Instituto de Qumica de So Carlos IQSC

Universidade de So Paulo

Caracterizao de Protenas

Disciplina: Bioqumica I

Docente: Profa. Dra. Fernanda Canduri

Aula modificada de: Profa. Dra. Clia R. Carlini - PUCRS

ELETROFORESE Eletroforese

1. pH / tampo

2. Suporte

- papel : corrente alta (calor)

uso para peptdeos e aminocidos

- agarose : cidos nuclicos

Imunoeletroforese

Protenas nativas

- poliacrilamida : protenas

ac. nucleicos

no desnaturante ou nativa

desnaturante e redutor

peso molecular

composio de subunidades

focalizao isoeltrica: pI

bidimensional

Condies que determinam a separao

Realizado sem fervura das amostras

Pode ter SDS no gel de separao

Protenas analisadas na sua conformao nativa

possvel observar a presena de oligomerizao

Gel de eletroforese nativo

Eletroforese

Eletroforese desnaturante

A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) permite visualizar a composio de protenas de uma amostra. um mtodo complementar para a purificao de protenas.

Fornece informaes sobre a massa molecular e composio de subunidades da protena em meio desnaturante e redutor.

A poliacrilamida um polmero que forma um gel de malha porosa que funciona como uma peneira, deixando passar atravs de seus poros as molculas pequenas e retendo

as grandes.

H3C-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2- dodecil sulfato de sdio

Desnaturao de protenas por SDS

a desnaturao uniformiza a forma das protenas, que poderia influenciar na migrao atravs dos poros da poliacrilamida;

mascara a carga natural das protenas no pH da corrida, fazendo com que todas molculas migrem para o ando;

facilita o efeito de redutores, rompendo pontes dissulfeto intra- e inter-cadeias

A poro hidrocarboneto do

detergente interage com as

regies hidrofbicas da protena,

dispondo o grupo sulfato

carregado na superfcie, em

contato com o meio aquoso. A

repulso entre os grupos sulfato

desestabiliza os laos no

covalentes que mantm a

estrutura 3D da protena,

desnaturando-a.

Efeito do SDS

A B

C

C

C

A

A

B

B

SDS (dodecil sulfato de sdio

+

2-mercaptoetanol

Efeitos do SDS

desnaturao uniformiza a forma das protenas;

mascara a carga natural das protenas no pH da corrida, fazendo

com que todas molculas migrem

para o ando;

facilita o efeito de redutores

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE)

cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm)

As partes superior e inferior do gel fazem contato com recipientes de tampo, onde esto

os eletrodos que estabelecero o campo eltrico (~100V) durante a corrida (1 a 2h).

catodo

anodo

tampo

Poos para

as amostras

amostra

Placas

de vidro

1 mm

gel

SDS-PAGE das protenas da bactria

Salmonella tiphymurium

Direo da

migrao

Cada linha (banda) corada no gel

representa uma protena

Determinao da massa molecular de protenas

Curva de calibrao de SDS-PAGE a 15%

Mobilidade relativa (Rf)

Massa m

ole

cula

r (k

D)

Mobilidade relativa =

distncia percorrida pela banda X

distncia percorrida pelo marcador da corrida

97.4

87.0

45.0

29.0

21.0

12.5

6.5

(-)

(+)

Peso molecular ou massa molecular relativa: Mr, relao da massa da molcula para um duodcimo da massa do carbono 12. (adimensional) Massa molecular: m, expressa em dltons (Da) (duodcimo da massa do carbono 12) 1 kDa = 1.000 Da Ex.: uma molcula tem Mr = 18.000 ou m = 18.000 Da (18 kDa)

migrao atravs de um gradiente de pH

protenas focalizam nos seus pIs

Anflitos: Misturas de compostos poliaminados/policarboxilados

Gel no tamponado polimerizado com anflitos

1 corrida: anflitos criam gradiente

2 corrida: amostras so aplicadas

Aps a corrida: pedaos do gel so analisados quanto ao seu pH.

3.0

4.0

5.0

6.0

pH

+ Marcadores de pI conhecidos

_

Aplicaes: - Determinao do pI

- Isoformas da mesma protena: - glicosilao - fosforilao - mutaes pontuais

Eletroforese focalizao isoeltrica

1a.dimenso: focalizao isoeltrica

2a.dimenso: SDS-PAGE (perpendicular a 1a.)

MM x 103

Eletroforese Bidimensional

-

P I pI

+

3

3.5

4

4.5

5

5.5

Origem

5 4 3 2 6 7 8 9 10

PROTEOMA

anlise simultnea de at 5.000 protenas

permite comparao de todas as protenas expressas por uma clula em dois momentos diferentes:

anlise do efeito de hormnios,

anlise do efeito de drogas;

estados fisiolgicos (desenvolvimento);

condies patolgicas diversas (vrus, bactrias,etc.)

Eletroforese 2D de protenas totais (proteoma) de Escherichia coli

Protenas com mesmo pI

Protenas com a

mesma massa

aminocido

Para determinar a estrutura primria de uma protena,

necessrio primeiro conhecer a composio (nmero

e tipos) de seus aminocidos.

A posio do pico no cromatograma identifica o aminocido e

a rea do pico quantifica o aminocido.

A protena pura tratada com

HCl 6N fervente para quebrar

(hidrlise) as ligaes peptdicas.

A mistura resultante submetida

a mtodos cromatogrficos (fase

reversa, troca inica) para separar

os diferentes aminocidos. Tempo de reteno (min)

flu

ore

sc

ncia

Sequenciamento de protenas

Existem vrios mtodos para se determinar a sequncia de aminocidos de

uma protena.

Os dois mtodos atualmente mais utilizados:

a) Mtodo de Edman: reao do aminocido N-terminal da protena com

fenil-isotiocianato .

A protena modificada submetida a hidrlise cida liberando o aminocido

N-terminal modificado, e este identificado por cromatografia. Segue-se

novo ciclo de reao com o prximo aminocido na protena, que se tornou

o novo N-terminal.

b) Espectrometria de massa: determinao das massas de fragmentos

correspondendo a aminocidos, retirados sequencialmente da protena.

Sequenciamento de protenas

Quando uma protena possui mais de 20-30 resduos de aminocidos, no

possvel sequenci-la diretamente pelo mtodo de degradao de Edman.

Para obter a sequncia completa de uma protena, necessrio sequenciar vrios peptdeos

da mesma protena, obtidos por diferentes tipos de quebra da cadeia, at haver sobreposio

de suas sequncias.

Protena

Total 150 a.a

sequncia obtida a partir da protena intacta

30 aa

Diferentes mtodos so utilizados para obter-se diferentes peptdeos da protena:

A) enzimas proteolticas, como tripsina (quebra em resduos de Lys ou Arg) e quimotripsina

(quebra em resduos de Phe);

B) tratamento com brometo de cianognio (quebra em Met).

protena

inteira

peptdeos

mtodo A

peptdeos

mtodo B

Sequenciamento de novo de protenas por espectrometria

de massas

hlio ou argnio

A ligao peptdica se

quebra formando

fragmentos tpicos,

como os ons b e y

mostrados na figura

acima, que tero

massas diferentes de

acordo com o radical R

de cada aminocido.

MS/MS ou MS2 um

sistema em que

dois espectrmetros

de massa so

utilizados em

sequncia, separados

por uma cmara de

coliso

Espectro MS/MS do peptdeo

GLSDGEWQQVLNVWGK

AA Codes Mono. AA Codes Mono.

Gly G 57.021464 Asp D 115.02694

Ala A 71.037114 Gln Q 128.05858

Ser S 87.032029 Lys K 128.09496

Pro P 97.052764 Glu E 129.04259

Val V 99.068414 Met M 131.04048

Thr T 101.04768 His H 137.05891

Cys C 103.00919 Phe F 147.06841

Leu L 113.08406 Arg R 156.10111

Ile I 113.08406 CMC 161.01467

Asn N 114.04293 Tyr Y 163.06333

- - - Trp W 186.07931

Analisa-se o espectro

buscando diferenas de

m/z equivalentes a um

resduo de aminocido,

que permitem conhecer

a sequncia dos

peptdeos

Dicroismo circular

O CD pode ser empregado na obteno de detalhes

estruturais de diferentes tipos de compostos:

Protenas; Carboidratos; cidos nuclicos; Frmacos;

considerado o mtodo de escolha para determinao

rpida do contedo de estrutura 2dria de peptdeos e

protenas;

O CD um mtodo altamente sensvel, capaz de distinguir

conformaes de hlice , folhas e alas.

A preciso do mtodo varia em funo do tipo de

estrutura secundria apresentada pela protena:

97% para hlices; 75% para folhas ; 50% para voltas; 89% para outros tipos

A faixa de varredura do CD e propriedades derivadas:

UV distante, 190-250nm O cromforo a ligao peptdica: a intensidade do sinal ser

dependente dos ngulos torsionais e .

O espectro ser a soma das contribuies das curvas de CD de cada um dos tipos de estrutura 2daria existentes no sistema, consideradas

suas abundncias relativas;

A tcnica no tem resoluo para identificar os resduos especficos; Requer em geral 20-200L de soluo contendo de 1mg/mL a 50g/mL da protena em estudo, em qualquer tampo que no absorva

nesta regio do espectro.

Luz circularmente polarizada

Dicrosmo Circular a medida da absorbncia diferencial entre as duas

rotaes de luz circularmente polarizada por uma molcula assimtrica.

Neste caso, o que est sendo absorvido uma radiao eletromagntica na regio de

radiofrequncias;

Esta absoro, contudo, ser uma funo do tipo de ncleos atmicos na molcula em estudo;

1H, o istopo mais abundante; 13C, enquanto o istopo mais abundante o 12C; 15N, enquanto o istopo mais abundante o 14N; 31P, enquanto o istopo mais abundante o 30P.

Ressonncia Magntica Nuclear - RMN

Por que aplicar RMN a protenas?

Identificao de estados enovelados e no-

enovelados (assim como transies e fatores que os

governam);

Medida de constantes de afinidade;

Avaliar o efeito de mutaes na estrutura ou

protenas homlogas e dinmica de protenas;

Determinao de estruturas 2 e 3;

Caracterizao da flexibilidade e dinmica proteicas.

Cristalografia de raios X

A tcnica se baseia no uso de raios X para obter um

mapa da densidade eletrnica de uma determinada

molcula em ambiente cristalino:

uso de Radiao sncrotron; ou Gerador de raios X em laboratrio.

A partir do mapa de densidade eletrnica inicia-se o

preenchimento desta por tomos, relacionados

molcula de interesse, capazes de produzirem a

densidade obtida:

Protena p53 um supressor de tumor

A resoluo da estrutura da protena por RMN ou por

cristalografia de difrao de raios X permite a anlise das

interaes intra e intermoleculares.