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Citometría de flujo
Introducción: Fundamentos
Dra. Edith Cortés Barberena
Departamento de Ciencias de la Salud 1
Fundamentos
Sistema de fluidos
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¿Qué población es la de mayor tamaño? ¿Cómo se sabe esto?
Dispersión de luz por la célula en células de sangre Dispersión de luz por la célula en células de sangre completa lisadacompleta lisada
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Corriente de la
muestra
Fuente de luz
Sistema óptico (Filtros ópticos)
Tamaño
Complejidad
Verde
Rojo
Detectores
Gráficas para análisis
Punto de
interrogación
Fluido
envolvente
SISTEMAS INTEGRANTES
DE UN CITÓMETRO DE
FLUJO
Amarillo
Sistemas que componen un Citómetro de Flujo:
Sistemas que componen un Citómetro de Flujo:
• Fluidos:
• Ópticos:
• Electrónicos:
Los avances en cada uno de estos sistemas hapermitido el desarrollo de citómetros conmayores capacidades en la medición de células.
• Fluidos:
• Ópticos:
• Electrónicos:
Los avances en cada uno de estos sistemas hapermitido el desarrollo de citómetros conmayores capacidades en la medición de células.
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Sistemas que componen un Citómetro de Flujo:
Sistemas que componen un Citómetro de Flujo:
• Fluidos: Para introducir y alinear a lascélulas para ser medidas.– Aire: Actualmente no se usa.
– Líquidos
• Fluidos: Para introducir y alinear a lascélulas para ser medidas.– Aire: Actualmente no se usa.
– Líquidos
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Sistema de fluidosSistema de fluidos
Bomba de aire
Reguladorde fluido
Filtro
Celda de flujo
Depósito de fluido
Filtro de aire
Regulador dela muestra
Tubo de muestra
Desperdicio
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Hay dos tipos de cámaras
AbiertasCerradas
Dirección del flujo
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Punto de interrogación
Punto de interrogación
Punto de interrogación
Sistema de equipos BD
Los citómetros BD usan este tipo de cámara
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SISTEMA DE INYECCIÓN DE MUESTRASISTEMA DE INYECCIÓN DE MUESTRA
Flujo de la muestraFlujo de la muestra
Tubo externoTubo externo
Dirección del Dirección del flujo de laflujo de lamuestramuestra
Tubo internoTubo interno
AireAire
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Cámara tipo BD
Cerradas
Láser
Fluido
envolventeFluido de la muestra
Punto de
interrogación
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• Este tipo de sistema de fluidos permite el paso suave, continuo y no pulsátil de la muestra.
Velocidad alta (60µL/min) Velocidad baja (12µL/min)
Flujo de la muestraFlujo de la muestra
La diferencia depresión entre losfluidos ayuda aalinear a lascélulas frente alláser.
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Otros sistemas de fluidos
Otros controles de fluidos
• Otros equipos usan bombas peristálticas en combinación con frenos de fluidos y microprocesador para controlar directamente el fluido de la muestra.
• Ventaja: Disminución de costos. Compacto. Mantenimiento de bajo costo. En parte lo hace el usuario.
• Desventaja: Se obstruye frecuentemente.
Cambios en SIP
Tubo externo de acero inoxidable (como los otros). Tubo interno de polímero que baja al fondo del tubo.
Sistema de retro-alimentación dual en el diseño fluídico que controla la velocidad del flujo envolvente.
Ventajas: El cambio en el SIP asegura que se tome toda la muestra.
Se asegura la estabilidad del flujo de la muestra con el control del flujo envolvente.
Desventajas ¿?
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Otros sistemas de fluidos
Otros cambios en el SIP
• El inyector de aire está separado del tubo inyector.
• Hay dos electrodos con diferentes alturas que detectan el volumen de la muestra leída.
• Ventaja: Se puede hacer conteo celular (céls/ml).
• Desventajas: ¿?
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ElectrodoInyector de
aire
Tubo
inyector
de la
muestra
Tubo de
la
muestra
Electro
do
Otros sistemas de fluidos:
Celda de flujo microcapilar
• Se modifica para evitar el uso del flujo envolvente.
• Ventaja: Sistema compacto. Se usan menos células. Se producen menos desechos. El usuario puede remover la celda para la limpieza (menor costo de mantenimiento)
• Posible desventaja: Que se tape muy seguido la celda.
Enfoque acústico.
• Las células son enfocadas en una sola línea por ondas sonoras al pasar por una pieza que produce ultrasonido.
• Ventajas: Permite una mayor amplitud de concentración celular. Aumento o disminución de velocidad del fluido sin afectar alineación. Compacto.
• Desventaja: ¿?
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Demostración de alineación acústica (enfoque)
Enfoque acústico apagado (OFF).
Muestra desalineada.
Enfoque acústico encendido (ON).
Muestra alineada
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Fundamentos
Sistema óptico
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Características de Características de Análisis: LuzAnálisis: Luz
Dispersión de la luz
(Tamaño y Complejidad)
Fluorescencias:Fluorescencias:
FL1FL1, , FL2FL2, , FL3FL3, , FL4FL4, , FL5FL5….….
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Dispersión de luz por la célulaDispersión de luz por la célula
Luzdelláser
Luzdelláser
Dispersión lateral(SSC)
Dispersión lateral(SSC)
Dispersión frontal(FSC)
Dispersión frontal(FSC)
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¿Cómo se identifican otras características?
• Uso de anticuerpos u otras proteínas conjugadas con fluorocromos.
• Intercalantes de ADN fluorescentes.
• Fluorocromos sensibles a pH, especies reactivas de O, etc.
• SE REQUIERE GENERAR UNA SEÑAL FLUORESCENTE.
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Colorantes FluorescentesColorantes FluorescentesColorantes FluorescentesColorantes Fluorescentes
FITCFITCFITCFITC
PEPEPEPE
PerCPPerCPPerCPPerCP
APCAPCPara detectar a losanticuerpos unidos a lascélulas, se requiere el usode fluorocromos.
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Sistemas que componen un Citómetro de Flujo: Óptico.Sistemas que componen un Citómetro de Flujo: Óptico.
• Óptica de excitación: Una fuente deexcitación para generar las señales.
• Óptica de colección: Filtros de luz quepermiten el paso luz en longitudes de ondaespecífica y refleja aquella que seadiferente.
• Óptica de excitación: Una fuente deexcitación para generar las señales.
• Óptica de colección: Filtros de luz quepermiten el paso luz en longitudes de ondaespecífica y refleja aquella que seadiferente.
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Sistemas que componen un Citómetro de Flujo:
Sistemas que componen un Citómetro de Flujo:
• Óptica de excitación: Comprende unafuente de excitación para generar lasseñales de luz y lentes para enfocar la luzen el punto de interrogación.
• Fuentes de luz:– Láseres: Argón, kriptón ion, HeNe, etc.
– Lámparas de arco (como los microscopios defluorescencia): Mercurio y mercurio-xenón.
• Óptica de excitación: Comprende unafuente de excitación para generar lasseñales de luz y lentes para enfocar la luzen el punto de interrogación.
• Fuentes de luz:– Láseres: Argón, kriptón ion, HeNe, etc.
– Lámparas de arco (como los microscopios defluorescencia): Mercurio y mercurio-xenón.
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Fuentes de luz
• Se requiere que emita un número relativamente grande de fotones.
• ¿Por qué?
– Un tercio de la luz colectada se pierde en los filtros ópticos.
– Los detectores de diodo solo convierten la mitad de la señal luminosa a electrónica, mientras que los fotomultiplicadores solo un cuarto.
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Características de las fuentes de luz.
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Lámparas de arco y filamento, LEDs
• Requieren filtros para seleccionar la longitud de onda deseada.
• Luz dispersa en todas direcciones.
• Son insuficientes para la fluorescencia débil.
• Son una alternativa barata.
• Principal aplicación: cuantificación de ADN.
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Láser
• Una sola longitud de onda.
• Rayo de un punto pequeño. Iluminación uniforme.
• La mayoría producen entre 10 a 25 mW.
• Enfriamiento depende del poder del láser:
– 10 a 25 mW, enfriamiento por aire.
– 200 mW, enfriamiento por agua.
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Láser
• Alineamiento del láser solo por personal del proveedor.
• Si se dañan, el costo del cambio es alto.
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Óptica de excitación
Laser Longitud de onda
Fluorocromos
Azul
Argon-ión
488 nm FITC, PE, PerCP, PerCP-Cy5
Rojo
Diodo
635 nm APC
Violeta 407 nm Pacific Blue, Alexa Fluor 407 y
430, otros.29
Lente de enfoque
Fotodetector
Filtro de barrera
Filtro dicroico
Celda
FL1 verde
SSC azul
FL2 naranja
FL3 rojo
FSC azulLáser
Esquema general del sistema óptico
30
6
Lente de enfoque
Fotodetector
Filtro de barrera
Filtro dicroico
Celda
FL1 verde
PMTSSC
PMTFL2
PMTFL3
FSC azulLáser azul
Esquema general del sistema óptico
PMTFL4
Láser rojo
Filtros de luz y semi-espejos (lentes dicroicos)
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Longpass (LP)De longitud amplia
Shortpass (SP)De longitud corta
BandpassDe intervaloAncho de banda
500 520 480 500 520
*¿Creían que era paso de banda? ¡A bailar!
500400 600 500400 600 500400 600
480
500
520
LP500 SP500 500/50
Óptica de adquisición
Detector Filtro Color Fluorocromos
FL1 530/30 nm
Verde FITC
FL2 585/42 nm
Amarillo-naranja
PE
FL3 670nm LP Rojo PerCP, PerCP-Cy5.5
FL4 661/16 nm
Rojo-naranja APC
33 Celda de flujoCelda de flujo
Láser de 488nmLáser de 488nm
SSC
FL1
FL3
FL4
FL2
Lente de enfoqueLente de enfoque 488/10488/10Diodo de FSCDiodo de FSC
530/30530/30
488/10488/10
585/42585/42
661/16661/16
670LP670LP
Divisor de haz 90/10Divisor de haz 90/10
Láser de diodo rojoLáser de diodo rojo
Espejo dicroico 560SPEspejo dicroico 560SPEspejo dicroico 640LPEspejo dicroico 640LP
Semi-espejo Semi-espejo
*Modificado del manual
del FACSCalibur
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Cambios en la óptica
Diseño de pastel
• Arreglo de fotomultiplicadores en forma de pastel.
• Se reemplazan los lentes de enfoque y se disminuye el número de semi-espejos.
• Incrementa la captación de la luz al evitar la pérdida.
• Se reducen los problemas de la alineación de los láseres.
• Sistema muy compacto.
Diseño octagonal
• Láseres
• Lentes para moldear y enfocar los láseres
• Uso de fibra óptica.
• Se simplifica el cambio de filtros y espejos.
35Arreglo octagonal
D
F
H
AC
B
E
G
Señal del láser azul
Fibra óptica Filtro de
intervalo
Filtro dicroico
36
7
Citometría de flujo
Sistema electrónico: Detección de señales
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Sistema electrónico
Convierte las señales ópticas a señales electrónicas usando detectores de luz y amplificadores de señal.
•Cada medida tomada de cada detectores referida como un parámetro.
•Los datos son adquiridos como unalista de valores de cada parámetro(variable) por cada evento (célula)
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Láser
Dispersión lateral (SSC)
Dispersión frontal (FSC)
FotodiodoFotodiodo
Filtro
Señales generadas al incidir el láser en la célula
39Celda de flujoCelda de flujo
Láser de 488nmLáser de 488nm
SSC
FL1
FL3
FL4
FL2
Lente de enfoqueLente de enfoque 488/10488/10Diodo de FSCDiodo de FSC
530/30530/30
488/10488/10
585/42585/42
661/16661/16
670LP670LP
Divisor de haz 90/10Divisor de haz 90/10
Láser de diodo rojoLáser de diodo rojo
Filtro 560SPFiltro 560SPFiltro 640LPFiltro 640LP
Semi-espejo Semi-espejo
Detectores: PMT
Detector: Diodo
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Detección de señales
Tiempo Tiempo Tiempo
Láser Láser Láser
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Fotodiodo
• Es un semiconductor.
• Sensible a la luz.
• No requiere de fuente de poder externa para funcionar.
42
8
Detección de la dispersión de luz frontal
Láser
FITCFITC
PEPE
FSC
SSC
FotodiodoFotodiodo
Filtro
El detector de FSC convierte luz dispersada hacia delante en un pulso de voltaje proporcional al tamaño de la célula o partícula. 43
Tiempo
FS
C
Fotón
Fotodiodo
LIN
LOG
LIN
Pulsos en voltaje
Conversión de las señales ópticas en señales proporcionales electrónicas.
NivelesLevels
E00E01E02E03E-1
Pre-amplificador
FACSCalibur
Parámetro FSC
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El detector de El detector de FSCFSC convierte luz convierte luz
dispersada hacia delante en un pulso dispersada hacia delante en un pulso
de voltaje proporcional al tamaño de la de voltaje proporcional al tamaño de la célula o partícula.célula o partícula.
Láser
Dispersión lateral (SSC)
Dispersión frontal (FSC)
FotodiodoFotodiodo
Filtro
Dispersión lateral y fluorescencia
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El detector de SSC convierte la luz dispersada lateralmente en un pulso de voltaje proporcional al contenido en orgánulos membranosos (granularidad).
Fotomultiplicador (PMT)
Componentes electrónicos para generar el gradiente de voltaje
- - - --
- -- -
- --
--- --
Tubo al vacíoFotocátodo Electrones
Suministro de alto voltaje
Dinodo
Salida de la corriente de la señal
Modificado de Bogh y Duling, 1993. 46
Partes de un tubo fotomultiplicador (PMT)
• Fotocátodo.
• Sistema de entrada electro-óptica.
• Multiplicador de electrones.
• Ánodo.
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Tiempo
SS
CF
L4
FL
1F
L2
FL
3
Fuente de poder del PMT
Fotón
Salida de la señal
Voltaje150-999 v
LIN
LOG
LOG
Pulsos en voltaje
Conversión de la señales ópticas en señales proporcionales electrónicas.
ParámetroParameter
SSCFL1FL2FL3FL4
48
9
Tiempo
Volt
s
Cuantificación de un pulso de voltaje.
Altu
ra d
el p
uls
o
Ancho del pulso
Área del pulso
Ancho del pulso
Área del pulso
49
Láser LáserCélula
Tiempo Tiempo Tiempo Tiempo Tiempo
SS
C
FS
C
FL
1
FL
2
FL
3
Convertidor análogo-digital 0.01v/canal
Interfase GP10
10000
Análisis de la altura del pulso
Análisis de la altura y conversión digital.
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Amplificación de señales
• Lineal• (intervalos regulares)
• apropiada para:
– Señales que oscilan enun intervalo limitado(0-1,000)
– Con distribuciones conpicos estrechos comoel contenido en DNA.
• Logarítmica• (intervalos crecientes)
– Cubre un intervalo másamplio de variación dela señal (0-10,000). 51
Sistema electrónico
•La conversión de la señal de voltaje analógico adigital da como resultado valores que son mostradosen un eje dividido en canales.
•Cada canal corresponde a un valor de voltaje de laseñal.
2560 64 128 1920 64 128 192 25652
Sistema electrónico: Datos
Event Param1
FS
Param2
SS
Param3
FITC
Param4
PE
1 50 100 80 90
2 55 110 150 95
3 110 60 80 30
Datos de adquisición en modo de lista
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Sistema electrónico: visualización
Los datos se muestran en forma de una gráfica a través de un programa (software).
Parámetro 1
Par
ámet
ro 2
54
10
Análisis de datos
O como se pueden visualizar los datos.
55
Vocabulario
• Parámetro: Característica física o química de una célula.
– Intrínseca: Se obtiene sin necesidad de reactivos. Ej. Desviación de luz, autofluorescencia.
– Extrínseca: Se usan reactivos para revelarlos.
Por cierto, se le dicen pruebas al uso de reactivos en citometría.
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Histograma
Histograma de side scatter (90°) de una muestra de
sangre lisada y marcada con anticuerpos
fluorescentes. Shapiro, 2004.
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Gráficos de punto (Dot plots)
• Se obtienen gráficos por combinación de dos parámetros.
• Mejor visualización de poblaciones.
• En este ejemplo se grafican linealmente la desviación frontal y la lateral de luz.
Linfocitos
Monocitos
Granulocitos
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Picos y valles
• Una manera que era muy utilizada es el histograma de dos parámetros.
• En este ejemplo se grafica SSC y la fluorescencia en escala logarítmica.
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Gráficas de punto tridimensionales
• Shapiro les llama gráficos de nube.
• Es difícil interpretar estas gráficas.
• Una población puede quedar cubierta por otra.
60
11
Gráfica de densidad
• Los colores o la intensidad de un color indican abundancia de eventos.
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Gráficos de contorno
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Gate
• ¿Qué es un “gate”?
• ¿Qué significa hacer un “gating”?
Linfocitos
Monocitos
Granulocitos
Tamaño relativoTamaño relativo
Com
ple
jid
ad
rela
tiva
Com
ple
jid
ad
rela
tiva
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Con “gating”
Gate
• Se puede definir como la selección de una región de análisis para visualizar una población en otra gráfica y parámetros.
Linfocitos
Monocitos
Granulocitos
Tamaño relativoTamaño relativo
Com
ple
jid
ad
rela
tiva
Com
ple
jid
ad
rela
tiva
T
BSin “gating”
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Vocabulario
• Citometría multiparamétrica: Se realizan mediciones simultáneas de un número de diferentes substancias en las células.
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Vocabulario
• FSC: Desviación de luz frontal o de ángulo pequeño. Las siglas se derivan de las palabras en inglés “forward scattering”.
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Vocabulario
• SSC: Desviación de luz lateral, ortogonal, 90° o de ángulo amplio. Las siglas se derivan de las palabras en inglés “side scattering”.
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¿Qué es la fluorescencia?¿Qué es la fluorescencia?¿Qué es la fluorescencia?¿Qué es la fluorescencia?
LasLas moléculasmoléculas fluorescentesfluorescentes tienentienen lala capacidadcapacidad dedeabsorberabsorber energíaenergía dede lala luzluz.. SeSe lesles conoceconoce comocomofluorescenciafluorescencia oo fluoróforofluoróforo..
ElEl fluorocromofluorocromo liberalibera lala energíaenergía enen formaforma porpor::••VibraciónVibración yy disipacióndisipación dede calorcalor..
LasLas moléculasmoléculas fluorescentesfluorescentes tienentienen lala capacidadcapacidad dedeabsorberabsorber energíaenergía dede lala luzluz.. SeSe lesles conoceconoce comocomofluorescenciafluorescencia oo fluoróforofluoróforo..
ElEl fluorocromofluorocromo liberalibera lala energíaenergía enen formaforma porpor::••VibraciónVibración yy disipacióndisipación dede calorcalor..
488 nm
Energía de luz incidente
Energía de luz incidente
> 530 nm
Estructura en común 68
Vocabulario
• Fotoblanqueamiento: El fotón blanquea una molécula fluorescente por rompimiento de un doble enlace.
488 nm
Energía de luz incidente
No hay fluorescencia.
Estructura en común
Se rompe el doble enlace.
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