cellules souches neuroblastes précurseurs en différenciation zmc = zone marginale ciliaire zmc...
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Cellules souchesCellules souches
NeuroblastesNeuroblastes
Précurseurs enPrécurseurs endifférenciationdifférenciation
ZMC = zone marginale ciliaire
ZMCZMC
EpithéliumEpithéliumpigmentépigmenté
Rétine neuraleRétine neurale
NerfNerfoptiqueoptique
CristallinCristallin
Etude du transcriptomedes cellules souches rétiniennes
Candidats potentiels déjà disponibles
Musashi: nrp1, xrp1: voir partie “RNA binding proteins”
Cascade Hedgehog: voir poster Hedgehog, Amato et al.
Crible par hybridation in situ chez tropicalis
A B
C D
E F
G H
A B
C D
E F
G H
Chez les amphibiens, la rétine croît pendant toute la vie de l’animal par addition de nouvelles cellules de tous types au niveau de la zone marginale ciliaire. La ZMC est la région annulaire située aux extrémités de la rétine, composée de cellules souches, de rétinoblastes et de précurseurs neuraux en différenciation. La ZMC est non seulement accessible pour des analyses expérimentales pendant toute la vie de l’animal, mais a aussi l’avantage exceptionnel de présenter des cellules ordonnées spatialement selon le développement et la différenciation cellulaire.
Jusqu’en 2000, les cellules souches de la rétine avaient été identifiées uniquement dans la ZMC des poissons et des amphibiens. Cependant, il a récemment été montré que l’épithélium pigmenté du corps ciliaire de la rétine des mammifères adultes contient des cellules souches rétiniennes.
OBJECTIF
Etant données les applications potentielles des cellules souches rétiniennes dans des interventions thérapeutiques de dystrophies rétiniennes, il est important de caractériser davantage ces cellules souches rétiniennes au niveau moléculaire.
Notre projet constiste donc à:
rechercher par hybridation in situ des gènes exprimés dans les cellules souches de la ZMC de la rétine de xénope
étudier le rôle de ces gènes dans la maintenance et le potentiel de différenciation de ces cellules souches rétiniennes
Intérêts du xénope:
Approche in vivo
Approche à grande échelle
Banque de rétine et de cerveaux de bourgeons caudaux de Xenopus tropicalis Séquençage (Génoscope) de 30 000 clones Assemblage des séquences (N. Pollet; R. Thuret): 5-6000 gènes Préparation des sondes et crible in situ
Amplification par PCR des clones d’une plaque 96 puits
Transcription des sondes DIG anti-sens
Hybridation in situ sur embryons entiers de Xenopus tropicalis et coupes au vibratome des embryons présentant une expression dans l’œil
Rétinogenèse chez le xénope: des cellules souches aux neurones différenciés
Détermination des cellules rétiniennes
Les précurseurs rétiniens sont à l’origine de la rétine neurale et de l’épithélium pigmenté rétinien. La rétine neurale contient six types de neurones (cônes, bâtonnets, amacrine, bipolaire, horizontale et ganglionnaires) et un type de cellules gliales (Müller).
XHes2 GrouchoGroucho
helix loop helix
orange HC
WRPW
basique
LES CONSTRUCTIONS HES2
XHes2-∆WRPW (dominant négatif)
XHes2-∆WRPW-VP16 (antimorphe) domaine d’activation de VP16
∆WRPW
VP16
Témoin
XHes2
60
70
80
2
4
Cellules de Muller
gangl
ionnai
re
amac
rine
bipol
aire
horizo
ntale
photor
ecep
teur
Mülle
r
Témoin1244
cellules11 rétines
XHes2939
cellules13 rétines
% de cellules
Types cellulaires:
0
20
40
60
80
***
**
***
***
*** *
∆WRW
VP16
Témoin
0
10
20
30
40
**
***
**
** *
**
*
***
*
gangl
ionnai
re
amac
rine
bipol
aire
horizo
ntale
photor
ecep
teur
Mülle
r
OBJECTIF
Dans le but de mieux comprendre les cascades géniques impliquées dans le choix de la destinée de ces précurseurs rétiniens, nous avons étudié les rôles joués par les cascades de signalisation Hedgehog et Notch/Delta, ainsi que le rôle joué par des facteurs post-transcriptionnels.
Amato, M.A., K. Koebernick, T. Pieler, W.A. Harris and and Perron, M. Hedgehog signaling controls the maintenance of stem cell/progenitor proliferation in Xenopus retina. Soumis. Amato, M.A., Boy, S., Arnault, E., A, Girard, M., Sharif, A., Dellapuppa, A. and Perron, M. (2005). Comparison of the expression patterns of five neural RNA binding proteins in the Xenopus retina. J. Comp. Neurol. 481(4):331-9. Agnès, F. and Perron, M. (2004). RNA binding proteins and neural development: a matter of targets and complexes. NeuroReport . 15(17):2567-70. Amato M.A., Arnault E. and Perron M. (2004) . Retinal stem cells in vertebrates: parallels and divergences. Int. J. Dev. Biol. "Eye development" special issue 48: 993-100. Boy S., Souopgui J., Amato M.A., Wegnez M., Pieler T. and Perron M. (2004) XSEB4R, a novel RNA-binding protein involved in retinal cell differentiation downstream of bHLH proneural genes. Development 131: 851-62. Amato M.A., Boy S. and Perron M. (2004) Hedgehog signalling in vertebrate retinal development: a growing puzzle. Cell Mol Life Sci 61:899-910. Perron M, Boy S, Amato MA, Viczian A, Koebernick K, Pieler T, Harris WA. (2003). A novel function for Hedgehog signalling in retinal pigment epithelium differentiation. Development 130:1565-77. Ohnuma S, Mann F, Boy S, Perron M, Harris WA. (2002). Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development. Methods 28:411-9.
RNA binding proteins
RRM 1
Xseb4R
nrp-1xrp1
elrB, C, D
etr-1
Musashi
Elav/Hu
BrunoRRM 3RRM 2RRM 1
RRM 1 RRM 2
Post-mitotic cellsDividing cells
GCL
IINL
OINL
PRL
xrp1
Xseb4R
nrp1
etr-1nrp1
elrBelrCelrD
12
3
4
Xseb4R
nrp1
elrBelrCelrD
etr-1Xrp1
hermes
etr-1xrp1
etr-1
Xseb4R
nrp1elrC
nrp1
RPE
nrp1
0
10
20
30
40
50
% o
f re
tin
al c
ells
***
***
***
***
***
Ganglioncells
Amacrinecells
Bipolarcells
Horizontalcells
Photoreceptorcells
Müllercells
control1799 cells
Xseb4R1630 cells
***
*
control Mo 925 cells
Xseb4R Mo 476 cells
% o
f re
tin
al c
ells
Ganglioncells
Amacrinecells
Bipolarcells
Horizontalcells
Photoreceptorscells
Müllercells
0
10
20
30
40
Ntubulin expression
Control Mo Xseb4R Mo + DEX
- DEX
INDUCED AT ST 10,5 - 11
Technique de lipofection in vivo
DNA+
GFP DNA
+
Dotap
Expression du gène Xhes2 très régionalisée, dans les vésicules optiques et otiques
Expression du gène Xhes2 dans la zone marginale ciliaire de la rétine
Cascade de signalisation Notch/Delta:Étude d’un nouveau gène de la famille hairy/enhancer of split, Xhes2
« RNA binding proteins »
La surexpression de Xhes2 favorise la gliogenèseL’inhibition de Xhes2 diminue la gliogenèse
L’inhibition de Xhes2 affecte la distribution des différents types de neurones
XHES2
GLIOGENESE NEUROGENESE
SPECIFICATION NEURONALE
elrB, C, D xrp1 Nrp-1 Xseb4R Etr-1
Xseb4R est le premier facteur post-transcriptionnel, positionné dans la cascade de neurogenèse, à avoir un rôle dans la détermination des neurones rétiniens
Expression du gène Xseb4R dans la zone marginale ciliaire de la rétine
Laboratoire Gènes, Développment et Neurogenèse, UMR CNRS 8080Bât. 445 Université Paris XI, 91405 ORSAY
PUBLICATIONS
collaboration avec E. Bellefroid (Belgique); K. Koebernick; M. Solter; Jacob Souopgui et Tomas Pieler (Allemagne)
collaboration avec Nicolas Pollet; Raphaël Thuret; Qods Ymlahi Ouazzani et André Mazabraud
La surexpression de Xseb4R dans la rétine a un effet proneural, sa perte de fonction a l’effet opposé
Xseb4R aurait aussi un rôle “proneural” au cours de la neurogenèse primaire
La distribution des “RNA binding proteins” dans la rétine suggère que, comme les facteurs de transcription, ces régulateurs post-transcriptionnels jouent des rôles importants à toutes les étapes de la rétinogenèse et dans tous les neurones rétiniens.
M. Amato; S. Boy; A. della Puppa; Y. Aoki; N. Grandchamp; M. Segalen; J. Hamdache et M. Perron