Download - Caracterização de Proteínas
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Instituto de Qumica de So Carlos IQSC
Universidade de So Paulo
Caracterizao de Protenas
Disciplina: Bioqumica I
Docente: Profa. Dra. Fernanda Canduri
Aula modificada de: Profa. Dra. Clia R. Carlini - PUCRS
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ELETROFORESE Eletroforese
1. pH / tampo
2. Suporte
- papel : corrente alta (calor)
uso para peptdeos e aminocidos
- agarose : cidos nuclicos
Imunoeletroforese
Protenas nativas
- poliacrilamida : protenas
ac. nucleicos
no desnaturante ou nativa
desnaturante e redutor
peso molecular
composio de subunidades
focalizao isoeltrica: pI
bidimensional
Condies que determinam a separao
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Realizado sem fervura das amostras
Pode ter SDS no gel de separao
Protenas analisadas na sua conformao nativa
possvel observar a presena de oligomerizao
Gel de eletroforese nativo
Eletroforese
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Eletroforese desnaturante
A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) permite visualizar a composio de protenas de uma amostra. um mtodo complementar para a purificao de protenas.
Fornece informaes sobre a massa molecular e composio de subunidades da protena em meio desnaturante e redutor.
A poliacrilamida um polmero que forma um gel de malha porosa que funciona como uma peneira, deixando passar atravs de seus poros as molculas pequenas e retendo
as grandes.
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H3C-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2- dodecil sulfato de sdio
Desnaturao de protenas por SDS
a desnaturao uniformiza a forma das protenas, que poderia influenciar na migrao atravs dos poros da poliacrilamida;
mascara a carga natural das protenas no pH da corrida, fazendo com que todas molculas migrem para o ando;
facilita o efeito de redutores, rompendo pontes dissulfeto intra- e inter-cadeias
A poro hidrocarboneto do
detergente interage com as
regies hidrofbicas da protena,
dispondo o grupo sulfato
carregado na superfcie, em
contato com o meio aquoso. A
repulso entre os grupos sulfato
desestabiliza os laos no
covalentes que mantm a
estrutura 3D da protena,
desnaturando-a.
Efeito do SDS
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A B
C
C
C
A
A
B
B
SDS (dodecil sulfato de sdio
+
2-mercaptoetanol
Efeitos do SDS
desnaturao uniformiza a forma das protenas;
mascara a carga natural das protenas no pH da corrida, fazendo
com que todas molculas migrem
para o ando;
facilita o efeito de redutores
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Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE)
cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm)
As partes superior e inferior do gel fazem contato com recipientes de tampo, onde esto
os eletrodos que estabelecero o campo eltrico (~100V) durante a corrida (1 a 2h).
catodo
anodo
tampo
Poos para
as amostras
amostra
Placas
de vidro
1 mm
gel
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SDS-PAGE das protenas da bactria
Salmonella tiphymurium
Direo da
migrao
Cada linha (banda) corada no gel
representa uma protena
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Determinao da massa molecular de protenas
Curva de calibrao de SDS-PAGE a 15%
Mobilidade relativa (Rf)
Massa m
ole
cula
r (k
D)
Mobilidade relativa =
distncia percorrida pela banda X
distncia percorrida pelo marcador da corrida
97.4
87.0
45.0
29.0
21.0
12.5
6.5
(-)
(+)
Peso molecular ou massa molecular relativa: Mr, relao da massa da molcula para um duodcimo da massa do carbono 12. (adimensional) Massa molecular: m, expressa em dltons (Da) (duodcimo da massa do carbono 12) 1 kDa = 1.000 Da Ex.: uma molcula tem Mr = 18.000 ou m = 18.000 Da (18 kDa)
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migrao atravs de um gradiente de pH
protenas focalizam nos seus pIs
Anflitos: Misturas de compostos poliaminados/policarboxilados
Gel no tamponado polimerizado com anflitos
1 corrida: anflitos criam gradiente
2 corrida: amostras so aplicadas
Aps a corrida: pedaos do gel so analisados quanto ao seu pH.
3.0
4.0
5.0
6.0
pH
+ Marcadores de pI conhecidos
_
Aplicaes: - Determinao do pI
- Isoformas da mesma protena: - glicosilao - fosforilao - mutaes pontuais
Eletroforese focalizao isoeltrica
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1a.dimenso: focalizao isoeltrica
2a.dimenso: SDS-PAGE (perpendicular a 1a.)
MM x 103
Eletroforese Bidimensional
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P I pI
+
3
3.5
4
4.5
5
5.5
Origem
5 4 3 2 6 7 8 9 10
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PROTEOMA
anlise simultnea de at 5.000 protenas
permite comparao de todas as protenas expressas por uma clula em dois momentos diferentes:
anlise do efeito de hormnios,
anlise do efeito de drogas;
estados fisiolgicos (desenvolvimento);
condies patolgicas diversas (vrus, bactrias,etc.)
Eletroforese 2D de protenas totais (proteoma) de Escherichia coli
Protenas com mesmo pI
Protenas com a
mesma massa
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aminocido
Para determinar a estrutura primria de uma protena,
necessrio primeiro conhecer a composio (nmero
e tipos) de seus aminocidos.
A posio do pico no cromatograma identifica o aminocido e
a rea do pico quantifica o aminocido.
A protena pura tratada com
HCl 6N fervente para quebrar
(hidrlise) as ligaes peptdicas.
A mistura resultante submetida
a mtodos cromatogrficos (fase
reversa, troca inica) para separar
os diferentes aminocidos. Tempo de reteno (min)
flu
ore
sc
ncia
Sequenciamento de protenas
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Existem vrios mtodos para se determinar a sequncia de aminocidos de
uma protena.
Os dois mtodos atualmente mais utilizados:
a) Mtodo de Edman: reao do aminocido N-terminal da protena com
fenil-isotiocianato .
A protena modificada submetida a hidrlise cida liberando o aminocido
N-terminal modificado, e este identificado por cromatografia. Segue-se
novo ciclo de reao com o prximo aminocido na protena, que se tornou
o novo N-terminal.
b) Espectrometria de massa: determinao das massas de fragmentos
correspondendo a aminocidos, retirados sequencialmente da protena.
Sequenciamento de protenas
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Quando uma protena possui mais de 20-30 resduos de aminocidos, no
possvel sequenci-la diretamente pelo mtodo de degradao de Edman.
Para obter a sequncia completa de uma protena, necessrio sequenciar vrios peptdeos
da mesma protena, obtidos por diferentes tipos de quebra da cadeia, at haver sobreposio
de suas sequncias.
Protena
Total 150 a.a
sequncia obtida a partir da protena intacta
30 aa
Diferentes mtodos so utilizados para obter-se diferentes peptdeos da protena:
A) enzimas proteolticas, como tripsina (quebra em resduos de Lys ou Arg) e quimotripsina
(quebra em resduos de Phe);
B) tratamento com brometo de cianognio (quebra em Met).
protena
inteira
peptdeos
mtodo A
peptdeos
mtodo B
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Sequenciamento de novo de protenas por espectrometria
de massas
hlio ou argnio
A ligao peptdica se
quebra formando
fragmentos tpicos,
como os ons b e y
mostrados na figura
acima, que tero
massas diferentes de
acordo com o radical R
de cada aminocido.
MS/MS ou MS2 um
sistema em que
dois espectrmetros
de massa so
utilizados em
sequncia, separados
por uma cmara de
coliso
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Espectro MS/MS do peptdeo
GLSDGEWQQVLNVWGK
AA Codes Mono. AA Codes Mono.
Gly G 57.021464 Asp D 115.02694
Ala A 71.037114 Gln Q 128.05858
Ser S 87.032029 Lys K 128.09496
Pro P 97.052764 Glu E 129.04259
Val V 99.068414 Met M 131.04048
Thr T 101.04768 His H 137.05891
Cys C 103.00919 Phe F 147.06841
Leu L 113.08406 Arg R 156.10111
Ile I 113.08406 CMC 161.01467
Asn N 114.04293 Tyr Y 163.06333
- - - Trp W 186.07931
Analisa-se o espectro
buscando diferenas de
m/z equivalentes a um
resduo de aminocido,
que permitem conhecer
a sequncia dos
peptdeos
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Dicroismo circular
O CD pode ser empregado na obteno de detalhes
estruturais de diferentes tipos de compostos:
Protenas; Carboidratos; cidos nuclicos; Frmacos;
considerado o mtodo de escolha para determinao
rpida do contedo de estrutura 2dria de peptdeos e
protenas;
O CD um mtodo altamente sensvel, capaz de distinguir
conformaes de hlice , folhas e alas.
A preciso do mtodo varia em funo do tipo de
estrutura secundria apresentada pela protena:
97% para hlices; 75% para folhas ; 50% para voltas; 89% para outros tipos
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A faixa de varredura do CD e propriedades derivadas:
UV distante, 190-250nm O cromforo a ligao peptdica: a intensidade do sinal ser
dependente dos ngulos torsionais e .
O espectro ser a soma das contribuies das curvas de CD de cada um dos tipos de estrutura 2daria existentes no sistema, consideradas
suas abundncias relativas;
A tcnica no tem resoluo para identificar os resduos especficos; Requer em geral 20-200L de soluo contendo de 1mg/mL a 50g/mL da protena em estudo, em qualquer tampo que no absorva
nesta regio do espectro.
Luz circularmente polarizada
Dicrosmo Circular a medida da absorbncia diferencial entre as duas
rotaes de luz circularmente polarizada por uma molcula assimtrica.
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Neste caso, o que est sendo absorvido uma radiao eletromagntica na regio de
radiofrequncias;
Esta absoro, contudo, ser uma funo do tipo de ncleos atmicos na molcula em estudo;
1H, o istopo mais abundante; 13C, enquanto o istopo mais abundante o 12C; 15N, enquanto o istopo mais abundante o 14N; 31P, enquanto o istopo mais abundante o 30P.
Ressonncia Magntica Nuclear - RMN
Por que aplicar RMN a protenas?
Identificao de estados enovelados e no-
enovelados (assim como transies e fatores que os
governam);
Medida de constantes de afinidade;
Avaliar o efeito de mutaes na estrutura ou
protenas homlogas e dinmica de protenas;
Determinao de estruturas 2 e 3;
Caracterizao da flexibilidade e dinmica proteicas.
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Cristalografia de raios X
A tcnica se baseia no uso de raios X para obter um
mapa da densidade eletrnica de uma determinada
molcula em ambiente cristalino:
uso de Radiao sncrotron; ou Gerador de raios X em laboratrio.
A partir do mapa de densidade eletrnica inicia-se o
preenchimento desta por tomos, relacionados
molcula de interesse, capazes de produzirem a
densidade obtida:
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Protena p53 um supressor de tumor
A resoluo da estrutura da protena por RMN ou por
cristalografia de difrao de raios X permite a anlise das
interaes intra e intermoleculares.