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Cinética Enzimática e Inhibición
Dr. José Luis Cárdenas LópezEnzimas de Productos Marinos
Semestre 2014-1
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¿Qué medimos en una rx enzimática?
E + S ES E+P
enzimática?
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[Producto] vs tiempo
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O… desaparición de reactante
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El steady state (eq. dinámico)E + S ES E+P
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Equilibrio dinámico
0][][ =−=
dt
ESd
dt
ESd
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En términos de tiempo…
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Usando el enfoque de steady state
][][ ESdESd
E+ S ES E+Pk1
k-1
k2
0][][ =−=
dt
ESd
dt
ESd
0=[E][S]k1 -[ES](k-1+k2)
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Requisitos:
1) Cantidades catalíticas de E ( [S]>>[E] )
2) Solo la velocidad inicial (t casi 0), por lo
que P es casi nulo, k-2 es despreciable
3) Steady state (equilibrio dinámico)
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0 =[E][S]k1 -[ES](k-1+k2)
ET= [E]+[ES]
[E]=ET-[ES]
0 =[ET-[ES]][S]k1 -[ES](k-1+k2)
[ET-[ES]][S]k1 =[ES](k-1+k2)
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ET [S]k1 -[ES][S]k1 =[ES](k-1+k2)
ET [S]k1 =[ES](k-1+k2)+ [ES][S]k1
E [S]k =[ES](k +k +[S]k )ET [S]k1 =[ES](k-1+k2+[S]k1)
ET [S]k1 =[ES]
(k-1+k2+k1[S])
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])[(
][][
121
1
Skkk
kSEES T
++=
−
][][
21 kk
SEES T
++
=− ][)(
1
21 Sk
kk+
+−
][)(
][][
1
21
22
Sk
kk
SEkESk T
++
=−
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][)(
][][
1
21
22
Sk
kk
SEkESk T
++
=−
k2 ET= Vmax
k [ES]= vk2[ES]= v
][
]max[
SKm
SVv
+=
1
21
k
kkKm
+= −
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][
]max[
SKm
SVv
+=
ecuación Henri -Michaelis- Menten
1][
max
+=
S
Km
Vv
1][
1
max +=
S
KmV
v
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Victor Henri , francés de padres rusos(6 Junio 1872 – 21 Junio 1940)
1903
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Leonor Michaelis , alemán(Enero 16, 1875 – Octubre 8, 1949)
Maud Leonora Menten , canadiense (Marzo 20, 1879 – Julio 26, 1960)
Biochemische Zeitschrift (1913;49:333–369)
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Michaelis-MentenV
eloc
idad
(mm
ol/m
l/seg
)
60
80
100 Velocidad maxima (Vmax)
[Substrato] mmol/ml
0 50 100 150 200 250
Vel
ocid
ad(m
mol
/ml/s
eg)
0
20
40
Km=1/2 Vmax
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Transformación de Lineweaver Burk
][
]max[
SKm
SVv
+=
Invirtiendo:Invirtiendo:
max
1
][
1*
max
1
VSV
Km
v+=
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Lineweaver-Burk
1/V
eloc
idad
(m
mol
/ml/s
ec)
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
1/Vmax
1/[Substrato] mmol/ml
-0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
1/V
eloc
idad
(m
mol
/ml/s
ec)
0.1
0.2
-1/Km
1/Vmax
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Gráfica Eddie Hoffste
][
]max[
SKm
SVv
+=
]max[])[( SVvSKm =+ ]max[])[( SVvSKm =+
][max
]max[][
S
vKmVv
KmvSVSv
−=
−=
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Vmax1
Vmax2-Km1
2 enzimas?
Vo/[S]o
Vo-Km2
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Parámetros importantes
• Vmax= velocidad máxima• Km= Constante de Michaelis Menten
(afinidad con el sustrato)• Vmax/Km=eficiencia fisiológica• Vmax/Km=eficiencia fisiológica• Turnover number (o kcat)= “numero de
recambio” es la cantidad en mol de sustrato (S) que seran convertidos a producto (P) por segundo
• Velocidad = conc de enzima (inicio de la rx)
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Molecularidad
• Cúantas moléculas hay en ambos lados de la reacción
• A� P 1 reactante, 1 producto (UNI-UNI)• A+B� P BI-UNI• A+B� P BI-UNI• A+B+C� P+Q TRI-BI • Etc.
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Velocidad (Tasa)
• Cantidad (en concentración en un momento dado)
• A+B � 2P
dt
Bd
dt
Adv
][][ −≅−≅
dt
Pdv
][≅
Desaparición de reactivo
aparición de producto
En: concentración/tiempo = M seg -1
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Orden de la reacciónMichaelis-Menten
Vel
ocid
ad(m
mol
/ml/s
eg)
60
80
100 Orden “cero”
[Substrato] mmol/ml
0 50 100 150 200 250
Vel
ocid
ad(m
mol
/ml/s
eg)
0
20
40
60
1er orden
Orden mixto
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Orden de la reacción
• Relación entre velocidad y concentración• A+B� P
nAv ][∝ nAv ][∝mBv ][∝
mn BAv ][][∝mn BAkv ][][= k= constante de la tasa (rate constant)
Representa la proporcionalidad
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Orden de la reacción
• Indican la relación de la velocidad de aparición de producto o desaparición de reactantes y las concentraciones de reactantes a un tiempo determinadoreactantes a un tiempo determinado
• Integrando ecuaciones diferenciales se llega a ecuaciones que nos pueden decir la relación a cualquier tiempo de la reacción
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Orden 0
• La aparición de producto o desaparición de reactantes (según se mida la actividad) es independiente de la [reactantes]
dPdAPA
k
→dt
dPk
dt
dA ==−
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Gráficamente
[pro
du
cto
] (M
)
Tiempo (seg)
Pendiente = k = 0.22 M seg-1
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1 er Orden
• La aparición de producto o desaparición de reactantes (según se mida la actividad) depende de la [reactantes]
PAk
→dt
dPkA
dt
dA ==−
Integrando: ktPA
A =− )()(
)(log3.2
0
0
Donde Ao es la concentración inicial de reactante y P es la concentración de producto a tiempo t
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Para calcular kTiempo (seg) So-P = S (mM) P (mM) So/S ln So/S
0 9.00 0 -
300 8.55 0.45 1.052 0.0506600 8.12 0.88 1.108 0.1025900 7.71 1.29 1.167 0.1544900 7.71 1.29 1.167 0.1544
1200 7.32 1.68 1.229 0.20621500 6.95 2.05 1.294 0.25771800 6.60 2.40 1.363 0.3096
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Gráficamente
Ln (
So/
S) 0.10
0.12
0.14
0.16
Tiempo (seg)
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
Ln (
So/
S)
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
Pendiente = k= 1.7 x 10-4 seg-1
OJO: Unidades
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Reacciones multisustrato
• Nomenclatura Cleland (U Wisconsin)
E + S ES E+P
E
S P
EES EP
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2 sustratos 2 productosE+A+B E+P+Q
VARIAS POSIBILIDADES
1)primera
E
A P
EEAB EPQ
Q
EA EQ
B
Dos entran, dos salen, 2 sustratos, 2 productos (Bi-Bi)A entra primero, P sale primero “BI-BI ORDENADO”
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E
A
EEAB EPQ
EA
B
EB
P
EQ
Q
EP
2)
B A Q P
El orden de entrar salir es aleatorioBI-BI ALEATORIO
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E
A P
EFP F FB
Q
EA EQ
B
3) Tercera posibilidad
E EFP F FBEA EQ
La Enzima se convierte (F) durante la rxLos sustratos no se unen al mismo tiempo, un producto sale antes de que el segundo entreBI-BI PING-PONG
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¿Cómo distinguirlas?
• Union secuencial – Ordenada– Aleatoria– Ping-Pong– Ping-Pong
• Graficar 1/v vs 1/A a varios niveles de B
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Secuenciales
1/vB
1/[A]
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1/v B
Ping-Pong
1/[A]
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Inhibición
• Irreversible• Reversible
– Competitiva– No competitiva– No competitiva– Acompetitiva– Parcial
• Competitiva• No competitiva
– Mezclada• 3 Tipos (β=0, β=0 y α=β)
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Inhibición Competitiva
Et = E+ES+EI
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)][
1(´
Ki
I
Km
Km +=
max
1
][
1*)
][1(
max
1
VSKi
I
V
Km
v++=
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Inhibición no competitiva
Et = E+ES+EI+EIS
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)][
1(_
_
Ki
I
opendiente
inhpendiente +=
Grafica Dixon
)][
1(max
1
][
1*)
][1(
max
1
Ki
I
VSKi
I
V
Km
v+++=
Grafica Dixon
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Inhibición acompetitiva
E + S ES E+P
+ I
Et = E+ES+ESI
ESI
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1/Vo
control
[I]1
[I]2
>[I]1/Vmax (1+[I]/Ki)
1/[S]
1/Vmax
-1/Km
)][
1(max
1
][
1*
max
1
Ki
I
VSV
Km
v++=
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Inhibición parcial
• Competitiva
E + S ES E+P
+ I+ I
Ks][
]][[
ES
SEKs =
]][[ IEKi =
Et=E+EI+ES+ESI
ESI
+ I+ I
EI +S EI+PαKs
Ki αKi
][
]][[
ESI
SEIKs =α
][
]][[
ESI
IESKi =α
][
]][[
EI
IEKi =
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Parcial competitiva
• El sustrato y el inhibidor se unen en diferentes sitios activos, ES, EI y ESI
• El sustrato se une mejor a la enzima sola que a la EIque a la EI
• Tanto ES como ESI van a producto…
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Gráfica diagnóstica
1/vI
[I]=∞ pendiente α Ks/Vmax
[I]=Ki
1/[S]
[I]=0 pendiente Ks/Vmax
[I]=Ki
-1/Ks
-1/αKs
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Ki
I
Ks
SKsKi
IS
Ks
S
V
v
][][1
]][[][
max ++
+= α
][
][
max I
S
V
v =
][
)][
1(
)][
1(max
S
Ki
IKi
I
Ks
V
++
+=
α][
][
max SKs
S
V
v
aparente +=
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Inhibición parcial
• No Competitiva
E + S ES E+P
+ I+ I
Ks
Et=E+EI+ES+ESI
kp
ESI
+ I+ I
EI +S EI+PKs
Ki Ki
βkp
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Parcial no competitiva
• El sustrato y el inhibidor se unen en diferentes sitios activos, ES, EI y ESI
• El ESI va a producto pero no tan efectivamente como ESefectivamente como ES
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Gráfica diagnóstica
1/vI
[I]=∞ pendiente Ks/βVmax
[I]=Ki
1/[S]
[I]=0 pendiente Ks/Vmax
[I]=Ki
-1/Ks
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)][
1(
)][
1(
][
)][
1(
)][
1(
][
max
Ki
IKi
I
S
Ki
IKi
I
Ks
S
V
v
ββ +
++
+
+=
KiKi
][
][
max SKs
S
V
v
+=
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El resto
• No es tan complicado…como parece…• Consultar capítulo 4 del libro
– Enzyme Kinetics. Segel, I (1975) Wiley Int.
• Si alguien gusta consultarla, yo tengo una • Si alguien gusta consultarla, yo tengo una copia del libro, o buscarla en la biblioteca
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Inhibición irreversible
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Inhibición irreversible
• No específicos– Modificación química, son importantes para detectar
los grupos que están presentes en el sitio activo:– Lys DNFB (dinitrofluorobenceno), Cys iodoacetato,
bromo, MMTS (sulfonato de metilmetanotiol)• Etiquetadores de “afinidad” o reactivos dirigidos • Etiquetadores de “afinidad” o reactivos dirigidos
al sitio activo– Reactivos que tienen afinidad por el sitio activo– TPCK, glicidolfosfato, FSBA (benzoil-adenosina de
fluorosulfonilo)
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• Etiquetadores de fotoafinidad (activados con UV)– 8 azida ATP, 5 azida UTP
• Reactivos suicidas (se activan con la catálisis)• Reactivos suicidas (se activan con la catálisis)– Anhidrido isatoico, ciclopropil benzilamina– También se les llama “basados en el mecanismo”
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Algunos ejemplos de modificaciones químicas
Clase/grupo Rx reactivo Propósito
nucleófilonucleófilo
Lys –NH2 Sustitución nucleofílica
O-metilsoureaDinitrofluorobenceno(DTNB)
Bloquear -NH2
(DTNB)
Cys-SH alquilación IodoacetatoIodoacetamidabromo
No específicas para Cys, sino para nuc:
His imidazol acilación dietilpirocarbonato Lys, Tyr
Arg guanidino Adición a carbonilos 2,3 butano diona
electrófiloelectrófilo
Asp, Glu Formación de amida Amina + carbodiimida
aromáticos Yodinación I2, I3-, ICl His, SH,
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Algunos ejemplos de etiquetas de afinidad
Etiqueta de afinidad Enzima Cadena lateral modificada
Tosilfenilalaninaclorocetona(TPCK)
Serinaproteasas
Serina del sitio activo
Glicidol fosfato Triosafosfatoisomerasa,
Etiqueta nucleófilos o bases generales en el sitio activoisomerasa,
enolasagenerales en el sitio activo
Fluorosulfonilboenzoiladenosina(FSBA)
deshidrogenasas
NAD(P)H del sitio activo
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Algunos ejemplos de etiquetas de foto-afinidad
Etiqueta de afinidad Enzima Cadena lateral modificada
8 azido ATP recA proteina tirosina
8 azido cAMP Ribonucleasa A pancreática bovina
treonina
bovina
5 azido UTP UTP glucosa pirofosforilasa
![Page 67: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022021608/5bf0950609d3f2fb7d8b5bfb/html5/thumbnails/67.jpg)
Algunos ejemplos de reactivos suicidas
Reactivo suicida Enzima Cadena lateral modificada
Anhidrido isatoico quimiotripsina Serina del sitio activo
Ciclopropil benzilamina Monoamina oxidasa flavina
Adenosina 2,3, riboepóxido5 trifosfato
β galactosidasa metionina
![Page 68: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022021608/5bf0950609d3f2fb7d8b5bfb/html5/thumbnails/68.jpg)
Cooperatividad y alosterismo
![Page 69: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022021608/5bf0950609d3f2fb7d8b5bfb/html5/thumbnails/69.jpg)
Alostería
Bajo [S] Alto [S]Cambio de conformación
Se presenta en enzimas multisubunidades los sitios activos se comunicanLas enzimas cambian de forma, cambian su reactividad
Alo (otro) Steria (forma)
Kd1Kd2
Kd1 > Kd2 S adicional favorece los cuadros, que se unen mejorpor lo que sera cooperatividad positiva
Kd1 < Kd2 S adicional favorece los cuadros, que se unen peorpor lo que será cooperatividad negativa
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![Page 71: Cinética Enzimática e Inhibición - dipa.unison.mx · Cinética Enzimática e Inhibición Dr. José Luis Cárdenas López Enzimas de Productos Marinos Semestre 2014-1](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022021608/5bf0950609d3f2fb7d8b5bfb/html5/thumbnails/71.jpg)
¿Como medirla?
max1.0_][
max9.0_][
VVaqueproduzcS
VVaqueproduzcSRs
===
Rs = Factor de cooperatividad
max1.0_][ VVaqueproduzcS =
Cooperatividad positiva Rs < 81Cooperatividad negativa Rs > 81Comportamiento MMenten Rs 81
Demostrar esto
Ejercicio:
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Michaelis Menten
][
][9.0
max
max9.0
SKm
S
V
v
Vv
=++
==
=
][1.0][1.0
][
][1.0
max
max1.0
SKmS
SKm
S
V
v
Vv
=++
==
=
][9
][1.09.0
][9.0][9.0
SKm
SKm
SKmS
==
=+
][9
1
][9.01.0
][1.0][1.0
SKm
SKm
SKmS
=
==+
81
9
1
9 ==Km
KmRs
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Otra forma de determinar el Ki
• El Ki es sumamente importante• Es análogo al Km, concentración de
inhibidor tal que da la mitad de la inhibición (mitad de la velocidad máxima)inhibición (mitad de la velocidad máxima)
• Si es una droga nueva ¿qué se buscará con respecto al Ki?
• Ki>Km…?• Dixon buscó maneras gráficas de
determinarla
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Inhibición competitivaVariar la [I], manteniendo fijas las [S] (en varios niveles)
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Inhibición no competitiva
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IC50
• El IC50 es una medida muy usada en diseño de drogas
• Corresponde a capacidad inhibitoria al 50% (mide potencia del inhibidor)50% (mide potencia del inhibidor)
• que tanta cantidad del inhibidor es necesaria para reducir a la mitad el proceso (Rx enzimática, aunque es más amplia su aplicación)
• Tiene relación con el Ki
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Para los diferentes casos de inhibición
competitiva
No competitiva
acompetitiva
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pIC50
• A veces se usa un valor p análogo al pH o al pKa, es:
• pIC50 = -log10 (IC50)• Se usa para expresar la potencia de la • Se usa para expresar la potencia de la
droga en valores exponenciales y generalmente es en M (molar)
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Inhibición por sustrato
• A [S] altas se inhibe la rx enzimática• La gráfica de HMM, no da una hipérbola
sino una campana• La gráfica de LB por lo tanto no da una • La gráfica de LB por lo tanto no da una
recta
v
[S]
1/v
1/[S]
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Explicaciones posibles
1. La Enzima puede tener 2 sitios de unión para el mismo S– El sitio catalítico y el sitio de inhibición
2. Hay dos configuraciones reversibles 2. Hay dos configuraciones reversibles entre sí– Activa (Ea) e Inactiva (Ei)
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Mecanismo
Ea Ei+ +
< S > S
EaS EiS XEa + P
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ejemplo
Glucosa 6 fosfato +ADP Glucosa +ATPhexoquinasa
Si la G6P está en alta concentración, se inhibe la rx