FULL-LENGTH, GLYCOSYLATED NSP4 IS LOCALIZED TO PLASMA MEMBRANECAVEOLAE BY A NOVEL RAFT ISOLATION TECHNIQUEStephen M. Storey, Thomas F. Gibbons, Cecelia V. Williams, Rebecca D. Parr,Friedhelm Schroeder, and Judith M. BallINSTITUTO VENEZOLANO DE INVESTIGACIONES CIENTIFICASMAESTRIA BIOLOGIA DE LA REPRODUCCION HUMANABIOLOGIA CELULARE.G.: JHONNY GONZALEZ

CADENA LARGA GLICOSILADA DE NSP4 LOCALIZADO EN LA MEMBRANA PLASMTICA CAVEOLAS HA SIDO AISLADA POR UNA NUEVA TCNICA DE BALSA.INTRODUCION1955 observacin, llamadas pequenno bolsillo, vesculas, cuevas comunicando con el exterior en epitelio biliar1968 Bruns y Palade proponen que las caveolas estn involucradas en el movimiento transcelular y que intervienen en la captacin del cido flico mediado por receptor1992 descubrimiento de la caveolina, marcador de las caveolasLas caveolas se generan a nivel de los rafts lipdicos de membrana

CADENA LARGA GLICOSILADA DE NSP4 LOCALIZADO EN LA MEMBRANA PLASMTICA CAVEOLAS HA SIDO AISLADA POR UNA NUEVA TCNICA DE BALSA.INTRODUCIONCaveolas son un subconjunto de balsas lpidicas definida por la presencia de protenas caveolinas (caveolin - 1, -2 o -3) (50, 51) .Balsas lpidicas se definen principalmente a una coleccin de membranas celulares insoluble en detergentes anionicos a 4 C.Enriquecida con colesterol, esfingomielina, y glicolpidos, que producen un lquido o fase gel.

CADENA LARGA GLICOSILADA DE NSP4 LOCALIZADO EN LA MEMBRANA PLASMTICA CAVEOLAS HA SIDO AISLADA POR UNA NUEVA TCNICA DE BALSA. NSP4 Rotavirus, caracterizo como un receptor del retculo endoplasmtico intracelular, es una enterotoxina viral multifuncional que induce diarrea .Para determinar si el trfico NSP4 es especfico a un subconjunto de balsas en la membrana plasmtica, se aisl caveolas de un material de membrana plasmtica enriquecido y se obtuvo membranas libres de caveola del retculo endoplamtico y balsas de membrana plasmtica marcadas. Este estudio presenta un protocolo para el aislamiento RE contaminado libre de caveola; Describe la presencia de cadenas largas NSP4, glicosiladas H sensibles en la membrana plasmtica caveolas; y confirmacin que la NSP4 - caveolin interaccina en presencia y en ausencia de otras protenas virales.

CADENA LARGA GLICOSILADA DE NSP4 LOCALIZADO EN LA MEMBRANA PLASMTICA CAVEOLAS HA SIDO AISLADA POR UNA NUEVA TCNICA DE BALSA.MATERIALES Y METODOSAnticuerpos y reactivos. Abs dirigidos contra ATPasa Na / K , calnexina, catrina, y la toxina de clera.Purificado subunidad B de la toxina del clera .Generacin abs contra la NSP4 150 175 Fab. segmentos,(FRET)Cultivos de clulas y virus . MDCK, clulas HT29.f8.

CADENA LARGA GLICOSILADA DE NSP4 LOCALIZADO EN LA MEMBRANA PLASMTICA CAVEOLAS HA SIDO AISLADA POR UNA NUEVA TCNICA DE BALSA.MATERIALES Y METODOSCultivados en medio de mantenimiento con 4,5 g / litro de glucosa, l- glutamina, y piruvato de sodio; suplementado con 2 mM de glutamina l, 1 mM de piruvato de sodio , 0 .1 MM aminocido no esenciales, 100 U / litro penicilina, 100 g / litro estreptomicina, 0,25 g / litro anfotericina B (10.000 U, de la penicilina - 10, 000 U, de la estreptomicina - 25 g / Litro anfotericina B; 43,9 mM de bicarbonato de sodio, 5% suero bovino fetal, y 5% de Suero Supremo a 37 C en 5% de CO2 a 37 C en 5% de CO2.

CADENA LARGA GLICOSILADA DE NSP4 LOCALIZADO EN LA MEMBRANA PLASMTICA CAVEOLAS HA SIDO AISLADA POR UNA NUEVA TCNICA DE BALSA.MATERIALES Y METODOSel virus fue sonicado, incubadas en suero libre de DMEM con 5 g / ml de tripsina por 30 minutos a 37 C, y luego se incuban con las clulas por 60 minutos a 37 C en 5% de CO2. inculo fue sustituido con suero libre de DMEM suplementado con 1 g / ml de tripsina, y las clulas se incubaron por un perodo adicional de 7,5 o 24 horas.Las clulas HT29.f8 fueron cultivadas en vidrio para poder analizar las imgenes M.C. y FRET.Transfeccin NSP4,clulas MDCK y HT29.f8 con plsmido de ADN pcDNA3.2D NSP41 - 175 utilizando nucleoinfeccion.

MATERIALES Y METODOSCuantificacin Protena Aislamiento de caveola EM: se tieron negativamente con cido phosphotungstic 2%,l pH 7,0, .Microscopio confocal anlisis Western blotfretCADENA LARGA GLICOSILADA DE NSP4 LOCALIZADO EN LA MEMBRANA PLASMTICA CAVEOLAS HA SIDO AISLADA POR UNA NUEVA TCNICA DE BALSA.

CADENA LARGA GLICOSILADA DE NSP4 LOCALIZADO EN LA MEMBRANA PLASMTICA CAVEOLAS HA SIDO AISLADA POR UNA NUEVA TCNICA DE BALSA.RESULTADOSDistribucin intracelular de protenas y lpidos marcadores con Triton X - 100 se obtuvieron fracciones membrana (DRM). Cantidades iguales del total de protenas de las clulas lisado, DRM, y DSM fracciones de las clulas MDCK fueron estudiadas por la presencia de marcadores celulares especficos (cuadro 1) por Western Blot,se utilizaron antisueros especficos para detectar caveolin - 1 (A) y flotillin - 1 (B). (C) - B CT y CT - B -se utilizo antisueros especficos para detectar los niveles de la caveola localizados lpidos GM1 por punto secante. (D, E, yF)marcadores especficos del antisuero identificaron la distribucin de la contaminacin de la membrana ER (calnexin) (D), balsa no lpidos PM (Na / K - ATPasa subunidad ) (E), y clathrin abrigos (clathrin pesados Cadena) (F).

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CADENA LARGA GLICOSILADA DE NSP4 LOCALIZADO EN LA MEMBRANA PLASMTICA CAVEOLAS HA SIDO AISLADA POR UNA NUEVA TCNICA DE BALSA.Aislamiento de PM -La recuperacin del material PM - enriquecido fue optimizado para las clulas MDCK. Estas fracciones PM se utilizaron para aislar caveola libre de contaminantes en relacin con NSP4, en particular, ER contaminados. Esta fraccin PM enriquecida fue brevemente sonicada para romper la hojas grandes de membrana, y purificada por ConA y cromatografa por afinidad, y probado para caveola y noncaveola marcadas, y design CSC caveola.Diferenciacin y composicin de las protenasPara determinar si la composicin de protenas totales de la fraccin caveola CSC era similar a la de la fraccin DRM, se examinaron por tincin de plata. hubo distintos patrones de bandas para los DRM y CSC caveola, con una banda nica similares en las diferentes masas moleculares (Fig. 2). Las predominantes bandas DRM estuvieron presentes en 24 kDa y superiores, existe una notable diferencia en el contenido total de protena de la DRM y caveola CSC. La imgenes de EM de las caveola CSC mostr estructuras vesiculares de membrana (Fig. 3A)

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FIG.3.- 3. EM de imgenes y anlisis de la caveola CSC. Caveola CSC se tie negativamente con 2% cido phosphotungstic. (A) magnificacin digital de se utiliz para resolver la ultra estructura de las membranas a una resolucin de 1,52 pxeles por NM (barra indica 100 nm.) (B) Los anlisis de 161 discretos objetos revel la distribucin del tamao de las membranas en caveola CSC.CADENA LARGA GLICOSILADA DE NSP4 LOCALIZADO EN LA MEMBRANA PLASMTICA CAVEOLAS HA SIDO AISLADA POR UNA NUEVA TCNICA DE BALSA.

CADENA LARGA GLICOSILADA DE NSP4 LOCALIZADO EN LA MEMBRANA PLASMTICA CAVEOLAS HA SIDO AISLADA POR UNA NUEVA TCNICA DE BALSA.Caveola CSC - aisladas contuvieron marcadores de caveola en ausencia de ER perceptible y de los marcadores nonraft PM . Bandas especficas correspondientes a caveolin - 1 y flotillin - 1 y los spot especficos para GM1 confirm la presencia de cada marcador de caveola en el CSC caveola (Fig. 4A de la C). El perfil del marcador contaminante (Fig. 4D de la F) mostr que la composicin de protenas de la CSC caveola difiere de la de DRM aislado de las mismas celulas (Fig. 1). La ausencia de calnexina en las caveola CSC (Fig. 4D) demuestra que el mtodo de aislamiento CSC carece de las membranas contaminadas detectables endmica ER en la tcnica de DRM. Por lo tanto, preparacin de caveola CSC era conveniente en nuestros estudios para detectar NSP4 en PM caveola. La bandas relativamente intensa correspondientes a clathrin (26, 52, 59) y Na / K - ATPasa en la fraccin PM CSC, la ausencia de cantidades detectables de cualquier protena en caveola CSC indic que estos marcadores noncaveolar protenas estaban ausentes en la fraccin final Caveola CSC aislada de la PM del material enriquecido (Fig. 4E y F).

CADENA LARGA GLICOSILADA DE NSP4 LOCALIZADO EN LA MEMBRANA PLASMTICA CAVEOLAS HA SIDO AISLADA POR UNA NUEVA TCNICA DE BALSA.FIG.4 4. Distribucin intracelular de protenas y lpidos marcados en fracciones CSC - aislada de membrana. Cantidades iguales de protenas totales de homogenizadas (Homog), PNS, ER, PM, y fracciones aisladas de caveola (Cav) de clulas MDCK por aislamiento CSC fueron estudiados por la presencia del correspondientes marcadores (Cuadro 1). Pptido especficos de antisueros se utilizaron para detectar caveolin - 1 (A) y flotillin - 1 (B) por Western Blot. (C) - B CT y CT - B - antisueros especficos se han utilizado para detectar los niveles de la caveola localizados lpidos GM1 por punto secante. (D, E, yF) antisueros especficos maracado y western blot identifico la distribucin de la contaminacin de la membrana ER (calnexina) (D), no lpidos raft PM (Na / K - ATPasa subunidad ) (E), y clathrina cubierta de membranas (clathrin cadena pesada) (F) en cada una de las fracciones de membrana.

CADENA LARGA GLICOSILADA DE NSP4 LOCALIZADO EN LA MEMBRANA PLASMTICA CAVEOLAS HA SIDO AISLADA POR UNA NUEVA TCNICA DE BALSA.FIG.5.- 5. Distribucin de los marcadores intracelulares en caveola CSC en las clulas infectadas de RV Cantidades iguales de protenas totales fueron homogenizadas (Homog) y fracciones caveola aislada (Cav) de las clulas infectadas RV MDCK fueron estudiadas por un grupo de marcadores celulares (cuadro 1). antisueros especficos se utilizaron para detectar caveolin - 1 (A) y flotillin - 1 (B) por Western Blot. antisueros especficos identificaron la distribucin de la contaminacin de la membrana ER (calnexin) (C), no lpidos balsa PM (Na / K - ATPasa subunidad ) (D), y clathrin revestidos de membranas (clathrin pesados Cadena) (E) en cada fraccin de membrana.

CADENA LARGA GLICOSILADA DE NSP4 LOCALIZADO EN LA MEMBRANA PLASMTICA CAVEOLAS HA SIDO AISLADA POR UNA NUEVA TCNICA DE BALSA.FIG.6.- 6. Deteccin de cadenas largas, H - endo- sensibles NSP4 en caveola CSC aislados en clulas MDCK infectadas de RV. (A) Igual cantidades de protena total fueron homogenizadas, PNS, ER, PM, y caveola CSC (Cav) fracciones de modelo y RV - clulas MDCK infectadas fueron estudiadas para la presencia de NSP4 con NSP4150 - 175 - antisueros especficos. Homogenizados, PNS, ER, y PM mostraron fracciones NSP4 especficos con perfiles compatibles con los de bandas doblemente, por separado, y una cadena larga glicosilada de NSP4 (28, 24, y 20 kDa, respectivamente), adems de un ~ 16 kDa banda que puede ser Un dmero de la NSP4, fragmento (a 112 a 175). CSC caveola (carril 10) que figura doblemente glicosilada, de 28 kDa forma de NSP4, una cantidad relativamente pequea de 16 kDa se observ en banda cuando la pelcula fue en exceso (carril 11). (B)Cadena larga, H - endo- sensibles NSP4 estaba presente en caveola CSC aislados de clulas epiteliales infectados por de RV SA11

CADENA LARGA GLICOSILADA DE NSP4 LOCALIZADO EN LA MEMBRANA PLASMTICA CAVEOLAS HA SIDO AISLADA POR UNA NUEVA TCNICA DE BALSA.FIG.7.- 7. Asociacin de NSP4 con caveolin - 1 durante, antes y despus de la infeccin por rotavirus. RV - clulas MDCK infectadas se probaron con el anticuerpo primario. Fluorescencia de anticuerpos secundarios se fotografi con 488 - NM - y luego 647 - NM - longitud de onda . Las imgenes de simulacros (panel superior derecho), y RV (a la izquierda y el centro superior de los paneles) de las clulas infectadas en ausencia del anticuerpo primario se utilizaron para el control de la mancha especificidad e inespecficos vinculante de cada conjunto de abs. Tambin se muestran los datos adquiridos para caveolin - 1 y NSP4 y la fusin de imgenes (co localizationa; Caveolin - 1 est en verde, y NSP4 est en rojo). Las imgenes que se muestran son representativas de los resultados de cuatro experimentosNSP4 asocia con caveolin - 1, pero no con el aparato de Golgi protenas localizadas en las primeras y ltimas etapas de la infeccin por RV.

CADENA LARGA GLICOSILADA DE NSP4 LOCALIZADO EN LA MEMBRANA PLASMTICA CAVEOLAS HA SIDO AISLADA POR UNA NUEVA TCNICA DE BALSA.FIG.9.- 9. de NSP4 con caveolin - 1 en clulas transfectadas. HT29.f8 (arriba paneles) y MDCK (en la parte inferior paneles) clulas fueron transfectadas con pcDNA3.2D NSP41 - 175 plsmido de ADN y se probaron con el anticuerpos primarios. Caveolin - 1 (paneles a la izquierda) y NSP4 (en el centro grupos de trabajo) se muestran las distribuciones. Tenga en cuenta que slo uno de los dos HT29.f8 clulas transfectadas fue mostrado (NSP4 seal). Los grupos de la extrema derecha se fusionan las imgenes que muestra la colocalizacion de NSP4 (rojo) y caveolin - 1 (verde).La expresin NSP4 era suficiente para la colocalizacion con caveolin-1

En resumen, NSP4 es una glicoproteina de funciones multiples, compleja que interacta singularmente con molculas de la clula husped-vector. Los datos presentados es este documento confirman la presencia de NSP4 cadenas largas es PM caveola y la falta sealizacion en la red de Golgi, de un transporte PM. Se necesitan estudios adicionales pra determinar si transporte NSP4 depende de caveolin - 1 o caveola de circulacin intracelular y esclarecer plenamente las numerosas funciones de NSP4 durante la infeccin.CADENA LARGA GLICOSILADA DE NSP4 LOCALIZADO EN LA MEMBRANA PLASMTICA CAVEOLAS HA SIDO AISLADA POR UNA NUEVA TCNICA DE BALSA.

Gracias por su atencin