Proteínas ENZIMAS

CATALIZADORES¿Que es un catalizador?

• Ejemplo:

H3C C

O

OH + C2H5OH H3C C

O

OC2H5 + H2OH+

“Un catalizador es un compuesto que aumenta la velocidadde una reacción química sin ser destruido o incorporado al producto” (IUPAC)

¿Que es un catalizador?

Reacciones unimoleculares

S → P

dtPd

v][

dtSd

v][

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30

Tiempo (min)

% S

rem

anen

te

pendiente de la tangente a la curva = -[S]/t

¿Cómo se define la velocidad de reacción?¿De qué depende?¿Cuánto vale? ¿Cómo y cuando se calcula?¿Qué unidades tiene?

0 10 20 30 minutos

M

olar

0

.01

.

02

.0

3

Tres casos

- El Plegamiento proporciona un “andamio” que permite a ciertos aminoácidos (catalíticos) estar en la posición espacial adecuada para llevar acabo su función, además, genera un medio ambiente adecuado para la captura de los sustratos.

La posición espacial relativa de los elementos catalíticos se mantiene aunque la secuencia de aminoácidos cambie.

CholinesteraseDienelactone hidrolaseLipase/CutinaseThioestearaseSerine CarboxypeptidaseProlyl Imino/Oligo peptidaseBromoperoxidase

Haloalkane dehalogenaseFluoroacetate dehalogenaseEpoxide hydrolaseHydroxynitrile lyaseC-C Hydrolase2,4-DioxygenaseAmilasa

TIM barrels

- Flexibilidad: La “tapa” del sitio activo de algunas enzimas presenta mobilidad.

- Sitios Alostéricos: Otros sitios pueden activar a la proteína desde regiones alejadas del sitio activo.

- Cambios conformacionales: pueden suceder al unir un sustrato.

Glucocinasa

Glucosamina 6-Fosfato-desaminasa

- Aminoácidos catalíticos: Son los involucrados en la función.

- Están directamente involucrados en la catálisis.

- Ejercen un efecto en otro residuo o molécula de agua que está directamente relacionado con la catálisis.

- Estabilizan el estado de transición.

- Ejercen algún efecto en el sustrato o cofactor que ayuda a la catálisis.

- Aminoácidos del sitio activo no catalíticos: Participan en el reconocimiento del sustrato y lo colocan en la orientación correcta.

El tamaño de una enzima en relación con su función

Aminoácidos del sitio activo no catalíticos que estabilizan al Pirofosfato.

Aminoácidos del sitio activo no catalíticos que estabilizan a los sustratos.

Aminoácidos catalíticos

Arg59, Ser130, Lys 159

Mg++

Sitio Activo de la Tiamina Fosfato Sintasa

Lipases catalyse the hydrolysis of triglycerides:

H2C

HC O

H2C O

O

O

O

O

R

R

R

lipase

H2O

H2C

HC OH

H2C OH

OH

+ 3 HO

O

R

The active site of lipases contain 3 essential amino acids:asp, his and ser.

Lipases have ~250 other amino acid residues. Why?

Tripeptide asp-his-ser enhances the hydrolysis rate of triglycerides by a factor 2-10; lipases by a factor 108-1012

How do they do that?

Why are lipases such active enzymes?

• Exact alignment of the asp, his and ser side chains

• Stabilisation of the intermediate C-O

• Ensure the correct charges @ asp, his and ser

• Stabilise against proteolysis and denaturation

La triada catalítica SER-HIS-ASP

Serin-proteasa de Bacillus lentus

Ejemplo de Catálisis, una Serina proteasa

Analysis of Catalytic Residues in Enzyme Active Sites

JMB (2002) 324, 105-121

Conclusiones:

- Los aminoácidos mayoritariamente catalíticos son histidina, cisteina, ácido glutámico, ácido aspártico, arginina, lisina.

- Están muy poco expuestos al solvente, a pesar de su polaridad.

- Casi todos están formando puentes de hidrógeno.

- Tienen una movilidad muy baja en comparación con los demás aminoácidos.

- La función de un aminoácido catalítico es estabilizar un intermediario del estado de transición, actuar como nucleófilo o ser donador o aceptor de protones.

•Catálisis: Leyes Generales de la Catálisis•Catalizadores biológicos•Velocidades más elevadas de reacción•Condiciones de reacción mas suaves•Mayor especifidad de reacción•Capacidad para la regulación

Reactivos Productos

Energía de activación(con enzima)

Energía de activación(sin enzima)

Sinenzima

Conenzima

Niv

el d

e en

ergí

a

(S) C12H22O13 + H2O

(G) C6H12O6 + (F) C6H12O6

Reaction equations and reaction rate

A reaction like A B

may run via route 1;

the rate is determined by the

magnitude of Ea(1)

Alternatively, the reaction runs via an intermediate, like 2.

The rate is determined by the slowest step (= the one with the highest Ea).

Alternatively, the reaction can run via more intermediates, like 3

AB

1

E

2

3

Ea(1)

Features of a catalyst:

Makes an alternative reaction path in which less activation energy is needed.

Equally increases the rate of the back and forth reaction reaction catalysis has no effect on equilibrium position!

S Pk1

k--1

k1/k-1 = Peq/Seq = Keq

Keq = k1/k-1

v = k1 S – k-1P

v = 0 = k1 Seq – k-1Peq

No Enzimáticak1 = 10-3 min-1

k-1 = 10-5 min-1

k1 = 10 min-1

k-1 = 10-1 min-1

Enzimática

¿POR QUE SUCEDE UNA REACCIÓN?

Teoría de las colisiones.• En gas y líquidos, frecuencias muy altas:

A(g) + B(g) @ 1 Atm y 25 C 1028 colisiones /seg cm3

AA + B menor frecuenciaA+B+C de colisiones

• Explica la proporcionalidad entre velocidad y concentración

Arrhenius (1889) Sólo las que alcanzan cierto nivel de energía. Las activadas o exitadas; sólo las que adquieren…..

T E cinética velocidad choques de las moléculas

v S

v kS

v kS n

Donde k es la constante de velocidad de reacción y n es el orden de la reacción.

Orden y molecularidad: ¿es lo mismo? ¿Unidades de la constante de velocidad?

Pero es obvio que no todas las que chocan reaccionan: ¿porqué?

Example: hydrolysis of alkyl bromides

R-Br + OH– R-OH + Br– (SN2 reaction)

Reaction takes place by collision of the particles RBr and OH–, implying that the reaction rate is directly proportional to [RBr] and [OH–].

Alternative:

These are the most common reaction situations:- bimolecular: 2 particles collide and react- monomolecular: 1 particle dissociates or reacts

R-Br slow R+ + Br- ROH + Br- (SN1 reaction)OH-

v = k (R-Br)(OH-)

v = k1(R-Br) k2 + R-Br

Energía Cinética

Moléculas

En

ergí

a d

e ac

tiva

ción

k = A e -G++/RT

Las energía de activación (G++) de las reacciones enzimáticas son del ordende 6000 a 15,000 cal/mol

Las energía de desactivación o desnaturalización (G++) de activación una enzima son del ordende 50,000 a 150,000 cal/mol (a bajas temperaturasson estables pero al aumentar la T rápidamente sedesactivan.

ln k = ln A – G++ RT

k

¿En cuanto aumenta la velocidad de reacción del proceso deDescomposición del peróxido de hidrógeno,

H2O2 H2O + O2

si la energía de activación de la reacción natural es de 76 KJ/mol, mientras que la reacción con catalasa es de30 KJ/mol?

Si una reacción tiene una energía de activación de 6,000 cal/moly otra de 60,000 cal/mol ¿Cómo influye en cada una de ellas elaumento de la temperatura? (cada 10oC)

Temperatura (oC) Velocidad relativa 6,000 cal/mol

Velocidad relativa 60,000 cal/mol

x

x

El caso de la orotidina-5´-monofosfato decarboxilasa

Determination of reaction ratesDetermination of the concentration of a compound (substrate, product), as a function of time.The method used depends on the properties of the compound.

• Chromatography– Example:

OH

menthol(racemic)

+ H2CO

H

O

CH3

vinyl acetate

Candida rugosalipase

iPr2OO

(1R,2S,5R)-menthyl acetate

+OH

(1S,2R,5S)-menthol

O

CH3

GC analysis of the esterification of racemic menthol with vinyl acetate, catalysed by Candida rugosa lipase, in diisopropyl ether as the solvent. I.S., internal standard (decane). An enantioselective GC column is used, so the enantiomers are separated. There is only one product peak because the reaction is stereoselective.

Another example: the chlorination of barbituric acid (1) by chloroperoxidase from Caldariomyces fumago

HN

NH

O

OO

H

H barbituric acid(1)

HN

NH

O

OO

Cl

Hmonochloro-barbituric acid(2)

chloroperoxidaseH2O2, Cl-, pH 2.7

HN

NH

O

OO

Cl

Cldichloro-barbituric acid(3)

chloroperoxidaseH2O2, Cl-, pH 2.7

t (min)

• UV spectroscopy•Example: chlorination of 1 by chloroperoxidase

A

Can be done quantitatively through Lambert-Beer’s law: A = .c.d

• IR spectroscopy•Example: oxime formation

O

H3C

O

O-+ H2N OH

N

H3C

O

O-

OH

IR (in D2O)

max =1710 cm-1max =1400 cm-1

Problem: not quantitative

• Polarimetry (only for chiral compounds)•Example: hydrolysis of sucrose:

C12H22O11 + H2O C6H12O6 + C6H12O6

sucrose + water glucose + fructose[]D

20 = +66,5° []D20 = +52° []D

20 = –92° (together []D20 = –40°)

Can be done quantitatively

• Titration• Example: ester hydrolysis

Ester + water acid + alcohol

Excellent for quantitative measurements; hooked up to computer.ml base added vs time; slope = reaction rate

¿Que tipo de reacciones catalizan?

C 1 . _ . _ . _ C 2 . _ . _ . _ C 3 . _ . _ . _ C 4 . _ . _ . _

C 5 . _ . _ . _ C 6 . _ . _ . _

La entalpía es una medida del contenido de calor de una sustancia. Cada sustancia pura posee entalpía, o sea, una cierta cantidad de energía asociada en un estado particular de P y T

Es la energía que puede ser transferida en forma de calor cuando el proceso se realiza a presión constante.

Lo que puede determinarse es el cambio en el contenido de calor de las substancias: H = H (final) – H (inicial) Los signos matemáticos aplicados a los cambios en entalpía se interpretan como sigue:

H positivo; se añade calor al sistema (proceso endotérmico)H negativo; el sistema libera calor (proceso exotérmico)

Por lo general, los valores de H se reportan a 25oC y 1 atmósfera de presión. Esto es lo que se conoce como un estado a condiciones estándar y se representa por el símbolo Ho.

El calor de reacción es el cambio en entalpía asociado a esa reacción y equivale a:Ho reacción = H productos – reactivos

NO SON CRITRIOS DE ESPONTANEIDADES UN PRINCIPIO DE CONSERVACIÓN.Es energía potencial que se libera al transformar sustratos en productos.

1ª Ley de la Termodinámica:La energía total de un sistema y sus alrededores es constanteE = Ef – Ei = Q (calor absorbido - W (trabajo realizado)

por el sistema)E = H - PV En sistemas biológicos V=0 E = H

Reacciones endotérmicas

X*

Sustrato

Productoa > 0

Activación endotérmica

Hd < 0

Hr > 0

Reacciones exotérmicas

X*

Sustrato

Producto

Ha > 0

Activación endotérmica

Hd < 0

Hr < 0

Hr < 0 exotérmicoHa > 0 activación endotérmicaHd < 0 exotérmicoHr = Ha - Hd

Pero no es un criterio de espontaneidad de la reacción: La ley que prescribe la dirección del flujo de energía es la segunda ley de termodinámica.

Hr > 0 endotérmicoHr < 0 exotérmico

El Concepto de Entropía

• Una definición amplia de entropía es que ésta es una medida del grado de desorden de un sistema. Esto se puede interpretar también en términos de probabilidad: un estado de desorden es más probable que un estado ordenado. • El caso de la caja de canicas blancas y la de canicas negras. El calor no fluye entre dos objetos a menos que estén a diferentes temperaturas.

S univ = S sistema + S alrededores

Si S univ > 0 El sistema procede de manera espontánea del estado “a” al estado “b”. La entropía del universo tiende a aumentar

Si S univ = 0 El sistema está en equilibrio y no se moverá de ahí espontáneamente.

Si S univ < 0 El sistema procede espontáneamente pero en la dirección inversa, es decir de “b” a “a”

Una reacción ocurre por la tendencia a buscar un estado de mínima energía y por la tendencia a buscar aumentar el desorden.

El Concepto de Energía Libre

El Hr es el cambio de energía que acompaña a una reacción –medida por calorimetría-. ¿Cuál es la máxima cantidad de energía que podemos extraer de la reacción? La Energía disponible: G reacción

Si G > H o G < H ¿se cumple la primera ley?

1878 Gibbs: Una nueva función que resulta de la 1a y la 2a leyes:

G =–S El cambio de energía = cambio de energía – cambio de energíaLibre (a P y T ctes) total de organización

eg. AgNO3 + HCl AgCl (s) + HNO3 (los sólidos tienen una estructura más ordenada)

Kcal/molG=Kcal/mol-G = -2.5 Kcal/molEsta es energía que no puede usarse para generar trabajo, pues no esta disponible; es usada para aumentar el orden: TS (el cambio de entropíaen el proceso es negativo)

Si S > 0 mayor desorden G < H (aporte entrópico a la energía disponible)

Si S < 0 mayor orden G > H (consumo de energía para ordenamiento)

Es la combinación de G y H lo que determina la espontaneidad

Criterio de espontaneidad:

G < 0 proceso espontáneoG = 0 proceso en equilibrioG < 0 proceso no espontáneo

Para una reacción A + B C + D en cualquier momento:G = Go + RT ln [C][D]/[A][B] dondeGo es la energía libre estandar (pH 7, 1atm, 25oC) y función de la naturalezade los reactivos.

En el equilibrio: G = 0 de donde: Go - RT ln [C]eq[D]eq/[A]eq[B]eq

Go - RT ln Keq

GoKcal/mol KJ/mol Keq 6.82 28.53

4.09

1.36 5.69

0.0 0.0 1-1.36 -5.69 -4.09 -17.11

-6.82 -28.53

Catálisis ácido-básica

• La catálisis ácida general consiste en la transferencia de un protón desde un residuo de la enzima, que se comporta como un ácido de Bronsted, al sustrato o intermediarios de la reacción, disminuyéndose así la energía libre del estado de transición

• La catálisis básica general consiste en la transferencia de un protón desde el sustrato o intermediarios de la reacción a un residuo de la enzima, que se comporta como una base de Bronsted, disminuyéndose así la energía libre del estado de transición

• Si se dan ambos tipos de catálisis se tiene una catálisis ácido-básica concertada

a) Sin catalizarb) B)Catális ácida generalc) Catális básica general

Muchas reacciones de importancia bioquimica son suceptibles a catálisis ácido/ base: hidrólisis de peptidos y de ésteres, del grupo fosfato, tautomerizaciones, adiciones de grupos carbonilo….

Tautomerización ceto-enol

Catálisis electrostática

• Ocurre cuando la enzima estabiliza intermediarios o estados de transición de la reacción por neutralización de cargas gracias a la disposición espacial en el sitio activo de residuos con carga opuesta

• En otros casos la distribución de cargas en el sitio activo sirve para guiar a sustratos cargados o polares a sus sitios de unión

• Es llevada a cabo por metaloenzimas que contienen iones metálicos fuertemente unidos ( metales de transición como Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+ o Co3+) o por enzimas activadas por metal que fijan débilmente a los inoes metálicos en solución (iónes metálicos alcalinos como Na+, K+, Mg2+ o Ca2+)

• La funcion de los iones metálicos en la catálisis enzimática es– Mediar reacciones de óxido-reducción – Unir y orientar de los sustratos– Estabilizar cargas negativas– Promover la catálisis nucleofílica mediante la ionización del agua

Sitio activo de la anhidrasa carbónica humana. La flecha apunta hacia la cavidad del sitio activo

Las moléculas ligadasde agua, tienen un carácter mas ácido.

Catálisis covalente

• En este caso se incrementa la velocidad de la reacción por la formación transitoria de un enlace covalente entre un residuo de aminoácido de la enzima y el sustrato.

• La catálisis covalente consiste en tres estadíos sucesivos:

– Ataque nucleofílico de la enzima sobre el sustrato (formación del enlace covalente)

– Toma de electrones por el catalizador u otro sustrato (formación del producto)

– Separación del producto de la enzima (ruptura del enlace covalente, generalmente por hidrólisis)

Mecanismo de reacción de la amiloglucosidasa

El más importante:Catálisis a través de la fijación de un estado de transición ala enzima, con mayor afinidad a la enzima que el sustrato oel producto.

En conjunción con los mecanismos antes descritos.La enzima distorsiona al sustrato hasta llevarlo a la geometríadel estado de transición, en la que no encajaría el sustrato sindistorcionar.

Resumen sobre las estrategias de las enzimas como catalizadores

Reducen la energía de activación de la reacción.

i. Optimizan la posición de los residuos catalíticos respecto al sustrato.

ii. Promueven la proximidad entre reactantes.

iii. Desestabilizan los estados basales.

iv. Estabilizan el estado de transición.

What kinds of catalysts are there around?

• Organic

• Inorganic

• Biological (biocatalyst)

Other way of subdivision:• Homogeneous = freely dissolved in solution

– organic catalyst

– organometallic complex

– enzyme in water

• Heterogeneous = solid, in liquid or gaseous environment– inorganic catalyst (e.g. zeolite)

– immobilised enzyme

– enzyme in an organic solvent