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1. IntroduçãoO setor de celulose e papel, em muitas de suas atividades de controle operacio-

nal, investigação científica e inovação, depende da existência de métodos analíticos rápidos, seguros e acessíveis que orientem o desenvolvimento de seus produtos e processos. Neste sentido, é indiscutível a relação entre o sucesso de decisões estra-tégicas do setor e a confiabilidade e/ou veracidade dos métodos empregados para comprovar as tendências eventualmente identificadas no laboratório. Sendo assim, a existência ou disponibilidade de acesso a uma infraestrutura analítica adequada, e o cuidado com a implantação e execução de métodos analíticos de alta sensibilida-de, são absolutamente fundamentais para a reorganização ou reorientação técnica do setor.

O caráter altamente recalcitrante da lignocelulose nativa pode ser justificado pela associação íntima que existe entre os três componentes da parede celular de plantas superiores (Puri, 1984; Sinitsyn et al., 1991; Ramos, 1992a,b). Estruturas microfibrilares de celulose encontram-se embebidas em uma matrix composta por hemicelulose e lignina, cuja função estrutural é de agir como barreira natural con-tra a degradação enzimática e/ou microbiana (Fan et al., 1987). Neste contexto, as polioses ou hemiceluloses, que são heteropolissacarídeos estruturais que ocorrem na parede celular das plantas, atuam como uma interface entre a celulose e uma matrix não polissacarídica constituída majoritariamente pela lignina, um polímero tridimensional que resulta da condensação de várias formas ressonantes de radicais livres gerados pela oxidação de derivados do álcool p-hidroxicinâmico com vários graus de metoxilação (Fengel and Wegener, 1989). Assim como as hemiceluloses, o tipo e distribuição da lignina no tecido vegetal depende da espécie em questão e do modo de extração. Via de regra, a lignina do tipo guaiacílica predomina nas gimnospermas e a do tipo siringílica, em angiospermas, enquanto que a lignina de gramíneas e certas angiospermas ainda contém quantidades expressivas de unidades p-hidroxicinâmicas não metoxiladas e outras unidades aromáticas dela derivadas. Já as hemiceluloses de gramíneas e resíduos de cereais são geralmente caracterizadas pela presença de arabinoxilanas, enquanto que 4-O-metil-glucuro-noxilanas predominam em madeiras duras (angiospermas ou folhosas) e madeiras

CAPÍTULO VIIMÉTODOS ANALÍTICOS APLICADOS À

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA CELULOSE

Luiz Pereira Ramos / Mirtha Maximino / M. Graça Carvalho

278 | Panorama de la industria de celulosa y papel en Iberoamérica 2008

moles (gimnospermas ou coníferas) contêm um alto teor de glucomananas. Como resultado desta íntima associação, a caracterização e quantificação destes três com-ponentes é uma difícil tarefa experimental que muitas vezes exige a utilização de mais de um tipo de metodologia analítica, quer puramente química (como em métodos de extração seletiva para preparação de alfa-celulose e holocelulose), quer cromatográfica ou espectroscópica.

1.1. CELULOSE

A celulose é a substância natural de maior importância na natureza por cons-tituir a base estrutural da parede celular de plantas. Desta forma, considerando-se que os vegetais correspondem à grande maior parte dos organismos vivos existentes na crosta terrestre, a celulose representa o polímero de maior ocorrência natural, com uma disponibilidade total da ordem de 20 a 30 x 1010 t (Fengel and Wegener, 1989).

A celulose encontra-se presente nas mais variadas formas de vida terrestre, desde vegetais superiores a organismos primitivos como bactérias. Entretanto, a quantidade de celulose encontrada nestes organismos varia significativamente, desde os 95 a 99% do algodão e os 80 a 85% da fibra de rami até a faixa dos 20 a 25% de vários tipos de bactérias, protozoários e algas-marinhas (Young, 1986). Dentre os microorganismos aeróbicos e anaeróbicos capazes de sintetizar celulose extracelular, são dignas de menção os do gênero Acetobacter spp. (A. xylinum e A. pasteurianus estunensis) e as espécies Valonia ventricosa e Sarcina ventriculi.

A madeira constitui a maior fonte de celulose na natureza. Nela, a celulose en-contra-se em proporções da ordem de 45%, tanto em coníferas como em folhosas (Roelofsen, 1959; Butterfield and Meylan, 1980; Fengel and Wegener, 1989). No entanto, a separação e extração da celulose existente na madeira é complicada pela sua íntima associação com hemicelulose e lignina, razão pela qual processos como aqueles utilizados na indústria papeleira necessitam de condições operacionais bas-tante drásticas, necessárias e suficientes para produzir fibras com a qualidade neces-sária à confecção do papel (Roelofsen, 1959). No que diz respeito à indústria têxtil, o algodão constitui a principal fonte de fibras celulósicas, necessitando apenas de etapas seqüenciais de delipidação e branqueamento para servirem aos diversos seg-mentos desta atividade industrial (Preston, 1986).

Para os leigos no assunto, é importante salientar que a utilização industrial de celulose não se resume ao papel e derivados têxteis. Apesar da existência e utili-zação seculares deste material de propriedades únicas, novas aplicações vêm sendo suscessivamente sugeridas na literatura ao longo das últimas décadas, atendendo a uma grande variedade de segmentos da indústria, tais como as de alimentos, de cosméticos e de novos materiais para uma infinidade de aplicações. É impor-tante salientar que vários destes segmentos utilizam-se de materiais derivados da celulose por modificação química (éteres, ésteres de ácidos orgânicos e ésteres de ácidos minerais) ou fisico-química (celulose regenerada), enquanto que outros fa-

Métodos analíticos aplicados à caracterização química da celulose | 279

zem uso apenas das propriedades estruturais e grande homogeneidade que certas preparações celulósicas oferecem (celulose microcristalina). Um resumo da vasta diversidade de aplicações da celulose e seus derivados pode ser encontrado em vá-rias publicações da literatura especializada (Fengel and Wegener, 1989; Kuhad and Singh, 1993).

Quimicamente, a celulose é um homopolissacarídeo linear composto por unidades de D-glucopiranose ligadas por ligações glicosídicas do tipo β-(1→4). As evidências da grande uniformidade observada na molécula de celulose foram primeiramente obtidas por técnicas de hidrólise ácida, metilação e degradação par-cial ainda no início do século passado (décadas de 20 e 30). Tal estrutura primária confere à celulose características e propriedades bastante peculiares, que podem ser facilmente justificadas pela análise conformacional das unidades que constituem o homopolímero e do tipo de ligação glicosídica envolvida em sua composição (Ro-elofsen, 1959; Fengel and Wegener, 1989; Solomons, 1996). Apesar de constituída apenas por unidades de glucose, estudos mais elaborados da estrutura deste homo-polímero demonstraram que a celobiose (O-4-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopira-nose) é o seu verdadeiro elemento estrutural (Sarko, 1986). Isto se deve ao fato de que a estereoquímica da ligação β-(1→4) exige que cada nova unidade de glucose sofra uma rotação de 180o em torno de seu eixo longitudinal, fazendo com que o elemento básico de simetria da celulose se repita a cada segunda unidade de glucose substituída ao longo da molécula (Figura 1).

Uma importante característica de polissacarídeos como a celulose é a diferen-ciação que existe entre os seus grupamentos terminais, a exemplo de quaisquer outros polissacarídeos existentes na natureza. Em uma das extremidades, encon-tra-se o grupamento hidroxílico do carbono C-4 e a baixa reatividade deste álcool secundário, comparada a outros centros reativos da molécula, confere ao terminal o nome de terminal não redutor. Em contrapartida, na outra extremidade da mo-lécula encontra-se o seu terminal redutor e nele pode-se observar a mutarrotação, fenômeno bastante conhecido que caracteriza esta classe de compostos orgânicos (Baker and Engel, 1992; Solomons, 1996).

Genericamente, o carbono que possui propriedades redutoras em um car-boidrato é denominado de carbono anomérico e o princípio da anomericidade ou mutarrotação é caracterizado pela abertura e fechamento do anel hemiacetálico em meio aquoso, gerando dois isômeros de posição em C-1 (epímeros), ou seja, a possibilidade de haver substituições hidroxílicas axiais e equatoriais em C-1, res-

FIGURA 1.Elementos estruturais da celulose.


pectivamente gerando as formas anoméricas alfa e beta. É importante salientar que, devido a sua maior reatividade, reações não enzimáticas de degradação ou despo-limerização ocorrem comumente a partir do terminal redutor da molécula (Fengel and Wegener, 1989; Solomons, 1996).

Sabe-se que a β-D-glucose (massa molecular de 180 unidades de massa atômi-ca, u.m.a.) é o carboidrato ou poli-hidroxialdeído mais estável que se encontra na natureza. Isto se deve basicamente ao fato de que todas as hidroxilas existentes no anel hemiacetálico assumem uma posição equatorial ao plano do anel, condição esta de muito maior estabilidade conformacional que a posição axial cuja orien-tação perpendicular ao plano do anel gera tensões comumente interpretadas como fatores de instabilidade conformacional (Solomons, 1996). Com a orientação equa-torial das hidroxilas, distribuídas lateralmente a uma conformação piranosídica do anel em cadeira do tipo 4C

1, a molécula da D-glucopiranose adquire uma disposição

quasi-planar que, ligada a outras unidades D-glucopiranosídicas por ligações do tipo β-(1→4), permite a obtenção de oligômeros (ou oligossacarídeos) lineares capazes de alinharem-se uns aos outros formando estruturas organizadas estabilizadas por ligações de hidrogênio inter e intramoleculares (Figura 2) (Preston, 1986; Young, 1986; Fengel and Wegener, 1989). Quanto maior a extensão do oligômero, medi-da através de seu grau de polimerização (número de unidades glucopiranosídicas existentes na molécula), maior a estabilidade do agregado formado cuja estrutura supramolecular confere ao seu interior uma característica bastante hidrofóbica, enquanto que a sua superfície possui caráter hidrofílico pronunciado. Termodi-namicamente, existe um limite para a organização e manutenção deste agregado molecular para-cristalino, a partir do qual a organização supra-molecular é perdida e as moléculas passam a assumir uma orientação e direcionamento randômico (ao acaso). A estas regiões desordenadas da organização estrutural da celulose dá-se o nome de regiões amorfas e o processo de conversão gradual de celulose cristalina em celulose amorfa é denominado amorfogênese ou mercerização.

1.1.3. NATUREZA FIBRILAR DA CELULOSE E SUA OCORRÊNCIA NA PAREDE CELULAR DE PLANTAS A celulose, em nível molecular, é definida como um polímero linear consti-

tuído por unidades de D-anidroglucopiranose unidas por ligações glicosídicas do tipo β-(1→4), sendo, portanto, uma (1→4)-β-D-glucana cuja unidade de repetição estrutural corresponde à celobiose (Figura 2) (Fengel e Wegener, 1989).

Um grande número de modelos têm sido postulados para explicar a natureza cristalina da celulose e como esta organização estrutural é rompida, formando re-giões amorfas onde uma menor orientação molecular é observada. A estrutura cris-talina da celulose pode ser representada esquematicamente pela associação ordena-da de fibrilas elementares, cuja espessura varia de 2 a 6 nm dependendo da origem e da metodologia usada para extração (Figura 2). Estima-se que o número médio de cadeias de celulose por fibrila elementar seja de aproximadamente 40 unidades.


FIGURA 2.Associação dos principais componentes da parede celular. 1- Esqueleto da cadeia de celulose, com a indicação do comprimento da sua unidade estrutural básica, a celobiose; 2- arranjo das cadeias de celulose na formação da fibrila elementar;3- cristalito de celulose; 4- seção transversal da microfibrila da celulose, mostrando cristalitos de celulose embebidos na matriz de hemicelulose e protolignina (Ramos, 2003).

A associação entre estas unidades estruturais fibrilares é garantida por uma in-terface polissacarídica de natureza amorfa, cuja constituição química é majoritaria-mente composta por polioses ou hemiceluloses (e.g., xiloglucanas e heteroxilanas), substâncias pécticas (e.g., rhamnogalacturonanas) e, eventualmente, proteínas. Da associação de quatro ou mais destas unidades elementares, com a interveniência de uma matriz amorfa de constituição análoga à anterior, formam-se então as microfi-brilas, cuja seção transversal possui 10 a 30 nm de lado (Fengel and Wegener, 1989) (Figura 2). Finalmente, a partir da organização progressiva das microfibrilas, e de seus estados intermediários de transição cristalina, formam-se estruturas contínuas que resultam na distribuição lamelar observada na parede celular de plantas, mais notavelmente a camada S-2, onde concentra-se a maior quantidade de celulose da célula. A este nível, a interposição de lignina (ou protolignina) é também fator de vital importância para a manutenção da estabilidade do agregado. Dados de mi-croscopia eletrônica sugerem que zonas “amorfas” ou não cristalinas não devem exceder a 5 nm em comprimento, enquanto que moléculas de água podem ocorrer no interior desta estrutura em espaços interfibrilares com cerca de 1,2 a 5 nm de largura (Young, 1986).

Nas regiões cristalinas do agregado, as cadeias de celulose são lineares e as uni-dades glicosídicas estão arranjadas em planos superpostos. Três razões justificam este arranjo supramolecular: (a) a estereoquímica da ligação β-(1→4) glicosídica;


(b) a conformação piranosídica assumida pelo anel, disposto em cadeira do tipo 4C

1 (conformação de menor energia potencial e/ou maior estabilidade); e (c) as

interações inter e intramoleculares existentes entre as cadeias de celulose, que de-terminam grande parte de suas propriedades físicas e químicas (Nevell e Zeronian., 1985; Fengel e Wegener, 1989; Sjöström, 1993; Dence e Reeve, 1996). Mudando-se a ligação glicosídica entre unidades de D-glucopiranose para o tipo α-(1→4), a dis-posição espacial das moléculas assumiria uma forma helicoidal devido à orientação axial da hidroxila anomérica. Esta estrutura helicoidal encontra-se presente na na-tureza na forma de amilose que, juntamente com a amilopectina, constituem a mais importante substância de reserva do reino vegetal, o amido. A única diferença entre estes dois componentes do amido se deve ao fato de que a amilopectina também apresenta ligações glicosídicas do tipo α-(1→6), razão pela qual trata-se de um polissacarídeo altamente ramificado (Solomons, 1996).

A estabilização das cadeias moleculares longas e lineares da celulose em siste-mas organizados com propriedades para-cristalinas é primariamente devida uma rede bastante rígida de ligações ou pontes de hidrogênio inter e intramoleculares. Sabe-se que a energia associada a uma ligação de hidrogênio (10 a 25 kJ.mol-1) é dez a vinte vezes mais fraca que uma ligação covalente, e aproximadamente 100 vezes mais forte que uma interação de van der Waals. No entanto, devido à periodicidade existente entre as unidades de glucose ao longo da cadeia, um grande número de ligações de hidrogênio são formadas em função da vicinalidade entre grupos hi-droxílicos, gerando uma estrutura de alto grau de associação molecular.

As ligações de hidrogênio são sem dúvida as maiores responsáveis pelo caráter cristalino da celulose. Existem várias proposições na literatura sobre quais os tipos de ligações de hidrogênio que contribuem mais intensamente para a manutenção dos agregados moleculares de celulose. Uma das proposições mais aceitas envol-ve uma ligação de hidrogênio intramolecular entre a hidroxila O-3 (hidroxila do carbono C-3) e o oxigênio do anel da unidade vizinha (O-5) e uma ligação inter-molecular entre a hidroxila O-6 e a hidroxila O-3 de uma unidade adjacente, ou seja, pertencente a outra cadeia de celulose existente no mesmo plano (Sarko, 1986; Young, 1986). O único grupamento hidroxílico suficientemente livre para efetuar interligações entre os diferentes planos adjacentes é a hidroxila em C-6 (O-6), que supostamente interage com os planos logo superior (ou logo inferior) através de uma ligação de hidrogênio do tipo O-6...O-4. O resultado líquido destas interações é um arranjo altamente organizado de cadeias de celulose onde nada, nem sequer um próton, pode penetrar com facilidade.

O arranjo espacial das cadeias de celulose, em suas regiões de alta organização estrutural, confere ao agregado a definição de planos cristalográficos de simetria cuja intensidade, medida por difração de raios-X, é proporcional ao caráter cristali-no do material. Em função destes estudos, várias formas alomórficas da celulose já foram descritas na literatura e cada uma delas é gerada em função de uma alteração da estrutura cristalina da celulose nativa, caracteristicamente designada como celu-


lose I (rede cristalina monoclínica). As celulose II, III e IV (e suas subdivisões) são, portanto, o resultado de uma ação química e/ou fisico-química sobre a estrutura fina da celulose nativa (Fengel and Wegener, 1989).

Quanto ao sentido das cadeias de celulose nos agregados moleculares, o mo-delo atualmente aceito é o de que a celulose nativa (forma alomórfica I), ou seja, o produto da biossíntese, apresenta uma disposição paralela das cadeias lineares, isto é, todas encontram-se orientadas em um mesmo sentido. Por outro lado, a celulose II ou celulose regenerada, obtida pela reorganização das cadeias de celulose após uma amorfogênese alcalina, é considerada de natureza anti-paralela, tendo assim as cadeias dispostas em sentido oposto. A única forma alomórfica pura da celulose é a celulose nativa. Todos os outros tipos de arranjo cristalino apresentam polimorfis-mo, isto é, consistem de uma mixtura de duas ou mais formas alomórficas diferen-tes (Sarko, 1986; Fengel and Wegener, 1989). Por exemplo, à celulose I apresenta duas formas alomórficas distintas, Iα e Iβ, sendo que a segunda constitui cerca de 80% da celulose presente em vegetais superiores.

A principal diferença entre as estruturas paralela e anti-paralela reside no em-pacotamento tri-dimensional das várias camadas de celulose. O empacotamento anti-paralelo permite a formação de uma malha mais rígida de ligações de hidrogê-nio, resultando em uma estrutura mais estável e de menor energia. Na verdade, este fato explica o por quê de não ser possível reverter uma transformação de celulose I em celulose II - tal transformação é considerada termodinamicamente proibida, pois resulta em uma diminuição da entropia do sistema (Sarko, 1986).

É importante salientar que a estrutura da celulose I forma-se apenas sob cir-cunstâncias muitos especiais, como aquelas presentes na biossíntese. A condição fundamental parece ser a síntese simultânea e unidirecional de várias cadeias de celulose, imediatamente seguida por um mecanismo que permita o fenômeno da cristalização ou ordenação molecular (Sarko, 1986). Na verdade, este parece ser o mecanismo utilizado por bactérias como o Acetobacter xylinum, um microorganis-mo capaz de produzir celulose de alta cristalinidade. Já outros autores sugerem que a formação biológica de celulose I depende da associação extracelular de (1→4)-β-D-glucanas pré-sintetizadas, cuja progressiva estabilização supramolecular é conferida pela formação de ligações de hidrogênio em uma etapa de natureza não-enzimática. Neste modelo, a microfibrila nascente formar-se-ia a partir de associações laterais entre cadeias adjacentes, envolvendo ligações de hidrogênio entre as hidroxilas O-3 e O-6 de cadeias vizinhas. Tais associações formariam camadas cujas faces seriam hidrofóbicas com bordas hidrofílicas. O subsequente empacotamento entre cama-das (lamelas monomoleculares) estabilizar-se-ia através de interações hidrofóbicas (Young, 1986).

A observação de que a estrutura supramolecular da celulose (microfibrila) possui bordas iminentemente hidrofílicas é de extrema importância para a com-preensão de várias de suas propriedades intrínsecas. Considerando-se a existência de bordas hidrofílicas e interações hidrofóbicas interplanares, supõe-se que a


microfibrila permita ambos os tipos de interação através destas duas “superfícies” distintas.

Estima-se que cerca de 40% da hidroxilas totais existentes em microfibrilas celulósicas estejam na superfície. Sabendo-se, portanto, que um número apreciável de moléculas encontram-se confinadas no interior da estrutura cristalina, não é difícil imaginar que as principais reações de modificação da celulose dependam de sua área superficial e que o aumento da eficiência de um processo de hidrólise ou conversão dependa do aumento da área superficial disponível para interação com o agente externo, quer químico ou biológico (Fan et al., 1987; Ooshima et al., 1990; Singh et al., 1991; Ramos, 1992a).

1.2. HEMICELULOSES

As hemiceluloses constituem cerca de 20 a 30% da madeira, sendo predomi-nantemente encontradas nas paredes celulares primárias e secundárias, podendo ainda ocorrer na lamela média (Lewin e Goldstein, 1991).

Da madeira deslignificada, muitas vezes referida como holocelulose, as hemi-celuloses podem ser extraídas por soluções alcalinas aquosas, sendo classificadas em dois grupos: precipitável ou não precipitável mediante neutralização a partir da adição de ácido mineral diluído (Sjöström, 1993; Biermann,1996). Portanto, as hemiceluloses representam uma classe bastante heterogênea de polissacarídeos.

Fisicamente, as hemiceluloses são sólidos brancos raramente cristalinos e, quimicamente, compõem uma classe de polissacarídeos cujos blocos construtivos se constituem de carboidratos de 5 e 6 átomos de carbono, sendo xilose e arabinose (pentoses) e glucose, manose, galactose e ácido 4-O-metil-D-glucurônico (hexoses) seus principais constituintes (Lewin e Goldstein, 1991; Sjöström, 1993; Biermann, 1996).

Hemiceluloses foram por muito tempo consideradas como intermediários na biossíntese da celulose, mas hoje sabe-se que são heteropolissacarídeos formados por rotas sintéticas distintas (Sjöström, 1993; Biermann, 1996).

Galactoglucomananas são as principais hemiceluloses de coníferas, corres-pondendo a cerca de 20% em massa. Conforme a Figura 3, possuem cadeia linear

FIGURA 3.Estrutura de uma

galactoglucomanana, com a ligação

β–(1→4) em evidência (Biermann, 1996).


formada por ligações do tipo β−(1→4) entre unidades de D-glucopiranose e D-ma-nopiranose, (Sjöström, 1993; Biermann, 1996).

Arabinoglucuronoxilanas também estão presentes em coníferas, (5-10%) e possuem cadeia principal com ligações do tipo β−(1→4) entre moléculas de D-xilopiranose, com substituição parcial em C-2 pelo ácido 4-O-metil-D-glucurônico e em C-3 pela L-arabinofuranose. A estrutura genérica desses polissacarídeos en-contra-se na Figura 4, onde as ligações α e β dos principais substituintes estão em evidência (Sjöström, 1993; Biermann, 1996).

O-Acetil-4-O-metil-glucuronoxilanas são as principais hemiceluloses de folho-sas e, dependendo da espécie, correspondem a 15 a 30% de seu peso seco. A cadeia principal é composta de unidades de D-xilopiranose unidas por ligações β−(1→4), com substituição parcial da xilose pelo ácido 4-O-metil-glucurônico em C-2 e por grupamentos O-acetil em C-2 e C-3 da xilose. São em média 7 substituições acetíli-cas para cada grupo de 10 unidades de xilose na cadeia principal, conforme a Figura 5 (Sjöström, 1993).

Além das xilanas, as folhosas contêm cerca de 2 a 5% de glucomananas, as quais são compostas por unidades de D-glucopiranose e D-manopiranose unidas por ligações β−(1→4), conforme a Figura 6. A relação glucose:manose varia entre 1:2 e 1:1, dependendo da espécie de madeira (Biermann, 1996).

1.3. LIGNINA

A palavra lignina vem do latim “lignum”, que significa madeira. Trata-se de um dos principais componentes dos tecidos de gimnospermas e angiospermas, ocorrendo em vegetais de tecidos vasculares. Sabe-se que a lignina tem um impor-tante papel no transporte de água, nutrientes e metabólitos, sendo responsável pela resistência mecânica de vegetais, além de proteger os tecidos lignificados contra o ataque de microorganismos. Vegetais primitivos como fungos, algas e líquenes, não são lignificados (Carioca, 1984; Mesquita, 1990).

A literatura, durante os últimos cento e cinqüenta anos, tem demonstrado in-teresse científico sobre a lignina. Neste longo tempo de estudo, foi possível concluir que a lignina é uma substância amorfa, de natureza aromática e complexa, que constitui parte das paredes celulares e da lamela média dos vegetais.

FIGURA 4.Estrutura de uma arabinoglucuronoxilana. Em detalhe, a ligação β–(1→4) e as ligações α–(1→2) e α–(1→3) do ácido 4-O-metil-glucurônico e da L-arabinose, (Biermann, 1996).


FIGURA 5.Estrutura da O-

acetil-4-O-metil-glucuronoxilana. Em

detalhe a ligação β−(1→4) da cadeia

principal e a ligação α−(1→2) do ácido

4-O-metil-glucurônico (Biermann, 1996).

FIGURA 6.Estrutura da

glucomanana, com a ligação β-(1→4) em detalhe (Biermann,

1996).

Anselme Payen foi o primeiro a reconhecer a natureza complexa da madeira (Payen, 1821, citado por Sjöström, 1993). Através de tratamentos da madeira com ácido nítrico, foi o primeiro a identificar a existência de duas substâncias diferen-tes: a primeira, um resíduo fibroso e que possuía a mesma composição do amido, o qual denominou de “celulose”, e a segunda, um material rico em carbono, a que se referiu como “material incrustante”, que supostamente intermeava a celulose na madeira. O termo “lignina” foi somente introduzido por Schulze em 1865. Três anos mais tarde, Erdmann observou que catecol e ácido protocatequínico eram formados na fusão alcalina da madeira e concluiu que o constituinte não celulósico era de natureza aromática. Em 1890, Benedikt e Bamberger demonstraram que grupos metoxílicos estavam presentes nos tecidos da madeira, mas, eram ausentes em amostras de celulose pura (Sjöström, 1993).

O desenvolvimento de alguns processos de polpação, especialmente o proces-so sulfito, despertou um grande interesse sobre as reações envolvendo a lignina e, em conexão com seus estudos sobre a composição de ligninas sulfonadas, Klason introduziu em 1897 a idéia de que a lignina estava quimicamente relacionada ao álcool coniferílico. Sua hipótese foi baseada no fato de que o aquecimento do ál-cool coniferílico com soluções de bissulfito acidificado produzia o ácido sulfônico correspondente, que Klason acreditava ser similar à estrutura das ligninas sulfonadas (Sjöström, 1993).

O estudo químico de ligninas evoluiu a partir da análise dos produtos de suas reações de hidrólise, oxidação com nitrobenzeno (Freudenberg, 1968; Adler, 1977) e etanólise (Cramer, 1939), que permitiram concluir que as ligninas são formadas a partir de unidades básicas arilpropanóides (Freudenberg, 1968) (Figura 7). Através da análise dos produtos dessas reações, foi possível elucidar os principais tipos de subestruturas das ligninas e constatar que estas realmente variam em concentração


de espécie para espécie e, até mesmo, dentro da mesma espécie, dependendo da natureza e de seu modo de obtenção (Adler, 1977).

As ligninas podem ser classificadas segundo sua origem (nativa ou industrial), tipo de procedimento utilizado para extraí-la (seja diretamente do vegetal, por reação química ou por extração com solventes após moagem) e, finalmente, pelo tipo de planta industrial que a produz (como as indústrias de celulose e de pro-dução de furfural a partir de madeira ou de cana-de-açúcar) (Casey, 1982).

A lignina é um dos três constituintes principais da madeira. É um polímero natural proveniente da condensação desidrogenativa de três álcoois precursores: álcool coniferílico, álcool sinapílico e álcool p-cumarílico (Figura 7). Sendo assim, define-se a lignina como um polímero constituído de unidades arilpropanóides, do tipo C

6C

3 ou, simplesmente, C

9, denominadas de guaiacilpropano, siringilpropano

e p-hidroxifenilpropano, respectivamente. Diferentemente da celulose e de outros polímeros naturais, as ligninas apresen-

tam uma estrutura macromolecular em que as unidades monoméricas não se repe-tem de forma regular e encontram-se entrelaçadas por diferentes tipos de ligações (Freudenberg, 1968), tais como ligações carbono-carbono entre as cadeias alifáticas C

3 (β-β’, α-α’, α-β’), entre as cadeias alifáticas e os anéis aromáticos (β-5’, β-1’,

α-1’, β-6’) e entre carbonos aromáticos (5-5’), além de ligações etéreas envolvendo cadeias alifáticas e anéis aromáticos (β-O-4’, α-O-4’, α-γ’).

Em 1974, Nimz propôs um arranjo para a lignina de faia (Nimz, 1974) (Fagus silvatica), que é um tipo de folhosa. Em 1992, Morais propôs um fragmento repre-sentativo da lignina do Eucalyptus grandis (Morais, 1993), o qual está mostrado na Figura 8.

Apesar de todos os estudos realizados até hoje sobre a lignina, muitos pontos relativos à sua estrutura ainda não se encontram esclarecidos, mesmo consideran-do-se a grande contribuição trazida pela aplicação de técnicas modernas de análise instrumental. Ela difere nitidamente dos polissacarídeos por ser um composto aro-mático, amorfo e isotrópico, que está presente em maior concentração nos espaços

FIGURA 7.Estrutura dos álcoois precursores de ligninas: A: álcool coniferílico, B: álcool sinapílico e C: álcool p-cumarílico.


intercelulares, também chamados de lamela média (Sjöström, 1993; Freudenberg, 1968).

1.4. COMPONENTES MINORITÁRIOS

Os componentes minoritários da madeira incluem uma variedade de compos-tos orgânicos, sendo que nenhuma espécie vegetal os contém em sua totalidade. A presença relativa destes é governada por uma série de fatores, entre os quais merece maior destaque os de natureza genética e climática (D’Almeida, 1988).

Os constituintes menores não residem na parede celular da planta e dividem-se, basicamente, em duas classes. A primeira classe engloba materiais conhecidos como extrativos por serem extraíveis em água, solventes orgânicos neutros, ou volatilizados por arraste de vapor. A segunda classe engloba materiais que não são comumente extraíveis com os agentes mencionados, como, por exemplo, compos-tos inorgânicos, proteínas e substâncias pécticas. Esses constituintes minoritários são freqüentemente responsáveis por determinadas características da planta, como cor, cheiro, resistência natural ao apodrecimento, sabor e propriedades abrasivas (D’Almeida, 1988).

É comum a denominação de resina para uma determinada classe de extra-tivos. Este termo, no entanto, caracteriza mais a condição física do que designa compostos químicos. Chama-se de resina uma série de compostos diferentes que inibem a cristalização. Deste modo, os seguintes compostos podem ser encontrados

FIGURA 8.Fragmento da estrutura proposta para a lignina

do E. grandis (Morais, 1992).


como componentes de resinas: terpenos, lignanas, estilbenos, flavonóides e outros aromáticos. Além dessas substâncias, outros compostos orgânicos podem estar presentes nos extrativos, como gorduras, ceras, ácidos graxos, álcoois, esteróides e hidrocarbonetos de elevada massa molar.

Os terpenos podem ser considerados múltiplos de unidades do isopreno (2-metil-butadieno). De acordo com o número destas unidades, podem ser sub-divididos em várias classes como: monoterpenos (2 unidades); sesquiterpenos (3 unidades); diterpenos (4 unidades); sesterpenos (5 unidades); e triterpenos (6 unidades).

Os extrativos de coníferas contêm, geralmente, todas as classes de terpenos, exceto os sesterpenos, que são raros (D’Almeida, 1988). Como exemplo, a terebin-tina, óleo volátil das coníferas, consiste principalmente de monoterpenos, sendo os mais importantes o α-pineno, o β-pineno e o limoneno.

Graxas são definidas como ésteres de ácidos graxos com glicerol (ésteres glice-rídicos), enquanto que ceras são ésteres de ácidos graxos com álcoois de alta massa molecular. Graxas e ceras são extraíveis da madeira com solventes orgânicos (éter de petróleo, acetona, éter etílico etc.), sendo que nas substâncias extraíveis de folho-sas ainda se podem encontrar aminoácidos, carboidratos e alcalóides (D’Almeida, 1988).

Nos extrativos de coníferas, também se encontram vários compostos fenóli-cos, dos quais alguns são resíduos e subprodutos da biossíntese da lignina. Estes compostos podem ser classificados em: (a) fenóis simples, como a vanilina, p-hi-droxibenzaldeído e coniferaldeído; (b) lignanas, que são estruturas formadas por acoplamento oxidativo de duas unidades fenilpropanóides; (c) estilbenos, que são derivados do 1,2-difeniletileno contendo ligações duplas conjugadas; (d) flavonói-des, que são derivados da flavona (2-fenil-benzopirona) com esqueleto carbônico do tipo C

6C

3C

6; e (e) taninos, que correspondem a compostos fenólicos que vão

desde fenóis simples até sistemas de flavonóides condensados. Substâncias não extraíveis são, na sua grande maioria, formadas por compos-

tos inorgânicos e estão presentes na madeira em teores inferiores a 1%. São cons-tituídos, principalmente, por sulfatos, fosfatos, oxalatos, carbonatos e silicatos de cálcio, de potássio e de magnésio, além de um grande número de outros elementos em quantidades muito pequenas (traços) (D’Almeida, 1988).

A maioria dos compostos inorgânicos está combinada com substâncias or-gânicas e possui funções fisiológicas, exercendo, assim, papel importante no me-tabolismo da planta. Além dos minerais, se encaixam nesta série as pectinas que são, essencialmente, polímeros de ácido galacturônico não extraíveis em solventes orgânicos neutros.

2. Métodos Analíticos Convencionais para Caracterização de Materiais CelulósicosToda biomassa celulósica residual é composta em sua maioria por três subs-

tâncias naturais, a celulose, a hemicelulose e a lignina (Roelofsen, 1959; Butterfield


and Meylan, 1980). Conforme o exposto acima, as moléculas de celulose formam uma estrutura altamente organizada cuja estabilização depende principalmente de ligações de hidrogênio intra- e intermoleculares (Figura 2). Tal associação resulta em uma estrutura rígida altamente resistente a agentes químicos e biológicos (Puri, 1984; Fan et al., 1987; Sinitsyn et al., 1991). Porém, apesar de suas propriedades pa-racristalinas, a estrutura da celulose apresenta regiões amorfas que correspondem a aproximadamente 30-40% de sua massa. Por esta razão, vários autores têm postula-do que a decomposição da celulose ocorre inicialmente através destas regiões amor-fas e que o aumento de sua reatividade, durante o processo de pré-tratamento, pode ser correlacionado com o aumento relativo de seu caráter amorfo (amorfogênese).

Em termos práticos, a composição química de materiais celulósicos nativos e pré-tratados é comumente baseada na determinação de lignina de Klason (lignina insolúvel em ácido sulfúrico), através do método “TAPPI T222 os-74”. Esta análise, embora relativamente simples, deve ser precedida por uma etapa de remoção dos extrativos existentes na matéria, principalmente devido ao envolvimento destas substâncias de baixa massa molecular em reações de condensação cujos produtos, devido a critérios de insolubilidade em soluções ácidas diluídas, podem ser errone-amente quantificados como lignina (Puls, 1993).

Segundo a técnica original, aproximadamente 1 g do material seco e moído (20-40 mesh) deve ser tratado com 15 mL de uma solução de ácido sulfúrico 24 ± 0,1 N (72%) por 2 h a 20 ± 1°C. Durante esta fase de pré-hidrólise, a mistura deve ser constantemente agitada com um bastão de vidro para que ocorra melhor solubilização (e/ou hidrólise parcial) dos polissacarídeos constituintes da matéria. Em seguida, a mistura deve ser diluída cuidadosamente a uma concentração de aproximadamente 3% em ácido sulfúrico e mantida sob refluxo por 4 h (alternati-vamente, pode-se substituir esta etapa pela hidrólise em autoclave a 121°C por 1 h) (Gomide e Demuner, 1986; Barnett et al., 1992). Após o refluxo, o hidrolizado total deve ser filtrado através de um filtro de porcelana com porosidade média e o ma-terial insolúvel em ácido (lignina) lavado a quente e posteriormente quantificado gravimetricamente. A lignina parcialmente solubilizada em ácido durante o pro-cesso também pode ser determinada por espectrofotometria, utilizando o método “TAPPI Useful 250” (Barnett et al., 1992; Silva, 1995).

Dando continuidade ao procedimento de Klason, a composição em carboi-dratos monoméricos do material celulósico é determinada no produto de hidrólise ácida por cromatografia a líquido de alta eficiência (HPLC) ou cromatografia a gás após derivatização dos açúcares a acetatos de alditóis. No entanto, em ambos os casos, as concentrações de açúcares obtidas cromatograficamente devem ser corri-gidas por um fator correspondente à labilidade ácida de cada um dos carboidratos quantificados. É importante salientar que, devido a heterogeneidade de materiais de natureza celulósica, a significância estatística de cada análise exige um número mínimo de três repetições, de forma a permitir que o cálculo de coeficientes de variação representativos (Puls, 1993).


Devido à maior simplicidade em sua execução, métodos de HPLC têm sido mais comumente empregados na caracterização dos hidrolisados decorrentes da análise de Klason. Como o hidrolisado é ácido, colunas de troca iônica podem ser empregadas para a análise de modo a não exigir nenhuma etapa de neutralização. A Figura 9 fornece um exemplo de corrida cromatográfica, utilizando uma coluna Aminex HPX-87H (Bio-Rad) sob eluição com ácido sulfúrico 8 mM a 65°C, em que os carboidratos foram detectados por refratometria diferencial (Ramos, 1992). Esta técnica é perfeitamente aplicável a hidrolisados de folhosas ou angiospermas, em que a hemicelulose predominante é uma heteroxilana, mas apresenta o incon-veniente de não resolver entre os monossacarídeos manose, galactose e xilose. Por esta razão, outras colunas cromatográficas (SugarPak, da Waters, ou Aminex HPX-87P, da Bio-Rad), que exigem neutralização do hidrolisado para análise, precisam ser empregadas para caracterizar materiais lignocelulósicos mais complexos, como os derivados de coníferas.

A mesma análise cromatográfica mostrada acima também pode ser estendida à quantificação de furfural e hidroximetilfurfural, que correspondem aos produtos de desidratação de pentoses e hexoses, respectivamente. No entanto, para assegurar uma boa análise quantitativa destes componentes, a detecção deve ser preferencial-mente realizada por espectrofotometria no UV, no comprimento de onda de 280 nm. A Figura 10 apresenta um cromatograma característico deste procedimento analítico, cujas curvas de calibração usualmente atendem aos critérios mais rígidos de quimiometria.

A importância da quantificação do furfural e do hidroximetilfurfural já foi enfatizada em muitos trabalhos associados à caracterização da fitobiomassa. No entanto, os procedimentos empregados para este fim variam bastante. Silva (1995) propôs o emprego de cromatografia a líquido de fase reversa quimicamente ligada para a quantificação destes produtos de desidratação de açúcares. Neste procedi-mento, furfural e hidroximetilfurfural, além de compostos fenólicos eventualmente presentes nos hidrolisados, são adsorvidos em matriz de fase reversa do tipo Sep-pack C18 (Waters) em que carboidratos como hexoses e pentoses não são retidos. Com isto, a análise de carboidratos por cromatografia de troca iônica fornece cro-matogramas mais limpos, com a vantagem adicional de que a coluna cromatográfi-ca é preservada da contaminação com componentes de baixa polaridade presentes nos hidrolisados. O material de baixa polaridade, retido no cartucho de adsorção, é dessorvido por lavagem com metanol e o adsorbato analisado subsequentemen-te por cromatografia a líquido em coluna de fase reversa, fornecendo tempos de retenção bem menores do que os eventualmente observados em colunas de troca iônica (vide Figura 10). A diferença entre os dois métodos é a de que as Figuras 9 e 10 são oriundas de uma única corrida cromatográfica, enquanto que o método descrito por Silva (1995) exige dois procedimentos cromatográficos precedidos de uma etapa de extração em fase sólida para separar os componentes presen-tes nos hidrolisados da biomassa. Por outro lado, a principal desvantagem do


5E+5

4E+5

3E+5

2E+5

1E+5

0E+04 6 8 10 12 14 16

Resp

osta

do

dete

ctor

(RID

)

Tempo de retençao (min)

ácido sulfurico

celobiose

glucose

xilose

arabinose ácido acético

FIGURA 9.Análise cromatográfica (HPLC) dos hidrolisados

de Klason de uma amostra de bagaço de

cana. O pico majoritário corresponde ao ácido

sulfúrico utilizado para hidrólise, cuja remoção

não é necessária para esta análise.

procedimento realizado por troca iônica é o tempo prolongado de análise, que praticamente exige a disponibilidade de sistemas automáticos de injeção (“auto-sampler”) para permitir a análise seqüencial e ininterrupta de várias amostras de hidrolisado.

A falta de resolução e/ou eficiência nos métodos de HPLC pode ser compen-sada pelo emprego de métodos de cromatografia a gás para a separação e quanti-ficação individual dos carboidratos presentes na fitobiomassa. O procedimento para esta análise é relativamente longo, mas o resultado é deveras compensador

600.000

10


hidroximetilfurfural

furfural

18 26 34 42 50 58

500.000

400.000

300.000

200.000

100.000

0

A (2

80 n

m)

FIGURA 10.Análise cromatográfica

(HPLC) dos produtos de desidratação de

pentoses e hexoses presentes nos

hidrolisados de Klason do bagaço de cana.


(Figura 11). A coluna capilar geralmente empregada para esta análise correspon-de a uma OV225 (ou outra similar) de 30 metros, onde o inositol é comumente empregado como padrão interno (Blakeney et al., 1993). Na verdade, este pro-cedimento é absolutamente fundamental porque acetatos de alditol apresentam diferentes fatores de resposta para detectores de ionização de chama (FID). Outra preocupação relevante é a recuperação dos açúcares ao longo do processo de de-rivatização, que envolve a hidrólise ácida dos polissacarídeos, seguida de redução com boroidreto de sódio e preparo dos alditóis para acetilação com anidrido acético em piridina.

Naturalmente, a evolução dos métodos cromatográficos de análise tem facili-tado muito a caracterização de amostras complexas. Um exemplo disto está rela-cionado à detecção em cromatografia de alta resolução, muitas vezes empregando métodos espectrométricos de vanguarda como a ressonância magnética nuclear e a espectrometria de massas. Por exemplo, se a detecção de massas é feita através do monitoramento de íons individuais previamente selecionados, informações univariadas altamente fidedignas podem ser obtidas mesmo em situações onde a resolução cromatográfica não seja satisfatória.

A análise da celulose por espectrometria no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) pode fornecer dados interessantes sobre a sua estrutura, particu-larmente na caracterização de grupos funcionais importantes e na determinação de parâmetros estruturais como o grau de cristalinidade (vide abaixo). Porém, como o FTIR não se presta à análise quantitativa tanto quanto à qualitativa, resultados conclusivos são muitas vezes decorrentes da análise comparativa de espectros gera-dos sob as mesmas condições experimentais. Para facilitar esta análise comparativa, recomenda-se que os espectros sejam normalizados pela absorbância característica

FIGURA 11.Análise cromatográfica (GC) dos carboidratos presentes em hidrolizados de polpas kraft de eucalipto, após derivatização dos mesmos a acetatos de alditol (o inositol corresponde ao padrão interno da análise).

14000

6


arabinitol

7 8 9 10 11 12

12000

10000

8000

6000

4000

2000

Resp

osta

do

dete

ctor

(FID

)

013 14

xylitol

manitol

galactitol

glucitol

inositol (PI)


do carbono anomérico C1 (900 cm-1) através de cálculos matemáticos, tornando-

os equivalentes a todos os materiais celulósicos em análise. Dentre as principais bandas atribuídas à celulose em espectros de FTIR, constam: 3200-3400 cm-1, que correspondem à deformação axial de O-H em grupamentos hidroxila associados; 2800-2950 cm-1, que representa os estiramentos simétricos das ligações C-H em grupos metílicos e metilênicos; 800-1500 cm-1, que congrega as absorções corres-pondentes à impressão digital dos carboidratos; 1100-1200 cm-1, que representa as deformações axiais de éteres; 900 cm-1, que representa vibração característica da ligação glicosídica do tipo β; e a banda em 1640 cm-1, que se deve à água adsorvida ou à presença de carbonilas conjugadas e/ou insaturações provavelmente resultan-tes da oxidação de carboidratos e/ou de fragmentos contaminantes de lignina (vide Figura 12).

A análise por FTIR é geralmente realizada a partir de pastilhas de KBr, prepara-das em prensa apropriada na presença de concentração conhecida do material celu-lósico previamente moído (1 a 2% em massa seca). Os espectros no infravermelho próximo são geralmente gravados de 4000 a 400 cm-1, com resolução de 4 cm-1 e coleta de 32 interferogramas por espectro antes da aplicação da transformada de Fourier. Alternativamente, os espectros de FTIR podem ser gerados a partir de ma-teriais celulósicos utilizando-se da técnica de reflectância difusa (ou “DRIFT”), cuja excecução dispensa a confecção de pastilhas de KBr e, por conseguinte, a moagem das fibras celulósicas. Embora menos comuns, outras regiões do espectro do infra-vermelho, como o infravermelho próximo (NIR) e a espectroscopia Raman, tam-bém têm sido aplicadas com sucesso na caracterização de materiais celulósicos.

3. Métodos Analíticos Não Convencionais3.1. DETERMINAÇÃO DO GRAU DE CRISTALINIDADE DA CELULOSE

A estrutura supramolecular da celulose pode ser caracterizada através de mé-todos que permitam a determinação de sua cristalinidade e grau de polimerização.

500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 3.500 4.000 4.500

100

80

60

40

20

0

Número de onda (cm-1)

Tran

smitâ

ncia

(%)

FIGURA 12.Espectrometria no infravermelho com

transformada de Fourier de polpa kraft

branqueada em pastilha de KBr a 1% (m/m).


Segundo Sarko (1986), citado por Ramos (1992), a natureza cristalina da celulose foi primeiro estabelecida usando microscopia de luz polarizada, mas a confirmação desta hipótese somente foi possível com o desenvolvimento da difratometria de raios-X. Cada plano cristalográfico da unidade espacial da celulose é representado no difratograma de raios-X por um pico a um ângulo de difração característico. Embora, vários planos cristalográficos (hkl) contribuam para o padrão de difração da celulose, as reflexões obtidas nos planos (101), (101) e (002) são, em geral, do-minantes. Esses planos correspondem a picos centrados nos ângulos de difração (2θ ou ângulo de Bragg) de 14,6, 16,2 e 22,6 graus, respectivamente, quando uti-lizada como fonte de radiação a linha alfa do cobre (CuKα = 0,154 nm). Porém, quando a linha alfa do cobalto (CoKα = 0,179 nm com filtro de Ni) é utilizada, há um deslocamento homogêneo do difratograma em relação à linha alfa do cobre de aproximadamente + 3,5 graus (Ramos, 1992). Este deslocamento não causa qualquer alteração analítica na determinação do índice de cristalinidade, havendo perfeita equivalência entre os perfis obtidos por difração de raios-X em qualquer um destes casos.

A cristalinidade é geralmente avaliada por difração de raios-X (Sarko, 1986; Ramos et al., 1993b), empregando o método empírico de Segal et al. (1959) (Figura 13). Neste método, (a) a região cristalina é estimada pela intensidade de difração no plano (hkl) = (002), correspondente a um ângulo de Bragg (2θ) de 22,5o, (b) a região amorfa é caracterizada pela intensidade mínima na região de 2θ = 18,5o e (c) o índice de cristalinidade é calculado através da seguinte expressão:

8 12 16 20 24 28 32 36

100

80

60

40

20

0

Angulo de Bragg (2 Θ)

Inte

nsid

ade

rela

tiva

(%)

FIGURA 13.Difração de raios-X de polpa kraft branqueada, com a identificação das intensidades utilizadas na relação empírica de Segal et al. (1959). Valores em parêntesis indicam diferentes planos cristalográficos e seus respectivos (hkl).

(101) (101)(021)

(002)

(040)

IAM ICR


No entanto, a interpretação dos dados de difração de raios-X deve sempre ser muito cuidadosa, principalmente quando este método é utilizado para avaliar o efeito de um processo hidrolítico e/ou degradativo da celulose. Conforme dito anteriormente, à medida que a superfície das fibrilas (ou mesmo os cristalitos, em uma menor dimensão) de celulose são atacadas por agentes químicos (ácidos minerais) ou biológicos (enzimas), moléculas de menor grau de polimerização são geradas. Estas moléculas, durante o preparo da amostra para difração de raios-X, são suscetíveis à recristalização devido à remoção de água por processos como a lio-filização, muitas vezes mascarando o real efeito causado pelo processo degradativo em estudo (Atalla, 1984; Ramos et al., 1993).

Outros métodos analíticos, tais como a ressonância magnética nuclear de 13C no estado sólido (Newman and Hemmingson, 1994; Evans et al., 1995) e a espectrometria no infravermelho (FTIR) do material compactado em pastilhas de KBr (Evans et al., 1995), também têm sido sugeridos para a determinação da cristalinidade. O trabalho publicado por Evans et al. (1995) traz uma excelente discussão sobre cada um destes métodos, cuja abordagem vai além dos objetivos deste ensaio.

Em decorrência destes estudos, foi proposto que a celulose nativa é composta por duas formas cristalinas alomórficas, chamadas de Iα e Iβ. Assim, a celulose nativa foi classificada em duas famílias: a família das celuloses bacterianas (Valonia e Acetobacter), onde a celulose é rica na forma Iα, e a família das fibras vegetais (ra-mie e algodão), onde a forma Iβ é predominante. Um aspecto do dimorfismo Iα/Iβ da celulose é que a forma Iα é metaestável e pode ser rapidamente convertida em Iβ por tratamento térmico na presença de NaOH (Sugiyama et al., 1991; Newman, 1994).

O tamanho da molécula de celulose nativa é inferior a 5 μm, o que corresponde a um tamanho de cadeia de aproximadamente 10000 unidades de anidroglucose (AnGlc). O menor elemento de construção do esqueleto celulósico é considerado por muitos como a fibrila elementar, formada por um agregado de moléculas de celulose nas quais regiões altamente ordenadas (cristalinas) alternam-se com re-giões menos ordenadas (amorfas). As fibrilas elementares formam as microfibrilas (Figura 2) que, por sua vez, formam as fibras de celulose. Dada a esta estrutura macromolecular, a celulose possui alta resistência à tensão e é insolúvel em muitos solventes (Nevell e Zeronian, 1985; Fengel e Wegener, 1989). Por outro lado, a proporção entre regiões ordenadas e desordenadas varia consideravelmente em decorrência da origem da amostra. Assim, a celulose do algodão é mais cristalina do que a celulose da madeira, que possui índice de cristalinidade entre 50 a 70% (Sjöström, 1993).

3.2. DETERMINAÇÃO DO GRAU DE POLIMERIZAÇÃO DA CELULOSE

Juntamente com o grau de organização molecular ou cristalinidade, o grau de polimerização é também um dos principais parâmetros para avaliação da estrutu-


ra molecular da celulose. Classicamente, esta propriedade tem sido determinada em solução mediante o uso de solventes reativos como complexos nitrogenados contendo íons metálicos, geralmente cobre ou cádmio (por exemplo, cuoxam, cuproetilenodiamina ou cadoxen). Com base nas propriedades viscosimétricas da solução obtida, avaliadas por viscosimetria capilar, conclusões sobre massa mole-cular média, polidispersidade e conformação do polímero podem ser obtidas com relativa facilidade (Fengel e Wegener, 1989).

Outros métodos podem também ser utilizados para avaliação das proprieda-des poliméricas da celulose. Por exemplo, o número molecular médio (ou média aritmética das massas moleculares, MM

N) pode ser medido por osmometria ou pela

determinação do número relativo de grupos redutores terminais, enquanto que a massa molecular média (ou média ponderada das massas moleculares, MM

M) pode

ser deduzida a partir de dados obtidos por espalhamento de luz. Para a celulose, a relação entre massa molecular (MM) e grau de polimerização (GP) é de GP=MM/162, onde 162 é a massa molecular de uma unidade de anidroglucose. A razão MM

M/ MM

N é a medida de polidispersidade, que corresponde à largura da distri-

buição em massas moleculares (Nevell e Zeronian, 1985; Fengel e Wegener, 1989).Cada unidade D-glucopiranosídica dentro da cadeia de celulose contém três

grupos OH reativos, dois secundários (OH-2 e OH-3) e um primário (OH-6). Os álcoois primários e secundários na celulose reagem do mesmo modo que substân-cias simples de constituição química similar. Estes grupamentos podem ser, por-tanto, rapidamente oxidados, esterificados e/ou convertidos em éteres.

Utilizando-se de métodos controlados de derivatização à ésteres de celulose, vários protocolos de síntese têm sido propostos para adequar a investigação do grau de polimerização da celulose a métodos cromatográficos como a cromato-grafia de permeação em gel (GPC), de cujos perfis se pode obter dados estruturais mais refinados como a distribuição em massas moleculares de amostras nativas e parcialmente hidrolisadas. Um destes métodos preconiza a utilização da reação de carbamilação, cujo produto (celulose per-carbamilada) é suscetível à CPG por ser perfeitamente solúvel em tetrahidrofurano (Valtasaari and Saarela, 1975; Schroeder e Haigh, 1979; Kossler et al., 1981; Miller et al., 1991). A análise de outros derivados da celulose, tais como o seu produto de nitração, permitem igualmente com que se determine o grau de polimerização da celulose, desde que sempre assistidos por métodos de calibração universal. Porém, nestes casos, os derivados obtidos são me-nos estáveis do que aquele obtido pela reação de carbamilação (Wood et al., 1986; Ramos et al., 1993, 1999).

O derivado per-carbamilado pode ser obtido por reação com isocianato de fenila em meio contendo piridina ou sulfóxido de dimetila (DMSO) (Ramos, 1992; Ramos et al., 1993b, 1999b). A Figura 14 apresenta o perfil cromatográfico obtido a partir dos derivados tricarbamilados da celulose presente no algodão e em polpas celulósicas branqueadas do tipo kraft. Obviamente, a celulose do algodão apresenta


massas moleculares superiores aos da polpa kraft, pois esta última é decorrente de um processo quimicamente degenerativo e hidrolítico (polpação kraft).

A massa molecular da celulose varia significativamente, dependendo da ori-gem da amostra. Por exemplo, a celulose encontrada nas fibras de rami possui uma massa molecular da ordem de 50.000 u.m.a., o que corresponde a um grau de po-limerização (GP) de aproximadamente 300 unidades de anidroglucose, enquanto que a celulose de origem bacteriana possui um GP da ordem de 7.000 unidades de anidroglucose ou mais. Celulose oriunda de plantas superiores pode atingir GP su-periores a 10.000, ou seja, na faixa de 2 a 3 milhões de u.m.a. (Fengel and Wegener, 1989). Todos os processos que envolvem o isolamento e utilização da celulose para fins industriais geram uma diminuição radical de seu GP. Processos de polpação do tipo kraft fazem com que o GP da celulose encontrada na madeira caia para a faixa de 1.000 a 1.300, enquanto que outros processos como a hidrólise ácida podem gerar decréscimos ainda mais contundentes em GP, chegando a valores limites da ordem de 250 a 300 unidades de anidroglucose (Fan et al., 1987). Este produto celulósico de alta cristalinidade, a que chamamos de celulose microcristalina, tem grande aceitação no mercado e serve a uma série de aplicações nas indústrias farma-cêutica (como excipiente para fármacos), de cosméticos, de alimentos e de aditivos para os mais variados fins.

polpa de Pinus

0

Resp

osta

Nor

mal

izad

a do

Det

ecto

r

Grau de Polimerizacão

10 100 1.000

algodão

20

40

60

100

80

10.000

FIGURA 14.Análise de celulose

per-carbamilada por cromatografia de

permeação em gel, indicando a distribuição em massas moleculares

do polímero oriundo de fibras de algodão

hidrófilo e polpa kraft branqueada de Pinus

spp.


O termo celulose microcristalina se originou da observação que, durante o tra-tamento ácido de celulose das mais diversas origens, o produto parcialmente hidro-lisado adquiria uma cristalinidade cada vez maior, simultaneamente ao decréscimo gradativo em seu GP médio. Teoricamente, o processo de hidrólise age sobre o ma-terial celulósico eliminando as regiões amorfas que interligam as regiões cristalinas de maior organização molecular, gerando um produto altamente homogêneo e es-truturalmente definido (Fan et al., 1987). Mesmo aqueles oligômeros parcialmente hidrolisados, que prevaleceram ainda desorganizados em sua orientação espacial, sofrem uma reorientação “catalisada” pela retirada da água durante o processo de secagem para comercialização. Isto resulta em um processo de recristalização ou redeposição de forma organizada na superfície do agregado, reforçando o caráter cristalino do produto (Atalla, 1984).

A redução do GP da celulose não ocorre de uma forma homogênea e uniforme. Mesmo a partir de uma distribuição de moléculas bastante uniformes, métodos de degradação parcial da molécula levam a um aumento da polidispersidade (ou po-lidispersividade) do produto, caracterizando assim a geração de sub-populações de moléculas ou oligômeros que se distribuem ao longo de uma grande faixa de mas-sas moleculares. Tal efeito é devido a vários fatores, dos quais o mais importante é o ataque inicialmente superficial ao agregado molecular cristalino, gerando gradati-vamente uma maior variedade de fragmentos e o eventual acúmulo de oligômeros à medida que a degradação progride para as regiões mais internas do compósito (Ramos et al., 1993b, 1999b).

3.3. CARACTERIZAÇÃO DE EXTRATIVOS DE POLPA E MADEIRA Esta seção enfoca fundamentalmente os principais métodos analíticos para

caracterização dos extrativos lipofílicos de madeira e polpa. Embora geralmente classificados de acordo com a sua localização e função no tecido vegetal, os extra-tivos também são agrupados de acordo com a sua polaridade e solubilidade em diferentes solventes, como demonstra a Tabela 1.

Na maioria dos casos, é necessário isolar os extrativos das amostras antes de proceder as suas respectivas análises. A extração de amostras sólidas usualmente se realiza com extratores Soxhlet ou Soxtec. Este último requer menos da metade do tempo de extração e permite o tratamento simultâneo de até seis amostras (Sitholé et. al. 1991).

Vários tipos de solventes podem ser utilizados para a extração de amostras de madeira, polpa e papel. Atualmente, se utilizam os seguintes solventes, expressos em relação ao volume: etanol, etanol:benzeno (1:2), etanol:tolueno (1:2), acetona, acetona:água (9:1) e diclorometano, assim como outros alcanos como o hexano.

Um novo método padrão SCAN (SCAN – CM 49:93) substituiu o diclorome-tano por acetona para a extração de polpas celulósicas porque, apesar de um bom solvente, o diclorometano apresenta certos riscos ambientais e para a saúde. Na verdade, a acetona tem sido amplamente utilizada para extração desde os anos 70 e


foi há muito selecionada como solvente de referência no Canadá (CPPA Standard G13 e G20).

A acetona, ou ainda melhor, a acetona:água (9:1), é um solvente efetivo para os componentes resínicos da madeira. Trata-se de um sistema inerte, estável e seguro. No entanto, quando comparada ao diclorometano, a acetona apresenta a desvan-tagem de também extrair alguns componentes hidrofílicos importantes, tais como açúcares simples e fenil glicosídeos.

A análise de extrativos pode ser realizada em três níveis: a) Quantificação de extrativos totais (por gravimetria ou outra determinação); b) Determinação de diferentes grupos de componentes; c) Análise de componentes individuais (algumas vezes precedida por uma etapa

de separação de diferentes componentes ou grupos de componentes) Para a análise de rotina e controle de qualidade, a quantificação gravimétrica

de extrativos totais pode ser considerada suficiente. No entanto, não são raras as situações em que informações detalhadas sobre componentes individuais, como triglicerídeos, esteróis, ácidos graxos e ácidos resínicos, se fazem necessárias para estudos de otimização de processos.

Os diferentes tipos de componentes presentes nos extrativos podem ser deter-minados por várias técnicas cromatográficas, como as de fase gasosa (GC) e fase líquida de alta eficiência (HPLC), de fluido supercrítico (SFC) e de camada delgada (TLC).

A grande resolução alcançada com GC, utilizando colunas capilares curtas, torna este método uma excelente técnica para análise de misturas multicompo-nentes complexas, como são os extrativos da madeira. A combinação de GC com a

Tabela 1. Classificação dos extrativos de madeira e polpa (Holmbom, 1999a.)

Localização

Componentes,

solubilidade e

ocorrência

Canais

resiníferos

Células

ParenquimáticasCerne

Zona de

crescimento

e câmbio

Agua ascendente,

seiva

Principais

componentes

Ácidos resínicos,

monoterpenos e

outros terpenos

Graxas, ácidos

graxos e esteróis

Substâncias

fenólicas

Glicosídeos,

açúcares, amido

e proteínas

Solubilidade em:

Alcanos +++ +++ 0 0 0

Éter dietílico,

DCM+++ +++ ++ 0 0

Acetona +++ +++ +++ ++ +

Etanol ++ ++ +++ + +

Água 0 0 + +++ ++

Ocorrência ConíferasTodas as espécies

de madeira

Geralmente

coníferas

Todas as espécies

de madeira

Todas as espécies

de madeira

+++: facilmente solúvel; ++: solúvel; +: ligeramente solúvel; 0: insolúvel.


espectrometria de massa (GC/MS) permite a obtenção de informações qualitativas complementares e é adequada à identificação dos componentes individuais presen-tes nas amostras. A Figura 15 mostra cromatogramas de GC dos extratos de acetona de diferentes amostras de madeiras.

Métodos de HPLC têm sido igualmente utilizados para a análise de grupos de extrativos nos modos de exclusão por tamanho (HPSEC) e fase reversa (RP). Uma boa separação dos principais componentes da resina pode ser obtida no modo SEC usando colunas de poliestireno entrecruzado e tetrahidrofurano como fase móvel. A principal limitação desta análise é a superposição comumente observada entre esteróis e ácidos graxos.

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Fatty

acids

Resin

acids

std

Lignans SterolsSterols

std

0,2 %

std

SterylSteryl

estersesters Triglycerides

Fatty

acids

std

std=cholesterol

0,2 %

std

Sterols

SterylSteryl

estersesters TriglyceridesTriglycerides

Spruce heartwood (1 g wood, 2 mg std)

Birch wood (1 g wood, 2 mg std)

FIGURA 15.GC de extratos em acetona de madeira de spruce e birch (Holmbom,1999b)


A cromatografía de camada delgada (TLC) é uma técnica conveniente e econômica para a análise de resinas. A TLC geralmente proporciona uma boa visualização da composição da amostra, mas não oferece qualquer precisão como método quantitativo. Portanto, a TLC é apropiada para a separação preparativa dos componentes da resina para posterior análise por métodos mais detalhistas como a cromatografia de fase gasosa (GC).

A necessidade de derivatização tem sido considerada uma desvantagem do GC, quando comparado às técnicas de fase líquida (HPLC). No entanto, esta etapa não é muito demorada para a análise de extrativos se comparada com o tempo neces-sário para a secagem, moagem e extração da amostra, seguida da evaporação total do solvente.

A HPSEC pode ser realizada sem derivatização, apesar de que a metilação geralmente melhora a separação de ácidos resínicos e ácidos graxos. Ademais, esta técnica permite o isolamento de frações ou grupos de componentes que poderão ser separados para posterior análise dos componentes individuais.

8.3

min

16:0

17:0

ai

17:0

std

18:3

18:2

18:1

18:0

P IPSa

Pal

LeD

eAb

AB

+ 2

0:3

20:0

Neo

21:0

std

18.9

min

5.8

min

16:0

18:0

P

Sa

IP20

:3Pa

l + L

e DeA

b

Ab

Neo

16.5

min

TMS esters

Methyl esters

FIGURA 16.Análise por GC de

ácidos graxos e ácidos resínicos derivados do processo kraft,

na forma de metil e trimetilsilil ésteres.

Ácidos graxos identificados:

16:0-20:0, saturados; 18:3, pinolénico;

18:2, linoleico; 18:1, oléico;

20:3, 5,11,14-eicosatrienóico.

Ácidos resínicos: P, pimárico;

IP, isopimárico; Pal, palústrico;

Lê, levopimárico; Ab, abiético;

Neo, neoabiético.


A cromatografía de fluido supercrítico (SFC) é uma técnica que apresenta semelhanças ao GC e ao HPLC. Como no GC, pode-se fazer uso do detector de ionização de chama (FID) e, como no HPLC, permite a análise direta e rápida dos extratos de madeira e polpa sem hidrólise ou qualquer tipo de derivatização. A separação é similar à obtida por GC, embora não tenha sido possível obter boas separações entre esteróis e triglicerídeos.

Devido a sua alta resolução e eficiência, o GC com colunas capilares proporciona a separação dos componentes individuais da resina, ainda que sem nenhum pré-fracionamento dos extratos. Como exemplo, a Figura 16 apresenta a separação, em coluna capilar de dimetilpolisiloxano de 30 m de comprimento, dos ésteres metílicos e trimetilsilil derivados de ácidos graxos, ácidos resínicos, álcoois graxos e esteróis.

3.4. DETERMINAÇÃO DE ÁCIDOS URÔNICOS EM POLPAS O método para a determinação dos ácidos urónicos utilizado por Simão e co-

laboradores (2005a,b) é uma modificação do método proposto por Blumenkrantz e Asboe-Hansen (1973), que foi desenvolvido originalmente para a determinação de mucopolissacarídeos ácidos em materiais biológicos. O método baseia-se na formação de um grupo cromóforo de cor rosa resultante da reação dos ácidos urônicos, previamente tratados com o reagente 2-hidroxibifenila (ou 2-fenilfenol). Segundo Blumenkrantz e Asboe-Hansen (1973), a cor obtida é estável e o método apresenta melhores sensibilidade e especificidade que outros métodos colorimétri-cos propostos até a data, usando os reagentes carbazol e orcinol. No entanto, não é conhecido o mecanismo desta reação.

No trabalho de Simão (2007), cuja descrição se segue, foram introduzidas algumas modificações no procedimento original, de modo a utilizar uma maior quantidade de polpa por amostra. As amostras de polpa ou de madeira moída são previamente hidrolisadas através de um método baseado na hidrólise de Saeman: a 0,02 g de madeira ou polpa juntam-se 400 μL de ácido sulfúrico a 72%. A mistura é colocada num banho térmico a 25ºC durante 3 horas, após as quais se adicionam 4,4 mL de água ultra-pura, diminuindo assim a concentração do ácido sulfúrico para 1 M. Em seguida, coloca-se a amostra em um banho térmico a 100 ºC durante 1 hora.

As amostras assim hidrolisadas são centrifugadas e o líquido sobrenadante é recolhido. Este é então diluído de modo a que a concentração de ácidos urônicos produza uma absorvância dentro dos limites da validade da Lei de Beer-Lambert (entre 0,2 e 0,6). Para cada amostra são utilizados cinco tubos de ensaio, em cada um dos quais se introduz 1 mL da solução. Adicionam-se 6 mL de uma solução de tetraborato de sódio 0,0125 M em ácido sulfúrico concentrado. A mistura é agitada em agitador Vortex e colocada em banho térmico a 100ºC durante 10 minutos, ao fim dos quais é colocada em banho de gelo durante 5 minutos. Posteriormente, 200 μL de uma solução de 2-hidroxibifenila 0,15% em NaOH 0,5% são adicionados a quatro dos cinco tubos envolvidos no ensaio. Depois de agitada a mistura, a absor-


vância é lida a um comprimento de onda de 520 nm. Como alguns açúcares neutros geram cor na reação com a solução de tetraborato de sódio e ácido sulfúrico, um branco deve sempre ser efetuado em cada ensaio (5º tubo de ensaio), no qual o rea-gente 2-hidroxibifenila deve ser substituído por uma solução de NaOH 0,5%.

No trabalho de Simão (2007), foram ainda efetuados testes de repetibilidade tendo esta sido calculada através da análise de madeiras de E. globulus em 35 en-saios. Obteve-se um valor de 0,34%, em base madeira, para uma média de 5,2%, com um grau de confiança de 95%. A Figura 17 apresenta o histograma dos valores obtidos.

A técnica colorimétrica utilizada para determinação dos ácidos urônicos quantifica tanto o ácido metilglucurônico como os ácidos galacturônico e glucurô-nico. Uma vez que na madeira de folhosas existem apenas quantidades residuais destes últimos (Sjöstrom, 1989), é comum considerar, neste tipo de madeiras, que todos os ácidos urônicos determinados por esta técnica correspondem a ácidos metilglucurônicos (GlcA). Nas polpas kraft, por sua vez, existem também ácidos hexenurônicos (HexA) formados durante o cozimento alcalino. Contudo, estes são degradados em grande extensão nas condições analíticas associadas à referida téc-nica colorimétrica, pelo que não é necessário efetuar qualquer correção dos valores experimentais.

Para quantificar os ácidos urônicos, é necessário construir uma curva de cali-bração utilizando soluções de concentrações diferentes de ácido galacturônico. O gráfico da Figura 18 apresenta uma curva de calibração deste tipo. Como se pode observar nesta representação, verificou-se uma variação linear da absorvância (Abs) com a quantidade de ácido galacturônico (Gal) quando esta variou entre 23 e 50 μg/ml, correspondendo a absorvâncias inferiores a cerca de 0,6 (lidas em um espec-

FIGURA 17.Histograma dos teores

de ácido glucurônico (GlcA) na madeira de E. globulus (Simão, 2007).

0

Núm

ero

de o

bser

vaçõ

es

[GIcA] (% odw)

4.4

1

2

3

4

5

6

7

8

9

4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 5 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8


trofotômetro Beckman DU-600). O reagente colorimétrico tinha uma pureza de 90% (Aldrich), enquanto que a do padrão era de 99% (Riedel). A correlação obtida foi:

Gal (μg/ml) = 5,0 + 181,5*Abs R2=0,9972

3.5. DETERMINAÇÃO DE ÁCIDOS HEXENURÔNICOS EM POLPAS Sabe-se que folhosas como o Eucalyptus spp. contêm um alto teor de 4-O-

metil-glucuronoxilanas e que as unidades de ácido 4-O-metil-glucurônico podem contribuir com até 5% de sua massa seca (Carvalho, 1999). Estas unidades, duran-te o processo de polpação, são parcialmente convertidas no ácido hexenurônico (HexA) por desmetoxilação seguida de um rearranjo interno (Figura 19).

A ocorrência de altos teores de HexA em polpas kraft representa a extensão com que as hemiceluloses foram degradadas durante o processo. A formação e a

Avs

orvâ

ncia

Ácido galacturônico (μg/mL)

00 20 40 60 80 100 120

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

FIGURA 18.Curva de calibração utilizada nos ensaios para a determinação dos ácidos urónicos (Simão, 2007).

FIGURA 19.Mecanismo de formação do ácido 2-furóico em meio ácido, a partir do ácido hexenurônico (Teleman et al. 1996)


estabilidade do ácido hexenurônico é muito influenciada pelas condições de cozi-mento, em especial pela temperatura e pela carga alcalina (Buchert, 1995). Assim, polpas marrons obtidas sob diferentes condições de polpação (diferentes severida-des) apresentam diferenças no conteúdo destes ácidos carboxílicos.

A existência de ácidos hexenurônicos (HexA) em polpas kraft era, até há pouco tempo, desconhecida porque estes compostos degradam durante procedimentos de hidrólise ácida (Johansson e Samuelson, 1977; Teleman et al., 1996). Os primeiros autores a detectar a presença destes ácidos em polpas kraft (Buchert et al., 1995) substituíram a tradicional hidrólise ácida por uma hidrólise enzimática, utilizando depois as técnicas de RMN e HPLC para determinar a composição dos carboidratos da polpa.

Desde então, vários métodos foram desenvolvidos para a detecção e quantifica-ção destes ácidos hexenurônicos. Tenkanen et al. (1999) fizeram uma comparação dos três principais métodos desenvolvidos até a data: o método VTT, que consiste na hidrólise enzimática das polpas seguida de análise dos carboidratos por HPA-EC-PAD (Tenkanen et al., 1995); o método HUT, que consiste em uma hidrólise ácida seletiva com formato de sódio, seguida de análise por espectrofotometria no UV (Vuorinen et al., 1999); e o método KTH, que consiste em uma hidrólise com acetato de mercúrio e reação com ácido tiobarbitúrico, produzindo uma cor rosa que é quantificada por espectrofotometria no visível (Gellerstedt e Li, 1996). Mais recentemente, Jiang et al. (2001) propuseram um método de determinação dos HexA por hidrólise com ácido sulfúrico e análise dos ácidos furóicos resultantes da reação por cromatografia de troca iônica com detecção por condutividade suprimi-da. No entanto, até o momento, não existe um método considerado padrão para a determinação destes compostos em polpas kraft.

Ácidos hexenurônicos têm sido comumente medidos pelo método descrito por Jiang et al. (2001) nos hidrolisados ácidos de polpas kraft. A análise dos hi-drolisados pode ser realizada por HPLC utilizando uma coluna com fase reversa quimicamente ligada (octadecilsilano ou C18). A análise quantitativa é geralmente efetuada por padronização externa utilizando concentrações crescentes de ácido 2-furóico, que corresponde ao produto de hidrólise ácida dos ácidos hexenurônicos presentes na polpa. Para este fim, o monitoramento do eluato da coluna é efetuado por espectrofotometria no ultravioleta, no comprimento de onda máximo de ab-sorção deste analito (254 nm).

Como a ligação glicosídica que ancora os HexA à hemicelulose residual é de natureza lábil ao ataque de ácidos minerais, o procedimento cromatográfico de-pende de uma etapa hidrolítica com ácido sulfúrico diluído cujo rendimento em ácido 2-furóico é de difícil determinação. Assim, não é possível garantir que 100% dos HexA existentes nas polpas seja liberado em solução mediante este tratamento. Apesar disso, o procedimento baseado em hidrólise ácida tem sido amplamente utilizado para a análise destas estruturas em polpas celulósicas.


A determinação do teor de HexA em polpas, no âmbito dos trabalhos de Pe-droso (2001), Pedroso e Carvalho (2003), Simão (2007) e Simão et al. (2005a,b), foi feita com base no método proposto por Chai et al. (2001). Estes autores desenvol-veram uma metodologia que permite a determinação do teor de HexA em polpas através de uma hidrólise com uma solução de cloreto de mercúrio (II) em acetato de sódio. Os produtos da hidrólise são quantificados através de espectrofotometria no UV. A hidrólise com cloreto de mercúrio é semelhante à hidrólise com acetato de mercúrio que está incluída no método KTH; contudo, ao contrário do acetato de mercúrio, o cloreto de mercúrio tem uma absorvância muito baixa na região do UV, o que permite a determinação dos HexA por espectrofotometria sem a influên-cia deste reagente. Para corrigir a contribuição da lignina dissolvida na absorvância medida por este método, os autores utilizaram uma técnica de medição em dois comprimentos de onda diferentes (260 e 290 nm), tendo encontrado uma razão de 1,2 entre as intensidades de absorção atribuídas à lignina.

No trabalho de Pedroso (2001), a temperatura e o tempo desta reação foram otimizados, sendo de 70ºC e 70 min para polpas cruas de E. globulus, respectiva-mente. Por sua vez, no trabalho de Simão (2007), as quantidades foram modifica-das em relação à metodologia original de modo a permitir a análise de uma maior quantidade de polpa por amostra, tendo sido realizados também testes para deter-minar os tempos de reação mais adequados. A solução aquosa de hidrólise é com-posta por cloreto de mercúrio (HgCl

2) 0,6% em acetato de sódio (CH

3COONa)

0,7%, o que mantém a solução neutra (pH 6 a 7). A necessidade de adicionar um composto tampão é devida ao fato do HgCl

2 ser extremamente ácido e degradar os

HexA em compostos furânicos. Por exemplo, para preparar 500 mL de solução, são necessários 2,99 g de HgCl

2 e 3,50 g de CH

3COONa. É ainda importante ressaltar

que a solução deve ser guardada em um local escuro, à temperatura ambiente, e que estará em boas condições enquanto não apresentar qualquer precipitação.

Como procedimento experimental, juntam-se 0,2 g de madeira ou polpa com 40 mL de uma solução de cloreto de mercúrio/acetato de sódio. A mistura é agitada em agitador Vortex e colocada em banho térmico a 70 ºC com agitação durante 70 min. Após este tempo, as amostras são colocadas em gelo durante 10 min e centri-fugadas durante 5 min a uma velocidade de 2700 rpm. Se necessário, procede-se ainda à filtração do sobrenadante. O sobrenadante é colocado em uma célula de quartzo com um percurso óptico de 10 mm e a absorvância é lida a 260 nm e a 290 nm. O teor de HexA na polpa é calculado a partir da expressão desenvolvida por Chai et al. (2001):

CHexA=0,287A260-1,2A290 ·V

W

em que CHexA

é o teor de HexA em mmol/kg odp, A260

e A290

são as absorvâncias a 260 e 290 nm, V é o volume da solução de hidrólise em mL, e w é a massa seca em g da amostra de polpa.


No trabalho de Simão (2007), para cada amostra de polpa foram realizadas no mínimo três réplicas. A repetibilidade do método foi calculada através de uma aná-lise ANOVA, obtendo-se um valor de 3,08 mmol/kg com um intervalo de confiança de 95% para uma média de valores de 19,54 mmol/kg. Os teores de HexA podem ser posteriormente convertidos em percentagem da massa de madeira inicial, considerada mais adequada para estudos cinéticos, multiplicando-se pela massa molecular de 176 g/mol e pelo rendimento.

Segundo Chai et al. (2001), as amostras de polpas não necessitam de extração prévia com solventes, tendo o mesmo sido confirmado por Pedroso (2001). De fato, Pedroso (2001) obteve 54,8 e 54,5 mmol HexA/kg de polpa, respectivamente, para uma polpa kraft crua de E. globulus, não extraída e extraída com diclorome-tano. Pedroso (2001) também estudou a influência da dimensão das partículas de polpa, tendo obtido resultados de HexA inferiores em polpas moídas em moinho de facas do tipo Wiley.

4. ConclusãoA caracterização de materiais lignocelulósicos é uma difícil tarefa experimental

cuja solução exige a aplicação de uma diversidade de métodos analíticos de van-guarda. Uma das principais justificativas para este comportamento está relacionada à íntima associação que existe entre os seus componentes majoritários, celulose, hemiceluloses e lignina. Cada um destes componentes tem características químicas próprias e nenhum método é capaz de caracterizá-los simultaneamente sem gerar alguma ambigüidade, perdas de processo ou erros experimentais. Por esta razão, o grande desafio que acompanha estes procedimentos é o fechamento de um balan-ço de massas aceitável, isento de respostas ambíguas e de artefatos experimentais. Este capítulo teve como objetivos revisar as bases da química de materiais lignoce-lulósicos e abordar alguns dos principais métodos instrumentais que vêm sendo empregados para sua caracterização. Detalhes sobre outros métodos analíticos não abordados neste ensaio poderão ser obtidos em artigos científicos ou revisões bi-bliográficas amplamente disponíveis na literatura especializada.

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