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Institut d'Investigació Sanitària de Palma (IdISPa)
Plataforma Citometría y cultivos celulares
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Descripción Plataforma
Citometría de flujo
Introducción
Análisis: características analizador y aplicaciones
Sorting: características sorter y aplicaciones
Nuevas aplicaciones
Cultivos celulares
2
ÍNDICE
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Plataformes Científico-Tècniques: Citometria i Cultius Cel·lulars
3
Institut d'Investigació Sanitària de Palma (IdISPa)
1. Espais La Plataforma de Citometria i Cultius Cel·lulars de l’IdISPa està ubicada en el mòdul F de la planta -1 de l’Hospital Universitari Son Espases i ocupa una superfície útil: Citometria, 21,60m2 i Cultius Cel·lulars, 17.25m2 al mòdul I, i 14.15m2 al mòdul F.
Pt. Citometria
Mòdul F Mòdul I Cultius Cel·lulars
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Plataformes Científico-Tècniques: Citometria i Cultius Cel·lulars
2. Equipament:
Citometria i Cultius Cel·lulars:
Citòmetre analitzador BD FACSVerse (Làsers 488, 640 i 405nm i 8 fluorescències). Citòmetre analitzador Cytomics FC500. Beckman Coulter Citòmetre Sorter BD FACSAria Fusion (Làsers 488, 640 i 405nm i 14 fluorescències). Citòmetre Sorter FACS Influx. BD Biosciencies Preparació de mostres BD FACS Assistant Lyse Wash
Cabines de flux laminar Incubadors Microscopis Equips migració cel·lular: RTCA ACEA Comptador de cèl·lules Electroporador per a cèl·lules eucariotes: Lonza Nucleofector Electroporador Cell pulser: BioRad Dissociador de teixits Irradiador de cèl·lules
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Institut d'Investigació Sanitària de Palma (IdISPa)
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Plataformes Científico-Tècniques: Citometria i Cultius Cel·lulars
3. Serveis Preparació de mostres per a Citometria de flux
Separació Cel·lular
Immunofenotipat (de membrana o intracel·lular)
Estudi del cicle i funcionalitat cel·lular
Proliferació
Apoptosi
Ús d’ Incubadors i de cabines per a cultius primaris i per a manteniment de línies cel·lulars
Dissociació de teixits
Electroporació
Comptador de cèl·lules
Estudis de Migració Cel·lular (RTCA)
Conservació de cèl·lules i de línies cel·lulars a -150ºC (criocongelador o en N2 líquid)
Assessorament tècnic i Formació dels usuaris en el maneig dels equips
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Institut d'Investigació Sanitària de Palma (IdISPa)
4. Personal Tècnic Tècnic de suport
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Sala citometría
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• Citometría de Flujo (Flow Cytometry)
– Medición de propiedades de células en suspensión
• Separación Celular (Cell Sorting)
– Separación de células en función
de las propiedades medidas
CITOMETRÍA DE FLUJO
Video
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BASES DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO
• Células (partículas) en suspensión
• alineadas en un flujo atravesado
• por una fuente luminosa con
• dispersión de luz y emisión de fluorescencia
• filtrada, captada y
• convertida a señales digitales
• almacenadas en un ordenador.
FLUIDOS
ÓPTICA
ELECTRÓNICA
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ESQUEMA CITÓMETRO DE FLUJO
Emisión de fluorescencia y bancada óptica
Air-cooled Argon Ion Laser
Beam Shaping Lenses
High Sensitivity
Quartz Flow Cell
Forward Scatter
Detector
Side Scatter
Detector
525BP FL1 (FITC)
575BP FL2 (RD1)
620BP FL3 (ECD) 675BP FL4 (PC5)
488DL 488BK
550DL 600DL
645DL
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Injector Tip
Fluorescencias
Laser
Sheath fluid
Enfoque
hidrodinámico
¿CÓMO FUNCIONA UN CITÓMETRO DE FLUJO?
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Forward Scatter (FSC)
< 10° deflection
~ Tamaño celular
Y Laser
Side Scatter (SSC) 90° deflection
~ Estructura celular
Intensidad fluorescencia ~ Densidad antígeno
PARÁMETROS ANALIZADOS
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FSC
SS
C
Lymphocytes
Monocytes
Granulocytes
RBCs, Debris,
Dead Cells
Since FSC ~ size and SSC ~ internal structure, a correlated
measurement between them provides a basis for a simple
differentiation between the major populations
©1990-2012 J. Paul Robinson,
Purdue University BMS 631
FSC/SSC
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©1990-2012 J. Paul Robinson,
Purdue University BMS 631
OCTÁGONOS Y TRÍGONOS
Material source: BD website
Minimizar pérdidas luz
-Fibra óptica
-Sistemas compactos
-Reflexión vs transmisión
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• PARAMETER SELECTION
• GATE DEFINITION
• DATA DISPLAY AND STORING
LIST MODE FILES:
NON-CORRELATED
DATA MATRIX
HISTOGRAMS
DOTPLOTS
REAL-TIME
DATA ACQUISITION
KINETIC PLOTS
FCS 2.0 FORMAT FILES
NON-INTERFACED COMPUTER
WITH STAND ALONE OR
THIRD-PARTY SOFTWARE
SORTING
+ - AUTOMATED
DATA STATISTICS
AND REPORTS
INTERFACED COMPUTER
WITH CYTOMETER SOFTWARE
OFF-LINE ANALYSIS
LASER
FLOW CHAMBER
SAMPLE
PHOTOMULTIPLIERS
FILTER ASSEMBLY
FORWARD SCATTER
DETECTOR
FLUORESCENCE
COLLECTING LENS
CYTOSETTINGS
SORT SETTINGS
INSTRUMENT
CONTROL
DIGITALIZED SIGNALS
INTENSITY-CLASSIFIED DATA
• SIGNAL COLLECTION
• SIGNAL AMPLIFICATION
• PULSE PROCESSING
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0 Channel Number 1024
• Células Negativas o Positivas (%)
• Densidad antígeno ~ Intensidad media (o
mediana) fluorescencia (MFI) ~ Canal
ANÁLISIS SEÑAL ESTADÍSTICA
% células negativas
0 Channel Number 1024
mean
fluorescence
intensity
% células positivas
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Parameter 1
Y 12
X 123
Análisis 2-colores : Coexpresión de 2 antígenos
Morfología: FSC-SSC
ANÁLISIS SEÑAL Correlación dos parámetros
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488 nm laser
+ - Placas cargadas
Células separadas
Detector de FS
Detector de
fluorescencia
SEPARACIÓN CELULAR
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• Análisis de gran número de células (107 células)
• Tiempo análisis (sec) 10.000-25.000 e/s
• Gateo permite detección de subpoblaciones celulares
• Medida de eventos raros
• Medida objetiva y cuantitativa de la intensidad de fluorescencia
• Detección simultánea de hasta 18 fluorescencias por célula
• Poco invasivo
CITOMETRÍA DE FLUJO Ventajas
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APLICACIONES
•Antígenos de superficie o intracelulares (anticuerpos
monoclonales)
•Contenido celular DNA, RNA (ciclo celular o apoptosis)
•Parámetros funcionales:
•Concentración Ca+ intracelular
•Proliferación, viabilidad
•Cuantificación proteínas solubles (unión microesferas)
•Separación celular
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CITOMETRÍA DE
FLUJO Y
SEPARACIÓN
CELULAR
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ANALIZADOR FACSVerse
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CARACTERÍSTICAS ANALIZADOR
Ventajas:
3 láseres, 8 fluorescencias
Universal loader
Alta sensibilidad
Velocidad: hasta 30.000 eventos/segundo
Contaje absoluto
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Sergio Scrimini “Caracterización de granulocitos periféricos de baja densidad productores de Arginasa 1 en
EPOC”. Financiación: Grups Competitius MAR (Govern Balear) Ref PRE-R-22528-2011
INMUNOFENOTIPO
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Phenotype markers and cytokine intracellular production by CD8+ gammadelta T
lymphocytes do not support a regulatory T profile in Behçet's disease patients and
healthy controls. Immunol Lett. 2010 Apr 8;129(2):57-63.
Clemente A, Cambra A, Munoz-Saá I, Crespí C, Pallarés L, Juan A, Matamoros N, Julià
MR.
GD+CD8+ GD+CD8-
INMUNOFENOTIPO INTRACELULAR
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CD25 FITC
CD
4 P
Cy5
TCRγδ FITC
CD
8 P
Cy5
FOXP3
86,2%
CTLA4
65,4%
FOXP3
0.2%
CTLA4
0.3%
Even
ts
Log Fluorescence Intensity (PE)
ISOTYPE Control
INMUNOFENOTIPO INTRACELULAR
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PLAQUETAS
CD62 PE CD62 PE
Impaired circadian variation of platelet activity in patients with sleep apnea. Sleep Breath.
2012 Jun;16(2):355-60.
Barceló A, Piérola J, de la Peña M, Frontera G, Yañez A, Alonso-Fernández A, Ayllon O,
Agusti AG.
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La inhibició de la interacció TCF-β-catenina indueix apoptosi en cèl·lules de sarcomes de parts toves. A. Obrador.
Leiomiosarcoma CP0024 Control
0.25 μM 0.50 μM
CICLO CELULAR/ APOPTOSIS
G2
M G0
G1
S
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BACTERIAS GFP - GFP +
CEPAS CLÍNICAS
Biological markers of Pseudomonas aeruginosa epidemic high-risk clones. Antimicrob Agents Chemother.
2013;57(11):5527-35.
Mulet X, Cabot G, Ocampo-Sosa AA, Domínguez MA, Zamorano L, Juan C, Tubau F, Rodríguez C, Moyà B,
Peña C, Martínez-Martínez L, Oliver A; Spanish Network for Research in Infectious Diseases (REIPI).
BACTERIAS
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FACSAria Fusion
Ventajas:
3 láseres, 14 fluorescencias
Alta sensibilidad
Velocidad teórica: hasta 70.000 e/s
(252x106 por hora)
Control automático delay
Hasta 4 vías de recogida muestra
Recogida en tubos, placa, porta…
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Características FACSAria Fusion
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Características FACSAria Fusion
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In vitro evaluation of T cell regulatory function in Behçet’s disease patients and healthy controls.
Clemente A, Crespí C, Cambra A , Pallarés L, Juan A, Olea JL, Julià MR
SEPARACIÓN CELULAR
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SEPARACIÓN CELULAR
Linfocitos B
13,7% 98,6%
Toni Clemente. Grupo Inmunología.
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SEPARACIÓN CELULAR
Sergio Scrimini “Caracterización de granulocitos periféricos de baja densidad productores de Arginasa 1 en
EPOC”. Financiación: Grups Competitius MAR (Govern Balear) Ref PRE-R-22528-2011
Pre-sort
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FACS Assistant Lyse Wash
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ESTACIÓN DE ANÁLISIS
January 14, 2015 37
FACSDIVA
Adquisición y análisis
FLOWJO
Análisis
Representación gráfica
Batch
MODFIT
Análisis ciclo celular
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APLICACIONES
•Antígenos de superficie o intracelulares (anticuerpos
monoclonales)
•Contenido celular DNA, RNA (ciclo celular o apoptosis)
•Parámetros funcionales:
•Concentración Ca+ intracelular
•Proliferación, viabilidad
•Cuantificación proteínas solubles (unión microesferas)
•Separación celular
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MACS® Cytokine Secretion Assays (Miltenyi)
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PrimeFlow™ RNA Assay Principle (Affymetrix)
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SmartFlare™ RNA Detection Probes (Millipore)
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Plataformes Científico-Tècniques: Citometria i Cultius Cel·lulars
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Institut d'Investigació Sanitària de Palma (IdISPa)
1. Espais La Plataforma de Citometria i Cultius Cel·lulars de l’IdISPa està ubicada en el mòdul F de la planta -1 de l’Hospital Universitari Son Espases i ocupa una superfície útil: Citometria, 21,60m2 i Cultius Cel·lulars, 17.25m2 al mòdul I, i 14.15m2 al mòdul F.
Pt. Citometria
Mòdul F Mòdul I Cultius Cel·lulars
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Plataformes Científico-Tècniques: Citometria i Cultius Cel·lulars
2. Equipament:
Citometria i Cultius Cel·lulars:
Citòmetre analitzador BD FACSVerse (Làsers 488, 640 i 405nm i 8 fluorescències). Citòmetre analitzador Cytomics FC500. Beckman Coulter Citòmetre Sorter BD FACSAria Fusion (Làsers 488, 640 i 405nm i 14 fluorescències). Citòmetre Sorter FACS Influx. BD Biosciencies Preparació de mostres BD FACS Assistant Lyse Wash
Cabines de flux laminar Incubadors Microscopis Equips migració cel·lular: RTCA ACEA Comptador de cèl·lules Electroporador per a cèl·lules eucariotes: Lonza Nucleofector Electroporador Cell pulser: BioRad Dissociador de teixits Irradiador de cèl·lules
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Institut d'Investigació Sanitària de Palma (IdISPa)
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Salas de cultivo
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Equipos migración y proliferación celular: RTCA ACEA
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Contador de células: Millipore Scepter
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Electroporador para células eucariotas: Lonza Nucleofector
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Disociador de tejidos: Miltenyi
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Equipos ultracongelación y criocongelación
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Flow Cytometry - A Basic Introduction. Michael G Ormerod (http://flowbook.denovosoftware.com)
Practical flow cytometry. 4th edition. Howard M. Shapiro (http://www.beckmancoulter.com)
Flow cytometry: First principles. 2nd edition. Alice L. Givan
©1990-2012 J. Paul Robinson, Purdue University (http://www.cyto.purdue.edu)
Beckmann-Coulter
Becton-Dickinson
Millipore
Miltenyi
Lonza
FlowJo
Acea
BIBLIOGRAFÍA