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Caratterizzazione microbiologica e metagenomica di compost

Massimo Zaccardelli, Catello Pane, Riccardo Scotti

CREA-Centro di ricerca Orticoltura e Florovivaismo Pontecagnano (SA)

Portici, 15 giugno 2018

È la capacità di un compost di limitare lo sviluppo di malattie fungine o batteriche in presenza della pianta ospite

Meccanismi della Soppressività

► Azione diretta di sostanze antifungine proprie dei compost

►Incremento della competizione per lo spazio e i nutrienti a discapito dei patogeni ►Rilascio di composti fungitossici, antibiotici, HCN, VOCs, siderofori ed enzimi idrolitici da parte dei microrganismi antagonisti

►Induzione della resistenza sistemica nelle piante ospiti

ANTAGONISTA È un microrganismo, batterio o fungo, in grado di contrastare un patogeno.

►Parassitismo diretto


Meccanismi della Soppressività

Direct mechanisms Indirect mechanisms


NON Sterilizzato Sterilizzato (autoclavato)

Quando si sterilizza con il calore un compost soppressivo, quest’ultimo generalmente perde la soppressività


CTRL INOC C1 (p.+i.) C4 (p.) C5 (forsu) CC (c.) CCF (c.+f.)

st. st. st. st. st.

La Soppressività dei compost


Not inoculated CTRL

InoculatedCTRL

InoculatedNot sterile Compost

InoculatedSterile

Compost

Crescione /Sclerotinia minor

Es. compost da posa di caffè


Numerosi tipi di microrganismi antagonisti accrescono la soppressività del compost. Tra questi in particolare ci sono molti funghi − Trichoderma sp

O da batteri come

− Pseudomonas sp − Bacillus sp − Streptomyces sp

Principali microrganismi colturabili noti ai quali è attribuito in ruolo attivo nei compost soppressivi


Selezione di batteri antagonisti

Aloni di inibizioni in pastre Petri tra il fungo fitopatogeno e i batteri

produttore di sostanze antifungine diffusibili

Fungo

Batteri


0

10

20

30

40

50

60

70

1 6 11 16 21 26 31

P2, residui disoleati P1, residui non disoleati

Rivoltamenti

Tem

pera

tura

°C

Fase attiva (giorni)

Fase Attiva (30 gg) Fase di Maturazione (60 gg)

Compostaggio e temperature


Lactuca sativa / Sclerotinia minor

Brassica oleracea / Rhizoctonia solani

Solanum tuberosum / Fusarium solani

Saggio in vivo di batteri sporigeni isolati da compost


Microrganismi antagonisti/PGPR

A sinistra pomodoro inoculato con un Bacillus PGPR


Compost nella difesa dalle malattie telluriche


Control of Corky root of tomato

Pseu

dom

onas

(CFU

104

g-1)

0

50

100

150

200

250

300 6

5

4

3

2

1

0

Spor

e-fo

rmin

gba

cter

ia(C

FU 1

06g-1

)

C15 MINC45 CNT C15 MINC45 CNT

March April May June JulyMarch April May June July

Pseu

dom

onas

(CFU

104

g-1)

0

50

100

150

200

250

300 6

5

4

3

2

1

0

Spor

e-fo

rmin

gba

cter

ia(C

FU 1

06g-1

)

C15 MINC45 CNT C15 MINC45 CNT

March April May June JulyMarch April May June JulyMarch April May June JulyMarch April May June July

0

1

2

3

4

CNT MIN C15 C45

Treatments

Dis

ease

Seve

rity

0

1

2

3

4

CNT MIN C15 C45

Treatments

Dis

ease

Seve

rity

Control Compost

Examples


“CarbOnFarm”


Soppressività dei compost CarbOnFarm

0

25

50

75

100

L1 L2 L3

L7-8

TO M

.P.

S.S.

TO

L1A L4 CV

L2A

L3A

L4A

L5/6

A

L7A

RhizoctoniaSclerotinia

Inci

denz

a di

pia

ntin

e m

alat

e (%

)

* * Compost

Con sono indicati i compost capaci di controllare completamente Sclerotinia minor su Lepidium * Con x sono indicati i compost incapaci di controllare Rhizoctonia solani su Lepidium

X X X


Caratteristiche microbiologiche dei compost

Batteri Totali

Funghi Totali

L1 8,59 4,67L2 7,78 4,23L3 7,48 5,92L7-8 7,59 6,36L2C 6,98 4,56L7A 5,88 5,23L1A 7,98 6,00L4 12,56 5,15L2A 6,76 3,30L3A 6,62 4,00L4A 8,12 5,96L5/6A 8,16 5,19CV 6,21 4,78S.S. TO 6,00 3,85TO M.P. 8,78 4,19

Compost(Log10 u.f.c. g-1)


Enterobatteri Clostridi E. coli Salmonella Streptococchi

L1 0 0 0 0 15,0 0,9 0L2 0 4,48 0 0 9,5 4,5 0L3 0 4,00 0 0 25,0 4,5 0L7-8 0 3,68 0 0 9,5 4,5 0L1A 0 2,60 0 0 9,5 0,4 0L4 0 0 0 0 140,0 45,0 0L2A 0 3,73 0 0 0,9 0,4 0L3A 0 3,38 0 0 0 0 0L4A 0 3,78 0 0 0,4 0 0L5/6A 0 0 0 0 7,5 2,5 0L7A 0 3,24 0 0 9,5 0,9 0L2C 0 2,52 0 0 9,5 0 0CV 0 0 0 0 9,5 0 0S.S. TO 0 0 0 0 4,5 0,9 0TO M.P. 0 0 0 0 4,5 0 0

Compost(M.P.N./g)(Log10 u.f.c./g)

Coliformi fecali

Coliformi totali



Selezione di batteri termoresistenti potenzialmente antagonisti


Soppressività in vivo


Sostanze antibiotiche prodotte dai Bacillus spp.

2. Bacilisina

1. Surfactina

3. Iturina

5. Fengicina

4. Bacillomicina-D

Patogeni target Botritis cynerea Sclerotinia sclerotiorum Fusarium graminearum Penicillium expansum Rhizoctonia solani

1 2 3 4 5 MW


Codice ceppo Denominazione

Specie

8 P6i Bacillus subtilis 16 P8o Brevibacterium haloterans

19 P9b Bacillus subtilis

20 P9d Bacillus amyloliquefaciens

25 P10e Brevibacterium haloterans

26 P10f Bacillus subtilis

30 P11f Bacillus amyloliquefaciens

Identificazione mediante sequenziamento del 16S r-DNA


Trichoderma atroviride (10 isolati); Trichoderma harzianum (3 isolati); Trichoderma longibrachiatum (2 isolati)

I compost sono fonte di microrganismi agenti di biocontrollo


T Rs

Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP)

• L’analisi si basa sulla digestione, con enzimi four-cutter, di prodotti di PCR ottenuti utilizzando un oligo marcato con fluoroforo (es. FAM, HEX).

• La tecnica fornisce informazioni circa la diversità presente nel microbioma di un determinato campione.

• Il risultato di tale tecnica è un elettroferogramma che descrive un profilo di diversità della comunità microbica in relazione all’altezza ed ampiezza dei picchi presenti nel grafico.



Calcolo degli indici di biodiversità

dove:

Tipayno et al., Applied Soil Ecology 61 (2012) 137– 146

Risultati analisi T-RLFPs

Compost

Indi

ci d

i bio

dive

rsità


Risultati analisi T-RLFPs


La differenziazione delle comunità microbiche sulla base della struttura genetica osservata, non ha mostrato rela zioni significative con la funzione soppressiva misurata Pertanto, lo studio ha indicato che nei compost ha prevalso un modello di soppressività generale

0

25

50

75

100L1 L2 L3

L7-8

TO M

.P.

S.S.

TO

L1A L4 CV

L2A

L3A

L4A

L5/6

A

L7A

RhizoctoniaSclerotinia

Inci

denz

a di

pia

ntin

e m

alat

e (%

)

* *

La Soppressività dei compost


Compost A Compost B

+ suppressive - suppressive 4 different samples of compost 4 different samples of compost

CarbOnFarm composts

Next Generation Sequencing dei due compost L5/6A e L2A rispettivamente molto soppressivo e poco soppressivo


Lo studio della soppressività dei compost basato sull’isolamento di microrganismi in substrati selettivi ha dei grossi limiti perché:

solo il 5% dei microrganismi è colturabile in vitro

Metagenomica

Coltivazione dei microrganismi e Metagenomica


Sequencing 16S, V3-V4 region •Archea •Bacteria 18S, NS1-NS2 region •Fungi •Plantae Whole genome shotgun •Functional annotation

•16S amplicon sequencing, V3 and V4 region (2 x 300 bp,V3, paired-end) on Illumina MiSeq platform, 1.5 M reads.

•18S amplicon (NS1 and NS2 region) sequencing, (2 x 300bp,V3, paired-end) on Illumina MiSeq platform, 1.5bM reads.

•Single sequencing (2x300bp,V3, paired-end,10.000.000 reads/sample) on Illumina MiSeq platform.

Metagenomica di compost


Collaboration with European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI)

www.ebi.ac.uk


Identificazione dei microorganism

Analisi bioinformatica MiSeq - Illumina

Amplificazione di una regione del 16 S r-DNA

Studio di compost soppressivi mediante la Metagenomica

Sequenziamento


16S Taxonomy

Phylum level Other phyla

Acidobacteria

Gemmatimonadetes

Verrucomicrobia

Chloroflexi

Firmicutes

Deinococcus-Thermus

Planctomycetes

Actinobacteria

Bacteroidetes

Proteobacteria

L2A (B) L5/6 (A)

25

75

50

100

0

Rel

ativ

e ab

unda

nce

(%)

0 20 40

Compost L2ACompost L5/6A

Relative abundance (%)

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

HS LS

•Higher percentage of Proteobacteria and Bacteroidetes in HS C

•Higher percentage of Planctomycetes in compost B

•Gemmatimonadetes, Verrucomicrobia and Acidobacteria in LS C


16S Taxonomy Genus level

4-4.99 3-3.99 2-2.99 1-1.99 0-0.99

L2A L5/6A

2 4 6 8 2 4 6 8 0 0 Log2 FoldChange Log2 FoldChange

Genus Relative abundance (%)

Compost

Nocardiopsis Glycomyces Streptomyces Galbibacter Parapedobacter Flavobacterium Arenibacter Planktosalinus Sphingobacterium Pedobacter Mariniradius Pricia Truepera Rhodopirellula Blastopirellula Luteimonas Pseudomonas Paracoccus Pseudofulvimonas Pedomicrobium

α = Actinobacteria; β = Bacteroidetes; δ = Deinococcus-Thermus; κ = Planctomycetes; π = Proteobacteria

α

β

δ

κ

π

*

*

* *

*

* *

* *

* *

* *

* *

* *

*

* = padj < 0.05

HS


LS

18S Taxonomy Phylum level

Unclassified

Other phyla

Arthropoda

Cryptomycota

Mucoromycota

Ascomycota

Basidiomycota

L2A LS

L5/6A HS

25

75

50

100

0

Rel

ativ

e ab

unda

nce

(%)

0 20 40

Compost L2ACompost L5/6A

Relative abundance (%)

*

*

*

*

•Few differences at phylum level for the 18S


Biological process Molecular function WGS functional analysis

L5/6A HS L2A LS


Compost soppressiveness

Direct antifungal activity

Filter-sterilized exstracts from composts


Disease suppressive assays 13C NMR spectra

ppm 0255075100125150175

Car

boxy

licC

Phen

olic

C

Arom

atic

C

O-a

lkyl

C

CH

3O/C

N

Alky

lC

C1

C4

C5

CC

CCF

ppm 0255075100125150175

Car

boxy

licC

Phen

olic

C

Arom

atic

C

O-a

lkyl

C

CH

3O/C

N

Alky

lC

C1

C4

C5

CC

CCF

Pane et al., (2013), Applied Soil Ecology 65: 43-51

Compost soppressiveness

Direct antifungal activity


Grazie per l’attenzione

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