cambios bioquimicos antioxidantes naturales

Cambios bioquímicos durante el almacenamiento de puré de aguacate adicionado conantioxidantes naturales y procesado con alta presión hidrostática

Biochemical changes during the storage of high hydrostatic pressure processed avocado puree inthe presence of natural antioxidants

Daniel A. Jacobo-Velázqueza, Gerardo Castellanos-Dohnala, Porfirio Caballero-Matab and Carmen Hernández-Brenesa*aDepartment of Biotechnology and Food Engineering, School of Biotechnology and Food, Centro de Biotecnología-FEMSA, Tecnológicode Monterrey-Campus Monterrey. E. Garza Sada 2501 Sur, C.P. 64849, Monterrey, N.L., México; bCentro de Calidad Ambiental,Tecnológico de Monterrey-Campus Monterrey, E. Garza Sada 2501 Sur, C.P. 64849, Monterrey, N.L., México

(Received 29 October 2012; final version received 4 February 2013)

High hydrostatic pressure (HHP) is an effective strategy to improve the storage stability of avocado puree. However, during storage ofHHP-treated avocado puree, oxidative reactions take place affecting the fruit quality. Project objectives were to evaluate biochemicalchanges during the storage (4°C, 45 days) of HHP treated (600 MPa, 3 min) avocado puree in the presence of natural antioxidants(rosemary, thyme, and grapefruit-seed). After processing, residual activities of polyphenoloxidase (PPO) and lipoxygenase were 46% and58%, respectively. PPO activity increased during the first 10 days (2.9-fold) and subsequently returned to original levels. Formation ofhexanal and free fatty acids was observed during storage. Results indicated that certain natural phenolic extracts offer moderate protectionagainst the action of oxidative enzymes, and thus may improve the storage stability of HHP processed avocado paste.

Keywords: avocado; high hydrostatic pressure (HHP) processing; polyphenoloxidase; lipoxygenase; natural phenolic extracts; storagestability

La alta presión hidrostática (APH) es una alternativa al tratamiento térmico para lograr la pasteurización del puré de aguacate. Durante elalmacenamiento del aguacate pasteurizado con APH ocurren reacciones oxidativas que afectan la calidad del producto. El objetivo delestudio fue evaluar los cambios bioquímicos durante el almacenamiento (45 días, 4ºC) de puré de aguacate adicionado con extractosnaturales (romero, tomillo y semilla de toronja) y procesado con APH (600 MPa, 3 min). El puré de aguacate tratado con APH mostróactividades residuales de polifenoloxidasa (PPO) y lipooxigenasa de 46% y 58%, respectivamente. Durante los primeros 10 días dealmacenamiento, la actividad de PPO se incrementó (2,9 veces) y después regresó a sus niveles originales. Durante el almacenamiento, lasconcentraciones de hexanal y ácidos grasos libres se incrementaron. Algunos extractos naturales inhibieron parcialmente la acción deenzimas oxidativas, lo cual se reflejó en un incremento en la estabilidad del producto.

Palabras claves: aguacate; alta presión hidrostática (APH); polifenoloxidasa; lipooxigenasa; antioxidantes naturales; estabilidad durante elalmacenamiento

Introducción

El aguacate posee una gran cantidad de propiedades alimenti-cias. Contiene de una a dos veces más proteína que cualquierotra fruta; es rico en fibra, magnesio, fósforo, hierro y potasio,pero bajo en sodio (Naveh, Werman, Sabo, & Neeman, 2002;Ozdemir & Topuz, 2004). Así mismo, es una buena fuente decompuestos nutracéuticos como los fitoesteroles y carote-noides (Duester, 2001; Jacobo-Velázquez & Hernández-Brenes, 2012). Además, es rico en lípidos (monosaturados) yes excelente fuente del ácido graso esencial linoleico y enmenor medida del ácido graso esencial linolénico (Navehet al., 2002). Sin embargo, cuando el aguacate se transformaen puré, su calidad nutrimental y sensorial se ve afectadarápidamente debido a la acción de enzimas oxidativas. Lapolifenoloxidasa (PPO) es la enzima encargada de oscurecerel puré de aguacate debido a la oxidación de sus compuestosfenólicos. Por otro lado, la lipooxigenasa (LOX) afecta pri-meramente la calidad nutrimental destruyendo los ácidos gra-sos esenciales, co-oxidando carotenoides y posteriormente la

calidad sensorial generando malos olores y sabores (Jacobo-Velázquez, Hernández-Brenes, Cisneros-Zevallos, &Benavides, 2010; Ludikhuyze, Indrawati, Weemaes, &Hendrickx, 1998). En el fruto también existe actividadenzimática hidrolítica (lipasas) las cuales causan la hidrólisisde los enlaces ester-ácido graso en los triglicéridos, dandocomo resultado ácidos grasos libres, diacilgliceroles, monoa-cilgliceroles y glicerol. La liberación de los ácidos grasosfacilita y acelera las reacciones de auto-oxidación puesto quelos radicales libres atacan más fácilmente a los mismos que alos triglicéridos (Mottram, 1998). Ambos procesos (auto-oxidación y oxidación enzimática) dan como resultado larancidez de puré de aguacate durante su almacenamiento.

Generalmente en la industria de alimentos se utiliza el calorpara inactivar enzimas. Sin embargo, el tratamiento térmico en elpuré de aguacate afecta negativamente su calidad sensorial resul-tando en cambios de color, aparición de malos sabores, pérdidade vitaminas y valor nutricional (López-Malo, Palou, Barbosa-Cánovas, Welti-Chanes, & Swanson, 1998). También se han

*Corresponding author. Email: [email protected]

CyTA – Journal of Food, 2013Vol. 11, No. 4, 379–391, http://dx.doi.org/10.1080/19476337.2013.775185

© 2013 Taylor & Francis

utilizado antioxidantes como el butilhidroxitolueno (BHT), butil-hidroxianisol (BHA) y butilhidroxiquinona terciaria (TBHQ)para retardar el proceso oxidativo; sin embargo, los aditivossintéticos tienden a ser rechazados por los consumidores debidoa su asociación con efectos potencialmente negativos para lasalud humana. Debido a lo anterior surge la necesidad deexplorar la eficacia de antioxidantes naturales como potencialessustitutos de aditivos alimentarios sintéticos.

Por otro lado, el procesamiento de aguacate con APH haresultado ser una alternativa efectiva al procesamientotérmico. Se ha reportado que el puré de aguacate procesadocon APH bajo condiciones comerciales (600 MPa, 3 min,23ºC) resulta en un producto microbiológicamente estable ysu vida de aquel en condiciones de refrigeración (~20 días) seve limitada por cambios sensoriales, principalmente desarrollode sabor ácido y en menor medida desarrollo de sabor rancio(Jacobo-Velázquez & Hernández-Brenes, 2011; Jacobo-Velázquez, Ramos-Parra, & Hernández-Brenes, 2010b). Asímismo, se ha reportado que durante el almacenamiento enrefrigeración del puré de aguacate procesado con APH, bajocondiciones comerciales (600 MPa, 3 min, 23ºC), ocurre ladegradación parcial de importantes micronutrientes como loscarotenoides (Jacobo-Velázquez & Hernández-Brenes, 2012).Observaciones previas sugieren que pueden ser el resultado dela acción residual de la enzima LOX, debido a que estaenzima en el aguacate corresponde al isómero tipo II, el cualposee la capacidad de co-oxidar carotenoides (Jacobo-Velázquez et al., 2010a).

El objetivo del presente proyecto de investigación fueevaluar el efecto del procesamiento con APH (600 MPa,3 min) sobre la estabilidad bioquímica de puré de aguacateadicionado con extractos ricos en antioxidantes naturales(extracto de romero, tomillo y semilla de toronja). Los resul-tados de esta investigación permitieron evaluar el potencialde dichos extractos naturales como alternativas para incre-mentar la estabilidad del puré de aguacate procesadocon APH.

Materiales y métodos

Extractos naturales comerciales y reactivos químicos

El extracto comercial de romero (StabilEnhanceTM WSR) fueproporcionado por la empresa Naturex (Avignon, Francia). Elextracto comercial de semilla de toronja (Citricidal®) seobtuvo a través de la empresa TecnoespecialidadesComerciales S.A. de C.V. (Monterrey, N.L., México) y esproducido por BioChem Research (Petaluma, CA., E.U.A.).El hidróxido de sodio, la acetona, el cloruro de sodio y elácido sulfúrico se obtuvieron de Desarrollo de EspecialidadesQuímicas, S.A. de C.V. (San Nicolás de los Garza, N.L.,México).

El fosfato de sodio se obtuvo de Fermont-ProductosQuímicos Monterrey S. A. de C. V. (Monterrey, NL., México)y el Trixton® X-100 de United Status Biochemical Corp.(Cleveland, OH., E.U.A.). Los solventes grado HPLC se obtu-vieron de Fisher Scientific (Fair Lawn, New Jersey, E.U.A.).Los estándares de ácidos grasos se obtuvieron deAccuStandard, Inc. (New Haven, CT., E.U.A.). El nitrógenogrado reactivo y el helio grado analítico se obtuvieron dePraxair México S.A. de C.V. (Monterrey, N.L. México).Todos los demás químicos se obtuvieron de Sigma-AldrichCo. (St. Louis, MO., E.U.A.).

Preparación del extracto acuoso de tomillo

El procedimiento de extracción de compuestos fenólicos deltomillo (Thymus vulgaris) se realizó a partir de hojas secasobtenidas de un supermercado local (Marca Carabobo,Sonora, México). Para la purificación del extracto acuoso detomillo se siguió el procedimiento descrito por la patente No.5,908,650 de Lenoble, Richheimer, Bank, & Bailey (1999). Lashojas secas de tomillo (1,67 kg) se colocaron en agua bidesti-lada (28 L), y se mantuvieron en ebullición (95ºC, 8 h), bajoagitación continua y manteniendo el volumen de agua con-stante. Posteriormente, se dejó enfriar el extracto a temperaturaambiente y se separaron los sólidos por filtración con telaMiracloth (EMD Biosciences Inc., Darmstadt, Alemania). Seajustó el valor de pH del extracto a 2 con HCl 12 M. Dichoextracto se centrifugó (8000 rpm, 24 min, 4ºC) en unacentrífuga Beckman modelo AVANTI J-25 I (Fullerton, CA.,E.U.A.). El líquido decantado se filtró con vacío a través demembranas Millipore de 5 μm (Bedford, MA., E.U.A.). Lasolución filtrada se pasó por columnas C-18 Sep-Pak®(Waters Co., Milford, MA., E.U.A.) con capacidad de 20 mLy 5 g de adsorbente, para retener los compuestos fenólicos delextracto. Dichas columnas se activaron previamente con dosvolúmenes (40 mL) de metanol grado HPLC con 0,1 mL/L deHCl 12 M y posteriormente con dos volúmenes de agua gradoHPLC con 0,1 mL/L de HCl 12 M. Los compuestos adsorbidosen la columna C-18 se lavaron con dos volúmenes de aguaacidificada (40 mL), en la concentración antes mencionada. Sepasó aire por ~1 min a través de la columna para secar el agua ypor último los compuestos fenólicos se eluyeron de la resina C-18 con 10 mL de metanol acidificado grado HPLC. Los extra-ctos metanólicos resultantes se sometieron a evaporación apresión reducida en un rotavapor Büchi (Flawil, St. GallenCanton, Suiza) a 45°C y –84,7 kPa para eliminar el solventeorgánico. Al final se agregó etanol (150 mL/L) para facilitar ladisolución del extracto en el agua residual (extracto concen-trado). Debido a la elevada viscosidad del extracto y parafacilitar su manejo se preparó una dilución de trabajo pormedio del pesado del extracto concentrado (58 g) aforado a500 mL con agua destilada. Ambos extractos de tomillo (con-centrado y dilución de trabajo) fueron almacenados a –86 ºCpara su posterior utilización en la cuantificación de compuestosfenólicos totales.

Determinación de compuestos fenólicos totales en losextractos por el método de Folin-Ciocalteau

La determinación del contenido de compuestos fenólicos totalesen los extractos de tomillo y de romero (StabilEnhanceTM WSR)se realizó mediante una modificación reportada por Vinson, Su,Zubik, & Bose (2001) del método de Folin-Ciocalteau (Swain &Hillis, 1959).

Preparación del puré de aguacate y adición deantioxidantes

Para la elaboración del puré, se utilizaron frutos de aguacate(Persea americana Mill var. Hass) con madurez comercial (mate-ria seca de aproximadamente 200 g/kg) obtenidos de la región deMichoacán, México. Los frutos se lavaron y se sanitizaron med-iante inmersión por 8 s en una solución de VigorOxTM (FMCCorporation, Filadelfia, PE., E.U.A). Dicho sanitizante consiste deuna solución acuosa que contiene ácido peroxiacético (150 mL/L)

380 D.A. Jacobo-Velázquez et al.

y peróxido de hidrógeno (100 mL/L). Finalmente, los aguacates sepelaron y se maceraron para obtener el puré.

Para evaluar el efecto de la adición de extractos naturalesantioxidantes y/o antimicrobianos sobre la estabilidad bioquímicade puré de aguacate procesado con APH, se prepararon tres trata-mientos con extractos naturales (romero, tomillo y semilla detoronja) y un control sin aditivos. Tanto el extracto de romeroStabilEnhanceTM (ER) como el extracto de tomillo (ET), sediluyeron antes de su adición al puré de aguacate para que unavez adicionados al alimento, resultaran en una concentración de0,1 g/kg de compuestos fenólicos. El primer tratamiento aplicado alpuré de aguacate consistió en la adición de ER (1 mL/kg) previa-mente diluido en agua destilada (1:10). El segundo tratamiento, seaplicó mediante la adición de la solución diluida de ET (7,7 mL/kg).Finalmente, el tercer tratamiento fue aplicado mediante la adiciónde extracto de semilla de toronja (EST) Citricidal® (0,25 mL/kg)(BioChem Research, Petaluma, CA., E.U.A.). Una vez pesada lapulpa de aguacate para cada tratamiento, se adicionó de maneragradual el extracto correspondiente. La pulpa se homogenizó man-ualmente hasta incorporar efectivamente el extracto. Al final de esteproceso se obtuvo un puré homogéneo.

Antes del envasado, el puré de aguacate se sometió a unvacío durante 100 s a una presión de –88,2 kPa por medio de unabomba de vacío Ultravac UV2100A (Koch Equipment LLC,Kansas City, MO, E.U.A.). Para el envasado, se colocaron~200 g de puré de aguacate en envases de plásticos flexiblesimpermeables al O2 (WinpaK Ltd., Winnipeg, Manitota,Canadá). Las dimensiones del envase fueron de 14 cm delargo, 12,6 cm de ancho y 3 cm de alto. El material del envaseutilizado fue de un grosor de 0,018 cm, compuesto de 7 capas depolímeros, lo cual resulta en un envase prácticamente imperme-able al oxígeno. El puré de aguacate se envasó al vacío (2s a –20pulg Hg) mediante una envasadora Multivac R230 serie 542(Multivac, Wolfertschwenden, Germany).

Procesamiento con alta presión hidrostática (APH)

El procesamiento con APH se realizó en la empresa Avomex Inc.(Sabinas, Coahuila, México). Cada tratamiento y el control sesometieron a 3 min de procesamiento a 600 MPa por medio deun equipo de presurización 215L ULTRA (Avure Technologies,Kent, WA., E.U.A.). El tiempo requerido para obtener los600 MPa fue de 3,5 min. El tiempo de descompresión fue de2,75 min. El medio de presurización utilizado fue agua purifi-cada. La temperatura de la cámara de presurización fue de 23ºC.Después del procesamiento, las muestras se almacenaron en aguafría (1–3ºC) y se transportaron en refrigeración (4°C) al Centrode Biotecnología del Tecnológico de Monterrey-CampusMonterrey (Monterrey, Nuevo León, México). Finalmente, elpuré de aguacate procesado con APH fue almacenado durante45 días a 4 ± 1°C, en un refrigerador Fisher Scientific (Hampton,NH., E.U.A.). Se tomaron muestras de los tratamientos y elcontrol después del tratamiento con APH y durante el almace-namiento cada 5 días para realizar las determinacionesfisicoquímicas y microbiológicas.

Determinaciones de pH, acidez titulable, color y activi-dades enzimáticas de polifenoloxidasa (PPO) y lipoox-igenasa (LOX)

Para las determinaciones de pH se colocó el electrodo de unpotenciómetro Beckman (Fullerton, California, E.U.A.)

directamente en el puré de aguacate. El potenciómetro secalibró previamente utilizando soluciones amortiguadoras decalibración de pHs 4 y 7.

Para la determinación de la acidez titulable total se reali-zaron pequeñas adaptaciones al método AOAC 942,15A(AOAC 1990). Se pesaron 3 g de puré de aguacate y sediluyeron en 30 mL de agua bidestilada. Las muestras setitularon con hidróxido de sodio 0,03981 N utilizandofenoftaleína al 1% en alcohol como indicador. Los resultadosde acidez titulable total se expresaron como % de ácidoacético. Las actividades enzimáticas de la PPO y LOX semidieron con el procedimiento descrito por Jacobo-Velázquez& Hernández-Brenes (2010).

Los cambios en color del puré de aguacate durante sualmacenamiento se describieron utilizando los parámetros decolor instrumental: luminosidad (L*), escala verde-roja (a*),escala amarillo-azul (b*), y tono (ángulo Hue). Éstosparámetros fueron obtenidos utilizando un colorímetro MinoltaChroma Meter CR-300 Series (Minolta Co. Ltd., Osaka, Japón)en la escala CIE Lab con una fuente de iluminación D65 y unobservador estándar de 10°.

Análisis de hexanal

Para el análisis de hexanal se utilizó un sistema de purga ytrampa O∙I∙Analytical 4560 (College Station, TX., E.U.A.) y unmulti-muestreador de purga O∙I∙Analytical 4560 (CollegeStation, TX., E.U.A.). Para el método de purga y trampa pri-meramente se optimizaron las condiciones de análisis, para locual el flujo de helio se mantuvo constante (40 mL/min), y seevaluaron tiempos de purga de 12, 60, 100 y 120 min ytemperaturas de desorción de aproximadamente 25°C(ambiente), 35°C y 45°C. Dicho estudio previo indicó queuna temperatura de 45°C y 100 min de purga resultó en unamejor extracción.

La separación y cuantificación de hexanal se realizó en uncromatógrafo de gases Hewlett Packard 5890 (Palo Alto, CA., E.U.A.) con una columna cromatográfica Volcol (30 m ×0,25 mm × 1,5 µm) de Supelco (Bellefonte, PA. E.U.A.), acopladaa un detector de espectrometría de masas Hewlett Packard 5989A(Palo Alto, CA., E.U.A.), en el modo de escaneo detectando masasentre 30 a 550 (m/z). Para la ionización se utilizó el impacto deelectrones, donde la temperatura utilizada de la fuente fue de 250–375°C y del cuadrupolo de 100–150°C. Inicialmente se mantuvo elhorno a 35°C durante 4 min, luego se incrementó la temperatura arazón de 8°C/min hasta alcanzar los 180°C manteniéndolo a estatemperatura durante 3 min. Las temperaturas en el inyector y en eldetector fueron de 220 y 280°C, respectivamente. El gas acarreadorutilizado fue helio (0,5 mL/min).

Para el aislamiento de los volátiles, se pesaron las muestrasde puré de aguacate (20 g) y se mezclaron con cloruro de sodio(5 g). Una vez obtenida una pasta homogénea, se pesó una sub-muestra (20 g) en un matraz semejante a uno de aforaciónacondicionado para utilizarse con el equipo de purga y trampa.Utilizando una placa eléctrica se calentó la muestra a 45°C y sepurgó con helio grado analítico durante 100 min a un flujo de40 mL/min. La identificación de hexanal se realizó mediante labiblioteca de espectros de masas del software Wiley 275.L2000 6ta edición (John Wiley & Sons, Inc, Hoboken, NJ, E.U.A.). La cuantificación de hexanal ser realizó mediante unacurva de calibración externa elaborada con un estándar dehexanal.

CyTA – Journal of Food 381

Análisis de ácidos grasos

Para el análisis de ácidos grasos en el puré de aguacate seempleó el método AOAC 963.22 (AOAC 1990). Se tomaronmuestras del puré de aguacate (1 g), se les agregó sulfato desodio anhidro (1 g), se homogenizaron y se colocaron a −20°Chasta su utilización (antes de 2 días). Del homogenizado inicialse tomaron sub-muestras (150 mg), las cuales se colocaron entubos de ensayo y se adicionaron con 3 mL del reactivo demetanol-ácido sulfúrico (960 mL/L de metanol y 40 mL/L deácido sulfúrico concentrado). A cada muestra se le pasó unacorriente de nitrógeno grado reactivo y los tubos se cerraroninmediatamente. Las sub-muestras se mezclaron en un VortexGenie 2 (Fisher Scientific, Bohemia, NY., E.U.A.) y se calen-taron durante 1 h a 110°C, retirándolas cada 20 min para agitar-las en el Vortex. Posteriormente, se dejaron enfriar a temperaturaambiente, se les agregó agua bidestilada (2 mL) y hexano gradoHPLC (2 mL), se mezclaron por 20 s en el Vortex y se centri-fugaron en una centrífuga Eppendorf 5804 R (Eppendorf,Hamburg, Alemania) durante 3 min a 5000 rpm. De la fasesuperior (hexano) se extrajeron 50 μL y se aforaron a 1 mLcon hexano grado HPLC. Para la determinación ycuantificación de ácidos grasos se utilizó un cromatógrafo degases Agilent 6890 con un sistema de inyección y auto-muestreoAgilent 7683 (Palo Alto, CA., E.U.A.), acoplado a un detectorde espectros de masas Agilent 5973 (Palo Alto, CA., E.U.A.). Eldetector de masas se programó en el modo de escaneo paradetectar masas entre 20 a 550 (m/z). Para la ionización seutilizó el impacto de electrones, en donde la temperatura de lafuente fue de 230–250°C y del cuadrupolo de 150–200°C. Laseparación se llevo a cabo en una columna PTE-5(30 m × 25 mm × 0,25 µm) (Supelco, Bellefonte, PA. E.U.A.)utilizando helio grado analítico (Praxair México S.A. de C.V., D.F., México) como gas acarreador a un flujo de 1,2 mL/min.Inicialmente se mantuvo el horno del cromatográfo de gases a40°C durante 2 min., luego se incrementó la temperatura a razónde 20°C/min hasta alcanzar los 230°C manteniéndolo a esatemperatura durante 7 min. Posteriormente, la temperatura seincrementó a 240°C a razón de 35°C/min y se mantuvo a esatemperatura durante 3,6 min. Finalmente, la temperatura delhorno se llevó a una temperatura de 270°C a una tasa de 30°C/min y se mantuvo a esa temperatura durante 5 min. Las temper-aturas del inyector y del detector fueron de 220 y 280°C,respectivamente.

La identificación de los ácidos grasos se realizó utilizando labase de datos de espectros de masas del software Wiley 275 L 20006ta edición (John Wiley & Sons, Inc, Hoboken, NJ, E.U.A.) y pormedio de la inyección de una mezcla de estándares de ácidos grasos(ácidos caproico, caprílico, heptanoico, cáprico, perlargónico,undecanoico, láurico, mirístico, palmítico, esteárico, oleico, lino-leico, linolénico) y la comparación de tiempos de retención ycomparación directa de los cuatro iones principales del espectrode masas de cada estándar con los picos obtenidos en las muestrasde puré de aguacate. Para la cuantificación se prepararon curvas decalibración externas con los estándares comerciales de ácidos gra-sos empleados para la identificación de los mismos.

Análisis estadístico

El análisis estadístico de la información generada se llevó a caboutilizando el paquete estadístico JMP versión 5.0 (SAS InstituteInc. Cary, NC., E.U.A.) mediante el análisis de varianza(ANOVA), y la separación de medias se realizó utilizando la

prueba de LSD (p < 0,05). Todos los tratamientos y análisis sellevaron a cabo por triplicado.

Resultados y discusión

Caracterización de los extractos naturales

De acuerdo con el procedimiento descrito por Lenoble et al.(1999), se obtuvo un ET de alta viscosidad con 150 mL/L deetanol, de olor pungente y color café oscuro. Se obtuvieron untotal de 120 mL del extracto crudo de tomillo con un peso de163,24 g el cual representó 98,4 g/kg del material vegetal departida. Al ser este extracto muy viscoso y de difícil manejo, sepreparó una solución de trabajo pesando 58 g de extracto con-centrando y aforándolo a 500 mL con agua bidestilada,obteniéndose una concentración de fenólicos de 0,0686 M(12,9 g/L).

No se encontraron estudios previos en la literatura en loscuales se haya aplicado extracto de tomillo como antioxidantepara aguacate. Por lo tanto, se decidió comparar éste extracto conun extracto comercial de romero y utilizar la concentraciónsugerida (1 mL/L) por los productores del extracto de romero(Naturex, Avignon, Francia). Debido a diferencias encomposición química entre el ET y ER, no se puede establecerque 1 mL/L de extracto de romero sea equivalente a 1 mL/L deextracto de tomillo. Por lo tanto, considerando que los compues-tos fenólicos son los que contribuyen mayoritariamente a laactividad antioxidante en ambos extractos (del Baño et al.,2003; Echeverrigaray et al., 2001; Ibañez et al., 2003; Lealet al., 2003; Lee & Shibamoto, 2002; Masuda, Inaba, &Takeda, 2001; Rababah, Hettiarachchy, & Horax, 2004), sedecidió tomar la cantidad total de fenólicos como base decomparación. El contenido de fenólicos totales en el extractode romero, extracto de tomillo y en la solución de trabajo detomillo se presentan en la Tabla 1. Con base en los resultados deconcentración fenólica se calculó la cantidad de extracto a adi-cionar a cada tratamiento de 18 kg de aguacate. Se añadieron18 mL de ER 0,5306 M (99,9 g/L) disueltos (1:10) en agua parafacilitar la homogenización y 140 mL de ET diluido 0,0686 M(12,9 g/L) a 18 kg de aguacate, de tal forma que la concentraciónde fenólicos en el puré de aguacate para ambos extractos fuesimilar (0,1 g/kg).

Por otro lado en el estudio también se incluyó un tratamientoadicional con el aditivo comercial EST extraído de la semilla dela toronja, el cual se aplicó un una concentración de 250 ppmsiguiendo las recomendaciones proporcionadas por el proveedor(BioChem Research, Petaluma, CA., E.U.A.).

Tabla 1. Concentración de fenólicos totales en los extractos detomillo y romero

Table 1. Total phenolic contents of thyme and rosemaryextracts.

Aditivo natural Fenólicos Totales1

ER- Extracto de Romero 0,5306 ± 0,0025 M2

ET- Extracto de Tomillo 0,5588 ± 0,0073 MET- Extracto de Tomillo3 0,0686 ± 0,0003 M

Notas: 1Expresados en moles de fenólicos totales como equivalentes deácido gálico por kg de extracto. 2Error estándar. 3Dilución adicionada alpuré de aguacate.

Notes: 1Expressed as moles of gallic acid equivalents per kg of extract.2Standard error. 3Dilution added to the avocado puree.


Efecto del procesamiento con APH y almacenamientosobre el pH y acidez titulable

Después del procesado con APH, los tratamientos control y ERno presentaron cambios significativos en los valores de pH enreferencia con el puré fresco (sin aditivos) y sin presurización(Figura 1A). Sin embargo los tratamientos con ET y EST pre-sentaron disminuciones significativas en el pH, las cuales puedenatribuirse a la adición de ácidos presentes en los mismos extra-ctos. El pH del tratamiento control presentó un valor inicialpromedio de 6,49 y durante los primeros 15 días de almacena-miento descendió rápidamente (14,48%), presentando

diferencias estadísticamente significativas entre cada día eva-luado (Figura 1A). Finalmente, el valor de pH se estabilizó en~5,42. Además, se observaron diferencias significativas en el pHde los diferentes tratamientos a lo largo del almacenamiento. ElER mostró el valor de pH promedio más alto a través del tiempode almacenamiento (5,71), seguido del control (5,63), el ET(5,59) y finalmente el EST (5,53).

Así mismo, la acidez titulable se incrementó durante elalmacenamiento del puré de aguacate (Figura 1B). Incrementoque resultó en concordancia con las disminuciones observadasen los valores de pH. Sin embargo, la acidez incrementó a partir

–10 0 10 20 30 40 50

pH

4

5

6

7

Fresco

Control

ER – Extracto de Romero

ET– Extracto de Tomillo

EST– Extracto de Semilla de Toronja

Tiempo (días)

–10 0 10 20 30 40 50

% A

cid

ez

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

*

*

(A)

(B)

Figura 1. Efectos del procesamiento con alta presión hidrostática (600 MPa, 3 min) y almacenamiento (4ºC por 45 días) sobre los valores de pH y acideztitulable del puré de aguacate. (A) pH, (B) acidez titulable. Los valores graficados son el promedio de 3 repeticiones y las barras representan el errorestándar de la media. *Muestra sin presurizar y sin aditivos.

Figure 1. Effects of high hydrostatic pressure (HHP) processing (600 MPa for 3 min) and storage (4 °C for 45 d) on the pH and titratable acidity ofavocado puree. (A) pH, (B) titratable acidity. Values represent the mean of 3 replications with their standard error bars. *Unprocessed avocado pastewithout natural antioxidant addition.


del día 5 alcanzando un valor máximo de 0,05% en el día 20para el tratamiento control sin aditivos. Con base en las tenden-cias observadas para los valores de pH, se esperaba que losvalores de acidez titulable se mantuvieran constantes o quepresentaran algún incremento en los días posteriores de almace-namiento. Sin embargo, en los diferentes tratamientos el valor deacidez titulable descendió en las siguientes dos muestreos (día 25y 30) y al final se estabilizó (~0,03%) sin presentarse diferenciassignificativas hasta el término de los 45 días de almacenamiento.A pesar de las diferencias observadas en las tendencias de cadamedición y tratamiento, se encontró una correlación (r = 0,64)entre el aumento de los valores de acidez titulable y ladisminución del pH.

Los resultados obtenidos permiten proponer que los cambiosen los valores de pH y acidez titulable que se observaron duranteel almacenamiento de los diferentes tratamientos de puré deaguacate, pueden ser atribuidos a una liberación de ácidosorgánicos hacia la matriz del puré. En el tejido vegetal intacto,los ácidos orgánicos en primera instancia se encuentran conteni-dos en organelos de la célula vegetal (vacuolas). Sin embargo,después de la aplicación de la APH existen cambiosmorfológicos de la misma (compresión del gas en las vacuolas;alargamiento de las células; formación de filamentos; modifica-ciones del citoesqueleto, núcleos y organelos intracelulares) queconllevan a la ruptura de las membranas y una posteriorliberación de compuestos del líquido intracelular (Cheftel,1995; Gonzalez, Anthon, & Barret, 2010; Jacobo-Velázquez &Hernández-Brenes, 2010; Shimada et al., 1993). Los resultadosobservados en el presente estudio soportan dicho fenómeno deliberación de ácidos orgánicos por efecto de la aplicación deAPH. Durante los primeros 15 días de almacenamiento loscambios de pH y acidez fueron más notorios, lo que sugiere laliberación de los ácidos orgánicos hacia la matriz de aguacate.Los datos experimentales mostrados en las Figuras 1A y Bparecen indicar que una vez que se liberaran los ácidosorgánicos los valores de pH y acidez de la matriz del aguacate

ya no cambian significativamente. Además de los factores antesmencionados, las tendencias observadas para el pH y acidez delproducto podrían también estar influenciadas por la liberación deácidos grasos de los triglicéridos (Figura 6) y la subsecuenteoxidación de los mismos, debido a que en las fases más avanza-das de oxidación los ácidos orgánicos son productos potenciales.Adicionalmente es posible que el tratamiento con APH pudieratener efecto sobre los equilibrios de disociación de la matriz delalimento afectando sus valores de pH, lo anterior puede postu-larse con base en lo descrito por Torres & Velázquez (2005)sobre el efecto de la aplicación de APH sobre solucionesamortiguadoras.

Efecto del procesamiento con alta presión hidrostática(APH) sobre la actividad de polifenoloxidasa (PPO) ylipoxigenasa (LOX)

La actividad residual de la enzima PPO después del tratamientocon APH se muestra en la Tabla 2. Como se puede observar, elcontrol mostró una actividad residual de PPO de ~46% y noexistió diferencia significativa entre el control y los nivelesresiduales de dicha enzima en los tratamientos con los extractosnaturales. Los resultados obtenidos parecen confirmar las obser-vaciones de estudios previos que han reportado que la PPOcuenta con un isómero sensitivo a las altas presiones que pierdesu actividad después de los 450 MPa y un isómero resistente querequiere presiones mayores a los 700 MPa para su inactivación(Matser, Knott, Teunissen, & Bartels, 2000; Weemaes,Ludikhuyze, Van den Broeck, & Hendrickx, 1998). Losparámetros comerciales utilizados en el presente trabajo(600 MPa y 3 min) dieron como resultado una actividad residual(46%) similar a la de Rapeanu, Loey, Smout, & Hendrickx(2005) quienes reportaron que cuando se obtiene unainactivación del 50% en la PPO se afecta solamente al isómerosensitivo. Además la literatura previa indica que la inactivaciónde la PPO está en función de la presión y del tiempo de

Tabla 2. Actividad enzimática residual de la polifenoloxidasa (PPO) y lipooxigenasa (LOX) del puré de aguacate despuésdel tratamiento con alta presión hidrostática (APH) a 600 MPa por 3 min.

Table 2. Residual polyphenoloxidase (PPO) and lipoxygenase (LOX) activity in avocado puree after high hydrostaticpressure (HHP) processing (600 MPa, 3 min).

Enzima Proceso Tratamiento Actividad enzimática (U) Actividad residual1 (%)

Sin presurizar Fresco 15352 a3

PPO Presurizado Control 702 b 46 aER- Extracto de Romero 938 b 61 aET- Extracto de Tomillo 751 b 49 aEST- Extracto de Semilla de Toronja 797 b 52 a

Sin presurizar Fresco 764 a

LOX Presurizado Control 44 b 58 aER- Extracto de Romero 25 b 33 aET- Extracto de Tomillo 32 b 42 aEST- Extracto de Semilla de Toronja 27 b 35 a

Notas: 1Actividad residual (%) calculado en función del puré fresco (sin presurizar). 2Unidades de actividad de PPO (U) definidas como 0,001ΔAbs./min-ml de extracto de enzima a 25°C y pH 6,5. Los valores representan el promedio de 3 repeticiones 3En una misma columna, valoresque presentan letras diferentes para cada enzima son significativamente diferentes (LSD Test, P < 0,05). 4Actividad de LOX expresada enµmol/mg-min/103.

Notes: 1Residual activity (%) calculated based on the activity of the enzyme in the unprocessed puree. 2Units of enzymatic PPO activity (U)defined as 0.001 ΔAbs./min-ml of the enzymatic extract at 25°C y pH 6.5. The values represent the mean of 3 replicates 3 Different letterswithin a column indicate that values are significantly different by the LSD test (P < 0.05). 4LOX activity expressed as µmol/mg-min/103.


procesamiento. El trabajo de Palou et al. (2000) con pasta deaguacate acidulada (guacamole) indicó que se puede alcanzaruna actividad residual de 22% de la PPO cuando el aguacate seconserva por medio de una combinación de acidulantes y trata-mientos de alta presión de 689 MPa por 20 min. En estudiosprevios con puré de aguacate no acidulado y presurizado bajo lasmismas condiciones comerciales utilizadas en el presente estudio(600 MPa por 3 min), Jacobo-Velázquez & Hernández-Brenes(2010) reportaron una actividad residual de la PPO del 50%. Elefecto del isómero de la PPO resistente a los tratamientos conalta presión se ha observado también en otros productos deorigen vegetal. Por ejemplo, después de 10 min a 800 MPa, sereportaron actividades residuales de la enzima del 40% y 60% enpapas y champiñones, respectivamente (Tewari, Jayas, & Holley,1999) y según Matser et al. (2000), se necesitan presionesmayores a 950 MPa para inactivar completamente a la PPO, locual en la actualidad a nivel industrial resulta limitante debido arestricciones tecnológicas en los equipos comerciales existentes.

Otra enzima estudiada en el presente trabajo debido a surelevancia para la estabilidad del aguacate fue la LOX, la cualmostró un comportamiento similar al de la PPO (Tabla 2). Laactividad residual observada para los tratamientos control fue de58% (Tabla 2). Jacobo-Velázquez & Hernández-Brenes (2010)observaron un comportamiento similar en los valores de LOX depasta de aguacate procesada bajo las mismas condiciones delpresente estudio. La LOX es considerada sensitiva a la APH. Porejemplo, la LOX de leche de soya se inactiva completamentedespués de un tratamiento a 600 MPa por 10 min (Ludikhuyzeet al., 1998). Aunado a esto, es relevante recordar que la resis-tencia de las enzimas a la inactivación por medio de la APHdepende del medio y de las condiciones ambientales como el pH,presencia de azúcares, sales o aditivos (Weemaes et al., 1998). Elpuré de aguacate es una matriz muy compleja, en la cual suscomponentes y también los extractos naturales añadidos puedenestar afectando de diversas formas a sus actividades enzimáticas,pero en general se observó una acción protectora de la matriz en

si hacia la actividad de la LOX. Lo anterior se propone debido aque la actividad residual observada fue mayor que la reportadapara otros productos procesados bajo condiciones de presiónsimilares a las del presente estudio. Sin embargo, otros estudioshan utilizado diseños experimentales que han incluido lavariación en presiones y tiempos de proceso sobre la estabilidadde la LOX de tomate, ejote y aguacate (Indrawati, Ludikhuyze,& Hendrickx, 2000; Palou et al., 2000; Tangwongchai, Ledward,& Ames, 2000) con lo cual han logrado demostrar que lainactivación de la LOX aumenta a medida que se incrementa lapresión, el tiempo de presurización o se utilizan ciclos de pro-cesamiento. Sus resultados indican que el incremento en cual-quiera de dichos parámetros en el procesamiento industrial puedeaumentar la vida de anaquel del puré de aguacate y de otrasmatrices. La actividad residual observada en la matriz de estudiose vuelve relevante debido a que otros estudios previos hanreportado que la LOX del aguacate es del tipo II (Jacobo-Velázquez et al., 2010a), la cual es una isoenzima que se harelacionado con la destrucción de ácidos grasos esenciales, asícomo daños a compuestos incluyendo vitaminas, proteínas,además de pigmentos como la clorofila y carotenoides dandocomo resultado cambios de color y la generación de malossabores y olores (Boyes, Perera, & Young, 1992; Ludikhuyzeet al., 1998).

Cambios en la actividad enzimática de polifenoloxidasa(PPO) durante la vida de anaquel

Como se discutió en secciones previas, la medición de actividadresidual de PPO en el aguacate tratado con APH presentó unisómero baroresistente (Tabla 2); y como se puede observar enla Figura 2 su actividad enzimática residual se incrementó duranteel almacenamiento del producto. Después de 10 días de almace-namiento la enzima alcanzó un valor máximo promedio de2279 ± 92 (U), y tanto el control como los tratamientos nopresentaron diferencias significativas entre ellos. Jacobo-

–10 0 10 20 30 40 500

1000

2000

3000

4000

Fresco




Control

Tiempo (días)

Activid

ad d

e p

olif

enolo

xid

asa

(U)

Figura 2. Efectos del procesamiento con alta presión hidrostática (600 MPa, 3 min) y almacenamiento (4ºC por 45 días) sobre la actividad de lapolifenoloxidasa (PPO) del puré de aguacate. Los valores graficados son el promedio de 3 repeticiones y las barras representan el error estándar de lamedia. *Muestra sin presurizar y sin aditivos.

Figure 2. Effects of high hydrostatic pressure (HHP) processing (600 MPa for 3 min) and storage (4°C for 45 d) on polyphenoloxidase (PPO) activity ofavocado puree. Values represent the mean of 3 replications with their standard error bars. *Unprocessed avocado paste without antioxidant addition.


Velázquez & Hernández-Brenes (2010) reportaron un comporta-miento similar para la actividad de la PPO de puré de aguacateprocesado y almacenado bajo las mismas condiciones que en elpresente estudio. El aumento de la actividad de PPO se puedeatribuir a que después del tratamiento de presurización, muchasproteínas regresan a su conformación macromolecular nativa(estructura terciaria y cuaternaria) o a una modificada que puedeser similar a la forma nativa, pero no necesariamente idéntica(Mozhaev, Heremans, Frank, Masson, & Balny, 1996). Sinembargo, el aumento en la actividad enzimática más que debersea un cambio conformacional, puede atribuirse también a laliberación de la enzima de compartimientos celulares (cloropastos)y una mayor cercanía con los sustratos (vacuolas) (Soliva-Fortuny,Elez-Martínez, Sebastián-Calderó, & Martín-Belloso, 2002;Tewari et al., 1999). Los cambios observados en el pH y acideztitulable proveen evidencia adicional en soporte de esta segundahipótesis de difusión de los componentes intracelulares. Tambiénhay que considerar que la PPO existe en forma soluble e insolubley que mediante tratamientos como la APH la enzima se puedesolubilizar y se puede obtener una actividad adicional por parte dela fracción insoluble (Kahn, 1977).

En la Figura 2 también se puede observar que los trestratamientos con antioxidantes naturales y el control presentaronactividades de PPO similares durante el almacenamiento. Sinembargo, si existieron diferencias significativas entre los mis-mos. El puré tratado con ER presentó una mayor actividad dePPO durante toda la vida de anaquel, le siguió el ET y finalmentelos tratamientos EST y control mostraron los niveles más bajos(sin presentar diferencias significativas entre ellos). Lo anteriorpermite concluir que los fenólicos del ER agregados al puré deaguacate, y en menor escala los del ET, incrementaron la activi-dad de la PPO por la presencia de sustratos en los mismos. Elefecto del ER fue más evidente, se pudo observar que la activi-dad de PPO en los tratamientos con EST y el ET comenzó adeclinar a partir del día 10, sin embargo en el ER estadisminución se presentó a partir del día 20. A pesar de que el

ER mantuvo una actividad máxima de PPO por más tiempo quelos demás tratamientos incluyendo el control, la disminución desu actividad fue muy rápida y para el día 40 no se observarondiferencias significativas entre ninguno de los tratamientos.

Cambios en la actividad enzimática de lipooxigenasa(LOX) durante la vida de anaquel

En el presente estudio, la aplicación de APH (600 MPa y 3 min)en el puré de aguacate, además de reducir de forma considerablela actividad de la LOX hasta un 57,65%, logró que la actividadde LOX se mantuviera relativamente estable durante el almace-namiento (Figura 3). Sin embargo, a los 20 días de almacena-miento, en el tratamiento control, se observó un ligeroincremento en la actividad de LOX comparado con la actividadobservada a los 15 días de almacenamiento. Dichos resultadosson similares a los previamente reportado por Jacobo-Velázquez& Hernández-Brenes (2010). El incremento en la actividad deLOX se puede deber a que la proteína puede recuperar algo de suconformación nativa durante el almacenamiento del producto(Mozhaev et al., 1996).

En cuanto a los tratamientos de puré adicionado con losextractos naturales (Figura 3), el análisis de los efectosestadísticos globales mostró que en promedio y durante toda lavida de anaquel, el tratamiento ER presentó una actividad de LOXsignificativamente menor (p = 1,96 × 10−10), seguido del ET yEST entre los cuales no se observaron diferencias significativas(p = 0,67). La mayor actividad de LOX se observó en el trata-miento control (p = 3,8 × 10−8), lo cual se puede deber al efectoinhibitorio de la LOX que presentan algunos compuestosfenólicos presentes en los extractos naturales (Jacobo-Velázquezet al., 2010a). Oszmianski & Lee (1990) encontraron que lacatequina y epicatequina tienen un efecto inhibitorio sobre laLOX y en menor grado el ácido cumárico y telúrico. Lainactivación de LOX inducida por los compuestos fenólicos pre-sentes en los extractos naturales evaluados puede tener un impacto

Tiempo (días)

–10 0 10 20 30 40 50

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Fresco

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1(u

mol/m

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10

3

Figura 3. Efectos del procesamiento con alta presión hidrostática (600 MPa, 3 min) y almacenamiento (4ºC por 45 días) sobre la actividad de lalipooxigenasa (LOX) de puré de aguacate. 1Actividad de LOX expresada en µmol/mg-min/103. Los valores graficados son el promedio de 3 repeticiones ylas barras representan el error estándar de la media. *Muestra sin presurizar y sin aditivos.

Figure 3. Effects of high hydrostatic pressure (HHP) processing (600 MPa for 3 min) and storage (4 °C for 45 d) on lipoxygenase (LOX) activity ofavocado puree. 1LOX activity expressed as µmol/mg-min/103. Values represent the mean of 3 replications with their standard error bars. * Unprocessedavocado paste without antioxidant addition.


positivo en el valor nutracéutico del aguacate tratado con APH,debido a que se ha reportado que los carotenoides del aguacate sevan degradando durante el almacenamiento, posiblemente por lacapacidad que posee la LOX para co-oxidarlos (Jacobo-Velázquezet al., 2010a; Jacobo-Velázquez & Hernández-Brenes, 2012).

Evaluación del color instrumental

Según se discutió en secciones previas, en el fruto del aguacatela enzima PPO se encuentra en cloropastos y los compuestosfenólicos en las vacuolas. Durante la maceración de la pulpa deaguacate, ocurre una decompartimentalización celular por lo queentran en contacto la enzima con el sustrato y se inicia lareacción de oscurecimiento enzimática que afecta la aceptabil-idad del puré de aguacate (Soliva-Fortuny et al., 2002). Asimismo, se ha postulado que después del tratamiento con APHexiste un daño adicional a las paredes celulares, liberándose aúnmás estos compuestos del interior de los organelos al líquidointracelular (Gonzalez et al., 2010).

En la Figura 4 se presentan los resultados de los cambios decolor durante el almacenamiento en refrigeración del puré deaguacate tratado con APH. En cuanto al valor de luminosidad delproducto (L) (Figura 4A), el ER y el EST no presentaron difer-encias significativas entre ellos y mostraron el valor más alto(66,24), seguidos por el tratamiento control (65,36) y el ET(64,85). Con respecto al ángulo Hue (Figura 4B), solamente elER mostró valores significativamente menores (110,8) que losdemás tratamientos, es decir una tonalidad de verde ligeramentediferente. Respecto a la escala azul-amarilla, representada por elvalor b* (Figura 4C), el EST presentó el valor más alto (41,19)

(más amarillo), el ER el valor menor (38,18) y entre el control(40,29) y el ET (40,26) no se observaron diferencias significati-vas. En general, los cambios de valores de b*, L* y Hue quefueron apreciables mediante el colorímetro, no parecen tenermucho sentido práctico para el consumidor. En un estudio reali-zado por Jacobo-Velázquez & Hernández-Brenes (2011) cuyoobjetivo fue determinar las diferencias en atributos sensorialesde muestras almacenadas y frescas de puré de aguacate tratadocon APH (600 MPa, 3 min), los panelistas entrenados no detec-taron cambios significativos en color. Por lo tanto, los cambiosinstrumentales de color observados son tan pequeños que sen-sorialmente son muy difíciles de detectar. Así mismo, los valoresse mantuvieron constantes durante toda la vida de anaquel.

Los cambios colorimétricos más relevantes tuvieron lugar enlos valores a* (Figura 4D), en los cuales se observó que eltratamiento con ER presentó valores iniciales y durante el alma-cenamiento que fueron significativamente mayores, es decir, uncolor más rojizo-café. El aumento se observó inmediatamentedespués de la aplicación del extracto de romero (día 0) por locual se puede atribuir a la coloración aportada por el extractomismo. Resulta interesante el hecho que el ET obtenido de lapurificación de las hojas de tomillo a simple vista presentó unacoloración similar al ER comercial (rojizo-café); sin embargo, elET no afectó el color del puré de aguacate (al no verse afectado elvalor a de dicho tratamiento). En donde si se observaron difer-encias significativas fue en los valores a* durante el almacena-miento, los cuales se incrementaron en todos los tratamientosincluyendo al control. Dicho aumento se puede atribuir a laactividad residual e incrementos observados en las actividadesde PPO durante el almacenamiento, puesto que la PPO polimeriza

–10 0 10 20 30 40 50

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Tiempo (días) Tiempo (días)

–10 0 10 20 30 40 5060

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Fresco

Control


ET – Extracto de Tomillo


Ángulo

Hue

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Valo

r b*

Valo

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–16

–14

–12

–10

Valo

r L*

(D)(C)

(A) (B)

Figura 4. Efectos del procesamiento con alta presión hidrostática (600 MPa, 3 min) y almacenamiento (4ºC por 45 días) sobre los valores de color CIEinstrumental de puré de aguacate. (A) Valor de luminosidad, (B) Ángulo hue, (C) Valor b*, (D) Valor a*. Los valores graficados son el promedio de 3repeticiones y las barras representan el error estándar de la media. *Muestra sin presurizar y sin aditivos.

Figure 4. Effects of high hydrostatic pressure (HHP) processing (600 MPa for 3 min) and storage (4°C for 45 d) on CIE color values of avocado puree.(A) Lightness, (B) Hue angle, (C) b* value, (D) a* value. Values represent the mean of 3 replications with their standard error bars. *Unprocessed avocadopaste without antioxidants addition.


compuestos fenólicos a o-quinona de color rojizo. Además el O2

intracelular, que no se remueve completamente con los dos trata-mientos de vacío previos al procesamiento con APH (Jacobo-Velázquez & Hernández-Brenes, 2012), permite que la PPOactúe sobre los compuestos fenólicos puesto que la actividad dela PPO es dependiente del O2.

Análisis de hexanal

Los procesos de oxidación lipídica (auto-oxidación y enzimática)dan como resultado la rancidez, que se puede definir como laformación de malos sabores y olores a partir de lípidos. Loshidroperóxidos que se forman durante la oxidación del ácidolinoleico, el ácido graso más abundante y susceptible a oxidacióndel aguacate, se descomponen rápidamente a un gran número decompuestos que causan olor y sabor rancio (hexanal, cis-3-hexenal,y trans-2-hexenal). En el presente estudio, se cuantificó el hexanalcomo indicador de rancidez en el puré de aguacate debido a quepresenta una muy buena correlación con evaluaciones sensorialesde oxidación de lípidos realizadas por otros investigadores (Heiniö,Lehtinen, Oksman-Caldentey, & Poutanen, 2002). En estudiossensoriales realizados por Rychlik, Schieberle, & Grosch (1998),encontraron que el valor de detección sensorial del hexanal esde 3,08 mg/kg en harina de trigo. En agua y leche se hanreportado valores de 0,21 y 5,1 × 10−3 mg/L respectivamente(Adhikari, Hein, Elmore, Heymann, & Willott, 2006).Kirchhoff & Schieberle (2002) reportaron un valor de10,5 × 10−3 mg/L para agua y Tan & Siebert (2004) 0,35 mg/Len cerveza. Al observar la Figura 5 vemos que el tratamientocontrol de puré de aguacate tratado con APH sobrepasa el valorde detección de hexanal en harina de trigo (3,08 mg/kg) a los30 días de almacenamiento, mientras que los tratamientos ESTy el ER lo exceden en el día 35 y el ET no llega a sobrepasarlohasta los 45 días de almacenamiento evaluados.

Los datos experimentales indican que el tratamiento de ETpresentó una tasa menor de producción de hexanal, lo cual puede

atribuirse al efecto antioxidante de los compuestos fenólicospresentes en el extracto de tomillo. A pesar de que los tratamien-tos ET y ER poseían la misma cantidad de compuestos fenólicostotales (Tabla 1), es importante tener en cuenta que la capacidadantioxidante de los extractos de plantas está dada por el perfil delos compuestos fenólicos presentes y no sus contenidos totales(Jacobo-Velázquez & Cisneros-Zevallos, 2009). Puesto que elET presentó menor producción de hexanal comparado con el ER,es posible que la mezcla de compuestos fenólicos presente en elET sea más efectiva para neutralizar radicales libres. Los resul-tados de Lee & Shibamoto (2002) respaldan los observados en elpresente estudio, los autores probaron la capacidad antioxidantede varias especias en sistemas lipolíticos y el tomillo resultótener la mayor capacidad, además de que en concentracionesde 50 µg/mL encontraron que el ET tiene una actividad antio-xidante similar a la del BHT y α-tocoferol en un ensayo dedienos conjugados.

En un estudio sobre la vida útil sensorial de puré deaguacate (sin aditivos y procesado con APH y almacenadobajo las mismas condiciones que el presente estudio) sedemostró que los consumidores rechazan el producto a ~20días de almacenamiento (Jacobo-Velázquez et al., 2010b). Asímismo, otros estudios sensoriales con aguacate procesado conAPH también han indicado que, a pesar de que si existe unincremento en sabor rancio durante el almacenamiento, elmotivo por el cual los consumidores rechazan el producto espor el aumento en el sabor ácido (Jacobo-Velázquez &Hernández-Brenes, 2011). Por lo tanto, a pesar de que losresultados mostrados en la Figura 5 indican que durante elalmacenamiento del producto tiene lugar la generación de he-xanal, es posible que dichos incrementos no tengan un impactodirecto sobre la aceptabilidad del producto por parte de losconsumidores. Sin embargo, los resultados del presente estudioindican que la aplicación del ER y ET retardan la producción dehexanal, lo cual indica que el proceso de oxidación en elaguacate procesado con APH se ve retardada por los extractos

Figura 5. Efectos del procesamiento con alta presión hidrostática (600 MPa, 3 min) y almacenamiento (4ºC por 45 días) sobre la concentración dehexanal de puré de aguacate. Los valores graficados son el promedio de 3 repeticiones y las barras representan el error estándar de la media. *Muestra sinpresurizar y sin aditivos.

Figure 5. Effects of high hydrostatic pressure (HHP) processing (600 MPa for 3 min) and storage (4°C for 45 d) on hexanal concentrations of avocadopuree. Values represent the mean of 3 replications with their standard error bars. *Unprocessed avocado paste without antioxidant addition.


naturales. La adición de ER y ET pudiera ser de beneficio parael consumidor debido a que es posible que se disminuya lavelocidad de degradación de algunos micronutrientes impor-tantes como los carotenoides; los cuales sufren degradacionesdurante la vida de anaquel del producto, según lo reportado porJacobo-Velázquez & Hernández-Brenes (2012) para puré deaguacate procesado con APH bajo condiciones comerciales.Adicionalmente, es posible que la adición de ER y ET incre-menten de manera significativa la actividad antioxidante de lapulpa lo que puede ser de beneficio para la prevención dediferentes enfermedades crónico-degenerativas.

Evaluación de ácidos grasos

El aguacate es una excelente fuente de lípidos (15–30 g/100 gfruta fresca), de los cuales la mayoría son mono-insaturados. Enlos purés evaluados se encontró que del total de los ácidosgrasos, el ácido oleico correspondió al 41–53%, el ácidolinolénico entre 8–15%, y el ácido palmítico entre 16%–20%.Otros autores han reportado composiciones similares en lascuales el ácido oleico estuvo presente en un 48,7–67% del

total, el ácido linoléico del 10–12,1%, el ácido palmítico del13–17% y el ácido palmitoleico del 3–5,1% (Naveh et al., 2002;Villa-Rodríguez, Molina-Corral, Ayala-Zavala, Olivas, &González-Aguilar, 2011; Werman & Neeman, 1986). Como sepuede apreciar los rangos en los cuales cada uno de estos ácidosgrasos está presente en el fruto son amplios, aunque las propor-ciones parecen conservarse. Las diferencias pueden estar influ-enciadas por los estadios de madurez en los que se evaluaron lasmuestras en cada estudio, así como por el muestreo utilizado,debido a que se ha reportado que dentro de la misma fruta(centro amarillo y exterior verde) el perfil de ácidos grasoscambia significativamente (Sharon-Raber & Kahn, 1983; Villa-Rodríguez et al., 2011).

Las lipasas se encuentran presentes en el aguacate (Tursi,Phair, & Barnes, 1994) y estudios previos han reportado que paralograr la inactivación con APH del 50% de lipasas deRhizomucor miehei se requirieron presiones de 500 MPa por60 min, lo cual demuestra su alta baroresistencia (Noel &Combes, 2003). Estas enzimas catalizan la hidrólisis de enlacesester-ácido graso en un triglicérido para dar ácidos grasos libres,diacilgliceroles, monoacilgliceroles y glicerol. Por tal motivo, en

–10 0 10 20 30 40 50

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1

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3

4

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6

Fresco

Control

ER - Extracto de Romero

ET - Extracto de Tomillo

EST - Extracto de Semilla de Toronja

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*Tiempo (días)

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(E)

(C) (D)

Figura 6. Efectos del procesamiento con alta presión hidrostática (600 MPa, 3 min) y almacenamiento (4ºC por 45 días) sobre la concentración de ácidosgrasos libres de puré de aguacate. (A) Ácido palmítico, (B) Ácido esteárico, (C) Ácido oléico, (D) Ácido linoléico, (E) Ácidos grasos totales. Los valoresgraficados son el promedio de 3 repeticiones y las barras representan el error estándar de la media. *Muestra sin presurizar y sin aditivos.

Figure 6. Effects of high hydrostatic pressure (HHP) processing (600 MPa for 3 min) and storage (4°C for 45 d) on free fatty acid contents of avocadopuree. (A) Palmitic acid, (B) Stearic acid, (C) Oleic acid, (D) Linoleic acid, and (E) Total free fatty acids. Values represent the mean of 3 replications withtheir standard error bars. *Unprocessed avocado paste without antioxidant addition.


el presente estudio se decidió monitorear los ácidos grasos delpuré de aguacate procesado por APH con el objetivo de deter-minar si presentaban incrementos durante la vida de anaquel delproducto que pudieran relacionarse de manera indirecta con laactividad de lipasas. En la Figura 6 se muestra el comporta-miento de los ácidos grasos del puré de aguacate; visualmentese aprecia que existe un incremento general en las concentra-ciones de ácidos grasos libres a través del almacenamiento. Enel caso del ácido palmítico, oleico y ácidos grasos totales(Figura 6A, 6C y 6E, respectivamente) los incrementos se pre-sentaron a partir del día 20. Se observó el incremento en lasconcentraciones de ácido linoleico (Figura 6D) en el día 40 ypara el ácido esteárico (Figura 6B) los niveles se mantuvieronprácticamente sin cambios a través del almacenamiento. Estosaumentos o liberación de ácidos grasos del triglicérido se puedenrelacionar de manera indirecta con la actividad de las lipasas. Enalgunos puntos de muestreo, durante el almacenamiento, seobservan incrementos seguidos de disminuciones en las concen-traciones de ácidos grasos específicos, lo que podría atribuirse ala reversibilidad de la reacción enzimática de esterificación. Lavariación del comportamiento también se puede deber a que amedida que los ácidos grasos se liberan, en especial el ácidolinoleico y el oleico, los mismos se van oxidando por acción dela LOX y la auto-oxidación. En referencia a los tratamientos deextractos naturales no se encontraron diferencias significativascon el comportamiento observado en el control.

Conclusiones

El presente trabajo permitió incrementar el conocimientocientífico sobre los cambios bioquímicos que ocurren duranteel almacenamiento de puré de aguacate adicionado con antiox-idantes naturales y procesado con alta presión hidrostática. Laadición de los extractos naturales como estrategia de mejora enla estabilidad del producto tuvo efectos distintos sobre lasvariables de respuesta evaluadas. El ET en general presentólos mejores resultados, debido a que al ser adicionado noafectó el color inicial del puré de aguacate como en el casodel ER. Adicionalmente, el ET presentó poder inhibitorio sobrela actividad de la enzima LOX lo que se vio reflejado en unamenor generación de hexanal. Otra característica del ET es quelos compuestos fenólicos presentes en el extracto no son bue-nos sustratos de PPO en comparación con el ER, lo cual se vereflejado en menor potencial de oscurecimiento enzimático delproducto. Por otro lado, se observó que durante el almacena-miento del puré de aguacate tratado con APH en presencia delos antioxidantes naturales, se incrementó la concentración deácidos grasos libres indicando la actividad enzimática de lipa-sas baroresistentes. La adición de extractos naturales como elET pudiera tener un impacto positivo sobre la estabilidad nutri-mental del producto ya que al inhibir a la LOX se inhibe la co-oxidación de importantes micronutrientes como lo son loscarotenoides.

AgradecimientosEl presente estudio fue financiado por la iniciativa de Cátedrasde Investigación del Tecnológico de Monterrey (CAT 198 andCAT-05) y el programa de Becas de Excelencia de Posgrado delTecnológico de Monterrey-Campus Monterrey. Lasmetodologías utilizadas fueron desarrolladas en un proyectoprevio financiado por The University of California Institute forMexico and the United States (UCMEXUS) y el ConsejoNacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) de México.

Los autores también agradecen a la compañía Avomex Intl., S.A. de C.V. (Sabinas, Coahuila, México), por la donación deaguacates, tiempo de uso del equipo de APH y por su compro-miso con el avance de la ciencia del fruto del aguacate.

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