coinvolgimento della membrana plasmatica e delle proteine citoscheletriche nell'infertilità...

Universita Politecnica delle Marche

DIPARTIMENTO DI SCIENZE DELLA VITA E DELL’AMBIENTE

Corso di Laurea Magistrale in Biologia Applicata

Tesi di Laurea Magistrale

Coinvolgimento della membrana plasmatica e delle proteinecitoscheletriche nell’infertilita maschile

Candidato:

Ilaria CataliniMatricola 1053042

Relatore:

Prof. Giancarlo Balercia

Correlatore:

Dott.ssa Eleonora Salvolini

Anno Accademico 2013-2014

Indice

1 Introduzione 1

1.1 Spermatogenesi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.2 Spermatozoi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.3 Analisi del liquido seminale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.4 Motilità nemaspermica e astenozoospermia . . . . . . . . . . . . 7

1.5 Alterazioni del DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.5.1 Difetti di maturazione del DNA e della cromatina . . . . 9

1.5.2 Fenomeno Apoptotico e sue alterazioni . . . . . . . . . . . 10

1.5.3 Stress Ossidativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.6 Scopo della tesi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2 Materiali e Metodi 16

2.1 Pazienti oggetto di studio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

2.2 Valutazione del materiale seminale . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

2.3 Isolamento di spermatozoi da liquido

seminale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2.4 Fluidità ed idratazione di membrana . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.5 Analisi Immunoistochimica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

2.6 Analisi Statistica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

i

ii

3 Risultati 25

3.1 Studi di �uidità ed idratazione di membrana . . . . . . . . . . . . 25

3.2 Analisi Immunoistochimica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

4 Discussione 33

Elenco delle �gure

1.1 Processo di spermatogenesi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.2 Anatomia dello spermatozoo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.3 Alterazioni nella morfologia degli spermatozoi . . . . . . . . . . . 6

1.4 Fasi della sostituzione delle proteine istoniche con protamine du-

rante il processo di spermatogenesi . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

1.5 E�etto dei radicali liberi a livello cellulare . . . . . . . . . . . . . 13

2.1 Sonde DPH e TMA-DPH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.2 Sonde DPH e TMA-DPH in relazione alla membrana plasmatica 21

2.3 Sonda Laurdan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

3.1 Anisotropia di �uorescenza delle sonde TMA-DPH e DPH . . . . 26

3.2 Polarizzazione generalizzata mediante utilizzo della sonda Laurdan 27

3.3 Espressione immunoistochimica di Ezrin . . . . . . . . . . . . . . 28

3.4 Espressione immunoistochimica di Cdc42 . . . . . . . . . . . . . 29

3.5 Espressione immunoistochimica di CD9 . . . . . . . . . . . . . . 30

3.6 Espressione immunoistochimica della F-actina . . . . . . . . . . 31

3.7 Espressione immunoistochimica della β-tubulina . . . . . . . . . 32

iii

ELENCO DELLE TABELLE iv

Elenco delle tabelle

1.1 Confronto parametri seminali WHO 1999-2010 . . . . . . . . . . 5

3.1 Confronto espressione immunoistochimica di Ezrin. . . . . . . . . 28

3.2 Confronto espressione immunoistochimica di Cdc42 . . . . . . . 29

3.3 Confronto espressione immunoistochimica di CD9 . . . . . . . . 30

3.4 Confronto espressione immunoistochimica dell' F-actina . . . . . 31

3.5 Confronto espressione immunoistochimica della β-tubulina . . . . 32

Sommario

L'infertilità di coppia rappresenta un importante problema medico e sociale.

Almeno la metà delle sue cause è da ricercare nel maschio. I soggetti infertili

possono essere caratterizzati da un ridotto numero di spermatozoi, da una ri-

dotta motilità, da un'alterata morfologia nemaspermica o da un insieme di tutti

questi fattori. Tra di essi la motilità spermatica rappresenta una condizione

necessaria ai �ni della fertilizzazione e quindi uno dei principali determinanti

dell'infertilità maschile. Sulla base di ciò il seguente studio ha posto l'attenzio-

ne sull'analisi dell'astenozoospermia di tipo idiopatico, condizione caratterizzata

da una riduzione della percentuale di spermatozoi mobili le cui cause possibili

non sono individuabili. Pertanto inizialmente verrà introdotta una panoramica

sull'analisi del liquido seminale e sulle cause che possono alterarne i principa-

li parametri. Verrà poi presentata la popolazione oggetto di studio. Quindi

verranno esposte le tecniche attraverso le quali sono state e�ettuate l'analisi

del liquido seminale e l'isolamento degli spermatozoi. Poi saranno esaminate

le caratteristiche chimico-�siche della membrana plasmatica dello spermatozoo

e verrà determinata l'espressione immunoistochimica di proteine transmembra-

na e citoscheletriche coinvolte nella fertilizzazione. In�ne verranno riportati i

risultati che saranno discussi, alla luce di quanto riportato �nora in letteratura.

v

1Introduzione

Le cause di infertilità sono da ricondurre per un buon 40% ad un de�cit della

componente maschile, mentre per il 20% circa ad una sovrapposizione di fattori

maschili e femminili. Da qui possiamo rilevare che il 60% dell'infertilità è di

natura maschile. I soggetti infertili possono essere caratterizzati da un ridot-

to numero di spermatozoi, da una ridotta motilità, da un'alterata morfologia

nemaspermica o da un insieme di tutti questi fattori. Negli ultimi dieci anni

la misurazione dell'integrità della struttura della cromatina negli spermatozoi è

stato oggetto di numerosi studi che hanno evidenziato come un'eccessiva fram-

mentazione del DNA spermatico comprometta la fertilità maschile. Infatti si è

visto che, spermatozoi con normali parametri tradizionali ma con anomalie a

livello genomico, di�cilmente sono in grado di determinare un concepimento.

1.1 Spermatogenesi

Il gamete maschile è lo spermatozoo, prodotto attraverso il processo di sper-

matogenesi [1]. Le cellule spermatiche (spermatozoi) sono prodotte nei testi-

coli, che contengono le cellule germinali progenitrici (spermatogoni primari).

Attraverso il processo mitotico le cellule germinali progenitrici producono gli

spermatogoni secondari. Gli spermatogoni si trasformano in spermatociti pri-

mari, ognuno dei quali subisce una meiosi I dando origine a due spermatociti

1

CAPITOLO 1. INTRODUZIONE 2

secondari. Ogni spermatocita secondario va incontro alla meiosi II e il risulta-

to di queste due divisioni sono quattro spermatidi aploidi che si di�erenziano

successivamente nei gameti maturi, gli spermatozoi (Figura 1.1).

Figura 1.1: Processo di spermatogenesi

1.2 Spermatozoi

Lo spermatozoo maturo, derivante dal processo di spermatogenesi, presenta

una testa e una coda; quest'ultima è a sua volta costituita da un pezzo di

connessione o collo, una porzione intermedia, una principale ed una terminale

(Figura 1.2).


Figura 1.2: Anatomia dello spermatozoo

La testa dello spermatozoo maturo risulta appiattita e appuntita. All'inter-

no essa è costituita da due parti: il nucleo contenente cromatina ed il cappuccio

acrosomico che lo riveste. La cromatina nucleare è condensata e interrotta solo

occasionalmente da zone eucromatiche, più chiare. Il cappuccio acrosomico è

posto a ricoprire tra i due terzi e i tre quarti del nucleo; esso contiene numerosi

enzimi tra cui proteasi, fosfatasi acida, neuroaminidasi, ialuronidasi e può esse-

re considerato come un lisosoma gigante specializzato. Gli enzimi acrosomiali

vengono rilasciati quando lo spermatozoo prende contatto con la cellula uovo

e facilitano la penetrazione della testa dello spermatozoo attraverso la corona

radiata e la zona pellucida dell'oocito. La coda di uno spermatozoo maturo è

costituita da un �agello molto lungo che termina poco prima della testa in cor


rispondenza di una particolare zona chiamata piastra basale. La coda presenta

caratteristiche morfologiche di�erenti lungo il suo decorso, caratteristiche che

rendono necessaria la suddivisione della sua struttura in quattro parti: regione

del collo, porzioni intermedia, principale e terminale. Lungo la coda decorre

l'assonema, che è responsabile della motilità degli spermatozoi; esso è la strut-

tura portante di ciglia e �agelli e presenta la classica organizzazione 9 + 2 (2

microtubuli centrali circondati da 9 coppie di microtubuli periferici). La parte

prossimale della coda è detta collo. Si tratta di un segmento ristretto che contie-

ne una coppia di centrioli e il pezzo di connessione, dal quale si dipartono i nove

anelli �brosi che circondano l'assonema. L'assonema è situato nel centro della

porzione intermedia; si trova tra le nove �bre dense longitudinali che partono dal

pezzo di connessione del collo e presenta una zona esterna ricca di mitocondri

allungati strettamente impaccati. La funzione dei mitocondri è quella di utiliz-

zare il fruttosio e il glucosio presenti nel liquido seminale per produrre energia

sotto forma di ATP, al �ne di consentire il movimento dello spermatozoo. Il

passaggio alla porzione principale è segnato da un brusco restringimento, a vol-

te associato ad un ispessimento anulare della membrana cellulare, l'annulus. La

porzione principale è la parte più lunga della coda e comprende l'assonema cir-

condato dalle nove �bre dense longitudinali, che sono a loro volta racchiuse da

numerose �bre di rivestimento disposte circolarmente. Siccome una delle �bre

longitudinali anteriori e una di quelle posteriori sono fuse con le �bre circolari,

le sette rimanenti sono distribuite asimmetricamente, quattro in un comparti-

mento laterale e tre nell'altro. Nella giunzione tra la porzione principale e quella

terminale, le �bre longitudinali e circolari si interrompono, per cui la porzione

terminale della coda è composta dal solo assonema [2].

1.3 Analisi del liquido seminale

Lo spermiogramma è l'analisi del liquido seminale �nalizzata a valutare la

qualità degli spermatozoi, attraverso la veri�ca della forma, del numero e del-


la motilità. Tale esame rappresenta lo strumento principale per la valutazione

della fertilità maschile. Come riportato dalla rivista Annali dell'Istituto Supe-

riore di Sanità (2001) [3], lo spermiogramma è tra gli esami di laboratorio che

si distingue per il signi�cato particolare che si associa ai �valori normali� dei

vari parametri che misurano la qualità dello sperma: infatti, �normalità� non

implica necessariamente �fertilità�, dal momento che molte delle caratteristiche

funzionali che contribuiscono a de�nire la fertilità non sono ancora oggi ben

conosciute. La complessità dello spermiogramma è cresciuta a tal punto da in-

durre la World Health Organization (WHO) nel 1980 a promuovere alcune linee

guida per la standardizzazione delle indagini per lo studio di base del liquido

seminale e per la descrizione ed interpretazione dei risultati ottenuti; linee guida

che periodicamente vengono tenute al passo dei progressi nel settore, attraver-

so aggiornamenti successivi. Nel 2010 è stato redatto un nuovo Manuale di

Laboratorio per l'Esame del Liquido Seminale [4] che ha apportato importan-

ti aggiornamenti sui parametri di riferimento del liquido seminale rispetto alle

precedenti edizioni. Nella Tabella 1.1 vengono riportati i parametri seminali

relativi al 1999 e al 2010.

Valori WHO 1999 WHO 2010N◦ Spermatozoi/ml ≥ 20 · 106 ≥ 15 · 106Motilità Progressiva ≥ 50% ≥ 32%Morfologia ≥ 30% ≥ 4%

Tabella 1.1: Confronto parametri seminali WHO 1999-2010

Per quanto riguarda la motilità, un sistema semplice di classi�cazione pre-

vede la distinzione degli spermatozoi in progressivi, non-progressivi e immobili:

• motilità progressiva (PR): lo spermatozoo si muove attivamente, in modo

lineare o in un ampio circolo, indipendentemente dalla velocità;

• motilità non-progressiva (NP): comprende tutti gli altri tipi di motilità in

cui non c'è progressione nello spazio, per esempio movimenti che descrivo-

no piccoli circoli oppure quando l'onda �agellare riesce a spostare appena

la testa o ancora quando si osserva soltanto il movimento �agellare;


• immobilità (IM): nessun movimento.

Per quanto riguarda la morfologia, perché uno spermatozoo possa essere

considerato normale è necessario che siano normali la testa, il collo, il tratto

intermedio e la coda (Figura 1.3)

Figura 1.3: Alterazioni nella morfologia degli spermatozoi

Dal momento che spesso è di�cile descrivere con parole o numeri tutte le

alterazioni dei parametri seminali, è stata introdotta una terminologia per in-

dicarne i tipi principali [5], come riportato nel Manuale di laboratorio della

WHO. E' importante precisare che essa ha solo un valore descrittivo per le va-

riabili seminali e non indica nessuna relazione causale. Fatta questa premessa,

la terminologia dovrebbe essere così utilizzata:

• Oligozoospermia: concentrazione spermatica inferiore ai valori di riferi-

mento

• Astenozoospermia: motilità inferiore ai valori di riferimento

• Teratozoospermia: morfologia non conforme ai valori di riferimento

Possiamo trovare anche combinazioni di queste, come ad esempio l'oligoa-

stenospermia, in cui oltre ad avere una concentrazione spermatica inferiore ai

valori di riferimento, gli spermatozoi presentano anche valori di motilità inferiori


ai valori di riferimento, �no ad arrivare all'oligoastenoteratospermia (OAT) in

cui tutti e tre le variabili sono alterate e quindi al di sotto dei valori di riferi-

mento. In ultimo si può aggiungere l'azoospermia, cioè l'assenza di spermatozoi

nell'eiaculato e l'aspermia, cioè l'assenza di eiaculato. Con l'introduzione dei

nuovi valori di riferimento, soprattutto relativamente alla morfologia e alla mo-

tilità degli spermatozoi, sono stati forniti più frequentemente referti di normo-

spermia per liquidi seminali che prima risultavano oligoastenozoospermici e/o

teratozoospermici.

1.4 Motilità nemaspermica e astenozoospermia

La motilità spermatica rappresenta uno dei principali determinanti dell'in-

fertilità maschile ed una condizione necessaria ai �ni della fertilizzazione. Con il

termine motilità si indicano fondamentalmente due concetti di�erenti: la moti-

lità progressiva e la percentuale totale di spermatozoi dotati di movimento. La

valutazione della motilità viene espressa come percentuale totale di spermatozoi

mobili (aspetto quantitativo) e come percentuale delle diverse categorie cinetiche

(aspetto qualitativo inteso come tipo di velocità e direzione degli spermatozoi

mobili). È noto che gli spermatozoi testicolari nelle prime fasi successive alla

spermioistogenesi sono immobili. Gli spermatozoi acquisiscono la capacità di

movimento durante il transito attraverso l'epididimo. Infatti, in seguito all'in-

terazione con le cellule ciliate dell'epitelio epididimario e con il loro secreto,

essi vanno incontro soprattutto a modi�cazioni a carico della membrana cito-

plasmatica e ad un graduale sviluppo della motilità durante la progressione del

gamete dalla testa alla coda dell'epididimo [6]. Gli spermatozoi sono in grado

di e�ettuare movimenti di tipo diverso, che si adattano alle diverse esigenze

funzionali. Gli spermatozoi eiaculati infatti, nel plasma seminale, mostrano una

traiettoria lineare che corrisponde a quella presente durante la penetrazione nel

muco cervicale. Una volta che lo spermatozoo abbandona il plasma seminale e

inizia la sua risalita lungo le vie genitali femminili, le caratteristiche di moti-


lità cambiano. Quando avviene la capacitazione o poco prima, l'ampiezza del

movimento del �agello aumenta e lo spermatozoo inizia una traiettoria con uno

spostamento laterale della testa più pronunciato, si parla di stato transizionale

[7]. Quando ha realmente inizio la capacitazione, l'ampiezza dell'onda �agel-

lare diventa asimmetrica, dando luogo ad un movimento non più progressivo

ma vigoroso, noto come iperattivazione. Questa forma di motilità è tipica degli

spermatozoi totalmente capacitati e si pensa che fornisca allo spermatozoo la

forza necessaria per attraversare la zona pellucida [8]. È stato dimostrato che

il contatto delle cellule apicali della tuba con gli spermatozoi o�re un prolun-

gamento della durata della motilità, con incremento della velocità progressiva e

ritardo della capacitazione [9]. Si parla di astenozoospermia laddove ci si trovi

di fronte ad una riduzione della percentuale di spermatozoi mobili. Nel caso in

cui non sia possibile individuare cause speci�che di tale riduzione, si parla di

astenozoospermia di tipo idiopatico. Nonostante le strutture cellulari coinvolte

nello sviluppo e nel mantenimento della motilità dello spermatozoo siano state

ampiamente identi�cate, i meccanismi molecolari alla base di questa funzione e

la loro concatenazione temporale e spaziale non sono stati del tutto chiariti [10].

1.5 Alterazioni del DNA

Come descritto da Schulte et al. (2010) [11] ci sono una varietà di fattori

eziologici associati al danno del DNA degli spermatozoi e/o che comprometto-

no l' integrità della cromatina. Queste cause sono molteplici e dipendono da

condizioni ambientali come fumo di sigaretta, agenti chemioterapici, radiazioni,

esposizione a pesticidi, o da fattori intrinseci come leucocitospermia, varicocele,

cancro, eventi iatrogeni. I meccanismi attraverso i quali questi fattori portano

anomalie a livello del DNA e/o cromatina degli spermatozoi non sono ancora

chiari, tuttavia possiamo elencare tre diverse condizioni di danno al DNA dovute

a:

1. difetti di maturazione


2. alterazioni del fenomeno apoptotico

3. stress ossidativo

1.5.1 Difetti di maturazione del DNA e della cromatina

A di�erenza delle cellule somatiche, la cromatina dello spermatozoo è mol-

to più compatta, condensata, altamente organizzata e possiede una struttura

molto stabile [11]. Ciò consente al genoma paterno di essere protetto durante

il trasporto attraverso i dotti riproduttivi maschili e femminili e di raggiunge-

re, in un secondo momento, la cellula uovo in condizioni ottimali. Inoltre tale

struttura assicura che il DNA sia consegnato in una forma �sica e chimica tale

da permettere all'embrione in via di sviluppo di accedere facilmente all'infor-

mazione genetica. Durante il processo di spermatogenesi, la cromatina degli

spermatozoi va incontro ad una serie di cambiamenti in cui gli istoni vengono

sostituiti con proteine di transizione e in ultimo con protamine (nell'uomo sono

di due tipi prevalenti: PRM1 e PRM2)(Figura 1.4). Le protamine sono proteine

basiche a basso peso molecolare e ad alto contenuto di arginina e cisteina, che

vanno a costituire il componente proteico più abbondante nel nucleo spermatico

[12]. I domini di arginina sulle protamine inducono la doppia elica del DNA

ad assumere una struttura toroidale, in maniera indipendente dalla sequenza

nucleotidica. Ogni molecola di protamina viene avvolta da una spira di DNA,

di circa 11 bp, intercalando prevalentemente il solco minore dell'elica [13]. Lo

spermatozoo maturo dell'uomo, di�erenziato terminalmente, è caratterizzato da

un materiale genetico circa 6 volte più compatto di un cromosoma mitotico e

occupa un volume 40 volte inferiore a quello di una cellula somatica tipica. In

pratica, 1 m di DNA lineare nudo viene accomodato in un nucleo lungo circa

2 µm contenente circa 300 milioni di protamine. Se la quantità e il rappor-

to tra istoni e protamine non viene rispettato, il DNA degli spermatozoi può

essere più facilmente soggetto ad attacchi di varia natura che ne alterano la

struttura e quindi la funzionalità. Il rapporto fra protamine e istoni nell'uomo


è costante ed è di circa 85 : 15. Nell'uomo anche il rapporto fra le protami-

ne 1 e 2 (P1/P2) deve essere costante [14]. Negli individui fertili il rapporto

P1/P2 è compreso tra 0, 8 e 1, 2 mentre alterazioni di tale rapporto sono state

osservate negli uomini infertili. In particolare nei pazienti infertili si rilevano so-

prattutto bassi livelli di P2 e rapporti P1/P2 incrementati rispetto ai controlli

fertili. Tuttavia esiste una quota di pazienti caratterizzati da un basso rapporto

P1/P2. Questi dati suggeriscono l'esistenza di una relazione diretta tra de�-

cit protaminico ed infertilità maschile, infatti, l'alterata espressione di queste

due proteine provoca l'insorgenza di difetti nel processo spermatogenetico, con

un'incompleta condensazione cromatinica del nucleo dello spermatozoo e una

mancata progressione nella linea spermatogenetica. In conclusione, un alterato

rapporto fra istoni e protamine, fra le stesse protamine e la presenza di tagli

(nicks) a livello del DNA dello spermatozoo, dovuti alla mancata riparazione

da parte della topoisomerasi, compromettono la capacità dello spermatozoo di

fecondare l'uovo. In realtà l'ovocita è in grado di riparare eventuali danni del

DNA dello spermatozoo penetrato al suo interno, ma solo se questi sono di lieve

entità.

1.5.2 Fenomeno Apoptotico e sue alterazioni

Un'altra teoria relativa al danno a livello del DNA degli spermatozoi è as-

sociata all'apoptosi abortiva, come descritto da Schulte et al. (2010) [11]. Si

de�nisce apoptosi quel processo di morte programmata che avviene in tutte le

cellule del corpo. Nel testicolo, il processo apoptotico avviene normalmente,

al �ne di prevenire una sovrapproduzione di cellule germinali e di eliminare

selettivamente le cellule germinali non funzionali. Ciò è essenziale in quanto

le cellule del Sertoli sono in grado di contenere un numero limitato di cellule

germinali nel testicolo. Dunque l'apoptosi delle cellule germinali è un processo

che avviene normalmente e continuamente nel corso della vita [15]. Il norma-

le processo apoptotico è innescato tramite l'interazione del ligando Fas (FasL),

secreto dalle cellule del Sertoli, con la proteina Fas localizzata sulla super�cie


Figura 1.4: Fasi della sostituzione delle proteine istoniche con protaminedurante il processo di spermatogenesi

esterna della cellula germinale. La proteina Fas appartiene alla superfamiglia

dei recettori TNF (fattore di necrosi tumorale). Il ligando FasL è una protei-

na transmembrana ed anch'esso fa parte della famiglia dei TNF. L'interazione

ligando-recettore si risolve nella formazione di un complesso di segnalazione che

induce la morte cellulare. Dagli studi di Sakkas et al. (1999) [15] si evince che il

ruolo della proteina Fas durante la spermatogenesi non è ancora chiaro. Tutta-

via diversi studi evidenziano che l'apoptosi si veri�ca durante la spermatogenesi.

Ciò però non sempre accade. Si è visto infatti che gli spermatozoi con DNA

frammentato e che esprimono a livello della loro membrana il recettore Fas van-


no incontro ad un processo di apoptosi abortiva, in cui gli spermatozoi iniziano

il processo apoptotico ma poi sfuggono a quest'ultimo. Per valutare la presenza

di corpi apoptotici può essere utilizzata la citometria a �usso, che mostra una

popolazione apparentemente ipodiploide per ridotta capacità del DNA di legare

il colorante (ioduro di propidio o altri) o per e�ettiva riduzione del contenuto

di DNA.

1.5.3 Stress Ossidativo

Il danno a livello del DNA degli spermatozoi può essere associato anche ad

alti livelli di Specie Reattive dell'Ossigeno (ROS). Lo stress ossidativo è deter-

minato da uno squilibrio tra la produzione e l'eliminazione delle ROS da parte

del nostro sistema di difesa antiossidante. Le ROS sono una categoria di piccole

molecole, molto reattive [16]. Esse derivano, normalmente, dall'ossigeno du-

rante il processo di produzione dell'energia cellulare e sono divisibili in radicali

(ione idrossile, superossido, monossido d'azoto) e non radicali (ozono, perossido

di idrogeno). Diversi fattori esterni e speci�che condizioni cliniche possono in-

crementare la produzione di ROS: particolari stili di vita (fumo, alcool, droghe),

inquinamento ambientale ed alimentare (radiazioni, smog, gas industriali, dieta

sbilanciata ricca di grassi), patologie come in�ammazioni, traumi, infezioni. Po-

tenziali obiettivi delle ROS sono componenti cellulari come lipidi, proteine, acidi

nucleici e zuccheri (Figura 1.5). L'entità del danno indotta dalle ROS dipende

non solo dalla natura e dalla quantità di ROS coinvolta, ma anche dalla durata

dell'esposizione alle ROS stesse.

1.6 Scopo della tesi

Qualsiasi eiaculato presenta di�erenti tipi di cellule in grado di produrre

ROS, come gli spermatozoi maturi e immaturi, i leucociti e le cellule epiteliali.

Tra queste, i leucociti e gli spermatozoi sono considerati essere le due princi-

pali fonti di ROS. Piccole quantità di ROS possono avere un ruolo �siologico,


Figura 1.5: E�etto dei radicali liberi a livello cellulare

risultando necessarie per lo spermatozoo nell'acquisizione della capacità fecon-

dante. L'incubazione degli spermatozoi con basse dosi di ROS, infatti, stimola

la capacitazione, l'iperattivazione, la reazione acrosomiale e l'interazione con l'o-

vocita [17]. D'altro canto livelli eccessivi di ROS determinano una bassa qualità

del seme e generalmente uno stato di stress ossidativo spermatico che produ-

ce dei danni. In particolare le ROS possono causare infertilità attraverso due

meccanismi principali:

1. danni al DNA degli spermatozoi: quando il grado del danno al DNA

è basso, gli spermatozoi possono andare incontro ad una riparazione ed

inoltre lo stesso ovocita può riparare il danno al DNA dello spermatozoo,

una volta che esso è entrato al suo interno;

2. danni alla membrana spermatica che riducono la motilità e la capacità di

fusione con l'ovocita.


Se il danno è estensivo si può veri�care una diminuzione della percentuale

di fecondazione, una bassa qualità dell'embrione e un rischio di abortività. I ra-

dicali liberi possono causare la rottura dei �lamenti di DNA ed essere causa di

alterazioni cromosomiche (Azione Mutagena) attraverso l'attivazione di enzimi

come caspasi ed endonucleasi. Il danno al DNA indotto dalle ROS può accelerare

il processo di apoptosi e provocare una riduzione del numero degli spermato-

zoi. La frammentazione è un evento post-testicolare e può comportare anomalie

morfologiche che si evidenziano con la presenza di residui citoplasmatici nel col-

lo del gamete maschile. Inoltre le ROS possono reagire con gli acidi grassi dei

fosfolipidi che costituiscono la membrana plasmatica, in�uenzando così la �ui-

dità della membrana stessa e causando conseguentemente un danno funzionale

agli spermatozoi, anche se è stato suggerito che livelli elevati di ROS non inter-

feriscono sulla spermatogenesi. Dagli studi e�ettuati negli ultimi dieci anni [18]

viene evidenziato come il danno a livello della membrana spermatica avvenga

in seguito alla perossidazione lipidica della membrana stessa, che è particolar-

mente ricca di acidi grassi polinsaturi (PUFA). Questa particolare ricchezza di

acidi grassi insaturi della membrana spermatica rende gli spermatozoi parti-

colarmente suscettibili al danno perossidativo causato dall'attacco delle ROS.

Tale perossidazione lipidica provoca una riduzione della �uidità e della stabilità

della membrana ed una riduzione della motilità. Ciò ha un e�etto negativo sui

meccanismi della fertilizzazione dell'ovocita maturo da parte dello spermatozoo.

Infatti, la struttura della membrana plasmatica ha una grande importanza per

il successo della fecondazione, dato che la capacitazione, la reazione acrosomiale

(AR) e la fusione spermatozoo-uovo sono eventi associati alla membrana. Per

quanto riguarda la capacitazione degli spermatozoi, è stato suggerito l'interven-

to della ezrina, che rappresenta la più nota proteina della famiglia ERM, alla

quale appartengono anche la radixina e la moesina. Tale proteina potrebbe con-

tribuire al rimodellamento della membrana dello spermatozoo, poiché collega il

citoscheletro corticale con le proteine di membrana. L'ezrina è coinvolta anche

nell'attivazione della Rho GTPasi, promuovendo la polimerizzazione dell'acti-


na. Le proteine ERM sono inoltre indirettamente collegate ad altre proteine, le

tetraspanine. In particolare, la tetraspanina CD9 è essenziale per l'interazione

spermatozoo-oolemma. Le Rho GTPasi (come RhoA, Rac1 e Cdc42) sembra-

no essere implicate anche nella reazione acrosomiale, un evento fondamentale

per la fecondazione. Inoltre, Cdc42 è coinvolta nello stabilimento della polarità

cellulare in diversi citotipi. L'acquisizione della polarità cellulare è un requisito

importante per la formazione di spermatozoi vitali. Anche l'actina, insieme ad

altre proteine citoscheletriche, come la tubulina, sembra essere implicata nella

regolazione della capacitazione e della reazione acrosomiale, nonché nella motili-

tà degli spermatozoi. Sulla base delle conoscenze sopra citate lo scopo di questa

tesi è stato quello di isolare spermatozoi umani da donatori fertili normospermici

e da soggetti infertili a�etti da astenozoospermia idiopatica al �ne di valutare le

caratteristiche �sico-chimiche della membrana plasmatica mediante spettrosco-

pia di �uorescenza. Inoltre è stata valutata l'espressione immunoistochimica di

proteine transmembrana e citoscheletriche coinvolte nella regolazione della ca-

pacitazione, della reazione acrosomiale e nella motilità degli spermatozoi come

ezrina, CD9, Cdc42, F-actina, e β-tubulina.

2Materiali e Metodi

2.1 Pazienti oggetto di studio

Sono stati reclutati ed inclusi nello studio 25 uomini infertili, di età compresa

tra i 34 e i 47 anni. Tali pazienti sono da considerare infertili poiché incapaci

di iniziare una gravidanza dopo un periodo di tempo ≥ 18 mesi di rapporti non

protetti. Ventuno uomini fertili, della stessa fascia di età, hanno rappresenta-

to il nostro gruppo di controllo. I campioni di sperma sono stati ottenuti con

la masturbazione facendo attenzione alle condizioni igieniche e raccogliendo il

campione in contenitori di plastica sterili. Il paziente deve aver osservato un

periodo di astinenza sessuale dai tre ai cinque giorni. Un intervallo di tempo

più breve, diminuisce la concentrazione degli spermatozoi, un periodo più lungo,

ne diminuisce la motilità. Se il campione non è raccolto in un'apposita stanza

nei pressi del laboratorio, è importante che esso venga consegnato in labora-

torio entro un'ora, cercando di mantenere il contenitore ad una temperatura

di 20◦ − 40◦C, questo per evitare una diminuzione della motilità. Il campione

deve essere etichettato con un numero di identi�cazione e con la data e l'ora

della raccolta. Non appena emesso, il liquido seminale coagula per poi liquefarsi

nuovamente dopo trenta, sessanta minuti a temperatura ambiente. Campioni

normali di liquido seminale possono contenere granuli gelatinosi (corpi amila-

cei) che non si liquefanno e che non sembrano avere nessuna rilevanza clinica.

16

CAPITOLO 2. MATERIALI E METODI 17

La presenza di strie di muco, segno di incompleta liquefazione, può interferire

con l'esecuzione dell'analisi seminale. Il campione deve essere ben mescolato

nel contenitore dove è avvenuta la raccolta, ma non deve essere agitato ecces-

sivamente. Una delicata miscelazione continua o una rotazione del campione,

durante la liquefazione, possono ridurre gli errori nel determinare la concen-

trazione degli spermatozoi [19]. Dopo la liquefazione, sono stati determinati il

volume ed il pH dello sperma e la concentrazione, la vitalità, la motilità e la

morfologia degli spermatozoi, sulla base delle linee guida per l'esame e il tratta-

mento dello liquido seminale emesse dall'Organizzazione Mondiale della Sanità

(World Health Organization = WHO). Per essere inclusi nello studio i soggetti

dovevano mostrare una morfologia degli spermatozoi normale (forme normali

> 4%) e una concentrazione di globuli bianchi nel liquido seminale inferiore

a 1 · 106/mL. Quest' ultima sta ad indicare che non sono presenti eventuali

infezioni ed in�ammazioni. L'esame colturale, inoltre, ha evidenziato l'assenza

di infezioni alle vie genitali i cui microrganismi responsabili sono: Chlamydia,

Mycoplasmi ed Enterobatteri Routinariamenter. Allo stesso modo ha dato esi-

to negativo il MAR test (test di agglutinazione mista) che valuta la presenza

di anticorpi adesi agli spermatozoi. Infatti, in seguito a traumi o infezioni la

resistenza della barriera emato-testicolare viene alterata, dando origine ad una

reazione autoimmunitaria nei confronti degli spermatozoi contenuti nel testico-

lo, con produzione di auto-anticorpi rivolti contro gli spermatozoi del paziente.

L'anticorpo che lega lo spermatozoo ha un e�etto immobilizzante quando si le-

ga a livello della coda e promuove la comparsa di agglutinazioni. Inoltre può

impedire la penetrazione dello spermatozoo nell'ovocita nel caso in cui si leghi

alla testa dello spermatozoo [20]. Allo stesso modo anche il dosaggio ormonale è

risultato normale. In�ne, sono state escluse anche anomalie anatomiche del trat-

to genitale, varicocele, torsione testicolare ed infezioni del tratto genitale, così

come malattie sistemiche nei tre mesi precedenti all'analisi. Sono stati esclusi

dallo studio i soggetti a�etti da diabete mellito, ipertensione e dislipidemia, i

fumatori, i bevitori ed i tossicodipendenti. Dal momento che nessuno dei fattori


presi in esame è responsabile dell'alterazione della motilità degli spermatozoi, si

può parlare di astenozoospermia idiopatica.

2.2 Valutazione del materiale seminale

Per ogni paziente sono state eseguite due analisi complete per la valutazione

del volume, del numero di spermatozoi, della vitalità, della motilità e della mor-

fologia sulla base delle linee guida della WHO. L'analisi del materiale seminale è

stata eseguita mediante sistemi computerizzati di analisi delle immagini (sistemi

CASA) che consentono di valutare il movimento del �agello, l'ampiezza dell'on-

da �agellare, la velocità di propagazione e la frequenza del battito del �agello.

Sono disponibili speci�che camere di conta da impiegare nei sistemi CASA. Una

camera dello spessore di 20 µm Microcell (Conception Technologies) è in grado

di fornire risultati ottimali nell'analisi del liquido seminale. Un'aliquota di sper-

ma (3 µL) è stata quindi inserita nella camera di conta. Sono state caricate due

camere e sono stati esaminati diversi campi: 6 campi per settore sono necessari

per un risultato a�dabile. Sono stati analizzati un numero di spermatozoi

≥ 200 per ogni settore. La misurazione dei parametri del movimento spermatico

è stata e�ettuata con l'Analizzatore del Liquido Spermatico WLY 9000-CGA.

Tali parametri sono:

• Velocità: per la descrizione della motilità si utilizzano tre valori: velocità

curvilinea (VCL), velocità rettilinea (VSL) e velocità media (VAP).Ciascuna

delle tre descrive un aspetto di�erente della progressione nemaspermica.

La VCL è la distanza che compie lo spermatozoo lungo la sua traiettoria,

e viene calcolata con la somma delle distanze nel corso del tempo. La VSL

viene determinata calcolando la distanza in linea retta tra il primo e l'ul-

timo punto nel percorso dello spermatozoo. La VAP indica la longitudine

di una traiettoria nemaspermica.

• Linearità: esprime la relazione tra la proiezione bidimensionale della tra-

iettoria di uno spermatozoo e lo spazio guadagnato, calcolato come:


V SL

V CL· 100 (2.1)

Una traiettoria circolare, per esempio, avrà una ridotta linearità.

• Rettilineità: fornisce l'indicazione della relazione tra lo spazio netto gua-

dagnato e la traiettoria generale dello spermatozoo, calcolato come:

V SL

V AP· 100 (2.2)

• Ampiezza dei movimenti laterali della testa (ALH): viene calcolata come

un'approssimazione del battito del �agello.

• Frequenza del battito (BCF): dal momento che ogni avanzamento presup-

pone un ulteriore battito �agellare, la BCF de�nisce il numero dei battiti

del �agello dello spermatozoo, supponendo una rotazione come inizio del

battito.

Questi parametri de�niscono con precisione le caratteristiche della motilità

nemaspermica. A partire da questi parametri è possibile discriminare oggettiva-

mente uno spermatozoo maturo da uno immaturo, uno mobile da uno immobile,

uno con movimenti lenti e irregolari da uno con velocità elevata e moto lineare.

2.3 Isolamento di spermatozoi da liquido

seminale

La separazione degli spermatozoi dal plasma seminale per ottenere un cam-

pione contenente un'alta percentuale di spermatozoi morfologicamente normali

e mobili, privo di detriti e spermatozoi morti, è stata e�ettuata utilizzando i

gradienti di densità. La tecnica utilizzata in questo caso è quella su gradienti di

Percoll discontinui. Brevemente il Percoll è stato reso isotonico mediante l'ag-

giunta di 1 volume di NaCl 1, 5 mol/L tamponato con HEPES 0, 1 mol/L, pH


7, 4 a 9 volumi di Percoll. Sono poi state preparate due di�erenti concentrazioni

di Percoll, una all'80% ed una al 40%, diluendo la soluzione isotonica con Hu-

man Tubal Fluid Medium (Irvine Scienti�c) in Hepes 0, 01mol/L. In�ne è stato

strati�cato un millilitro di liquido seminale liquefatto al di sopra del gradiente

di Percoll ed è stato centrifugato a 500 g per 20 minuti. Gli spermatozoi che

costituiscono il pellet sono stati poi risospesi in PBS (0, 1 mol/L) a pH 7.4.

2.4 Fluidità ed idratazione di membrana

La �uidità di membrana è stata valutata determinando l'anisotropia di �uo-

rescenza (inversamente proporzionale alla �uidità di membrana) di due sonde:

1, 6− difenil− 1, 3, 5− esatriene (DPH), 1− [4− (trimetilammonio)fenil]−

6− fenil − 1, 3, 5− esatriene (TMA-DPH) (Figura 2.1).

Figura 2.1: Sonde DPH e TMA-DPH

La sonda �uorescente TMA-DPH si lega all'interfaccia acqua-lipidi del


doppio strato della membrana plasmatica, mentre il DPH è una sonda idrofobica

(Figura 2.2).

Figura 2.2: Sonde DPH e TMA-DPH in relazione alla membrana plasmatica

In particolare gli spermatozoi sono stati sospesi in tampone fosfato 0, 03

M a pH 7.8 (1900 ml) ed incubati con 3 µL della sonda TMA-DPH e DPH

rispettivamente per 5 minuti e 45 minuti a temperatura ambiente. Le intenstà

di �uorescenza delle componenti verticali ed orizzontali della luce emessa sono

state misurate con uno spettrofotometro Perkin-Elmer MPF66 ( λ d'eccitazione

= 365 nm, λ d'emissione = 430 nm). L'anisotropia di �uorescenza statica del

TMA-DPH e del DPH, in condizioni di equilibrio, viene calcolata usando la

seguente formula:

r =IVG− IhIV + 2Ih

(2.3)

Dove G è un fattore strumentale che corregge il valore r per un diverso rileva-

mento della luce polarizzata verticale (IV ) ed orizzontale (Ih). L'anisotropia di

�uorescenza è inversamente correlata alla �uidità della membrana che circonda


le sonde �uorescenti [21]. La sonda 6−dodecanoil−2−dimetil−aminonaftalene

(Laurdan) è stata invece utilizzata per lo studio dell' idratazione della membrana

plasmatica degli spermatozoi. (Figura 2.3)

Figura 2.3: Sonda Laurdan

In particolare gli spermatozoi sono stati sospesi in tampone HEPES 50 mM ,

pH 7.4, contenente NaCl (125mM). Le cellule sono state incubate con la sonda

Laurdan in DMSO (0, 2 µmol/L) per 15 minuti a 37◦C [22]. L'idratazione è

stata valutata considerando le modi�cazioni della polarizzazione generalizzata

(GP). Il valore di GP è stato calcolato utilizzando l'equazione:

GP =1430 − 14801430 + 1480

(2.4)

dove I430 e I480 sono le intensità di �uorescenza registrate rispettivamente

alle lunghezze d'onda di emissione di 430 e 480 nm (lunghezza d'onda di ecci-

tazione: 350 nm). Il valore di GP che si ottiene è inversamente proporzionale

all'idratazione della membrana plasmatica.


2.5 Analisi Immunoistochimica

Per l'analisi Immunoistochimica, gli spermatozoi isolati sono stati citocen-

trifugati a 200 g per 10 minuti su vetrini rivestititi con poli-L-lisina e �ssati in

paraformaldeide al 4% in tampone fosfato, pH 7.4, per 20 minuti a temperatura

ambiente. In seguito gli spermatozoi sono stati permeabilizzati in Triton X-100

(Sigma-Aldrich) allo 0, 1% in PBS per 10 minuti ed incubati a 4◦C per tutta

la notte con l'anticorpo policlonale di capra anti-ezrin o con gli anticorpi mono-

clonali di topo anti-Cdc42, anti-CD9, anti-f-actina e anti-β-tubulina I. L'analisi

Immunoistochimica è stata e�ettuata utilizzando la tecnica della streptoavidina-

biotina perossidasi. Dopo incubazione con 3, 3′ − diaminobenzidina (0, 05%

diaminobenzidina in 0, 05 mol/L tampone Tris, pH 7.6, e 0, 01% perossido di

idrogeno), i vetrini sono stati contro-colorati con l'ematossilina di Mayer. Come

controllo negativo al posto degli anticorpi primari sono state utilizzate IgG di

topo (al posto di anti-Cdc42, anti-CD9, anti-F-actina, anti-β-tubulina) e IgG di

capra (anziché anti-ezrin). Tutte le valutazioni sono state eseguite in modo in-

dipendente da due operatori mediante l'utilizzo di un microscopio ottico dotato

di una fotocamera digitale Nikon DS-Vi1. La concordanza dei risultati ottenuti

dai due operatori era sempre > 95%. Le eventuali discrepanze sono state risolte

ricorrendo ad un riesame dei vetrini con l'utilizzo di un microscopio in simul-

taneo. L'intensità di colorazione è stata valutata in modo semi-quantitativo

usando una scala a 5 punti:

• 0 = nessuna colorazione

• 0.5 = intensità debole

• 1 = intensità moderata

• 2 = intensità buona

• 3 = intensità forte

Inoltre è stata registrata anche la localizzazione cellulare della colorazione, a

livello della testa e della coda dello spermatozoo. Per la conta cellulare è stato


utilizzato il software di analisi d'immagine NIS Elements BR 3.22 (Nikon In-

struments) e sono stati presi in considerazione almeno dieci campi per campione

(dimensione del campo: 0, 07 mm2, ingrandimento: 400×). Le cellule colorate

sono state espresse come percentuale delle cellule totali presenti nel campo.

2.6 Analisi Statistica

Le analisi statistiche sono state e�ettuate utilizzando il pacchetto statistico

SAS (Statistical Analysis System Institute). Tutti gli esperimenti sono stati

eseguiti in triplo. I risultati sono stati espressi in termini di Medie ± Deviazione

Standard (SD). E' stato utilizzato il Test di Kolmogorov-Smirnov per veri�care

che i dati siano derivati da una distribuzione normale. Il t-Test di Student è

stato usato per valutare se le di�erenze tra i gruppi fossero signi�cative. Sono

stati considerati statisticamente signi�cativi valori di p<0.05.

3Risultati

In questo studio sono stati esaminati 46 soggetti, di cui 25 a�etti da aste-

nozoospermia di tipo idiopatico e 21 soggetti come popolazione di controllo.

Le caratteristiche del liquido seminale dei pazienti normospermici e astenozoo-

spermici sono state determinate seguendo i parametri di riferimento della WHO

aggiornati nel 2010. Come previsto i valori ottenuti sono stati simili nei due

gruppi, fatta eccezione per i parametri cinetici.

3.1 Studi di �uidità ed idratazione di membrana

La �uidità di membrana è stata valutata determinando l'anisotropia di �uo-

rescenza di due diverse sonde: il TMA-DPH fornisce informazioni riguardanti lo

strato più super�ciale della membrana plasmatica mentre il DPH sulla porzione

più interna essendo una sonda idrofobica. L'anisotropia di �uorescenza associata

alla sonda TMA-DPH è risultata signi�cativamente più alta negli spermatozoi

isolati da soggetti astenozoospermici (normospermici: 0, 179 ± 0, 01; astenozoo-

spermici: 0, 194 ± 0, 03; P < 0, 01). Al contrario, utilizzando la sonda DPH,

sono stati osservati valori più bassi di anisotropia di �uorescenza nei campioni

ottenuti dagli individui astenozoospermici rispetto a quelli isolati dai sogget-

ti normospermici (normospermici: 0, 196 ± 0, 02; astenozoospemici: 0, 178 ±

0, 01; P < 0, 01). Poiché l'anisotropia di �uorescenza è inversamente proporzio-

25

CAPITOLO 3. RISULTATI 26

nale alla �uidità di membrana, i risultati ottenuti hanno mostrato una riduzione

della �uidità di membrana nella porzione super�ciale della membrana plasma-

tica degli spermatozoi isolati dai soggetti astenozoospermici e un incremento

della stessa nella zona interna rispetto ai controlli (Figura 3.1).

Figura 3.1: Anisotropia di �uorescenza delle sonde TMA-DPH e DPH

La sonda Laurdan è stata invece utilizzata per lo studio dell'idratazione

della membrana plasmatica degli spermatozoi. L'idratazione è stata valutata

considerando le modi�cazioni della polarizzazione generalizzata (GP). La sonda

risponde in modo diverso al cambiamento del numero di molecole d'acqua ac-

cessibili ad essa stessa. Ciò dipende dalla struttura lipidica e dal contenuto in

colesterolo. I campioni ottenuti dai soggetti astenozoospermici mostrano valori

di GP signi�cativamente più alti rispetto a quelli isolati da individui normosper-

mici. Questo indica una bassa idratazione della membrana dei primi, in quanto il

valore GP e l'idratazione di membrana sono inversamente proporzionali (normo-

spermici: 0, 228 ± 0, 008; astenozoospermici: 0, 239 ± 0, 006; P<0, 001) (Figura

3.2).


Figura 3.2: Polarizzazione generalizzata mediante utilizzo della sonda Laurdan

3.2 Analisi Immunoistochimica

Le analisi immunoistochimiche sono state condotte valutando la positività

dei campioni ottenuti dagli individui astenozoopermici comparata con quella

dei controlli. I campioni isolati dai soggetti normospermici hanno mostrato

un'espressione immunoistochimica forte di Ezrin (98, 7 ± 7, 2% del totale delle

cellule) a livello sia della testa che della coda dello spermatozoo. I campioni

ottenuti dai pazienti astenozoospermici avevano una percentuale di spermatozoi

positivi signi�cativamente più bassa (90, 3± 5, 5%) e un'intensità debole a livello

della testa (25, 5 ± 3, 7% del totale), moderata e discontinua a livello della coda

(Tabella 3.1) (Figura 3.3).


Testa CodaIntensità della

colorazione 1

% 2 Intensità della

colorazione 1

% 2

Controlli 2, 98 ± 0, 11 98, 7 ± 7, 2 2, 95 ± 0, 22 98, 7 ± 7, 2Astenozoospermici 0, 52 ± 0, 163 25, 5 ± 3, 73 1, 00 ± 0, 14 3 90, 3 ± 5, 5 3

Tabella 3.1: Confronto espressione immunoistochimica di Ezrin.

Figura 3.3: Espressione immunoistochimica di Ezrin

L'espressione immunoistochimica di Cdc42 era forte e di�usa nei normosper-

mici (98, 6 ± 8, 1% di cellule positive); in particolare, nella testa l'espressione

era forte nella regione postacrosomiale e moderata/buona in quella apicale. Nei

campioni astenozoospermici la percentuale di cellule positive era simile a quella

dei normospermici (95, 4 ± 4, 3%), tuttavia l'intensità era debole a livello del-

la testa (25, 2 ± 4, 1% del totale delle cellule) e moderata a livello della coda

Tabella (3.2) (Figura 3.4).

10 = negatività; 0, 5 = intensità debole; 1 = intensità moderata; 2 = intensità buona; 3 =

intensità forte.2media ± deviazione standard delle cellule colorate rispetto alla totalità delle cellule

contate.3p < 0, 0014p < 0, 005



colorazione1% 2 Intensità della

colorazione 1

% 2

Controlli 2, 95 ± 0, 15 98, 6 ± 8, 1 2, 98 ± 0, 11 98, 6 ± 8, 1Astenozoospermici 0, 48 ± 0, 083 25, 2 ± 4, 23 0, 98 ± 0, 183 95, 4 ± 4, 33

Tabella 3.2: Confronto espressione immunoistochimica di Cdc42

Figura 3.4: Espressione immunoistochimica di Cdc42

Inoltre nei campioni normospermici la percentuale di spermatozoi positivi

al CD9 è stata del 95, 2 ± 6, 45% con un'intensità moderata a livello della

testa e moderata/buona a livello della coda. Nei campioni astenozoospermici la

percenutale di cellule positive era signi�cativamente più bassa (90, 1 ± 4, 7%)

e l'espressione immunoistochimica era debole a livello della coda e negativa a

livello della testa (Tabella 3.3) (Figura 3.5).



contate.3p < 0, 0014p < 0, 005



colorazione 1

%2 Intensità della

colorazione 1

%2

Controlli 1, 10 ± 0, 26 95, 2 ± 6, 4 1, 55 ± 0, 22 95, 2 ± 6, 4Astenozoospermici 0, 52 ± 0, 103 90, 1 ± 4, 74

Tabella 3.3: Confronto espressione immunoistochimica di CD9

Figura 3.5: Espressione immunoistochimica di CD9

L'analisi dell'espressione immunoistochimica delle proteine del citoschele-

tro, F-actina e β-tubulina, ha evidenziato quanto segue. La F-actina, negli

spermatozoi isolati da pazienti normospermici, aveva un'intensità buona nella

testa e forte nella coda. Negli spermatozoi di pazienti astenozoospermici l'e-

spressione immunoistochimica della f-actina era debole a livello della testa e

buona/moderata a livello della coda. La percentuale di cellule positive è stata

del 95, 5 ± 5, 2% e 95, 3 ± 6, 7% rispettivamente per i due gruppi di soggetti

(Tabella 3.4) (Figura 3.6).



contate.3p < 0, 0014p < 0, 005



colorazione 1

%2 Intensità della

colorazione 1

%2


Tabella 3.4: Confronto espressione immunoistochimica dell' F-actina

Figura 3.6: Espressione immunoistochimica della F-actina

In ultimo l'intensità della β-tubulina era maggiore negli spermatozoi otte-

nuti da uomini normospermici rispetto a quella degli spermatozoi ottenuti da

uomini astenozoospermici. In particolare, nei campioni di controllo l'intensità

era forte e di�usa, mentre negli spermatozoi ottenuti da pazienti infertili a�etti

da astenozoospermia idiopatica, l'intensità era buona sia nella testa che nella

coda. La percentuale di cellule positive era simile per le due categorie di indivi-

dui (normospermici: 98, 7 ± 7, 4%; astenozoospermici: 98, 5 ± 4, 9%) (Tabella

3.5) (Figura 3.7).



contate.3p < 0, 0014p < 0, 005



colorazione 1

%2 Intensità della

colorazione 1

%2


Tabella 3.5: Confronto espressione immunoistochimica della β-tubulina

Figura 3.7: Espressione immunoistochimica della β-tubulina



contate.3p < 0, 0014p < 0, 005

4Discussione

Lo stress ossidativo rappresenta una delle principali cause di compromissione

della funzione dello spermatozo nei pazienti astenozoospermici. Studi preceden-

ti hanno suggerito come l'aumento della produzione di ROS possa causare la

perossidazione dei lipidi della membrana citoplasmatica dello spermatozoo, in-

�uenzando così le caratteristiche chimico-�siche della stessa [23]. Ciò a sua

volta, può in�uire notevolmente sulle proprietà strutturali e funzionali della

membrana o delle proteine in essa incorporate. Sulla base di ciò, la nostra at-

tenzione si è focalizzata sullo studio della membrana plasmatica e delle proteine

caratteristiche del citoscheletro degli spermatozoi. Questa analisi, condotta su

spermatozoi isolati da soggetti normospermici fertili e pazienti astenozoospermi-

ci infertili, è la prima che si sia posta come obiettivo quello di valutare non solo

la �uidità e l'idratazione della membrana citoplasmatica dello spermatozoo, ma

anche quello di analizzare l'espressione immunoistochimica delle proteine tran-

smembrana e citoscheletriche, quali ezrin, Cdc42, CD9, F-actina e β-tubulina.

In primo luogo si sono dimostrati rilevanti i dati ottenuti sulla �uidità della

membrana citoplasmatica. In particolare, gli spermatozoi del gruppo degli aste-

nozoospermici presentano una ridotta �uidità di membrana a livello dello strato

super�ciale, cioè quello posto all'interfaccia lipidi-acqua, e una maggiore �uidi-

tà nella porzione più profonda del doppio strato lipidico, rispetto ai campioni

utilizzati come controllo. Inoltre l'analisi riguardante l'idratazione di membra-

33

CAPITOLO 4. DISCUSSIONE 34

na mediante utilizzo della sonda Laurdan ha evidenziato come gli spermatozoi

dei pazienti astenozoospermici mostrino un'idratazione di membrana inferiore

rispetto a quelli dei soggetti normospermici. Questo dato era già stato rilevato

da studi precedenti che avevano infatti dimostrato come la diminuzione dell'i-

dratazione della membrana fosse correlata alla riduzione della funzionalità degli

spermatozoi [22]. Pertanto, la ridotta capacità di fecondazione da parte di in-

dividui astenozoospermici potrebbe dipendere, almeno in parte, da alterazioni

che interessano la membrana. Infatti, è ben noto che la �uidità di membrana

regoli alcune funzioni importanti come la capacitazione, la reazione acrosomia-

le e la fusione spermatozoo-uovo [24]. Per quanto riguarda ezrin, la più nota

proteina della famiglia ERM che collega il citoscheletro corticale con le proteine

di membrana, i nostri risultati hanno dimostrato una sua espressione immunoi-

stochimica più forte e di�usa a livello della testa e della coda degli spermatozoi

nei soggetti normospermici rispetto a quelli isolati dai pazienti astenozoosper-

mici, in cui l'espressione risulta invece debole a livello della testa, moderata e

discontinua a livello della coda. Inoltre i campioni ottenuti dal gruppo di con-

trollo hanno una percentuale di spermatozoi positivi signi�cativamente più alta

in confronto a quella dei campioni ottenuti dai pazienti a�etti da astenozoosper-

mia idiopatica. Analogamente l'espressione immunoistochimica di Cdc42 risulta

forte e di�usa negli spermatozoi dei soggetti normospermici; in particolare nella

testa l'espressione è forte nella regione postacrosomiale e moderata/buona in

quella apicale; mentre nei campioni ottenuti dai pazienti astenozoospermici è

debole a livello della testa e moderata a livello della coda. Questi risultati sono

coerenti con gli studi precedenti che hanno messo in evidenzia il coinvolgimento

delle GTPasi nel processo di polimerizzazione dell'actina a livello della regione

postacrosomiale [25]. Anche se negli spermatozoi umani le funzioni di queste

proteine sono in gran parte sconosciute, esse sembrano essere coinvolte nella

motilità degli spermatozoi e in eventi fondamentali per la fecondazione. Quindi

non è da stupirsi se la loro espressione risulta essere più bassa nei soggetti infer-

tili astenozoospermici. Per quanto riguarda la proteina CD9, appartenente alla


famiglia delle tetraspanine, così chiamate perché contengono quattro segmenti

che attraversano la membrana, i nostri risultati hanno evidenziato che nei cam-

pioni normospermici l'espressione immunoistochimica è più intensa rispetto agli

astenozoospermici. Inoltre nei campioni di controllo la percentuale di sperma-

tozoi positivi al CD9 risulta maggiore in confronto a quella degli spermatozoi

provenienti da soggetti a�etti da astenozoospermia idiopatica. In particolare,

è da notare che, negli spermatozoi di pazienti astenozoospermici la testa è ne-

gativa per il CD9. Anche questo risultato non ci ha sorpreso visto che il CD9

a livello della testa dello spermatozoo sembra essere coinvolto nell'interazione

con l'oolemma. Di conseguenza una ridotta espressione di CD9 potrebbe con-

tribuire ad un'alterazione della capacità di fecondazione dei pazienti interessati

da astenozoospermia idiopatica. Recentemente, è stato suggerito che la protei-

na ezrin, le Rho GTPasi, le proteine della membrana citoplasmatica e quelle

del citoscheletro, siano coinvolte assieme nell'attivazione dello spermatozoo e

nella fecondazione. Circa l'espressione immunostochimica della proteina del

citoscheletro F-actina, abbiamo trovato che essa risulta più alta negli sperma-

tozoi ottenuti da soggetti normospermici, dove è di�usa sia nella testa che nella

coda. Al contrario negli spermatozoi ottenuti da pazienti astenozoospermici,

l'espressione immunoistochimica della F-actina è debole a livello della testa e

buona/moderata a livello della coda. Questi dati sono in linea con l'ipotesi se-

condo la quale la F-actina, insieme alle altre proteine del citoscheletro, giochi un

ruolo importante nella �siologia dello spermatozoo. Pertanto l'inibizione della

F-actina può compromettere la fecondazione e ridurre indirettamente la moti-

lità degli spermatozoi attraverso una disorganizzazione dell'assonema. In�ne

abbiamo valutato l'immunoespressione della β-tubulina. Abbiamo notato che

in entrambi i gruppi l'immunocolorazione è di�usa, ma nei campioni di pazienti

astenozoopermici è meno intensa rispetto a quella dei campioni di controllo.

Anche se è ben noto che le proteine del citoscheletro, a livello della coda degli

spermatozoi, hanno un ruolo centrale nella motilità, è stato suggerito che la tu-

bulina potrebbe avere un ruolo altrettanto importante a livello della testa dello


spermatozoo, dove sarebbe coinvolta attivamente nella fecondazione, in associa-

zione con altre proteine del citoscheletro. In conclusione, i nostri risultati nel

loro insieme suggeriscono che una riorganizzazione del citoscheletro, indotta da

un'alterazione delle caratteristiche �sico-chimiche della membrana plasmatica

degli spermatozoi e potenzialmente mediata dalle proteine ezrin, Cdc42 e CD9,

potrebbe contribuire alla compromissione della funzionalità spermatica in casi

di astenozoospermia idiopatica.

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