry Research, 2009, 48 (8), 3713–3729.

2. G. Cao, X. Zhang, S. Gong, F. Zheng. Investigation on emission factors of

particulate matter and gaseous pollutants from crop residue burning, Environ.

Sci., 2008, 20, 50 - 55.

3. Nguyễn Văn Vinh, Bùi Minh Trí, Hyeun Jong Bae. Đánh giá chất lượng một số

loại sinh khối thải từ mía, sắn và ảnh hưởng của kỹ thuật tiển xử lí nhằm chuyển

hóa thành cồn sinh học. Tạp chí sinh học, 2014, 36 (1se), 301-306.

4. H. Jorgensen, J. Bach Kristensen, C. Felby. Enzymatic conversion of

lignocellulose into fermentable sugars: challenges and opportunities, Biofuel.

Bioprod. Bior., 2007, 1, 119-134.

5. Y. Fukushima, B. Monties. Occurence, function and biosynthesis of lignins,

Wiley-VCH, Weinheim, Biopolymers, 2001,1, 1-64.

6. S. Kim, B.E. Dale. Global potential bioethanol production from wasted crops and

crop residues, Biomass Bioener., 2004, 26, 361-375.

7. H. Lilholt, M.J. Lawther. Natural organic fibres. Comprehensive composite

materials, Elsevier Science, 2000, 1, 303-325.

8. Hồ Sĩ Tráng. Cơ sở hoá học gỗ và cellulose, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật

Hà Nội, 30-81.

9. S. Park, O.J. Baker, M.E. Himmel, D.K. Parilla, P.A. Johnson. Cellulose

crystallinity index: measurement techniques and their impact on interpreting

cellulase performance. Biotechnol., Biofuels, 2010, 3, 1–10.

10. Nguyễn Thị Ngọc Bích. Kỹ thuật cellulose và giấy, Nhà xuất bản Đại học Quốc

gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2003.

140

11. W.R. De Souza. Microbial degradation of lignocellulosic biomass, Chandel A,

Da Silva, S. Sustainable degradation of lignocellulosic biomass techniques,

applications and commercialization. Brazil: InTech, 2013.

12. F.M. Girio, C. Fonseca, F. Carvalheiro, L.C. Duarte, S. Marques, R. Bogel-

Łukasik. Hemicelluloses for fuel ethanol: A review. Bioresource

Technology, 101, (13), 2010, 4775-4800.

13. R. Alen. Structure and chemical composition of wood In: Stenius P., editor.

(Ed.), Forest Prod Chem. Helsinki: 2000, 12–57.

14. Hetti Palonen. Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose, VTT

Biotechnology, 2004, 11-39.

15. A. Hatakka. Biodegradation of lignin. Biopolymers: Lignin, humic substances

and coal, 2001, 1, 129-180.

16. Y.L. Lin, C.W. Dence. In: Methods in lignin chemistry. 1st ed. New York:

Springer-Verlag Berlin, 1992.

17. http://www.pvn.vn/?portal=news&page=detail&category_id=11&id=516,

11/6/2018.

18. Lê Quang Diễn, Phạm Tuấn Anh, Tô Kim Anh, Nguyễn Thị Minh Nguyệt. Thu

nhận xenlulozơ từ bã mía cho sản xuất ethanol sinh học theo phương pháp xử lý

với axit axetic. Tạp chí hóa học, 2015, 53 (1), 50-55.

19. https://www.mard.gov.vn/Pages/hoi-nghi-tong-ket-san-xuat-nien-vu-mia-duong-

2016-2017.aspx, 29/6/2018.

20. A. Pandey, C.R. Soccol, P. Nigam, V.T. Soccol. Biotechnological potential of

agro-industrial residues. I. Sugarcane bagasse, Bioresour. Technol., 2000, 74,

69-80.

21. A.P. Fernandes, C.A. Alves, C. Gonc¸alves, L. Tarelho, C. Pio, C. Schimdlb và

H. Bauerb. Emission factors from residential combustion appliances burning

Portuguese biomass fuels, Journal of Environmental Monitoring, 13, 2011, 3196-

3206.

141

22. J.S. Van Dyk, B.I. Pletschke. Lignocellulose bioconversion using enzymatic

hydrolysis and synergistic cooperation between enzymes--factors affecting

enzymes, conversion and synergy. Biotechnol., 2012, 30, 1458-1480.

23. M. Latha Gandla, C. Martín and J. Jönsson. Analytical Enzymatic

Saccharification of Lignocellulosic Biomass for Conversion to Biofuels and Bio-

Based Chemicals. Energies. 2018, 11, 2936.

24. C. Martin, B. Alrikkson, A. Sjode, N. Nilverbant, L.J. Jonsson. Dilute sulphuric

acid pretreatment of agricultural and agro-industrial residues for ethanol

production. Appl. Biochem. Biotechnol., 2007, 136, 339–352.

25. I. Cybulska, H. Lei, J. Julson, Hydrothermal pretreatment and enzymatic

hydrolysis of Prairie cord grass. Energy Fuels, 2010, 24, 718–727.

26. Y. Sun, J. Cheng. Hidrolysis of lignocellulosic bagasses for ethanol production: a

review. Bioresour. Technol., 2002, 83, 1–11.

27. J.D. McMillan, M.E. Himmel, J.O. Baker, R.P. Overend, Pretreatment of

lignocellulosic biomass. In: Enzymatic ConVersion of Biomass for Fuels

Production; American Chemical Society: Washington, DC, 1994, 292-324.

28. M.J. Taherzadeh, K. Karimi. Acid-based hydrolysis processes for ethanol from

lignocellulosic materials: a review, Bio Resour., 2007, 2, 472-499.

29. Zhanying Zhang, Ian M. O’Hara, Sagadevan Mundree, Baoyu Gao, Andrew S

Ball, Nanwen Zhu, Zhihui Bai and Bo Jin. Biofuels from food processing wastes,

Current Opinion in Biotechnology, 2016, 38, 97–105.

30. K. Kucharska, P. Rybarczyk, I. Hołowacz, R. Łukajtis, M. Glinka and M.

Kaminski. Pretreatment of Lignocellulosic Materials as Substrates for

Fermentation Processes. Molecules, 23(11), 2018, 29-37.

31. L. Keikhosro Karimi. Mohammad, Taherzadeh. Pretreatment of Lignocellulosic

Wastes to Improve Ethanol and Biogas Production, International Journal of

Molecular Sciences, 2008, 9, 1621-1651.

142

32. R.A. Silverstein, Y. Chen, R.R. Sharma-Shivappa, M.D. Boyette, J. A. Osborne.

Comparison of chemical pretreatment methods for improving saccharification of

cotton stalks. Bioresour. Technol., 2007, 98, 3000-3011.

33. B.C. Saha, B.I. Loren, M.A. Cotta, Y.V. Wu. Dilute acid pretreatment, enzymatic

saccharification and fermentation of wheat straw to ethanol. Process Biochem.,

2005, 40, 3693-3700.

34. Trần Đình Toại, Nguyễn Thị Vân Hải. Động học các quá trình xúc tác sinh học,

NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 2005.

35. D.B. Wilson. Cellulases and biofuels. Curr. Opi. Biotechnol., 2009, 20, 295-299.

36. P. Roberts, S. Evans. The Book of Fungi: A Life-Size Guide to Six Hundred

Species from around the World. University of Chicago Press, Chicago and

London, UK, 2011.

37. Trịnh Tam Kiệt. Nấm lớn ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công

nghệ, 1 (Tái bản lần thứ 2), 2011.

38. C. Liers, R. Ullrich, K.T. Steffen, A. Hatakka, M. Hofrichter. Mineralization of

14C-labelled synthetic lignin and extracellular enzyme activities of the wood-

colonizing ascomycetes Xylaria hypoxylon and Xylaria polymorpha. Appl

Microbiol Biotechnol., 2006, 69 (5), 573-579.

39. D.W. Wong. Feruloyl esterase: a key enzyme in biomass degradation. Appl.

Biochem. Biotechnol., 2006, 133, 87-112.

40. H. Mori, K. Kawabata, N. Yoshimi. Chemopreventive effects of ferulic acid on

oral and rice germ on large bowel carcinogenesis. Anticancer Res., 1999, 19,

3775-3778.

41. Yang Ling Liang, Zheng Zhang, Min Wu and Jia Xun Feng. Isolation, screening

and identification of cellulolytic bacteria from natural reserves in the subtropical

region of china and optimization of cellulose production by Paenibacillus terrae

ME27-1. BioMed Research International, 2014, 2014, 497-512.

143

42. Dương Minh Lam, Đỗ Đức Quế, Trần Huyền Trang. Thành phần loài Xylaria ở

Vườn Quốc gia Cúc Phương, Ninh Bình. Báo cáo số 135, 4th National conference

on ecology and biological resources, 2011, Hanoi.

43. Parveen Kumar, M. Diane Barrett, J. Michael Delwiche and Pieter Stroeve.

Methods for Pretreatment of Lignocellulosic Biomass for Efficient Hydrolysis and

Biofuel Production. Industrial & Engineering Chemistry Research, 2009, 48 (8),

3713–3729.

44. P. Elba, S. Bon, Maria Antonieta Ferrara. Bioethanol production via enzymatic

hydrolysis of cellulosic biomass. FAO seminar held in Rome, 2015, 58 (3), 415-

521.

45. D. Peters. Raw materials. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol, 2007, 105, 1-30.

46. H. Lee, R.J. To, R.K. Latta. Some properties of extracellular acetylxylan esterase

produced by the yeast Rhodotorula mucilaginosa. Appl. Environ. Microbiol.,

1987, 53, 2831-2834.

47. T. Juha´sz, Z. Szengyel, K. Re czey, M. Siika-Aho, L. Viikari. Characterization

of cellulases and hemicellulases profuced by Trichoderma reesei on various

carbon sources. Process Biochem., 2005, 40, 3519 – 3925.

48. Martina Andlar, Tonci Rezi, Nenad Marđetko, Daniel Kracher, Roland Ludwig,

Bozidar Santek. Lignocellulose degradation: An overview of fungi and fungal

enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences.

Eng. Life Sci. 2018, 0, 1–11.

49. J.R.K. Cairns and A.Esen. β-Glucosidases, Cellular and Molecular Life Sciences,

2010, 67 (20), 3389-3405.

50. F. Haagensen, B.K. Ahring. Enzymatic hydrolysis and glucose fermentation of

wet oxidized sugarcane bagasse and rice straw for bioethanol production,

Environment Microbiology & Biotechnology Research Group, Technical

University of Denmark.

144

51. H. Punnapayak, G.H. Emert. Use of pachysolen tannophilus in simultaneous

Saccharification and Fermentation (Ssf) of lignocelluloslcs. Biotechnol. Lett,,

1986, 8, 63-66.

52. M. Dashtban, H. Schraft, and W. Qin. Fungal bioconversion of lignocellulosic

residues; opportunities & perspectives, International journal of biological

sciences, 2009, 4, 5(6), 578-595.

53. A. Chana, and T. Satyanarayana. Xylanase production by thermophilic Bacillus

licheniformis A99 in solid-state fermentation, Enzyme and Microbial Technology,

2009, 21 (1), 12-17.

54. M. Taniguchi, H. Suzuki, D. Watanabe, K. Sakai, K. Hoshino and T. Tanaka.

Evaluation of pretreatment with Pleurotus ostreatus for enzymatic hydrolysis of

rice straw, Journal of bioscience and bioengineering, 2005, 100 (6), 637-643.

55. M. Kurakake, N. Ide and N. Komaki. Biological pretreatment with two bacterial

strains for enzymatic hydrolysis of office paper, Current microbiology, 2007, 54

(6), 424-428.

56. P. Biely. Microbial carbohydrate esterases deacetylating plant polysaccharides.

Biotechnol. Adv. 2012, 30, 1575-1588.

57. M. Sundberg, K. Poutanen, P. Markkanen & M. Linko. An extracellular esterase

of Aspergillus awamori. Biotechnol. Appl. Biochem. 1990, 12, 670-680.

58. J. Linden, M. Samara, S. Decker. Purification and characterization of an acetyl

esterase from Aspergillus niger. Biotechnol. Appl. Biochem, 1994, 45, 383-393.

59. P. Christakopoulos, D. Mamma, D. Kekos & B. Macris. Enhanced acetyl esterase

production by Fusarium oxysporum. World J. Microbiol. Biotechnol. 1999, 15,

443-446.

60. C.B. Faulds, G. Williamson. Purification and characterization of a ferulic acid

esterase (FAE-111) from Aspergillus niger: specificity for the phenolic moiety

and binding to microcrystalline cellulose. Microbiol., 1994, 140, 779-787.

145

61. S. Mathew, T.E. Abraham. Ferulic acid: an antioxidant found naturally in plant

cell walls and feruloyl esterases involved in its release and their applications.

Crit. Rev. Biotechnol., 2004, 24, 59-83.

62. V.F. Crepin, C.B. Faulds. Connerton IF. Functional classification of the

microbial feruloyl esterases. Appl Microbiol Biotechnol. 2004, 63(6), 647-52.

63. T. Koseki, A. Hori, S. Seki, T. Murayama & Y. Shiono. Characterization of two

distinct feruloyl esterazas, AoFaeB and AoFaeC, from Aspergillus oryzae. Appl.

Microbiol. Biotechnol. 2009, 83, 689-696.

64. R.P. Jolie, T. Duvetter, A.M. Van Loey & M.E. Hendrickx. Pectin methylesteraza

and its proteinaceous inhibitor. Carbohydr. Res. 345, 2583-2595.

65. I. Benoit, D. Navarro, N. Marnet. Feruloyl esterases as a tool for the release of

phenolic compounds from agro-industrial by-products. Carbohydr. Res., 2006,

341, 1820-1827.

66. E.G. Benoit, R.J. Danchin, R.P. Bleichrodt. Biotechnological applications and

potential of fungal feruloyl esterases based on prevalence, classification and

biochemical diversity. Biotechnol. Lett. 2008, 30, 387-396.

67. J.B. Sutherland and D . L . Crawford. Lignin and glucan degradation by

species of the Xylariaceae. Trans. Br. Mycol. Soc. 1981, 76, 335-337.

68. S. Mani, G. Lope, A. Tabil, K. Opoku. Bioethanol from Agricultural Crop

Residues - an overview. ASAE/CSAE meeting presentation, Canada, 2002.

69. POET-DSM Advanced Biofuels LLC. First commercial-scale cellulosic ethanol

plant in the U.S. opens for business. www.poetdsm.com, 2014.

70. C. Krishnan, L.C. Sousa, M. Jin, L. Chang, B. Dale, V. Ebalan. Alkali-based

AFEX pretreatment for the conversion of sugarcane bagasse and cane leaf

residues to ethanol. Biotechnol. Bioeng., 2005, 107, 441–450.

71. C. Manochio, B.R. Andrade, R.P. Rodriguez, B.S. Moraes. Ethanol from

biomass: A comparative overview. Renew. Sust. Energ. Rev. 2017, 80, 743–755.

72. US Department of Energy/Energy Efficiency and Renewable Energy. Alternative

fuels data center (www.afdc.energy.gov).

146

73. C.R. Soccol, L.P.S. Vandenberghe, A.B.P. Medeiros, S.G. Karp, M. Buckeridge,

L.P. Ramos, A.P. Pitarelo, V. Ferreira-Leitao, L.M.F. Gottschalk, M.A. Ferrara,

E.P.S. Bon, L.M.P. Moraes, J.A. Araújo, F.A.G. Torres. Bioethanol from

lignocelluloses: status and perspectives in Brazil, Bioresour. Technol., 2010, 101,

4820-4825.

74. http://www.sinhhocvietnam.com/vn/modules.php?name=News&file=article&sid=

106, 27/7/2018.

75. US. Department of energy, energy information administration (EIA, 2016a),

2000-12 data; renewable Fuels Association (RFA, 2017), 2013-16 data.

76. E.P. Deurwaarder, J.H. Reith. Bioethanol in Europe - Overview and comparison

of production, GAVE programme.

77. http://www.agroviet.gov.vn, 11/6/2018.

78. Đỗ Trung Sỹ, Luận án Tiến Sĩ. Nghiên cứu chuyển hóa rong biển, phế thải nông

nghiệp chứa carbohydrate thành ethanol sử dụng xúc tác sinh học, 2016, Học

Viện Khoa học và Công nghệ.

79. Phan Đình Tuấn. Nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ rơm rạ, TCVN 4993

– 89, 2008.

80. J. Szczodrak, J. Fiedurek. Technology for conversion of lignocellulosic biomass to

ethanol. Biomass Bioenergy, 1996, 10 (5e6), 367- 375.

81. A.B.M.S. Hossain, S. Saleh, A.A. Aishah, A.N.Boyce, P.P. Chowdhury,

Naquiddin M., Bioethanol production from agricultural waste biomass as

arenewable bioenergy resource in biomaterials, IFMBE proceedings, 2008, 21.

82. R. Banerjee and A. Pandey. Bio-industrial applications of sugarcane bagasse: A

technological perspective. International Sugar Journal, 2002, 104 (1238), 64, 66–

67.

83. Nguyên Đức Minh. Tương lai của diesel sinh học, Báo cáo số 7, April 28th-2017,

National conference on biological resources, 2017, Hanoi.

84. P. Binod, K.U. Janu, R. Sindhu, A. Pandey. Hydrolysis of lignocellulosic biomass

for bioethanol production. In: Pandey, A., Larroche, C., Ricke, S.C. (Eds.),

147

Biofuels: Alternative Feedstocks and Conversion Processes. Elsevier Inc., USA,

2011, 229–250.

85. M. Balat. Production of bioethanol from lignocellulosic bagasses via the

biochemical pathway: a review. Energ. Convers. Manage. 2011, 52, 858–875.

86. Parameswaran Binod, Bioethanol production from rice straw:An

overview, Bioresource Technology, 2010, 101, 4767–4774.

87. M. Roehr. The Biotechnology of ethanol classical and future application,

Weinheim, WILEY-VCH Verlag GmbH, 2001.

88. Saha, C. Badal. Dilute acid pretreatment, enzymatic saccharification and

fermentation of wheat straw to ethanol, Process Biochemistry, 2005, 40 (12),

3693-3700.

89. Antonio Rodrı ıguez-Chong, Josee Alberto Ramı ırez, Gil Garrote. Hydrolysis of

sugar cane bagasse using nitric acid: a kinetic assessment, Journal of Food

Engineering, 2004, 61, 143–152.

90. Satriyo Krido Wahonoa, Cici Darsiha, Vita T. Rosyida, Roni Maryana, Diah

Pratiwi. Optimization of Cellulose Enzyme in the Simultaneous Saccharification

and Fermentation of Sugarcane Bagasse on the Second-Generation Bioethanol

Production Technology. Energy Procedia, 2014, 47, 268-272.

91. S.C. Rabelo, N.A. Amezquita Fonseca, R.R. Andrade, R. Maciel Filho, A.C.

Costa. Ethanol production from enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse

pretreated with lime and alkaline hydrogen peroxide. Biomass and bioenergy,

2011, 35, 2600-2607.

92. Maria Carolina de Albuquerque Wanderley, Carlos Martín, George Jackson de

Moraes Rocha, Ester Ribeiro Gouveia. Increase in ethanol production from

sugarcane bagasse based on combined pretreatments and fed-batch enzymatic

hydrolysis. Bioresource Technology. 2013, 128, 448–453.

93. N. Carlo, Hamelinck, Greertje van Hooijdonk, André PC Faaij. Ethanol from

lignocellulosic biomass: techno-economic performance in short – middle - and

long - term, Biomass and bioenergy, 2005, 28, 384-410.

148

94. B.O. Aderemi, E. Abu, B.K. Highina. The kinetics of glucose production from

rice straw by Aspergillus niger, African Journal of Biotechnology, 2008, 7 (11),

1745-1752.

95. S. Abedinifar, K. Karimi, M. Khanahmadi, M.J. Taherzadeh. Ethanol production

by Mucor indicus and Rhizopus oryzae from rice straw by separate hydrolysis

and fermentation. Biomass Bioenergy, 2009, 33, 828-833.

96. A. Abdulkareem, Saka Member, S. Ayo. Afolabi, Member and M.U. Ogochukwu.

Production and Characterization of Bioethanol from Sugarcane Bagasse as

Alternative Energy Sources, Proceedings of the World Congress on Engineering,

2015, Vol II WCE 2015 july 1-3, London, UK.

97. http://www.vinachem.com.vn, 16/6/2018.

98. Harshvadan Patel, Digantkumar Chapla, Amita Shah. Bioconversion of pretreated

sugarcane bagasse using enzymatic and acid followed by enzymatic hydrolysis

approaches for bioethanol production, Renewable Energy, 2017, 109, 323-331.

99. Yến. L.T.H, Thủy. N.T.P, Đức. N.A. Bước đầu nghiên cứu khả năng sinh enzyme

phân hủy xác thực vật của nhóm nấm sợi phân lập từ lá cây rụng ở Việt nam, Tạp

chí Di truyền học và ứng dụng, 2009, 5, 15-21.

100. Nguyễn Văn Vinh, Bùi Minh Trí, Hyeun Jong Bae. Đánh giá chất lượng một số

loại sinh khối thải từ mía, sắn và ảnh hưởng của kỹ thuật tiển xử lí nhằm chuyển

hóa thành cồn sinh học. Tạp chí sinh học, 2014, 36 (1se), 301-306.

101. http://www.vpct.gov.vn/Trangch%E1%BB%A7/tabid/53/KHCNCommand/task

Details/TaskID/229/Default.aspx, 23/7/2018.

102. D.H. Nghi, B. Bittner, H. Kellner. The wood-rot ascomycete Xylaria

polymorpha produces a novel GH78 glycoside hydrolase that exhibits α-L-

rhamnosidase and feruloyl esterase activity and releases hydroxycinnamic acids

from lignocelluloses, Appl. Environ. Microbiol., 2012, 78, 4893-4901.

103.Do Huu Nghi , René Ullrich, Franco Moritz , Le Mai Huong, Do Huu Chi, Martin

Hofrichter, Christiane Liers. The Ascomycete Xylaria polymorpha Produces an

149

Acetyl Esterase That Solubilises Beech Wood Material to Release Water-soluble

Lignin Fragments, Journal Korean Soci Appl Biol Chem, 2015, 58 (3), 415-521.

104. E.N. Bannerman and J. Nicolet. Isolation and characterization of an enzyme

with esterase activity from Micropolyspora faeni. Appl. Environ. Microbiol.

1976, 32(1):138.

105. Nguyễn Hoài Hương, Bùi Văn Thế Vinh. Báo cáo thực hành hóa sinh, trường

đại học kĩ thuật công nghệ thành phố Hồ Chí Minh, 2009.

106. J.J. Doyle, A rapid ADN isolation procedure for small quantities of fresh leaf

tissue. Phytochemical Bulletin, 1987, 19, 11-15.

107. T.J. White, T. Bruns, S. Lee, J. Taylor. Amplification and direct sequencing of

fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR Protocols: a guide to

methods and applications. (Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ, eds).

Academic Press, New York, USA, 1990, 315–322.

108. T.A. Hall, BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and

analysis program for Windows 95/98/NT, Nucl. Acids. Symp. Ser., 1999, 41, 95-

98.

109. K.B. Nicholas, H.B.J. Nicholas. GeneDoc 2.7: a tool for editing and annotating

multiple sequence alignments, 1997.

110. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.

111. K. Tamura, G. Stecher, D. Peterson, A. Filipski, S. Kumar, MEGA6.0.6:

Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0.6. Mol. Biol. Evol., 2013,

30, 2725-2729.

112. H. Lee, R.J. To, R.K. Latta, P. Biely and H. Schneider. Some properties of

extracellular acetylxylan esterase produced by the yeast Rhodotorula

mucilaginosa. Appl. Environ. Microbiol. 1987, 53, 2831-2834.

113. D.L. Blum, I.S. Kataeva, X.L. Li and L.G. Ljungdahl. Feruloyl esterase

activity of the Clostridium thermocellum cellulosome can be attributed to

previously unknown domains of XynY and XynZ. J. Bacteriol. 2000, 182, 1346-

1351.

150

114. T.K. Kirk, R.L. Farrell. Enzymatic “combustion”: the microbial degradation of

lignin. Annu. Rev. Microbiol., 1987, 41, 465-505.

115. C. Dupont, N. Daigneault, F.Shareck, R. Morosoli and D. Kluepfel.

Purification and characterization of an acetyl xylan esterase produced by

Streptomyces lividans. Biochem. J. 1976, 319, 881-886.

116. M. M. Bradford. Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram

Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding, Analytical

Biochemistry, 1976, 72, 248-254.

117. U.K . Laemmli. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head

of bacteriophage T4. Nature, 1970, 227, 680-685.

118. R. Chandraju, S. Mythily, C. Chidan Kumar. Liquid Chromatography/Mass

Spectroscopy and TLC Analysis for the Identification of Sugars Extracted from

the Outer Skin of Almond Fruit (Prunus dulcis), Recent Research in Science and

Technology, 2011, 3 (7), 58-62.

119. P. Muzikar, et al. Accelerator Mass Spectrometry in Geologic Research,

Geological Society of America Bulletin v., 2003, 115, 643 - 654.

120. G.L. Miller. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing

sugar, Anal. Chem., 1959, 3, 426-428.

121. Hoàng Minh Nam. Nghiên cứu công nghệ sản xuất và thiết bị liên tục xử lý rơm

xạ bằng hơi nước để lên men ethanol, 2009. Báo cáo đề tài cấp Bộ. Trường Đại

học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh.

122. ĐLVN 291:2016. Ethanol standard solution - Testing procedure, Văn bản kỹ

thuật đo lường Việt Nam, dung dịch chuẩn cồn quy trình thử nghiệm.

123. College of Science, University of Canterbury. Determination of Ethanol

Concentration in Aqueous Solutions. Christchurch new zbaland, New Zealand.

124. Nguyễn Minh Tuyền. Quy hoạch thực nghiệm, NXB Khoa học và Kỹ thuật. Hà

Nội, 2007.

125. Phạm Hồng Hải, Ngô Kim Chi. Xử lý số liệu và quy hoạch thực nghiệm trong

nghiên cứu hóa học, NXB Khoa học tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội, 2007.

151

126. K. Poutanen, J. Puls. Characteristics of Trichoderma reesei β-xylosidase and

its use in the hydrolysis of solubilized xylans. Appl Microbiol Biotechnol, 1988,

28, 425–432.

127. F.J.M. Kormelink, B. Lefebvre, F. Strozyk, A.G.J. Voragen. Purification and

characterization of an acetyl xylan esterase from Aspergillus niger. J.

Biotechnol., 1993, 27, 267-282.

128. S. Tsujiyama and N. Nakano. Distribution of acetyl esterase in wood-rotting

fungi. Mycoscience, 1996, 37, 289–294.

129. P. Basaran, Y.D. Hang. Purification and characterization of acetyl esterase

from Candida guilliermondii, Applied microbiology, 2000, 30(2),167-171.

130. S. Atta, S. Ali, M.N. Akhtar and I. Haq. Determination of some significant batch

culture conditions affecting acetyl-xylan esterase production by Penicillium

notatum NRRL-1249, BMC Biotechnol. 2011, 11: 52.

131. G. Degrassi, B.C. Okeke, C.V. Bruschi and V. Venturi. Purification and

characterization of an acetyl xylan esterase from Bacillus pumilis. Appl. Environ.

Microbiol. 1998, 64(2), 789-792.

132. T. Koseki, S. Furuse, K. Iwano, H. Sakai and Matsuzawa. An Aspergillus

awamori acetylesterase: purification of the enzyme, and cloning and sequencing

of the gene. Biochem J. 1997, 326, 485-490.

133. Shiyi Ou, Jing Zhang, Yong Wang, and Ning Zhang. Production of Feruloyl

Esterase from Aspergillus niger by Solid-State Fermentation on Different Carbon

Sources. Enzyme Research, 2011, Article ID 848939.

134. Michele Asther, Mireille Haon, Sevastianos Roussos, Eric Record. Feruloyl

esterase from Aspergillus niger: a comparison of the production in solid state and

submerged fermentation. Article in Process Biochemistry, Process Biochemistry,

2002, 38, (5), 685-691.

135. J.A. Donaghy, A.M. McKay. Production of feruloyl/rho-coumaroyl esterase

activity by Penicillium expansum, Penicillium brevicompactum and Aspergillus

niger. J. Appl Bacteriol. 1995 Dec, 79 (6), 657-62.

152

136. R.E. Purdy, P.E. Kolattukudy. Depolymerisation of a hydroxy fatty acid

biopolymer, cutin, by an extracellular enzyme from F. solani f. pisi isolation and

some properties of the enzyme. Arch. Biochem. Biophys., 1973, 159, 61–69.

137. W. Zhoua, X. Liub, L . Yec. The biotransformation of astragalosides by a novel

acetyl esterase from Absidia corymbifera AS2, Process Biochem., 2014, 49, 1464-

1471.

138. Rossana Liguori, Elena Ionata, LoredanaMarcolongo, Luciana Porto de Souza

Vandenberghe, Francesco La Cara and Vincenza Faraco1. Optimization of Arundo

donax Saccharification by (Hemi)cellulolytic Enzymes from Pleurotus ostreatus.

BioMed Research International , 2015, Article ID 951871.

139. A. Ruangmee and C. Sangwichien. Response surface opti-mization of enzymatic

hydrolysis of narrow-leaf cattail for bioethanol production, Energy Conversion

and Management, 2013, 73, 381-388.

140. Ilona Sárvári Horváth, Carl Johan Franzén, Mohammad J. Taherzadeh, Claes

Niklasson, Gunna Lidén. Effect of Fufural on the Respiratory Metabolism of

Saccharomyces Cerevisiae in Glucose-Limited Chemostats, American Scociety

for Microbiology, 2004, 69, 4076-4086.

141. A. Shatalov and H. Pereira. Xylose production from giant reed (Arundo donax

L.): modeling and optimization of dilute acid hydrolysis, Carbohydrate Polymers,

2012, 87 (1), 210-217.

142. C.E. Wyman, B.E. Dale, R.T. Elander, M. Holtzapple, M.R. Ladisch, Y.Y. Lee.

Comparative sugar recovery data from laboratory scale application of leading

pretreatment technologies to corn stover. Bioresour. Technol. 2005, 96, 2026–

2032.

143. Lương Đức Phẩm. Nấm men công nghiệp, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 2006.

144. Le Mini Guide Des Champignons by Jean Marie Polese, NXB Konemann,

2000.