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CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN SANIDAD ANIMAL (CISA)

Director: Dr. Esteban Domingo Solans (baja Marzo 2005) Directora Técnica: Dra. Marisa Arias Neira Dirección: Carretera de Algete a El Casar s/n 28130 VALDEOLMOS (MADRID) Teléfono: 91 6202300 (111) FAX: 91 6202247 Correo electrónico: [email protected]

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PERSONAL DEL CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN SANIDAD ANIMAL

Personal en plantilla Personal contratado Arias Neira, Marisa Directora Técnica Alejo Herberg, Alí Ramón y Cajal Muñoz Reoyo, Mª Jesús Investigador A2 Saiz Zalabardo, Margarita Ramón y Cajal Brun Torres, Alejandro Investigador A2 Mena Piñeiro, Ignacio Ramón y Cajal Bárcena del Riego, Juan Investigador A2 Ortego Alonso, Javier Ramón y Cajal Gómez Castilla, Jordi Investigador A2 Ruiz Argüello, Begoña Ramón y Cajal Real Soldevilla, Gustavo del Investigador A2 Tafalla Piñeiro, Carolina Ramón y Cajal Carballo Santaolalla, Matilde Investigador A3 Pérez Martínez, Mª del Mar Ramón y Cajal Castaño Calvo, Argelia Investigador A2 Borrego Rivero, Belén Titulado Superior Torres Trillo, Juan Mª Investigador A3 Chamorro Pérez, Sonia Titulado Superior Torre Reoyo, Ana de la Investigador A4 Espinosa Martín, Juan Carlos Titulado Superior. Blanco Lavilla, Esther Técnico Sup. Esp. Martín González, Sergio Titulado Superior Martínez García, Mercedes Jefe Servicio Gest. Lorenzo Alguacil, Gema Titulado Superior Pascual Alvarez, Gonzalo JefeServicio Mant Molina Polo, Nicolás Titulado.Superior Villa Díaz, Ana Técn. Esp.GMed. Iglesias Hidalgo, Javier Titulado Superior Paredes Tomás. Antonio Jefe Admón.. Martín del Burgo, Mª Ángeles Titulado Superior Pérez Taboada, Nazaret Jefe Biblioteca. Madueño Amor, Encarnación Titulado Superior Losada Carrasco, Magdalena Jefe Negociado Llorente Herranz, Alicia Titulado Superior Gómez Perochena, Elena Aux. Técnico Inv. Gallardo Frontaura, Mª Carmen Titulado Superior Cuellar Cuellar, Mª Luisa Ayudante Técnico Morales Camarzana Mónica Titulado Superior Algaba Alvarez, Julia Aux. Oficina P3 Sánchez Martín, Miguel Angel Titulado Superior González Guirado, Antonia Ayudante Técnico Vázquez Ruiz, Belén Titulado Superior González Esguevillas, Mónica Auxiliar Invest. Fernández Pinero, Jovita Titulado Superior Nuero García, Oscar Auxiliar Invest. Moreno López, Sonia Titulado Superior Lahoz Ruiz, Rosa Auxiliar Admón. Parra Arrondo, Beatriz Titulado Superior Sánchez Nieto, Carlos Auxiliar Técnico Martín Folgar, Raquel Titulado Superior González Sáez, Juan Carlos Oficial Inv y Lab. Cano Benito, Mª Jesús Tec. Sup. Inv. Benavente Pintor, Mª Angela Ayud. Manten. Fernández-Pacheco, Paloma Téc. Sup Invest. Gómez Gómez, Concepción Toledo Olaya, Ana Mª

Ayud. Manten. Ayud. Manten.

Nieto Martínez. Raquel Robles Suárez, Ana María

Téc. Sup. Invest. Tec. Sup. Invest

Sánchez Lobo, Iria Ayud. Manten. García Casado, María Ana Téc. Sup. Invest. Viva Alvarez, Fco. José Viva Barroso, Emilio

Ayud. Manten. Ayud. Manten.

Martín Lluch, Mercedes Cristina Herrador

Téc. Sup. Invest. Téc Medio

Esquinas Muñoz, Mª Angeles Sánchez-Arévalo Almena. Ana I.

Téc Medio Téc Medio

Gutiérrez Rivas, Mónica Juan de la Cierva Escribano Romero, Estela

Soler Sánchez, Alejandro Juan de la Cierva Aux. Invest.

Sánchez Freire, Esther Aux. Invest. Cuellar Lozano, Carlos Auxiliar admón. . Izquierdo Gil, Ana Aux. Invest. Losa Román, Nuria de la Aux. Invest. Ferraz Colomina, Rosa Mª Aux. Invest. Alcaraz Iglesias, Gema Aux- Invest. Martín Martín, Elena Aux. Invest. Relaño Ginéz, Aroa Aux. Invest.

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Becarios

Almanza Reyes, Horacio Esperón Fajardo, Fernando

Predoctoral Predoctoral

Angulo Herrera, Iván Predoctoral Cámara Pelliso, Susana Predoctoral Cubillos Zapata, Carolina Predoctoral Díaz Sansegundo, Fayna Predoctoral Estévez Fernández, Rodolfo Tecnólogo Herva Moyano, Mª Eugenia Predoctoral Rodríguez Benito, J. Antonio

Rodríguez Pulido, Miguel R. Padilla de Beer, Danielle Sotelo Girón, Elena Iglesias Martín, Irene Alamillo Gordo, Elia Quintana-Lacaci Sanz, Bárbara

Predoctoral Tecnólogo ALBAN Predoctoral Predoctoral Predoctoral Finnova

González Torres, Lucia Finnova Diaz Toledano, Rosa Mª

García Maceira, Patricia Predoctoral Predoctoral

Montón Redondo, Rosa Mª Finnova

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OBJETIVOS DEL CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN SANIDAD ANIMAL El Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA-INIA) está situado en Valdeolmos, a 40 Km. de Madrid, ubicado en una finca de 34 hectáreas, con acceso controlado y restringido. Está dotado de una instalación de “Alta Seguridad Biológica", diseñada, construida y equipada para trabajar con enfermedades infecciosas exóticas y de alto riesgo para la Sanidad Animal. En él se desarrollan diferentes actividades de investigación y desarrollo tecnológico, formación científico-técnica, y de cooperación internacional. El Centro, se inauguró el 3 de Febrero de 1993. El CISA es “Gran Instalación Científica española” desde 1995. INSTALACIÓN DE ALTA SEGURIDAD BIOLÓGICA: La zona de alta seguridad biológica de 10.824 m2, posee unas características arquitectónicas y funcionales reconocidas internacionalmente para la consecución de la bioseguridad. La hermeticidad del edificio se consigue gracias a su estructura de hormigón armado, sellado de sus juntas externas, aire acondicionado con diferentes niveles de presiones negativas, filtración del aire a través de filtros HEPA, descontaminación de efluentes e incineración de residuos. En el interior, todas las superficies se encuentran revestidas de resinas especiales, que les proporciona aislamiento y protección. Todas las conducciones que atraviesan las paredes, suelos y techos están selladas de forma independiente. La comunicación con el exterior se realiza a través de sistemas de descontaminación de doble puerta air-locks, autoclaves de barrera y sistemas de barrera de descontaminación superficial. Esta Instalación, con nivel de seguridad biológica 3 y 3+ , dispone de 26 Laboratorios y 14 salas comunes de nivel 3, y 2 Laboratorios de nivel de contención 3+ habilitados para trabajar y almacenar agentes infecciosos animales que eventualmente pudieran afectar al ser humano, de acceso restringido con puerta neumática y equipado con ducha convencional y química. Los trabajos realizados en los laboratorios de nivel 3+ se realizan utilizando trajes especiales con respiración autónoma, que aseguran el aislamiento y seguridad del personal. También existe un Animalario constituido por 21 estancias individuales y polivalentes diseñadas para albergar distintas especies animales, desde peces hasta ganado mayor, con medidas de bioseguridad que garantizan el trabajo in vivo incluso con patógenos transmisibles por aerosol. El CISA coopera con el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación como laboratorio Nacional de Referencia para algunas enfermedades de la antigua Lista A de la Oficina Internacional de Epizootías (OIE). Gracias a la labor desarrollada desde su creación en investigación y desarrollo y en la lucha contra las enfermedades de mayor impacto económico y sanitario, es Centro Mundial de Referencia de la OIE para la Peste porcina africana y Peste equina africana, y Centro colaborador de la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) en varias enfermedades como Peste porcina clásica y Fiebre aftosa, así como en materia de Bioseguridad. Por estas mismas razones fue nombrado Laboratorio de Referencia de la UE de Peste porcina africana en 2002.

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GRUPOS DE INVESTIGACIÓN • EPIDEMIOLOGÍA Y SANIDAD AMBIENTAL • ENFERMEDADES TRANSFRONTERIZAS Y EMERGENTES.

DESARROLLO Y CONTROL DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS. • ENFERMEDADES TRANSFRONTERIZAS Y EMERGENTES.

DIAGNÓSTICO E INMUNOPROFILAXIS • ENFERMEDADES TRANSFRONTERIZAS Y EMERGENTES.

ENFERMEDADES EMERGENTES – FIEBRE DEL VALLE DEL RIFT. • BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR. BIOLOGÍA MOLECULAR Y

CELULAR DE PRIONES. • BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR. MÉTODOS ALTERNATIVOS

A LA EXPERIMENTACIÓN ANIMAL • BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR. ARENAVIRUS • BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR. BIOLOGÍA MOLECULAR DE

VIRUS RNA • BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR. MODULACIÓN DEL

SISTEMA INMUNE POR VIRUS. • VIROLOGÍA ANIMAL, INMUNOLOGÍA Y PROFILAXIS. FIEBRE

AFTOSA. • VIROLOGÍA ANIMAL, INMUNOLOGÍA Y PROFILAXIS. SÍNDROME

REPRODUCTIVO Y RESPIRATORIO PORCINO (PRRS) • VIROLOGÍA ANIMAL, INMUNOLOGÍA Y PROFILAXIS. INFLUENZA

ANIMAL. • VIROLOGÍA ANIMAL, INMUNOLOGÍA Y PROFILAXIS. LENGUA

AZUL. • VIROLOGÍA ANIMAL, INMUNOLOGÍA Y PROFILAXIS.

CALICIVIRUS. • VIROLOGÍA ANIMAL, INMUNOLOGÍA Y PROFILAXIS. RESPUESTA

INMUNE DE PECES. • GRUPOS DE OTROS ORGANISMOS QUE REALIZAN ACTIVIDADES

EN EL CISA-INIA • OPI.: CBMSO – CSIC: FIEBRE AFTOSA. • OPI.: CBMSO – CSIC: RESPUESTA INMUNE FRENTE A FIEBRE

AFTOSA. • GRUPOS DE OTROS DEPARTAMENTOS DEL INIA QUE REALIZAN

ACTIVIDADES EN EL CISA-INIA • ANIMALARIO. PATOLOGÍA EXPERIMENTAL. PATOLOGÍA

ANIMAL. • SERVICIO DE SECUENCIACIÓN • SERVICIO DE SEGURIDAD BIOLÓGICA Y MANTENIMIENTO

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EPIDEMIOLOGÍA Y SANIDAD AMBIENTAL

COMPONENTES Cámara Pellisso, Susana Carballo Santaolalla, Matilde Esperón Fajardo, Fernando Iglesias Martin, Irene Muñoz Reoyo, Mª Jesús Torre Reoyo, Ana de la

Correo electrónico: [email protected]

OBJETIVOS 1. Relación de la exposición a contaminantes con presencia de patologías en

animales. 2. Desarrollo de sistemas de valoración de efectos toxicológicos 3. Valoración toxicológica de sustancias y efluentes. 4. Modelos epidemiológicos de prevención de la entrada de enfermedades

infecciosas animales. Análisis de riesgo.

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I

• Sanidad Animal- Ambiental. Exposición y valoración de efectos en

poblaciones animales: peces, aves y mamíferos. • Detección y valoración de efectos mediante metodología biológica y

procedimientos combinados químico-biológicos. • Valoración sanitario ambiental de sustancias, productos químicos , vertidos y

efluentes.

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PROYECTOS Código: REN2002-04162-C02-02/MAR Título: Valoración del estado sanitario de 3 especies de cetáceos residentes en el archipiélago canario: Physeter macrocephalus, Tursiops truncatus y Globicephala macrorhynchus. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2002-2005 Investigador responsable: Muñoz Reoyo, Mª Jesús

Principales resultados Estudio de la contribución de contaminantes ambientales en la aparición de patologías en animales: A.- Priorización del riesgo de efluentes en la isla de Gran Canaria Adaptación de Procedimientos WET para la identificación y priorización de efluentes potencialmente peligrosos para el medio marino. Identificación de las fracciones responsables de la toxicidad de cada vertido. Se detectaron los principales puntos de emisión contaminante al medio marino y los principales agentes responsables de la toxicidad aguda de los efluentes y determinados micro-contaminantes orgánicos que contribuían a la toxicidad crónica. Se han realizado avances en el procedimiento metodológico que ha permitido identificar compuestos presentes en nano-concentraciones utilizando sistemas de concentración. También se han empleado diferentes bioensayos para detectar efectos subletales utilizando ensayos crónicos y de teratogenia. Se ha desarrollado un protocolo especifico para el análisis y priorización del riesgo de efluentes. B.- Valoración de la exposición de poblaciones de cetáceos residentes a los contaminantes ambientales y su contribución en la aparición de patologías. Se procedió a la valoración toxicológica de los residuos de contaminantes (orgánicos e inorganicos) en tejidos de animales varados. Esta se realizó considerando (I) la concentración que se relaciona con efectos que podrían ser esperados, incluyendo reproductivos, cancerigenos, mutagénicos e inmunotóxicos, (II) la distribución tisular, (III) el contenido en cada una de las tres especies y (IV) las edades o desarrollo morfológico. Se realizó una comparación con las mismas especies de otras áreas geográficas y con los datos de la toxicidad descritos para otras especies de mamíferos. Se valoro los resultados obtenidos con los patrones de comportamiento, de acumulación y distribución tisular existentes. Los resultados de este estudio suministran un patrón diferencial de residuos con referencia a otras áreas. C.- Estudio virológico de virus presentes en tejidos de cetáceos. Se ha colaborado en el rastreo sistemático de virus en muestras de tejidos del banco de tejidos de cetáceos varados, que tuvieran lesiones compatibles con virus. Para ello se realizo la inoculación en líneas celulares convencionales de macerados de estos tejidos, para observar efecto citopático, microscopia electrónica para comprobar estructuras de morfología compatible con partículas víricas, y PCRs universales de Herpesvirus, Morbilivirus y Calicivirus. D.- Adaptación de nuevos métodos inmunológicos para la evaluación de la respuesta inmune en cetáceos Se ha procedido a la valoración inmunotoxicológica de las concentraciones tisulares de compuestos tóxicos, como metales pesados y compuestos organoclorados, de conocido carácter inmunotóxico. Se realizo mediante ensayos para valorar la estructura inmune en sangre periférica (caracterización de poblaciones de linfocitos, estableciendo unos

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valores basales de subpoblaciones mediante citometría de flujo con marcadores de superficie celular), y la funcionalidad (linfoproliferación y respuesta a mitógenos).

PUBLICACIONES

Artículos Revistas SCI Carballo, M, Aguayo, S, de la Torre, A., Muñoz, MJ. 2005 . Plasma vitellogenin levels and gonadal morphology of wild carp (Cyprinus carpio L) in a receiving rivers downstream of Sewage Treatment Plants . Science of Total Environment 341 (1-3): 71-79. Jaber, J. R. ; Pérez, J.; Carballo, M.; Arbelo, M.; Espinosa de los Monteros, A.; Herráez, P.; Muñoz, MJ.; Andrada, M.; Rodríguez M.; and Fernández, A. 2005. Hepatosplenic large cell immunoblastic lymphoma in a bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) with hight levels of polychlorinated biphenyl congeners. Journal of Comparative Pathology 132 (2-3):242-247 Carballo M., Jiménez JA., de la Torre A, Roset J., Muñoz MJ. 2005. A survey of potential stressor-induced physiological changes in carp (Cyprinus carpio) and barb (Barbus bocagei) along the Tajo River. Environmental Toxicology 20(2): 119-125

Otros artículos De la Torre, A; Muñoz, MJ, Carballo, M. 2005. Evaluación medioambiental. Evaluación ecotoxicológica. Repercusión ambiental. En: Toxicología Ambiental: Seguridad Química. E. de la Peña y E. Gómez, eds. Asociación Española de Toxicología. Madrid. CD-ROM. ISBN: 84-609-4429-8. Sánchez-Vizcaíno, JM; de la Torre, A; Martínez, B. 2005. Análisis del riesgo potencial de entrada y difusión de la fiebre aftosa en España. CERSA. ISBN: 84-89456-69-0 Monografía: Las emisiones de gases en el sector porcino. Mayo 2005. Directora de la monografía: Dra. MJ Muñoz. Número 87. PORCI. Aula Veterinaria. Tratado de ganado porcino. Grupo Luzán 5, División Veterinaria. Madrid. ISSN: 1130-8451. 2005. Muñoz, M.J.. 2005 “La Gestión ambiental de hoy”. Trasferencia de tecnología. Anaporc, 28-30. Número 18, Martínez-Salvador, A; de la Torre, A; Sánchez-Vizcaíno, JM. 2005.Distribución geográfica de la Lengua Azul. Ovis 95. 25 – 29 Ed. Luzán. De la Torre A, Carballo M, García E, Muñoz MJ. 2005. Ecotoxicología . Toxicología de Postgrado. ISBN 84-600-9848-6. CD. Área Toxicología de Sevilla. M. Repetto Ed. España.

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Nº Ponencias, comunicaciones y póster presentados/as y publicados en las actas: 4

Tesis Doctorales Fernando Esperón Fajardo (2005) “Contaminantes ambientales en odontocetos de las Islas Canarias. Implicaciones sanitarias”. Universidad Complutense de Madrid. Facultad de Veterinaria. Noviembre, 2005. Calificación: Cum Laude por unanimidad. Directoras: M.J. Muñoz Reoyo y M. Carballo Santaolalla

Suficiencia Investigadora Susana Cámara Pelliso.(2005) “Adaptación de nuevos métodos inmunológicos para la evaluación de la respuesta inmune de cetáceos”. Universidad Complutense de Madrid. Facultad de Veterinaria.

OTRAS ACTIVIDADES I Curso Internacional de Postgrado. Experto Universitario en Toxicología. Área de Toxicología. Universidad de Sevilla. Dirige: Dr. Manuel Repetto. Coordinadora: M.J. Muñoz. Enero-Octubre 2005. II Curso del Curso Internacional de Postgrado: Curso de Finalización del Master en Toxicología. Área de Toxicología. Universidad de Sevilla. España. Coordinadora: M.J. Muñoz. Enero-Octubre 2005. Curso de Tercer Ciclo Doctorado sobre: “Entradas de nitrógeno en el suelo”. Organiza: Prof. Bermúdez. Dpto. Ecología. Facultad de Biológicas de la UCM. 1 crédito (10 horas). Madrid, Febrero, 2005 Curso de Tercer Ciclo Doctorado. Organizado Dpto. de Morfología, Facultad de Veterinaria de Las Palmas de Gran Canaria. Febrero-Marzo, 2005 Curso de Tercer Ciclo Doctorado sobre Bioseguridad: “Puntos críticos sanitario-ambientales en explotaciones agropecuarias”. “Análisis de riesgo de enfermedades infecciosas”. Organizado Dpto. de Sanidad Animal de la Facultad de Veterinaria de la UCM. Impartido en la Facultad de Veterinaria de la UCM. Febrero- Abril 2005. Curso sobre Evaluación de efectos. Metodologías biológicas. Organizado por INEM-ETSIA. Madrid. 14 Marzo, 2005. Curso sobre Control de plagas y vectores biológicos. “Sistemas GIS como herramienta de modelización y previsión del riesgo”. Organizado por el Ayuntamiento de Madrid. Madrid, Mayo, 2005. Curso de Doctorado: Fundamentos de toxicidad celular y molecular. “Evaluación de efectos medioambientales”. Departamento de Nutrición, Bromatología y Toxicología. Facultad de Biología. U. Alcalá de Henares. Madrid, Mayo, 2005.

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Curso sobre Fundamentos y Técnicas de Evaluaciones Ecológicas Rápidas. Organiza: Parques Nacionales. MMA. Aranjuez, Madrid, Septiembre 2005. "IVX Curso Internacional sobre Enfermedades Exóticas". Centro de Investigación en Sanidad Animal, CISA-INIA. Valdeolmos. Financia: AECI-INIA. 2-30 Noviembre de 2000, 120 horas lectivas. Director del curso Marisa Arias Neira. Coordinadora del Curso: Matilde Carballo Santaolalla. Con la colaboración especial de la Facultad de Veterinaria de Córdoba. Profesores del Curso: Investigadores del CISA, así como Profesores, investigadores y profesionales de otras Instituciones y Universidades de España.

Colaboraciones Científicas con otros organismos e instituciones. Centro de Ciencias Medioambientales. CSIC. ETSI Agrónomos de Madrid. ETSI Minas de Madrid. F. de Biológicas de Universidad Complutense de Madrid F. de Biológicas de la Universidad de Salamanca F. de Farmacia en la Universidad de Alcalá de Henares F. Veterinaria de la UCM. F. Veterinaria de la ULPGC. Comité Técnico de Normalización del AEN/CTN 77 Medioambiente SC Suelos.

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ENFERMEDADES TRANSFRONTERIZAS Y EMERGENTES. DESARROLLO Y CONTROL DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

COMPONENTES Arias Neira, Marisa Martín Folgar, Raquel Blanco Lavilla, Esther Martín Lluch, Mercedes Brun Torres, Alejandro Martín Martín, Elena Fernández Pacheco, Paloma Nieto Martínez, Raquel Fernández Pinero, Jovita Robles Suárez, Ana Gallardo Frontaura, Carmina Salguero Bodes, Javier García Casado, María Ana Sánchez Martín, Miguel Angel Gemma Lorenzo Sánchez-Arévalo Almena, Ana Iglesias Hidalgo, Javier Sotelo, Elena Llorente, Alicia Vázquez Ruiz, Belén


OBJETIVOS 1. Actividades de investigación y desarrollo tecnológico, formación científico-

técnica y cooperación internacional con especial atención a las enfermedades transfronterizas y emergentes con mayor riesgo de introducirse o extenderse en el territorio nacional.

2. Conocimiento de las enfermedades infecciosas animales y de las enfermedades emergentes (su patología y patogenia), y de los patógenos que las producen (su caracterización inmunológica y molecular).


• Desarrollo, estandarización y mejora de métodos de diagnóstico para el diagnóstico de enfermedades infecciosas, transfronterizas, de interés económico y sanitario.

• Desarrollo de metodologías de diagnóstico para la vigilancia, el control y erradicación de enfermedades infecciosas de los animales de interés para el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, y el Ministerio de Defensa.

• Actividades como Centro Mundial de Referencia para la Oficina Internacional de Epizootías (OIE) en Peste Porcina Africana y Peste Equina Africana.

• Actividades como Laboratorio Comunitario de Referencia de Peste Porcina Africana.

• Actividades de apoyo científico-técnico e investigación como Laboratorio Nacional de Referencia de Peste porcina Africana, Enfermedad Vesicular porcina, Peste Porcina Clásica y Lengua Azul.

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PROYECTOS Código y título: OT01-002. Desarrollo de metodologías para diagnóstico de la Peste Porcina Africana, diagnóstico de enfermedades exóticas y actuaciones ante emergencias sanitarias. Entidad financiadora: INIA Duración: 2001-2006 Investigador responsable: Arias Neira, Marisa Código: CT2001-02216 QLK2 Título: African Swine Fever: Improved diagnostic methods and understanding of virus epidemiology and virus-host interactions Entidad financiadora: UE Duración: 2001-2005 Investigador responsable: Arias Neira, Marisa Código: ILRI2003-001 Título: Memorando de entendimiento entre el INIA y el ILRI - International Livestock Research Institute- del CGIAR (Nairobi, Kenya) para el desarrollo de nuevos ensayos de diagnóstico y control epidemiológico de patógenos víricos del ganado en África Sub-Sahariana. Entidad financiadora: ILRI-CGIAR Duración: 2004-2006 Investigador responsable: Arias Neira, Marisa Código: UE-LR PPA/03 Título: Laboratorio Comunitario de Referencia de Peste Porcina Africana Entidad financiadora: UE Duración: 2003-2006 Investigador responsable: Arias Neira, Marisa CONVENIOS Código: CC03-035 Título: Convenio entre el INIA y la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid, para la realización de prácticas Entidad financiadora: INIA Duración: 2004-2008 Investigador responsable: Arias Neira, Marisa CONTRATOS Código: NBQ20050267B Título: Contrato con la Fábrica Nacional de la Marañosa para la asistencia técnica para el diagnóstico de virus de interés en defensa Entidad financiadora: Ministerio de Defensa Duración: 2005-2006 Investigador responsable: Arias Neira, Marisa

Principales resultados

Desarrollo de nuevas metodologías para el diagnóstico de enfermedades infecciosas y/o exóticas de alto riesgo para España:

• Desarrollo de metodologías diagnósticas basadas en técnicas de detección molecular para Enfermedades vesiculares.

• Desarrollo de una nueva técnica de RT-PCR convencional y una técnica de RT-PCR a tiempo real, altamente sensibles y específicas, para la detección universal del virus de la Peste Equina Africana, válidas para su empleo en diferentes muestras clínicas.

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• Puesta a punto de un método para la detección mediante RT-PCR del virus de la Fiebre del Valle del Rift, para su adaptación a sistemas de tiempo real en un solo paso.

• Desarrollo, estandarización y validación de los nuevos métodos de diagnóstico serológico de la Peste Porcina Africana (PPA) desarrollados en el CISA basados en el uso de las proteínas recombinantes del VPPA p32, p54 y pp62. Validación de las técnicas serológicas desarrolladas analizando sueros africanos.

• Diseño de primers para identificación específica de aislados de VPPA en muestras recogidas en África. Validación de procedimientos para análisis por técnicas de diagnóstico molecular de muestras de suero, tejidos y garrapatas de origen africano.

• Caracterización clínica y patológica de aislados africanos de Peste porcina africana.

• Caracterización clínica, patológica y de protección con mutantes de delección de Peste porcina africana.

• Estandarización de estudios de epidemiología molecular de aislados europeos y africanos del VPPA basados en el estudio de la Región Central Variable (CVR) del genoma.

• Desarrollo y mantenimiento de una base de datos de secuencias del VPPA incluido también dentro de las actividades del CISA cómo centro de referencia de la OIE y de la Unión Europea.

• Inicio de los estudios para la valoración de filtros comerciales FTA (Whatman) en la recogida y almacenamiento de muestras de sangre infectadas con el virus de la Peste Porcina Africana (PPA) y su posterior detección mediante técnicas de PCR.

Otras actividades como Laboratorio de Referencia Investigación epidemiológica; asistencia a Laboratorios de las CC.AA en enfermedades para las cuales el CISA es Laboratorio Nacional de Referencia. Asistencia a laboratorios de la UE; y a distintos paises a nivel mundial en materia de investigación diagnóstica de PPA.

• Armonización y estandarización de metodologías de diagnóstico.

NRL-PPA: Organización del Ensayo colaborativo interlaboratorial como Centro Nacional de Referencia de PPA para la armonización de técnicas diagnósticas serológicas. Preparación de un panel de sueros y envío de reactivos de PPA a los laboratorios regionales participantes. Álava, Albacete, Algete, Badajoz, Barcelona, Burgos, Cáceres, Ciudad Real, Colmenar Viejo, Córdoba, Cuenca, Gerona, Gijón, La Pobla del Segur, León, Lérida, Logroño, Lugo, Murcia, Navarra, Palma de Mallorca, Reus, Santander, Segovia, Soria, Talavera de la Reina, Tenerife, Valencia, VIC, Vizcaya, Zamora y Zaragoza.

NRL-EVP: Organización del Ensayo colaborativo interlaboratorial como Centro Nacional de Referencia de EVP para la armonización de técnicas diagnósticas serológicas. Preparación de un panel de sueros y envío de reactivos de PPA a los laboratorios regionales participantes. Álava, Albacete, Algete, Badajoz, Barcelona, Burgos, Cáceres, Ciudad Real, Colmenar Viejo, Córdoba, Cuenca, Gerona, Gijón, La Pobla del Segur, León, Lérida, Logroño, Lugo, Murcia, Navarra, Palma de Mallorca, Reus, Santander, Segovia, Soria, Talavera de la Reina, Tenerife, Valencia, VIC, Vizcaya, Zamora y Zaragoza.

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EUCRL-OIEWRL–PPA: Organización del II y III Ensayo colaborativo interlaboratorial como Centro Europeo y mundial de Referencia de PPA para la armonización de técnicas diagnósticas serológicas y virológicas. Preparación de un panel de reactivos de PPA, sueros y tejidos, y envío a los laboratorios nacionales de referencia: Austria, Bélgica, Chipre, Dinamarca, Finlandia, Francia (2), Alemania, Grecia, Hungría, Irlanda, Italia (2), Latvia, Lituania, Holanda, Noruega, Polonia, Rumania, Eslovaquia, Eslovenia, UK, Suiza y EEUU.

CRL-PPA: Organización de agenda y documentos de trabajo para el “Annual Meeting of African Swine Fever Laboratories”. May 12- 15, 2005, Bruselas, Belgium.

Transferencia de tecnología de técnicas de diagnóstico serológico y molecular del VPPA a laboratorios de países del Este de África.

Transferencia de tecnología de técnicas de diagnóstico serológico y molecular de la Peste porcina Africana, Peste Equina Africana y Peste porcina Clásica a laboratorios e Instituciones de distintos paises Iberoamericanos a través del "XIV Curso Internacional sobre Enfermedades Exóticas".

Participación en el Ensayo Colaborativo Interlaboratorial de PPC promovido por el laboratorio de Referencia Europeo (Hannover) para la armonización de tecnologías virológicas y serológicas para el diagnóstico de Peste Porcina Clásica y evaluación de las técnicas de detección molecular desarrolladas en CISA.

Validación de Kits comerciales: Evaluación del kit de diagnóstico Competition ELISA Ingezim PPA Compac (INGENASA 11.PPA K3) para la detección de anticuerpos específicos del VPPA. Los principales objetivos fueron determinar la sensibilidad y especificidad del kit y la influencia del tratamiento térmico de las muestras analizadas.

• Estudios de experimentación “in vivo” con aislados de Peste Porcina Africana, Peste Porcina Clásica y Enfermedad Vesicular para caracterización patológica y estudios de patogenia; producción de reactivos biológicos para los laboratorios de referencia.

• Producción, y distribución de reactivos de diagnóstico para los programas de vigilancia epidemiológica de PPA y EVP en España - reactivos para distintas técnicas de diagnóstico serológico- más de dos millones de dosis/enfermedad). Existen informes anuales de actividad detallados de Laboratorios de Referencia.

• Producción, y distribución de reactivos de diagnóstico de PPA y PEA como Laboratorio Comunitario y Mundial de Referencia, a distintos países de EU, África y Europa no comunitaria. Más detalles en informes anuales a la OIE, y EU.

• Transferencia Tecnológica de las tecnologías desarrolladas a distintos países de Ibero América a través del Curso Internacional sobre Enfermedades Exóticas y de Workshop on ASF diagnosis.

• Participación en la colaboración en la redacción del capítulo referente a la PPA de la próxima edición del Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines de la OIE, en el que se ha incluido el método de PCR de la PPA descrito por Agüero et al. (J. Clin. Microbiol., 41 (9): 4431-4434, 2003) e íntegramente desarrollado y estandarizado en el CISA.

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PUBLICACIONES

Artículos en Revistas SCI Rasmussen, T.B.; Uttenthal, Å.; Fernández, J.; Storgaard, T. (2005) Quantitative multiplex assay for simultaneous detection and identification of Indiana and New Jersey serotypes of Vesicular Stomatitis Virus. Journal of Clinical Microbiology, 43 (1): 356-362. Gallardo, C., Blanco, E., Rodríguez, JM., Carrascosa, A.L., and Sánchez-Vizcaíno J.M., “Antigen properties and diagnostic potencial of African swine fever virus protein pp62 expressed in insect cells”. Journal of Clinical Microbiology (Vol. 44, No. 3, 1489-95)


Tesis Doctorales Jovita Fernández Pinero (2005). Desarrollo y estandarización de técnicas de PCR múltiple para el diagnóstico diferencial de enfermedades infecciosas animales de importancia económica”, Departamento de Biología Molecular, Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de Madrid. Dra. Maria Luisa Arias Neira y Dra.Montserrat Agüero García.

OTRAS ACTIVIDADES

Organización de Cursos Organización del "XIV Curso Internacional sobre Enfermedades Exóticas". Centro de Investigación en Sanidad Animal, CISA-INIA. Valdeolmos. Financia: AECI-INIA. 2-30 Noviembre de 2000, 120 horas lectivas. Director del curso Marisa Arias Neira. Coordinadora del Curso: Matilde Carballo Santaolalla. Con la colaboración especial de la Facultad de Veterinaria de Córdoba. Profesores del Curso: Investigadores del CISA, así como Profesores, investigadores y profesionales de otras Instituciones y Universidades de España.

Organización del Workshop on African Swine Fever Diagnosis. Centro de Investigación en Sanidad Animal, CISA-INIA, Valdeolmos. 17-19 Octubre 2005. Países participantes: Alemania, Austria, Bélgica, Bulgaria, Dinamarca, Eslovenia, Eslovakia, Grecia, Hungría, Italia, Irlanda, Letonia, Lituania, Noruega, Países Bajos, Polonia, Rumanía, Suecia

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ENFERMEDADES TRANSFRONTERIZAS Y EMERGENTES. DIAGNÓSTICO E INMUNOPROFILAXIS

COMPONENTES Blanco Lavilla, Esther Gallardo Frontaura, Mª Carmen Gómez Gómez, Concepción Izquierdo Gil, Ana Llorente Herranz, Alicia Martín Folgar, Raquel Quintana-Lacaci Sanz, Bárbara Soler Sánchez, Alejandro


OBJETIVOS 1. Investigación y desarrollo en diagnóstico e inmunoprofilaxis de enfermedades

infecciosas


• Desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico para enfermedades vesiculares y Peste Porcina Africana: Se siguen varias estrategias: i) Obtención de anticuerpos monoclonales frente a PPA para su utilización en el diseño de nuevos ensayos y para la obtención de reactivos para detección virológica del VPPA Ii) Obtención de proteínas β-galactosidasa quiméricas, para su utilización como biosensores, en la detección específica de anticuerpos frente a VFA, EVC y PPA.

• Estudio de la respuesta inmune inducida frente al VFA y PPA: En los hospedadores naturales de ambas enfermedades (el cerdo) se estudia la respuesta inmune inducida tras la inoculación con diferentes aislados de ambos virus. I) VFA; La respuesta humoral se estudia analizando titulo de anticuerpos neutralizantes, isotipo de los Ac generados, Ac totales medidos por ELISA frente a virus completo o péptidos sintéticos. La respuesta celular se caracteriza mediante la realización de ensayos de linfoproliferación, análisis de las citoquinas inducidas, análisis por FACS de subpoblaciones celulares implicadas en respuesta inmune. Además mediante RT-PCR Real Time se cuantifica el RNA viral presente en diferentes tejidos y muestras. II) PPA; se determina la presencia de Ac totales mediante ELISA e Inmunoblotting, así como los isotipos producidos. Análisis de Ac específicos frente a diferentes proteínas recombinantes (p54, p32, pp62, p72). Determinación del título de Ac inhibidores de hemoadsorción. La respuesta celular se evalua determinando la capacidad de respuesta linfoproliferativa frente a mitógenos inespecíficos (ConA, PMA, PHA, etc), asi como la producción de citoquinas.

• Desarrollo de nuevas vacunas frente al VFA y PPA: Se estudia el potencial de varias estrategias vacunales para ambas enfermedades, principalmente mediante la utilización de péptidos sintéticos y cápsidas vacías (VFA) o mediante inmunización DNA o proteínas recombinantes (PPA). En ambos

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casos se llevan a cabo diferentes experimentos de inmunización en los cuales se evalúa la respuesta inmune inducida por las diferentes estrategias diseñadas así como se determina la capacidad de protección frente al desafío viral.

PROYECTOS Código: AGL2004-07857-C03C02/GAN Título: Caracterización de nuevos inmunógenos del virus de la Peste porcina africana: Estudio de la respuesta inmune inducida en cerdo Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Blanco Lavilla, Esther Código CT2003-503603 SSPE Título: Improvement of Foot and Mouth disease control by ethically acceptable methods based on scientifically validated assays and new knowledge on FMD vaccines, including the impact of vaccination Entidad financiadora: UE Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Blanco Lavilla, Esther Código: WT 75813 Título: “Control of African Swine Fever Virus (ASFV) through improved understanding of the epidemiology of the disease and construction and testing of recombinant and attenuated virus vaccines”. Entidad financiadora: Wellcome Trust Duración: 2005-2010 Investigador responsable: Martínez Escribano, José Angel

PRINCIPALES RESULTADOS:

• Obtención de biosensores basados en la proteína recombinante β-Galactosidasa, capaces de detectar específicamente anticuerpos frente a el virus de la Fiebre Aftosa, que permiten diferenciar animales infectados de vacunados.

• Desarrollo de un nuevo kit de diagnóstico serológico de la PPA basado en el uso de proteínas recombinantes.

• Análisis epidemiológico y caracterización molecular de aislados de VPPA. Identificación de regiones genómicas que permiten diferenciar aislados virales muy similares.

• Análisis molecular de dos aislados de PPA procedentes de dos regiones diferentes de Uganda. Establecimiento de relaciones filogenéticas de ambos aislados con otros aislados de PPA africanos y de otros orígenes. Diferenciación de ambos aislados por análisis molecular. Caracterización del fenotipo de ambos aislados (hemoadsorbente).

• Desarrollo de una vacuna peptidica (dendrímero TB) frente al VFA capaz de proteger totalmente cerdos desafiados con el virus homólogo.

• Obtención y caracterización preliminar de anticuerpos monoclonales frente a las proteínas p32 y p54 del VPPA.

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PUBLICACIONES

Otros artículos Raquel Martín-Folgar Carmina Gallardo, A.Izquierdo, A.Llorente y E. Blanco. “Lengua azul: una enfermedad reemergente”. Revista Mundo Ganadero 173 (Enero 2005). Pag. 27-32

OTRAS ACTIVIDADES

Asistencia a reuniones internacionales:

• Asistencia a reunión proyecto Wellcome, invitada por la coordinación del proyecto, en Londres. Noviembre 2005.

• Asistencia a Reunión proyecto CT2003-503603 SSPE en Bruselas. Noviembre 2005

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ENFERMEDADES TRANSFRONTERIZAS Y EMERGENTES. FIEBRE DEL VALLE DEL RIFT

COMPONENTES Brun Torres, Alejandro Lorenzo Alguacil, Gema Martín Folgar, Raquel


OBJETIVOS 1. Desarrollo de métodos para el diagnóstico de la Fiebre del Valle del Rift . 2. Valoración de nuevas estrategias vacunales. 3. Estudios de patogenia e inmunidad.


• Desarrollo de métodos moleculares (one step RT-PCR en tiempo real) para la detección del virus de la FVR

• Desarrollo y caracterización de anticuerpos monoclonales frente a antígenos estructurales del virus de la FVR y herramientas moleculares para el análisis de la respuesta inmunológica frente al virus de la FVR

• Valoración de la respuesta inmunológica frente a vacunas DNA y estrategias de prime boosting (DNA-MVA), en modelos ovino y murino.

• Establecimiento de modelos murinos de infección para el estudio de patogenia del VFVR

PROYECTOS Código: GR2004/SAL/0466 Título: Valoración de la respuesta inmunológica inducida frente a antígenos del virus de la Fiebre del Valle del Rift mediante inmunización con DNA en ovinos. Entidad financiadora: Comunidad Autónoma de Madrid Duración: 2005-2006 Investigador Responsable: Brun Torres, Alejandro


En las etapas iniciales del proyecto GR/SAL/0466 se han obtenido diversas construcciones genéticas en diferentes sistemas de expresión eucariota y procariota. Las construcciones codificando las tanto las glicoproteínas (G1/G2) del VFVR como la nucleoproteína (N) viral, o combinaciones de las mismas, bajo control de promotor eucariota se han utilizado en ensayos de valoración de la respuesta inmunológica en ratones Balb/c. Las combinaciones que generaron una mejor respuesta cualitativa se inocularán en grupos de ovinos con el objeto de valorar el tipo de respuesta inmunológica generada, tanto a nivel humoral como celular.

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En combinación con el grupo de la Dra. Sarah Gilbert (University of Oxford, Wellcome Trust Centre for Human Genetics), se están generando vectores MVA recombinantes que expresan las glicoproteínas G1 y G2, así como su precursor G1/G2 y la nucleoproteína N. Se valorará su aplicación en estrategias de prime (DNA) boost (MVA) en colaboración con el ILRI de Nairobi (Kenia). Convenio INIA-ILRI Finalmente se ha puesto a punto un método para la detección mediante RT-PCR de secuencias específicas del virus, para su adaptación a sistemas de tiempo real en un solo paso.

PUBLICACIONES

Artículos en Revistas SCI Castilla, J., Gutiérrez-Adán, A., Brun, A., Pintado, B., Salguero, F.J., Parra, B., Díaz San Segundo, F., Ramírez, M.A., Rábano, A., Cano, M.J. and Torres, J.M., (2005). Transgenic mice expressing bovine PrP with a four extra repeat insert mutation show a spontaneous, non-transmissible, neurodegenerative disease and expedited course on BSE infection. Febs Letters 579: 6237-6246 Castilla, J., Brun, A., San Segundo, F., Salguero FJ., Gutiérrez-Adán, A., Pintado, B., Torres JM. (2005). Vertical transmission of BSE prions evaluated in a transgenic mouse model. Journal of Virology 79, 8665-8669. Gutiérrez-Adán, A., Castilla, J., Brun, A., Ramírez, M.A., Salguero, F.J., Parra, B., Torres, J.M., Pintado, B., (2005). Transgenic models to study BSE. Transgenic Research 14:346-347.


OTRAS ACTIVIDADES

• Coordinador de Workpackage “Vaccine technologies”. Red europea de Excelencia EPIZONE. Coordinación y armonización de tareas de investigación llevadas a cabo por diversos laboratorios europeos con el objeto de desarrollar futuras estrategias de vacunación frente a enfermedades de interés veterinario en las que no existen vacunas o su desarrollo puede ser mejorable.

• Tutor de Esther Sánchez Freire, Finnova 2005. • Profesor en el "XIV Curso Internacional sobre Enfermedades Exóticas".

Centro de Investigación en Sanidad Animal, CISA-INIA. Valdeolmos. Financia: AECI-INIA. 2-30 Noviembre de 2000, 120 horas lectivas. Director del curso Marisa Arias Neira. Coordinadora del Curso: Matilde Carballo Santaolalla. Con la colaboración especial de la Facultad de Veterinaria de Córdoba. Profesores del Curso: Investigadores del CISA, así como Profesores, investigadores y profesionales de otras Instituciones y Universidades de España.

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BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR: BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR DE PRIONES

COMPONENTES Alamillo Gordo, Elia Cano Benito, Mª Jesús De la Losa Román, Nuria Espinosa Martín, Juan Carlos González Torres, Lucía Hervas Moyano, Mª Eugenia Martín González, Sergio Morales Camarzana, Mónica Padilla de Beer Danielle, Alejandra Parra Arrondo, Beatriz Relaño Ginéz, Aroa Rodríguez Benito, J. Antonio Torres Trillo, Juan Mª Villa Díaz, Ana


OBJETIVOS 1. El objetivo general del grupo es avanzar en el conocimiento de la biología de los

priones mediante el desarrollo de modelos basados en ratones transgénicos y cultivos celulares que expresan diferentes secuencias de la PrP.

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I • Desarrollo de bioensayos de alta sensibilidad para la detección de priones y

el diagnostico de las enfermedades producidas por estos agentes infecciosos. • Estudio de los elementos moleculares que determinan la transmisión y la

barrera de especie de los priones. • Estudio de los elementos moleculares implicados en la replicación y en la

patogénesis de los priones • Diseño y evaluación de nuevas estrategias terapéuticas contra los priones.

PROYECTOS

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Código: EET2001-4217-C02-02 Título: Inmunoterapia aplicada a enfermedades producidas por priones Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2002-2005 Investigador responsable: Torres Trillo, Juan Mª Código: CT2002-01309 QLK3 Título: European project to study BSE strain in sheep. Entidad financiadora: UE Duración: 2003-2007 Investigador responsable: Torres Trillo, Juan Mª Código: CT2001-01333 QLRT Título: Improved bioassays for TSE agents based on the bank vole, wild rodent species highly susceptible to scrapie, and its possible role in scrapie epidemiology Entidad financiadora: UE Duración: 2002-2006 Investigador responsable: Torres Trillo, Juan Mª Código: EET2002-05140 Título: Estudio de la transmisibilidad de la EEB y del scrapie a la especie porcina Entidad financiadora: Plan Nacional de I+D+I Duración: 2003-2006 Investigador responsable: Torres Trillo, Juan Mª Código: EET2002-05168-C04-02 Título: Estudio neuropatológico de un modelo experimental murino de encefalopatía espongiforme bovina Entidad financiadora: Plan Nacional de I+D+I Duración: 2003-2008 Investigador responsable: Brun Torres, Alejandro Código: CT2004-506579 FOOD PRO Título: Network of Excellence of the Prion diseases “Neuroprion”. Entidad financiadora: UE Duración: 2003-2008 Investigador responsable: Torres Trillo, Juan Mª

CONVENIOS

Código: CC05-02 Título: Convenio de Colaboración entre el INIA y el Instituto Grifols S.A. para la preparación de un homogenado de cerebro de Hamster inoculado con la cepa de prion 263K. Entidad financiadora: Instituto Grifols S.A. Duración: 2005- 2007 Investigador responsable: Torres Trillo, Juan Mª Código: CC05-036 Título: Cooperation agreement between INIA, Bio-rad and the commissariat à l’energie Atomique for the development of a blood test to identify animals that are carriers of the q171 genotype in the ovine prp gene based on the 2A11 monoclonal antibody Entidad financiadora: Bio-Rad Duración: 2005- 2007 Investigador responsable: Juan Mª Torres Trillo


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En general, los proyectos han avanzado de acuerdo al calendario previsto. Hemos podido demostrar que la inmunogenicicidad de la PrP se ve incrementada cuando se presenta fusionada al peptido señal de transporte al lisosoma (LIMPII). Paralelamente se han generado ratones transgénicos que expresen el gen de la PrP con mutaciones asociadas a patología con el fin de desarrollar modelos biológicos que mimeticen las diferentes formas etiológicas de las encefalopatías espongiformes descritas en humanos.

• Ratones transgénicos expresando la PrP humana con la mutación E200K (CJD)

• Ratones transgénicos expresando la PrP humana con la mutación D178N (FFI)

• Ratones transgénicos expresando la PrP humana con la mutación A117V (GSS).

Se ha finalizado la caracterización de BSE antes y después de pasar por oveja en ratones transgenicos que expresan la PrP bovina. Esta caracterización nos ha permitido concluir que este modelo permite discriminar entre BSE y scrapie en oveja demostrando que BSE después de pasar por la obeja mantiene características de BSE pero con un claro aumento de su virulencia lo que tiene importantes implicaciones en sanidad animal y humana. Por otra parte, hemos generado ratones transgenicos que expresan la PrP humana M129M y V129V. Estos animales se han inoculado con diferentes aislados de BSE, BSE pasado por oveja y scrapie para su caracterización. Hemos conseguido desarrollar ratones transgénicos que expresan el gen de la PrP del campañol. Estos ratones están siendo analizados en relación a su susceptibilidad a BSE y a scrapie lo que nos permitirá concluir si los elementos determinantes de la susceptibilidad diferencial a BSE mapean en el gen de la PrP o si por el contrario son elementos no asociado a la secuencia de la PrP. Se ha confirmado la elevada barrera de transmisión que presenta la especie porcina a la infección con BSE. Los experimentos de infección de los ratones transgenicos que expresan PrP porcina siguen avanzando y confirmando hasta el día de hoy la imposibilidad de infectar estos ratones scrapie utilizando varios inoculos de distinto origen. Una alta barrera de transmisión parece evidente para Scrapie en cerdo, pero no podemos descartar que en los próximos meses aparezca algún positivo, aunque con tiempos de incubación muy largos. Se han obtenido muestras a los diferentes tiempos de inoculación y se está procediendo a su análisis mediante técnicas histopatológicas e inmunohistoquímicas. Igualmente a partir de muestras tomadas a diferentes tiempos se ha procedido a la extracción de RNA tisular para la obtención de cDNAs y su posterior marcaje con sondas Cy3 fluorescentes. Estos cDNAs marcados serán empleados para la hibridación de microarrays comerciales Debido a los largos tiempo de incubación, característicos de estas enfermedades, aún no se tienen resultados dignos de mención. Además de permitirnos afianzar nuestras relaciones con el resto de los 52 grupos de investigación europeos integrados en la Red Neuroprion, nos ha permitido realizar importantes avances en los temas en los que nuestro grupo está implicado.

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Hemos determinado algunas características bioquímicas y biológicas de BSE que solo son dependientes de cepa y que son independientes de la secuencia de la PrP de cada especie. Esto nos ha permitido proponer un sistema de diagnostico diferencial de EEB en otras especies (especialmente en oveja y humanos). Hemos obtenido neuroesferas de los diferentes modelos de ratones transgénicos generados previamente en el laboratorio y estamos estudiando su susceptibilidad a la infección con priones. Hemos obtenido células madre neurales y embrionarias de ratones nulos para el gen de la PrP y estamos evaluado su capacidad neuroregenerativa tras su implantación en el cerebro de ratones afectados de EEB. Se han obtenido los cerebros de hámster inoculados con 263K y se está procediendo a su procesamiento. Hemos confirmado que el monoclonal 2A11 es capaz de discriminar los diferentes aplotipos del residuo 171 de la PrP y estamos optimizando un test ELISA commercial para genotipado masivo con la colaboración de Bio-Rad y el CEA.

PUBLICACIONES

Artículos en Revistas SCI Soto, C., Anderes, L., Suardi, S., Cardone, F., Castilla, J., Frossard, M.J., Peano, S., Saa, P., Limido, L., Carbonatto, M., Ironside, J., Torres, J.M., Pocchiari, M., Tagliavini, F. “Pre-symptomatic detection of prions by cyclic amplification of protein misfolding”. FEBS Lett. 579(3): 638-642 (2005). Castilla, J., Brun, A., San Segundo, F., Salguero F.J., Gutiérrez-Adán, A., Pintado, B., Ramírez, MA., del Riego, L., Torres JM. “Vertical transmisión of BSE prions evaluated in transgenic mouse model.” J. Viro. 79:8665–8668 (2005). Gavín R, N Braun, O Nicolas, B Parra, JM Ureña, A Mingorance, E Soriano, JM Torres, A Aguzzi and JA del Río. PrP(106–126) activates neuronal intracellular kinases and Egr1 synthesis through activation of NADPH-oxidase independently of PrPc. FEBS letter 579(19): 4099-4106 (2005). Castilla, A.Gutiérrez-Adán, A. Brun, B. Pintado, F.J. Salguero, B. Parra, F. Díaz San Segundo, M.A. Ramírez, A. Rábano, M.J. Cano and J.M. Torres. Transgenic mice expressing bovine PrP with a four extra repeat octapeptide insert mutation show a spontaneous, non-transmissible, neurodegenerative disease and an expedited course of BSE infection. FEBS letter 579 (27): 6237-6246 (2005). Gutiérrez-Adán A, J. Castilla, A. Brun, M.A. Ramírez, F.J. Salguero, B. Parra, J.M. Torres, B. Pintado. Transgenic models to study BSE. Transgenic Research 14:346-347 (2005).

Eva Pericuesta, Miguel A Ramirez, Ana Villa-Diaz, Aroa Relano-Gines, Juan M Torres, Marta Nieto, Belen Pintado, Alfonso Gutierrez-Adan. The proximal promoter region of

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mTert is sufficient to regulate telomerase activity in ES cells and transgenic animals. Reproductive Biology and Endocrinology 2006, 4:5 Nº Ponencias, comunicaciones y póster presentados/as y publicados en las actas: 6 Tesis Doctorales Beatriz Parra Arrondo. (2005) Modelos basados en ratones transgénicos o en cultivos celulares para el estudio de las encefalopatías espongiformes transmisibles. Universidad Autónoma de Madrid. Departamento de Biología Molecular. Juan Mª Torres Trillo

OTRAS ACTIVIDADES

Cursos

• Juan María Torres: Profesor en el "IVX Curso Internacional sobre Enfermedades Exóticas". Centro de Investigación en Sanidad Animal, CISA-INIA. Valdeolmos.

• Profesor del “Master de Salud Pública” Escuela Nacional de Sanidad. (Juan Mª Torres Trillo)

• Tutor Externo de la asignatura de “Estancias” tutelando 200 horas de prácticas a alumnos de 2º ciclo de la Fac. Veterinaria de la Univ. Complutense. (Juan Mª Torres Trillo)

• Tutor Beca FINNOVA (Lucia González Torres) • Juan Maria Torres. Member of the executive committee of NoE neuroprion

Informes

• Juan María Torres. Evaluación de proyectos de investigación: • Varias convocatorias del Plan Nacional de I+D+I • Varias convocatorias de NoE neuroprion • Convocatoria “TSE Research requirements” DEFRA (UK)

Servicios Juan Maria Torres .Seguimiento y participación en el desarrollo del convenio CC03-034 (INIA-FEDENCA-FUNDACIÓN BIODIVERSIDAD-SYVA)

Estancias en el grupo de personal de otras entidades • Dr. Olivier Andréoletti UMR959 INRA-ENVT Institut de la Recherche

Agronomique Toulouse-France (Julio 2005) • Carlos Maluquer de Motes Porta. Dep. Microbiology, Faculty of Biology.

University of Barcelona. • Monica Morales Camarzana. SYVA (Enero-Diciembre 2005) • Julita García. INGENASA. (noviembre de 2004 a 31 de Agosto de 2005)

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BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR. MÉTODOS ALTERNATIVOS A LA EXPERIMENTACIÓN ANIMAL

COMPONENTES Castaño Calvo, Argelia Cuellar Cuellar, Mª Luisa Sánchez Nieto, Carlos Correo electrónico: [email protected] OBJETIVOS

1. Métodos alternativos a la experimentación animal. PROYECTOS Código: BIO2002-01912 Título: Aplicación y desarrollo de biomarcadores moleculares en células derivadas de peces como sistemas alternativos de valoración de alteraciones genómicas. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2002-2005 Investigador Responsable: Castaño Calvo, Argelia

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BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR. ARENAVIRUS

COMPONENTES Pérez Martínez, Mª del Mar Correo electrónico: [email protected] OBJETIVOS

1. Identificación de las Dianas Celulares de los Arenavirus y sus implicaciones PROYECTOS Código y Título: Identificación de las Dianas Celulares de los Arenavirus y sus implicaciones Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2005-2007 Investigador Responsable: Pérez Martínez, Mª del Mar

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BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR. BIOLOGÍA MOLECULAR DE VIRUS RNA

COMPONENTES Gómez Castilla, Jordi Diaz Toledano, Rosa Mª Mena Piñeiro, Ignacio Correo electrónico: OBJETIVOS

1. Caracterización de las señales de ARN alrededor del ires del virus de la hepatitis C y los pestivirus animales relacionados para el diseño de un ribozima modular derivado de la masa p de la canobac.

PROYECTOS Código: BIO2004-06114 Título: Caracterización de las señales de ARN alrededor del ires del virus de la hepatitis C y los pestivirus animales relacionados para el diseño de un ribozima modular derivado de la masa p de la canobac Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2004-2007 Investigador Responsable: Gómez Castilla, Jordi

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BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR. MODULACIÓN DEL SISTEMA INMUNE POR VIRUS

COMPONENTES Alejo Herberg, Alí Ruiz Argüello, Begoña Correo electrónico: [email protected] OBJETIVOS

1. El principal objetivo de este grupo es la caracterización de receptores solubles de citoquinas y de proteínas de unión codificadas por los poxvirus. Los poxvirus son una familia de virus DNA de gran tamaño que codifican proteínas únicas que imitan a las moléculas del sistema inmune del hospedador o que van dirigidas a componentes clave del sistema inmune. Una estrategia frecuentemente utilizada por los poxvirus es la expresión de receptores solubles de citoquinas que son secretados al medio extracelular, donde se unen a distintas citoquinas celulares, bloqueando su actividad biológica. Así, se han identificado varios receptores solubles de TNF en miembros de la mayoría de los géneros de poxvirus, lo cual indica la importancia de la vía del TNF como estrategia antiviral. Además, el hecho de que virus de diferentes familias hayan desarrollado estrategias contra las mismas moléculas inmunomoduladoras demuestra la importancia de éstas en los mecanismos de defensa del hospedador. Los resultados obtenidos serán particularmente relevantes para determinar la adaptación de los mecanismos virales de inmunomodulación al hospedador y por tanto, para comprender mejor su sistema inmune. También podrían identificar nuevas moléculas inmunomoduladoras. Asimismo, estos resultados serán importantes para el desarrollo de nuevas estrategias para la generación de vacunas y tratamiento de enfermedades emergentes.


• Identificación y caracterización in vitro de receptores solubles de citoquinas y proteínas de unión codificadas por los poxvirus.

• Estudio de la función de los inmunomoduladores virales durante la infección: ″Mousepox″ como modelo de patogénesis viral.

Principales resultados Se han caracterizado, in vitro, las proteínas virales CrmB y CrmD. Ambas contienen cuatro dominios ricos en cisteínas homólogos al dominio extracelular de los receptores de TNF y una región C-terminal de función desconocida que no se parece a ninguna proteína celular. Estudios previos del laboratorio del Dr. Alcamí demostraron, por primera vez, que estas proteínas no sólo bloquean la actividad biológica del TNF sino que además unen interleuquina-8. En colaboración con el Dr. A.Alcamí se ha realizado un screening completo (mediante SPR, BIAcore X) para determinar los posibles ligandos de estas proteínas y se ha demostrado que ambas unen e inhiben la actividad de

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algunas quimioquinas. Además, ambas pueden unir TNF y quimioquinas simultáneamente y por sitios independientes. Estos resultados identifican CrmB y CrmD como proteínas virales solubles de unión a quimioquinas y describen un nuevo dominio de interacción con quimioquinas (el dominio C-terminal). Por último, estudios preliminares in vivo demuestran que estas proteínas tienen un papel inmunomodulador en la patogénesis viral ya que ratones infectados con virus recombinantes a los cuales se les ha delecionado la proteína CrmD muestran un fenotipo atenuado. Se trabaja en estrecha colaboración con el laboratorio del Dr. Antonio Alcamí (Centro Nacional de Biotecnología, CSIC).

PUBLICACIONES

Artículos en Revistas SCI B. Costes, M. B. Ruiz-Arguello, N. A. Bryant, A. Alcami & A. Vanderplasschen. (2005) Both soluble and membrane-anchored forms of Felid herpesvirus 1 glycoprotein G function as a broad-spectrum chemokine-binding protein. J. Gen. Virol. 86: 3209-3214. Libros y capítulos de libros M. Begoña Ruiz-Argüello, Alí Alejo & Antonio Alcami. (2005) Secreted tumour necrosis factor inhibitors encoded by poxviruses. SGM Symposium 64: Molecular pathogenesis of virus infections (Editors P. Digard, A. A. Nash & R. E. Randall). Cambridge University Press, pp. 269-289.


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VIROLOGÍA ANIMAL, INMUNOLOGÍA Y PROFILAXIS. FIEBRE AFTOSA

COMPONENTES Gutiérrez Rivas, Mónica Molina Polo, Nicolás Rodríguez Pulido, Miguel Ramón Saiz Salabardo, Margarita


OBJETIVOS 1. Regulación de la expresión génica e infectividad del virus de la Fiebre Aftosa. 2. Caracterización funcional de las regiones no codificantes del genoma del virus

de la fiebre aftosa (FMDV). Implicación en procesos de replicación y traducción viral.

3. Estudio de genotipos virales atenuados con potencial vacunal. 4. Estudios de la base del tropismo y virulencia de FMDV.


• Mutagénesis sobre clones infecciosos y ensayos in vitro e in vivo de los genotipos variantes.

• Ensayos de virulencia en ratón lactante y cerdo

PROYECTOS Código: RTA03-201 Título: Identificación y estudio de regiones reguladoras en el genoma del virus de la fiebre aftosa: implicaciones en virulencia y respuesta inmune Entidad financiadora: INIA Duración: 2003-2005 Investigador responsable: Saiz Salabardo, Margarita Código: CT-2002-01719 QLK2 Título: Foot and mouth disease virus: the molecular basisi of tissue tropism (FMD tropism)” Entidad financiadora: UE Duración: 2002-2005 Investigador responsable: Saiz Salabardo, Margarita

Principales resultados • Identificación de interacciones entre regiones situadas en los extremos 5´ y

3´ del RNA viral. • Identificación de proteínas celulares que interaccionan con dominios del

extremo 5´ implicados en replicación y traducción. • Generación y caracterización de mutantes en la región de interacción con

receptores tipo integrina.


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VIROLOGÍA ANIMAL, INMUNOLOGÍA Y PROFILAXIS. SÍNDROME REPRODUCTIVO Y RESPIRATORIO PORCINO (PRRS)

COMPONENTES Núñez Garrote, José Ignacio

OBJETIVOS 1. Realización de estudios de epidemiología molecular de enfermedades de

relevancia en sanidad animal


• Epidemiología molecular del virus RNA de importancia en sanidad animal • Virus de la Fiebre Aftosa • Virus de la Peste porcina Clásica • Caracterización genómica del VSRRP

PROYECTOS Código: AGL2004-06850-C02-02/GAN Título: Variabilidad genómica de cepas del virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino (VSRRP) aisladas en España a lo largo del tiempo Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2002-2005 Investigador responsable: Núñez Garrote, José Ignacio Principales resultados Diseño de parejas de primers para la amplificación inicial de la región 5´de la ORF 1a de distintas cepas del virus del síndrome respiratorio y reproductor porcino (VSRRP). Empleo de reacciones de RT-PCR con RNAs control para la optimización y puesta a punto de las condiciones de amplificación mediante distintas estrategias como el uso de “random primers” para la obtención de cDNA, uso de distintas concentraciones de MgCl2, empleo de distintas condiciones de los ciclos de amplificación por PCR, así como el empleo de distintas polimerasas. Para todos los productos amplificados mediante el empleo de polimerasas sin actividad “proof-reading”, se ha realizado la amplificación de un segundo producto de RT-PCR para su comparación de secuencias, en todos los casos se ha observado idéntica secuencia. Obtención de datos de secuencia de la región comprendida entre los nucleótidos 964 y 1952 (posiciones referidas a Lelystad virus, número de acceso en EMBL M96262) de seis aislados españoles proporcionados por el grupo del subproyecto coordinado. El análisis de estas secuencias permitió obtener el primer alineamiento de una región no estructural de aislados españoles del VSRRP. Como parte de la colaboración entre los dos subproyectos, se ha trabajado en la reconstrucción filiogenética a partir de secuencias de la ORF 5 de 31 aislados españoles, analizando la evolución temporal de los aislados españoles del VSRRP y hemos

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establecido unas tasas de fijación de mutaciones para estos virus, todo ello ha permitido enviar un artículo para su publicación en una revista internacional

OTRAS ACTIVIDADES Como muestra de la colaboración con la empresa TDI, parte del diseño de los primers empleados para la amplificación del genoma de VSRRP se ha realizado con la ayuda del programa Hint-PCR, desarrollado en la empresa TDI (Dopazo and Sobrino J Virol Met. (1993) 41:157-65).

Se ha colaborado con el grupo del Dr. Fernando Alonso del departamento de biotecnología del INIA en un ensayo de interacción virus-células del sistema inmune porcino. Esta experiencia consistió en la inoculación de cerdos con el VSRRP, en el que nuestra colaboración incluyó la detección del virus en hisopos nasales y faríngeos, así como en muestras recogidas de sangre y suero a distintos tiempos p.i. por medio de RT-PCR para detectar la presencia de virus en estas localizaciones. Debido a la dificultad de evaluación de los síntomas clínicos en determinados ensayos al reproducir esta enfermedad, la detección por RT-PCR puede servir de indicativo de replicación viral.

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VIROLOGÍA ANIMAL, INMUNOLOGÍA Y PROFILAXIS. INFLUENZA ANIMAL

COMPONENTES Martín del Burgo, M. Angeles Real Soldevilla, Gustavo del


OBJETIVOS 1. Epizootiología de la influenza porcina: prevalencia de la enfermedad y

caracterización de los virus circulantes 2. Patogenia de la influenza porcina: factores de virulencia, mecanismos de

transmisión interespecífica 3. Vacunas frente a la Influenza porcina: desarrollo de cepas atenuadas, nuevos

vectores

PROYECTOS Código: AGL2004-02132 Título: Epizootiología molecular de la Influenza porcina en España. Desarrollo de nuevas vacunas frente a la gripe porcina Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Real Soldevilla, Gustavo del COVENIOS Código: CC03-017 Título: Caracterización genética y antigénica de cepas virales aviares presentes en España para las enfermedades de Gumboro, Bronquitis Infecciosa y Rinotraqueitis Aviar Entidad financiadora: INPROVO Duración: 2005 Investigador responsable: Real Soldevilla, Gustavo del

Principales resultados La situación actual de la Influenza porcina en España es desconocida ya que los últimos datos sobre su prevalencia son de los años 80. En otros países Europeos, de los que se disponen datos recientes, se ha constatado un cambio importante en la composición de las cepas circulantes lo cual tiene consecuencias importantes en el impacto de la enfermedad y en la eficacia de las vacunas actuales. Asimismo, el cerdo es un hospedador muy importante desde el punto de vista de la epidemiología de la gripe humana. La situación actual de alarma ante la aparición de un virus de gripe pandémico de origen aviar subraya, aún mas, su papel como hospedador intermediario al ser susceptible a la infección con virus aviares. La rápida evolución genética y antigénica de los virus de la gripe obliga a realizar un seguimiento epidemiológico continuo para detectar la aparición de cepas capaces de saltar de especie o con mayor virulencia. Las vacunas de la gripe también tienen que ser adaptadas en función de las cepas que circulan en cada momento y lugar. Desde el punto de vista teórico, es esencial conocer los mecanismos de virulencia, y de adaptación y transmisión a otras especies para poder

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prever la aparición de virus con mayor potencial patogénico y diseñar las medidas profilácticas adecuadas. En nuestro laboratorio hemos realizado un estudio epizootiológico de la gripe porcina en España en colaboración con los laboratorios Hipra de Amer (Gerona). De los datos resultantes se desprende una alta tasa de infección y una distribución de cepas diferente a lo esperado. El estudio de las características antigénicas y genéticas de aislados virales recientes también aporta información interesante sobre la patogenia de la enfermedad. Por otro lado, estamos evaluando nuevos métodos de vacunación en colaboración con la Escuela de Medicina Monte Sinaí de Nueva York en donde han desarrollado métodos originales de atenuación y de manipulación genética del virus Influenza.

PUBLICACIONES

Otros artículos Gustavo del Real: La influencia animal: una amenaza para la humanidad" En la revista: Ganadería. ISSN 1695-1123, Año 5, Nº. 33, 2005, pags. 44-49.

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VIROLOGÍA ANIMAL, INMUNOLOGÍA Y PROFILAXIS. LENGUA AZUL

COMPONENTES Calvo Pinilla, Eva Ortego Alonso, Javier


OBJETIVOS 1. Desarrollo de Vectores virales Bioseguros basados en genomas de Coronavirus 2. Desarrollo de vacunas recombinantes frente al virus de la Lengua Azul (BTV)


• Expresión de genes de Rotavirus para generar virus like particles (VLPs) • Modificación del tropismo de especie del virus TGEV. Cambio de tropismo

del virus porcino a humano y ratón. • Generación de DNAs desnudos que codifican las proteínas de la la cápsida

externa del virus de la lengua azul. • Generación de virus vaccinia recombinantes (rMVA) para expresar las

proteínas de la cápsida externa del virus de la lengua azul. • Evaluación de las estrategias de vacunación de las combinaciones

DNA/rMVA en modelos animales de laboratorio. • Desarrollo de test de ELISA diferenciales para lengua azul.


Vectores virales bioseguros basados en genomas de Coronavirus.

Se ha conseguido generar virus TGEV recombinantes que expresan las proteínas VP7, VP2 y VP6 de rotavirus. Se esta procediendo ahora al estudio de la generación de VLPs en células infectadas con estos virus recombinantes.

Se han generado virus recombinantes TGEV con tropismo por la especie humana y murina por intercambio de la proteína de la espícula con el de otros coronavirus con tropismo por estas especies (NL-63 y MHV respectivamente).

Desarrollo de vacunas marcadas recombinantes frente al virus de la lengua azul (BTV).

Se han generado hasta el momento los cDNAs y virus vaccinia recombinantes que expresan la proteína VP2 del virus de la lengua azul, serotipo 4 (responsable de los últimos brotes de este virus en España).

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OTRAS ACTIVIDADES

Cursos:

Profesor en el "IVX Curso Internacional sobre Enfermedades Exóticas". Centro de Investigación en Sanidad Animal, CISA-INIA. Valdeolmos. Financia: AECI-INIA. 2-30 Noviembre de 2000, 120 horas lectivas. Director del curso Marisa Arias Neira. Coordinadora del Curso: Matilde Carballo Santaolalla. Con la colaboración especial de la Facultad de Veterinaria de Córdoba. Profesores del Curso: Investigadores del CISA, así como Profesores, investigadores y profesionales de otras Instituciones y Universidades de España.

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VIROLOGÍA, INMUNOLOGÍA Y PROFILAXIS. CALICIVIRUS

COMPONENTES Almanza Reyes, Horacio Angulo Herrera, Ivan Bárcena del Riego, Juan Blanco Lavilla, Esther Cubillos Zapata, Carolina


OBJETIVOS 1. Desarrollo de vacunas basadas en péptidos sintéticos que mimetizan diversos

sitios antigénicos del VFA y son capaces de estimular linfocitos B y T porcinos. 2. Caracterización inmunogénica de VLPs quiméricas del virus de la enfermedad

hemorrágica del conejo (RHDV) que expresan sitios antigénicos B y T del VFA. 3. Caracterización de la respuesta inmune inducida en el cerdo por los distintos

péptidos y VLPs, seleccionados en los apartados anteriores.

PRINCIPALES LINEAS DE I+D+I

• Vectores vacunales basados en VLPS quiméricas de calicivirus • Bases moleculares del tropismo celular del calicivirus felino • Análisis de la reactividad cruzada entre pestivirus. • Caracterización genética de cepas virales aviares presentes en España para

las enfermedades de Gumboro, bronquitis infecciosa y rinotraqueitis aviar

PROYECTOS Código: BIO2002-04091-C03-03. Título: Nuevas estrategias vacunales frente al virus de la fiebre aftosa y estudio de los mecanismos implicados en la patogenicidad viral” Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2002-2006 Investigador responsable: Barcena de Riego, Juan

Principales resultados Se ha evaluado en cerdos la inmunogenicidad de construcciones de péptidos sintéticos dendriméricas (MAPs) que incluyen el sitio antigénico A del virus de la fiebre aftosa (VFA), junto con un epítopo T derivado de la proteína viral 3A. Dichas construcciones dendriméricas inducen niveles de anticuerpos y respuestas celulares significativamente mayores que los péptidos lineales correspondientes. En cuanto a las VLPs quiméricas que expresan sitios antigénicos B y T de VFA, se ha realizado un estudio sobre su capacidad para interaccionar con células dendríticas (CDs) porcinas. Los resultados obtenidos indican que las CDs porcinas son capaces de procesar eficientemente tanto las VLPs nativas de RHDV como las VLPs quiméricas ensayadas. Se comprobó además que las VLPs promueven incrementos en marcadores de superficie de CDs como CD80/86 y MHC de clase II, es decir, las VLPs promueven la activación de las CDs

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LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN EN VIROLOGÍA ANIMAL, INMUNOLOGÍA Y PROFILAXIS. RESPUESTA INMUNE DE PECES

COMPONENTES Sánchez Freire, Esther Tafalla Piñeiro, Carolina


OBJETIVOS 1. Estudio de los mecanismos de defensa antivirales en peces 2. Caracterización de citoquinas en trucha 3. Utilización de citoquinas como adyuvantes en vacunas dna frente a virus en

peces


• Estudio del sistema inmune antiviral en peces teleosteos. Función de citoquinas.

• Optimización de vacunas frente a virus en peces.

PROYECTOS Código: AGL2004-07404-C02-02 Título: Vacunas dna en acuicultura: estudio de la respuesta inmune celular en el modelo trucha arcoiris / rabdovirus Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Tafalla Piñeiro, Carolina


Interferón

En colaboración con el grupo del Profesor Secombes de la Universidad de Aberdeen se han puesto a punto PCRs cuantitativas para determinar los niveles de expresión de tres formas de interferón (IFN) de tipo I en respuesta a VHSV (IFN1, IFN2 e IFN3) que este grupo ha identificado. Se han evaluado los niveles de expresión de estos genes en respuesta a VHSV in vivo (en sangre, riñón, bazo, hígado y músculo), así como in vitro (en leucocitos totales de riñón y en la línea celular RTG-2).

Se ha realizado un estudio de la expresión de las proteínas Mx inducidas por IFN de tipo I en respuesta a distintos estímulos. Hasta el momento, se habían caracterizado tres isoformas de Mx en trucha arcoris (Mx1, Mx2 y Mx3), sin embargo, no se conoce el papel que cada una de estas isoformas tiene en la respuesta antiviral, ni en la resistencia inducida por una vacuna. Para intentar comprender la función de cada una de estas proteínas, hemos diseñado RT-PCRs específicas para cada una de las isoformas. Hemos inoculado truchas con VHSV, con una vacuna DNA frente a VHSV o con el estímulo viral Poly I:C, para evaluar la expresión de los distintos Mx en bazo, hígado riñón

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anterior y músculo. Hemos demostrado que en respuesta a VHSV se inducen las tres isoformas, aunque en todos los tejidos la expresión de Mx3 es menor. Sin embargo, cuando los peces se vacunan frente a VHSV, Mx3 es la isoforma que se expresa mayoritariamente en músculo e hígado. En el bazo de los peces vacunados es Mx1 la forma mayoritaria, y en el riñón no se induce significativamente la expresión de ninguna isoforma.

Interleuquina 8

Se está trabajando en el estudio de la actividad de la IL-8 (una quimioquina de tipo CXC) como adyuvante para una vacuna DNA. Para ello, se ha clonado el gen completo de la IL-8 en un plásmido de expresión eucariota (bajo el control del promotor CMV). En primer lugar, se ha comprobado la eficacia de este plásmido (pIL8) en expresar de forma correcta la IL-8. Hemos visto que tras su inyección intramuscular, la citoquina se transcribe fundamentalmente en sangre y músculo y es capaz de atraer células inmunes (fundamentalmente neutrófilos) al sitio de inyección. Una vez comprobada la eficacia de este plásmido, se han vacunado truchas arcoiris, tanto sólo con una vacuna DNA frente a VHSV como en conjunción con el pIL8. A distintos tiempos post-vacunación, se recogieron muestras de hígado, riñón y bazo y se determinó la expresión de distintas citoquinas pro-inflamatorias (IL-1 y TNF-α), citoquinas fundamentalmente inhibitorias como son el TGF-β y la IL-11, o la IL-18 (implicada en la proliferación linfocitaria). De estos trabajos se dedujo que la IL-8 era capaz de modular la respuesta inmune que se induce con la vacunación, actuando principalmente sobre las citoquinas pro-inflamatorias (IL-1 y TNF-α), aumentando significativamente sus niveles de expresión. Estos resultados sugieren que la IL-8 sería capaz de aumentar la inmunogenicidad de la vacuna DNA, lo cual se está estudiando es estos momentos, y se comentará en el siguiente informe.

En colaboración con el grupo de la Dr. Sara Pérez-Prieto (Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid) se ha realizado un estudio del papel de la IL-1 y la IL-8 en la coinfección de los virus IPNV e IHNV, que tiene como resultado la inhibición de IHNV. Se han determinando los niveles de expresión en respuesta a los distintos virus por separado o cuando están juntos.

PUBLICACIONES

Artículos en Revistas SCI Tafalla, C., Coll, J., Secombes, C.J., (2005) Expression of genes related to the early immune response in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) after viral haemorrhagic septicemia virus (VHSV) infection. Developmental & Comparative Immunology 29(7): 615-626.

Otros artículos Jiménez, J. Coll, A. Estepa & C. Tafalla (2005) Futuro de las vacunas DNA frente a virus en acuicultura. Revista Aquatic 23: 20-35.


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GRUPOS DE INVESTIGACIÓN DE OTROS ORGANISMOS QUE REALIZAN ACTIVIDADES EN EL CISA-INIA OPI: CBMSO - CSIC

GRUPO DE INVESTIGACIÓN EN FIEBRE AFTOSA

COMPONENTES Borrego Rivero, Belén Fernández-Pacheco, Paloma Ganges Espinosa, Lliliane Sobrino Castelló, Francisco


OBJETIVOS 1. Desarrollo de vacunas marcadoras basadas en subunidades de virus, empleando

como modelo el virus de la Fiebre Aftosa y el de la Peste Porcina Clásica. 2. Estudio de las bases moleculares de la patogenia de virus animales, empleando

como modelo el virus de la Fiebre Aftosa, con especial énfasis en la identificación de dianas y estrategias antivirales.


• Respuesta inmune frente al virus de la Fiebre Aftosa en cerdo: desarrollo de nuevas vacunas.

• Estudio de las bases moleculares de la patogenia del virus de la Fiebre Aftosa

• Desarrollo de nuevas vacunas frente al virus de la Peste Porcina Clásica.

PROYECTOS Código: CT2002-1304 QLK2 Título: Optimizing DNA based vaccination against FMDV in sheep and pigs (FMDNAVACC) Entidad financiadora: UE Duración: 2002-2006 Investigador responsable: Sobrino Castelló, Francisco Código: BIO2002-04091-C03-02 Título: Estudio de los mecanismos implicados en la patogenicidad del virus de la Fiebre Aftosa: Entidad financiadora: UE Duración: 2002-2005 Investigador Responsable: Sobrino Castelló, Francisco

CONVENIOS Código: CC05-016 Título: Ayuda a empresas de la CAM para la realización de proyectos de investigación y desarrollo tecnológico. Desarrollo de una vacuna contra fiebre aftosa basada en subunidades víricas. Entidad financiadora: BIONOSTRA SA. Duración: 2004-2005 Investigador Responsable: Sobrino Castelló, Francisco

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Principales resultados Se está caracterizando la respuesta inmune celular que induce el VFA y sus vacunas convencionales en modelos animales experimentales animales que incluyen un importante hospedador natural, el cerdo. Esta información está siendo empleada para el diseño de nuevas vacunas marcadoras basadas en subunidades virales (péptidos, vacunas DNA y VLPs heterólogas) y el análisis de su inmunogenicidad en modelos animales. Algunas de las estrategias desarrolladas están siendo también empleadas para el desarrollo de nuevas vacunas frente a otra importante enfermedad viral animal, la peste porcina clásica.

Se trabaja, también, en el análisis funcional de distintas proteínas virales en la internalización, el ciclo de multiplicación y los mecanismos que median la patogenicidad del VFA en cultivos celulares y modelos animales. En particular, se estudia la implicación funcional de proteínas no estructurales, como 3A, en el la virulencia y rango de hospedador del virus. Para ello se están caracterizando las interacciones de proteínas del virus con elementos celulares empleando ensayos de expresión transitoria y estable en líneas susceptibles, así como las propiedades biológicas de mutantes obtenidos utilizado clones infecciosos.

PUBLICACIONES

Artículos en Revistas SCI De Oliveira, E., Jiménez-Clavero, M.A., Núñez, J.I., Sobrino, F. and Andreu, D. (2005) Analysis of the immune response against mixotope peptide libraries related to foot-and-mouth disease virus. Vaccine. 23, 2647-2657. Ganges, L., Barrera, M., Núñez, J.I., Blanco, I., Frias, M.T., Rodríguez, F. and Sobrino, F. (2005) A DNA vaccine expressing the E2 protein of Classical swine fever virus elicits T cell responses that prime for rapid antibody production and total protection upon viral challenge. Vaccine. 23, 3741-3752. Díaz de Arce, H., Ganges, L., Barrera, M., Naranjo, D., Sobrino, F., Frías, M. and Núñez, J.I. (2005) Origin and evolution of viruses causing classical swine fever in Cuba. Virus Res. 112, 123-131. Núñez, J.I., Fussi, P., Borrego, B., Brocchi, E., Pacciarini, M.L. and Sobrino, F. (2005) Molecular epidemiology of the 1993 Italian foot-and-mouth disease outbreak. Arch. Virol. ISSN:0304-8608 (Paper) 1432-8798 (Online). DOI:10.1007/s00705-005-0585-y. Issue:Online First . Novella IS., Gilbertson DL, Borrego B., Domingo E., Holland JJ. Adaptability costs in immune escape variants of vesicular stomatitis virus.Virus Res. 2005 Jan;107(1):27-34.

Libros y capítulos de libros Carrasco, L., y Sobrino, F., Picornaviridae. En: Carrasco, L., y Almendral, J.M., (eds.). (2005) Virus patógenos. Editorial Hélice. Diplomas de Estudios Avanzados, 2005, (Dpto. Biología molecular, UAM):

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Raúl Postigo Fernández: funcionalidad de las proteínas no estructurales del VFA, y sus implicaciones en los fenómenos de virulencia y patogenicidad. Mónica González Magaldi: Análisis bioquímico y funcional de la proteína 3A del virus de la fiebre aftosa. Horacio Serrano: Análisis de la selección de variantes virales en animales inmunizados con vacunas sintéticas frente a la fiebre aftosa.

OTRAS ACTIVIDADES

Tutorías Seckin Soya, del Departamento de Ingeniería Genética de la Facultad de Ingeniería Universidad de Ege, Turquís. Julio 2005. (Belén Borrego)

Otros Belén Borrego: Miembro de la Comisión de Evaluación de Ganadería y Pesca de la ANEP (Agencia Nacional de Evaluación y Prospectiva) dentro del Programa Ramón y Cajal y Juan de la Cierva 2005.

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GRUPO DE INVESTIGACIÓN DE OTROS ORGANISMOS QUE REALIZAN ACTIVIDADES EN EL CISA-INIA

OPI.: CBMSO – CSIC

GRUPO DE INVESTIGACIÓN EN RESPUESTA INMUNE FRENTE A FIEBRE AFTOSA

COMPONENTES Díaz San Segundo, Fayna Ojosnegros Martos, Samuel Sanz-Ramos Rojo, Marta Sevilla Hidalgo, Noemí


OBJETIVOS Estudio de la respuesta inmune temprana frente al virus de la fiebre aftosa

(VFA) Interacción de VFA con células dendríticas (DCs). Estudio de la heterogeneidad de subpoblaciones virales en relación con sitios de

replicación in vivo.

PROYECTOS Código: AGL2004-00499 Título: Estudio de la respuesta inmune innata en la infección con el virus de la fiebre aftosa (VFA): papel de las células dendríticas y natural killer (NK). Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Sevilla Hidalgo, Noemí Principales resultados Con el objetivo de evaluar las características de la respuesta inmune temprana en hospedadores naturales, el cerdo, frente a la infección con VFA, se diseñó un experimento en el que 20 cerdos hembra Swiss White Landrace fueron inoculados con 105 UFP del VFA C-S8c1 y se fueron sacrificaron en grupos de 2 a distintos días post-inoculación (dpi): 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14 y 17 dpi. Cuatro cerdos se inocularon con PBS como animales control. Se obtuvieron PBLs (peripheral blood lymphocytes) y se marcaron con anticuerpos anti CD3, CD4, CD8 y CD21 conjugados a un fluorocromo para poder detectar las distintas poblaciones de linfocitos mediante citometría de flujo. Asimismo, utilizamos un anticuerpo anti proteína 3A del virus directamente conjugado por nosotros a un fluorocromo con el fin de detectar aquellas células que estuvieran infectadas por el virus durante el curso de la infección. Mediante esta técnica se observó que había una disminución drástica en el número de linfocitos, tanto T como B, en el pico de la replicación viral (entre 2 y 14 dpi), creando una ventana en la que el animal está inmunodeprimido y puede ser sensible a múltiples infecciones aún no estudiado en el caso de VFA. Por otra parte, el marcaje con una proteína anti VFA nos permitió

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detectar infección en linfocitos. Esto, para el caso de VFA, es la primera vez que se ha descrito, y parece ser que aplica únicamente al serotipo C (VFA tiene 7 serotipos distintos entre los cuales no existe protección cruzada) ya que otros serotipos evaluados, como O y A no infectan linfocitos. Nosotros hemos demostrado esta infección no sólo mediante citometría de flujo sino por ensayos de centros infecciosos en los que linfocitos purificados de cerdos infectados se cocultivaron con células BHK susceptibles a VFA, observándose placas de lisis resultante de la producción viral de estos linfocitos.

La linfopenia transitoria encontrada se podría atribuir a un “secuestro” de linfocitos en órganos linfoides. Para descartar esta posibilidad, se realizó inmunohistoquímica con marcadores de células T y B, obteniéndose una disminución significativa de linfocitos en órganos linfoides. Mediante técnica de TUNEL se descartó apoptosis en linfocitos como una posible explicación a la pérdida de los mismos, por lo que los datos apuntan a una muerte celular debido a infección viral pero que no implica apoptosis. La linfopenia y depleción linfoide detectada no era total en tanto en cuanto se encontraban linfocitos circulantes y en tejidos aunque en proporción mucho menor a los animales naive. La funcionalidad de estos linfocitos se determinó mediante ensayos de linfoproliferación en respuesta a estimulación con un mitógeno, en los que se determinó que estos linfocitos no eran capaces de proliferar. Todos los datos en conjunto apuntan a un estado inmunosuprimido de los animales comenzando a tiempos muy cortos pi, lo que sugiere que la respuesta inmune innata se encuentra comprometida en algún modo durante la infección de VFA. Este es uno de los puntos más importantes que se están analizando actualmente en mi laboratorio. De manera más concreta, nos estamos centrando en el efecto del virus sobre los linfocitos T, es decir, qué hace el virus en ellos para hacerles no funcionales.

Como otra línea de investigación en mi laboratorio nos estamos centrando en la interacción del VFA con células dendríticas, tanto in vivo como in vitro, aunque en este línea no tenemos resultados concluyentes todavía.

PUBLICACIONES

Artículos en Revistas SCI

Salguero, F.J., Sánchez-Martín, M.A., Díaz-San Segundo, F., de Avila, A. and Sevilla, N. (2005) Foot-and-mouth disease virus (FMDV) causes an acute disease that can be lethal for adult laboratory mice. Virology 332: 384-396. J. Andrade, J. T. Lam, M. Zamora, C. Huang, D. Franco, N. Sevilla, P. J. Gruber, J. T. Lu and P. Ruiz-Lozano (2205) Predominant fusion of bone marrow-derived cardiomyocytes. Cardiovasc Res. 68: 387-93.


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OTRAS ACTIVIDADES

Cursos Noemí Sevilla: tutora externo de la asignatura Estancias del 2º ciclo de la Facultad de Veterinaria Complutense de Madrid (200h)

Informes Noemí Sevilla, evaluación de proyectos de investigación:

• Convocatorias del Plan Nacional I+D+I • Evaluador externo del “Research Council Honk Kong Government”

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GRUPOS DE INVESTIGACIÓN DE OTROS DEPARTAMENTOS DEL INIA QUE REALIZAN ACTIVIDADES EN EL CISA-INIA

COMPONENTES Saiz Calahorra, Juan Carlos


OBJETIVOS 1. Colaboración para la experimentación “in vivo” en las instalaciones de BSL3

con el virus del Nilo Occidental (WNV), para llevar a cabo estudios de patogenicidad, viremia y de respuesta inmunológica en ratones gestantes y no gestantes


• Inoculación del virus del Nilo Occidental (West Nile Virus) en ratones gestantes y no gestantes. Además de determinar la mortalidad originada en los distintos grupos de ratones inoculados, también se procedió a la obtención de tejidos y sueros de los animales a distintos tiempos post-infección para, posteriormente, determinar los niveles de viremia y de anticuerpos

PROYECTO Código y título: AGL2004-06071 Título: Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Saiz Calahorra, Juan Carlos

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ANIMALARIO. PATOLOGÍA EXPERIMENTAL. PATOLOGÍA ANIMAL

COMPONENTES Benavente Pintor, Ángela Díaz Sansegundo, Fayna Salguero Bodes, Francisco Javier Sánchez Lobo, Iria Sánchez Martín, Miguel Ángel Toledo Olaya, Ana María Viva Álvarez, Francisco Viva Barroso, Emilio


OBJETIVOS 1. Apoyo clínico y veterinario. Colaboración científica y científico-técnica en

patología animal en experimentaciones “in vivo” de proyectos en ejecución o colaboración en el CISA.


• Apoyo a grupos de investigación que precisen del reactivo biológico animal de experimentación para sus fines científicos

• Colaboración científica y participación en proyectos I+D+I. • Responsable del Animalario ubicado en la zona de nivel de Seguridad 3,

realizando entre otras las siguientes actividades de carácter general: o Garantizar el bienestar de los animales presentes en la instalación en

todo momento:Alimentación; ambiente; trato humanitario, analgesia y anestesia; sacrificio con métodos humanitarios.

o Apoyo clínico y veterinario: Garantizar la salud de los animales mediante monitorización de las posibles enfermedades, haciendo cuarentenas, pruebas de laboratorio y observación.

o Gestión de los recursos humanos y materiales disponibles para el buen funcionamiento.

o Seguir las directrices de la Dirección del Centro, Oficina para la Seguridad Biológica y Comité de Ética en Experimentación Animal.

Principales resultados Durante el año 2005 se han llevado a cabo más de 30 ensayos de experimentación “in vivo”, procedentes de proyectos en ejecución en el CISA y/o colaboraciones con otras instituciones realizando la gestión necesaria para la realización de los mismos y realizando apoyo clínico y veterinario. Asimismo en una parte de los proyectos y colaboraciones se han realizado estudios de colaboración científica y científico-técnica en patología animal. Estos resultados han dado lugar a distintas publicaciones y se han presentado a diferentes reuniones y congresos de la especialidad.

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PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI Salguero F.J., Sánchez-Martín, M.A., Díaz-San Segundo, F., De Ávila, A., Sevilla N. Foot and Mouth disease virus causes an acute that can be lethal for adult laboratory mice. Virology 332/384-396/2005 Sánchez Cordón, P.J., Núñez, A., Salguero F.J., Carrasco L., Gómez-Villamandos J.C. Evolution of T-Lymphocytes and cytokines expression “in situ” during Classical Swine Fever . Journal of Comparative Pathology 132/249-260/2005 Núñez, A., Gómez-Villamandos, J.C., Sánchez Cordón, P.J., Fernández de Marco, M., Salguero, F.J., Carrasco, L. Expression of proinflammatory cytokines by hepatic macrophages in acute Classical Swine Fever. Journal of Comparative Pathology 133/23-32/2005. Castilla, J., Brun, A., San Segundo, F., Salguero FJ., Gutiérrez-Adán, A., Pintado, B., Torres JM. (2005). Vertical transmission of BSE prions evaluated in a transgenic mouse model. Journal of Virology 79, 8665-8669. Castilla, J., Gutiérrez-Adán, A., Brun, A., Pintado, B., Salguero, F.J., Parra, B., Díaz San Segundo, F., Ramírez, M.A., Rábano, A., Cano, M.J. and Torres, J.M., (2005). Transgenic mice expressing bovine PrP with a four extra repeat insert mutation show a spontaneous, non-transmissible, neurodegenerative disease and expedited course on BSE infection. Febs Letters 579: 6237-6246 Gutiérrez-Adán, A., Castilla, J., Brun, A., Ramírez, M.A., Salguero, F.J., Parra, B., Torres, J.M., Pintado, B., (2005). Transgenic models to study BSE. Transgenic Research 14:346-347.


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SERVICIO DE SECUENCIACIÓN

COMPONENTES Madueño Amor, Encarnación Nuero García, Oscar Correo electrónico: [email protected]

OBJETIVOS 1. Este servicio ofrece sus servicios a investigadores del Centro y de todo el

Instituto, así como a otros OPIs y empresas privadas.

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I El servicio de secuenciación del CISA presenta dos tipos de actividades principalmente: Secuenciación automática de DNA y Análisis de fragmentos de DNA. Incluidas en ambas técnicas está la obtención de DNA, purificación y cuantificación para su posterior análisis.

La secuenciación que se está realizando es de dos tipos:

• Microsecuenciación que incluye secuenciación simple ( obtención de secuencias puntuales muy útiles para los investigadores para comprobar la existencia de mutaciones, clonaje en el lugar adecuado, etc.) y secuenciación total de pequeños fragmentos de DNA mediante primer walking.

• Macrosecuenciación con este nombre se define la secuenciación de novo o la resecuenciación tanto de genomas como de grandes fragmentos de DNA. En ambos casos, esta actividad viene acompañada de la realización de otras técnicas previas como la sonicación del DNA en fragmentos más pequeños, subclonaje en vectores y preparación de DNA a gran escala.

Para la secuenciación se pueden utilizar cebadores universales, aportados por el servicio o cebadores específicos aportados por el usuario. Los reactivos y kits para la secuenciación son aportados por el servicio.

Se ofrece asistencia técnica para que el usuario pueda consultar cualquier duda sobre los procedimientos de secuenciación.

El análisis de fragmentos se aplica entre otros en el descubrimiento y validación de SNPs, detección de mutaciones, detección de heterocigotos, identificación de allelos, etc.

El servicio de secuenciación del CISA permite potenciar los estudios moleculares dirigidos a la diagnosis y prevención de patógenos animales de alto riesgo, exóticos y con gran impacto económico; así como también los estudios moleculares derivados de la investigación básica llevada a cabo por todo el personal investigador del INIA.

Pretende facilitar las actividades del CISA en el campo de la biología molecular en todos sus aspectos: identificación de aislados y nuevas cepas virales en caso de nuevos brotes epidémicos, estudios de filogenia viral, estudios de mutaciones virales, etc.

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Así mismo, participa en el desarrollo diagnóstico en sanidad animal, publicaciones y establecimiento de nuevas colaboraciones con otros centros de investigación.

Interviene directamente en los estudios de mejora genética de especies domésticas y la conservación de recursos genéticos animales ayudando a seleccionar los caracteres relacionados con la calidad de los productos, funcionalidad y resistencia a enfermedades.

Finalmente, está participando en estudios de detección e identificación de virus, viroides y fitoplasmas de especies vegetales de interés económico.

Principales resultados Durante el año 2005 se han realizado 236 registros que comprenden, 1613 reacciones de análisis de fragmentos, 2508 reacciones de secuenciación de ADN.

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SERVICIO DE SEGURIDAD BIOLÓGICA Y MANTENIMIENTO

Componentes Gómez Perochena, Elena Pascual Álvarez, Gonzalo


OBJETIVOS Este servicio atiende las necesidades surgidas en el CISA en cuanto a controles de seguridad biológica, mantenimiento de instalaciones y equipos, prevención de riesgos y controles externos de seguridad.

centro de investigaciÓn en sanidad animal (cisa) · almanza reyes, horacio esperón fajardo,...

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