chaperone-assisted crystallography(cac)
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Chaperone-Assisted Crystallography(CAC). Serdar Uysal University of Chicago, Department of Biochemistry and Molecular Biology ISFI. Outline. CAC concept and philosophy Chaperone scaffolds and phage display libraries HTP phage display library sorting CAC for high-hanging fruits. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Chaperone-Assisted Crystallography(CAC)
Serdar Uysal
University of Chicago, Department of Biochemistry and Molecular Biology
ISFI
Outline
• CAC concept and philosophy• Chaperone scaffolds and phage display
libraries• HTP phage display library sorting• CAC for high-hanging fruits
Chaperone-Assisted Crystallography (CAC)
Several different chaperones
Phasing Chaperone
Molecular Scaffolds
Fab (Herceptin) VH FN3
size (a.a.) ~220x2 ~130 ~95
libraries synthetic synthetic synthetic
affinity +++ ++ ++
expression 1~10 mg/liter ≥ 20mg/L ~100 mg/L
disulfide bonds 4 or 5 1 0
shelf life + +++ +++
crystallizationfriendly
++ + +
Phasing options MR MR + MAD MR + MAD
(U of C + Gtech)
(U of C)VH (Gtech)
Chaperone Library
Sorting
Chaperone Production
Crystallization & Structure Determinationof Target-Chaperone Complex
Targets
The Pipeline
Soluble proteins, RNAs, membrane proteins
Single Herceptin Fab Scaffold(i.e. no natural scaffold diversity allowed)
1L7I
1S781TZH
1TZI
1ZA3 2H9G
91 92 93 94 95 96
YS YS YS YS PL FILV
29 30 31 32 33 34
FILV YS YS YS YS IM
50 51 52 52a
53 54 55 56 57 58
YS I YS PS YS YS GS YS T YS
94 95 96 97 98 99 100
100a
100b
100c
101
R X X X X X X X AG FILM D
CDR-L3
CDR-H3
CDR-H2
CDR-H1
Synthetic Fab Libraries
X=Y,S,G (50%) and equal mixture of remaining amino acids
Why Y,S?
Library Sorting Pipeline 12 Targets in Parallel
1 week
1 weeks
1 week
1 week
Total: 4 weeks
Target validation and prep
automated sorting using a robot (3 rounds);
Confirm success of sorting
Transfer a mixture of clones to expression vector
HTP protein production and BIAcore assay
• 1H NMR analysis ("simple targets)• Phage binding• Biotinylation
• Expression level• Affinity
6 chaperones for each target
kon koff Kd
Fab(x104 s-1M-1) (x10-3s-1) (nM)
91 92 93 94 94a
94b
95 96 29 30 31 32 33 34 50 51 52 52a
53 54 55 56 57 58 94 95 96 97 98 99 100
100a
100b
100c
100d
100e
100f
100g
100h
100i
100j
100k
100l
100m
101
D10 18.2 <0.1 <1 Y Y S S - - L I I Y S S Y M Y I S S Y S G Y T S R E Y T Y G I G L - - - - - - - - - - - DD11 9.0 <0.1 <1 Y Y S S - - L F V Y Y S Y I S I S P Y S G Y T S R E S H Y G Y G L - - - - - - - - - - - DD12 20.0 0.5 2.3 S S Y Y S S L F V Y S S S M S I Y S S S G S T Y R L Y I E W N S Y S V D Y A M - - - - - DD13 10.6 0.7 6.6 S S Y Y S S L F V Y S S S M S I Y S S S G S T Y R L Y I E W N S Y S D Y A M - - - - - - DD14 10.8 7.7 70.7 S S S Y S S R I L Y Y S Y I S I Y P F Y G S T Y R G D Y Y S Y G L - - - - - - - - - - - D
D15 29.3 <0.1 <1 X X X X X X X X V Y S S S I S I Y S Y S G S T S R S S W Y S Y S F Y R G W V G L - - - - DD16 20.4 <0.1 <1 Y S S Y - - L I I S S Y S I S I S P S Y G S T Y R Y G L Y I Y S Y Q F Y F Y M Y G L - - DD17 20.1 0.8 4.2 S S S Y - - P F F S Y S S I S I Y S Y Y G S T S RX X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X- - - - - - - - - - - DD18 17.0 1.5 8.8 Y Y Y S S - L L I Y Y S S I S I Y P Y Y S Y T S R Y G Y S Y E Y G M - - - - - - - - - - D
D19 49.1 0.6 1.1 Y Y S S Y S L V F S S S Y I Y I S S Y S G S T S R Q W W G Y H G I - - - - - - - - - - - DD20 28.1 1.4 4.9 S Y S Y - - P F F Y Y S S I S I Y S Y Y G S T Y R P R G Y G G F A S G V N S S Y A L - - DD21 9.3 0.5 5.3 S S S Y S - L F L S S S Y I S I Y S S Y S S T Y R Y H S Q Y V R Y Y F W F S G A L - - - DD22 17.1 1.1 6.3 S Y Y S S - P I V Y S S Y M S I Y S S S S Y T S R W W L G G Y G I - - - - - - - - - - - DD23 6.1 0.4 7.0 Y S Y S Y S L L L S Y S Y I S I S S S Y S Y T S R S F Y R H P Y Y Y Y S Y E G F - - - - DD24 13.3 1.2 8.7 Y Y S Y - - P V V S S Y S I S I Y S Y S G S T Y R Y G G G Y Y Y E H N H Y Y Y G G Y A M DD25 26.0 2.7 10.5 S Y S Y - - P F I Y S Y S M S I Y S Y S G S T Y R Y Y E W N N G L - - - - - - - - - - - DD26 33.9 5.0 14.7 S Y S Y - - P F V Y S S S I S I Y S Y Y G S T Y R Y Y T Y W P Y I F R A I - - - - - - - D
D27 35.4 0.7 1.9 S Y Y Y - - P I V Y S Y Y M S I S S Y S S Y T S R E F S Y L W G Y G I - - - - - - - - - DD28 43.4 0.8 1.9 Y Y S S - - L F F S Y Y Y I S I S S Y Y G S T S R E Y Y G W G Y S A M - - - - - - - - - DD29 39.0 1.9 4.8 S Y Y S - - L L F S S S Y I Y I S P Y S G S T Y R E R Y D S W Y M A G I - - - - - - - - DD30 36.8 2.2 5.9 Y Y S S - - L F F Y Y S Y I S I Y P Y Y G S T Y R E N S H W G M S A M - - - - - - - - - DD31 25.0 1.5 6.0 S Y S S - - L L F S S Y Y I S I Y P S S G Y T Y R E R Y F I Y F Y N F W A M - - - - - - DD32 60.6 4.8 7.9 Y Y S S - - L F F S S Y Y I S I S S S S S Y T Y R E Y M N Y M L Q E A F - - - - - - - - DD33 20.0 2.2 11.2 S Y S S - - L F V Y Y S Y I S I Y S S S G S T S R E S H I Y M Y S V F W S G M - - - - - DD34 12.6 5.5 44.0 Y S S Y Y S L I I S S S Y I S I S P Y S S S T S R K R Y Y K M M S A L - - - - - - - - - D
D35 86.1 2.1 2.5 S S Y Y S S L L F S Y S S I S I Y S S S S S T S R S S S S P Y Y F Y S Y Y K M M - - - - DD36 61.2 1.8 3.0 S Y S Y S - P L I S Y S S I S I Y S S Y G S T Y R S Q S W Y Y K I Y Y S M A M - - - - - DD37 102.8 3.3 3.2 S Y S Y S - L V V S Y Y S M S I Y P S S S S T S R F S L W K I D G W Y P S Y Y K A L - - DD38 55.7 2.4 4.2 S S S S - - P F L Y Y S S I S I S P S S S Y T Y R R S G Y S V Y P S P G Y Y Y G M - - - DD39 63.1 3.0 4.8 S Y Y S Y - P I L Y S Y S M S I S S S Y G Y T S R Y G Y S G W Y P S Y Y G L - - - - - - DD40 33.0 3.0 9.0 S Y S Y Y S P V X X X X X X Y I S S Y Y S Y T S R S S S F W S W P H Y D Y D P A F - - - DD41 79.4 7.6 9.6 S S Y Y Y S P V F Y S S S I S I S P Y Y G S T S R Y G F G G V - - - - - - - - - - - - - DD42 16.9 7.0 41.4 Y S Y Y S - L F V Y Y Y S M S I S S Y S G Y T Y R G G S F Y A Y E Y W V D G I - - - - - D
CDR-L3 CDR-H2 CDR-H3CDR-H1
A
B
C
D
E
Fab clones for MCSG targets
Targets provided by H. Li, F. Collart, and A. Joachimiak (MCSG)
Benchmarking the Fab CAC pipeline with 17 MCSG Targets
Fellouse et al. JMB, in press
Successful Examples of CAC for High Hanging Fruits
Buried surface area: 1316 Å2
Crystal structure of FAB2-C209 (1.95 Å)
Jingdong Ye, Valya Tereshko, Joe Piccirilli
KcsA with Fab fragment
Crystal lattice of the KcsA+ channel in complex with a proteolytic FAB fragment (PDB code 1k4c)
KcsA
?8 binders produced
-5 0 5 10 15 20 25 30 35-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
-5 0 5 10 15 20 25 30 35-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
-5 0 5 10 15 20 25 30 35-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2A
u
Volume (ml)
KcsA:FAB2 1:1
KcsA:FAB10 1:1
KcsA wt (VVR)
-5 0 5 10 15 20 25 30 35
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
-5 0 5 10 15 20 25 30 35
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
-5 0 5 10 15 20 25 30 35
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
KcsA wt (VVR)
Au
Volume (ml)
KcsA:FAB2 2.5:1 KcsA:FAB10 2.5:1
-5 0 5 10 15 20 25 30 35
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
-5 0 5 10 15 20 25 30 35
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
-5 0 5 10 15 20 25 30 35
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
KcsA wt (VVR) KcsA:FAB10 1:2.5
Au
Volume (ml)
KcsA:FAB2 1:2.5
-5 0 5 10 15 20 25 30 35
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
-5 0 5 10 15 20 25 30 35
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
-5 0 5 10 15 20 25 30 35
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Au
Volume (ml)
KcsA wt (Sudha)
KcsA:FAB2 1:6 KcsA:FAB10 1:6
Res=3.7A°
Rwork=34%
Rfree=28%
Reinterpretation of Closed Conformation
Packing and Challenges
C-terminal domain at 2.6A°
2X Binding Fab_10
4X Binding Fab_2
4-Helix Bundle C-terminal Domain
Conclusions
• Synthetic libraries based on restricted AA diversity.• HTP pipeline for chaperone engineering.• High-affinity chaperones for membrane proteins,
functional RNAs and protein complexes.• Novel structures using the CAC strategy.
AcknowledgmentsThe Univ of ChicagoTony KossiakoffShohei Koide
Magda BukowskaVince CancasciKaori EsakiRyan GilbrethJames HornAkiko KoideBrenda LeungJames RaptisValya TereshkoJohn WojcikJingdong YeValeria Vazquez
Joe PiccirilliEduardo Perozo
Genentech, Inc.Dev Sidhu
Fred FellouseSara BirtalanPierre Barthelemy
UC Core FacilitiesFlow Cytometry FacilityDNA sequencing Facility
Advanced Photon Source/ANL
Funding: NIH (NIGMS, NIDDK), HHMI, UC Cancer Research Center
Tertiary complex