correlações do polimorfismo genético do vírus linfotrópico de células-t humanas do tipo 1...
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Correlações do Polimorfismo Genético do Vírus Linfotrópico de Células-T Humanas do
Tipo 1 (HTLV-1) com o Polimorfismo dos genes do Hospedeiro Envolvidos no
Desenvolvimento de TSP/HAM em Salvador.
Pesquisador PRODOC: Luiz Carlos Alcântara
Responsável Institucional: Bernardo Galvão-Castro
Área: Medicina da Saúde – Sub-área: Epidemiologia molecular dos microorganismos
1. Caracterização molecular do genoma proviral (U3-LTR) dos indivíduos infectados – Análise dos polimorfismos destas regiões relacionando os mesmos com o desenvolvimento de TSP/HAM;
2. Caracterização molecular de genes do hospedeiro envolvidos no mecanismo de transativação por Tax (promotores de IL2, IL2-R, IL6) em indivíduos infectados assintomáticos e com TSP/HAM;
3. Determinar a carga proviral nos indivíduos infectados, assintomáticos e com TSP/HAM, correlacionando estes resultados com as alterações genotípicas do hospedeiro.
QUAL A IMPORTÂNCIA DO ESTUDO DO POLIMORFISMO NA
REGIÃO LTR VIRAL?
LTR GAG POL ENV X LTR
5’
3’
3’
5’
•Ainda não se sabe porque a infecção pelo HTLV-I na maioria dos indivíduos resulta em uma infecção assintomática, enquanto poucos desenvolvem doença.
•Há poucas investigações que têm determinado correlações entre as manifestações clínicas e as alterações polimórficas nos genes provirais envolvidos na patogenicidade de Tax.
•Correlações entre o polimorfimo viral e o desenvolvimento de TSP/HAM no Japão.
U3 R U5
21-pb enhancer
ATT
TATA box
ESTRUTURA DO LTR DO HTLV-IESTRUTURA DO LTR DO HTLV-I
Sinal deSinal de poliadenilaçãopoliadenilação
3’ 5’
LTR GAG POL ENV X LTR
5’ 3’
TAX
CREB/ATF
TAX/CREB
5’
3’ 5’
3’
U3 R U5
LTR
TR
E 1
TR
E 2
TR
E 3
Transcrição
9032 pb
TRE - Elemento de resposta a TAX
Manuscrito em fase final de preparação ( Trabalho premiado da
Jornada Científica do IOC/FIOCRUZ - 2005 )
POPULAÇÃO ESTUDADA ( n=88 )
CHTLV n= 6
TSP/HAM total= 36 FNN n= 30
CHTLV n= 34 ASSINTOMÁTICOS POPULAÇÃO GERAL n=3 total= 52 FNN n=12 ACRE n= 3
CHTLV n= 18
Menor 45 anos BAHIA AZUL n=3 total n=32
ASSINTOMÁTICOS FNN n= 9 ACRE n= 2
Maior 45 anos CHTLV n=16 FNN n=3 total=20 ACRE n=1
RESULTADOS
Análise da Freqüência de Mutações no gene LTR3’ (355 pb)
*A significance level p<0.05 value was calculated by x2 test
Table 1: Analysis of the frequency (%) of mutations in gene LTR3’ (355pb) between asymptomatic and symptomatic group. Comparing with the LTR ATK1 Japanese prototype: We detected a -632C>T mutation (19,2%; p=0.024).
Table 2: Analysis of the frequency (%) of mutations in gene LTR3’(355pb) asym patients by age (up and down 45), comparing with the LTR ATK1 Japanese prototype: the -631-632C insertion was detected only in younger asym patients (25%, p=0.017).
* A significance level p <0.05 value was calculated by x2 test
RESULTADOS PRELIMINARES
Análise da Freqüência de Mutações no gene LTR3’ (355 – 55 pb)
• A mutação -632C>T está presente no grupo assintomático (19,2%; p=0.024).
• Quando dividimos os pacientes assintomáticos pela idade (menor e maior que 45),
uma inserção na posição -631C foi detectada somente no grupo com maior idade (25%,
p=0.017). Estudos anteriores não encontraram correlações entre variações gênicas específicas
e as diversas manifestações clínicas como ATLL e TSP/HAM (Osame et al., 2000).
• Em resumo, as mutações detectadas na região U3-LTR dos isolados do HTLV-1
poderiam estar relacionadas com a eficiência no mecanismo de transcrição viral e
desenvolvimento da TSP/HAM.
• Na análise filogenética, todos os isolados da América Latina (do subtipo
Cosmopolita, subgrupo Transcontinental) apresentaram as mutações nas posições –632 e –
452, enquanto as mutações –595, -471 e –631 foram encontradas apenas fora deste
grupamento.
QUAL A IMPORTÂNCIA DO ESTUDO DO POLIMORFISMO NOS PROMOTORES DAS CITOCINAS?
•Ainda não se sabe porque a infecção pelo HTLV-I na maioria dos indivíduos resulta em uma infecção assintomática, enquanto poucos desenvolvem doença.
•Há poucas investigações que têm determinado correlações entre as manifestações clínicas e as alterações polimórficas nos genes das várias proteínas do hospedeiro envolvidas na patogenicidade de Tax.
• Estudo das propriedades moleculares e biológicas dessas proteínas nos indivíduos infectados fornecerá informações importantes sobre a patogenicidade do vírus;
•Correlações entre o polimorfimo nos genes do hospedeiro e o desenvolvimento de TSP/HAM no Japão.
IL-6
Células B
Células T
Células T citotóxicas
Células tronco hematopoiéticas
Diferenciação e secreção de anticorpos
Produção de IL-2 e de receptor de IL-2
Atividade estimuladora
de colônia
Potencializa a diferenciação na presença de IL-2 e IFN-
Co-estimulante
IL-6
http://adams.mgh.harvard.edu/Reeves/Research%20Images/Cytokinealign.jpg6
http://www.nature.com/emboj/journal/v16/n5/thumbs/7590092f1.jpg
IL-6
IL-1
TNF-
fator de crescimento
derivado de plaquetas
endotoxinas
infecção viral
+
+
+
-
glicocorticóides
esteróides
Ativação de macrófagos e células T
Crescimento e diferenciação de
células B
Resposta de fase aguda
Hematopoiese+
+
Normalmente IL-6 é expressa em níveis muito baixos.
Infeçção, estresse, trauma: níveis
Menopausa e andropausa: níveis
Ershler WB & Keller ET, 2000
Vários estudos têm mostrado correlação: polimorfismos em genes de citocinas, entre elas IL-6, e susceptibilidade/ resistência a algumas doenças lupus, artrite reumatóide, diabetes, artrite juvenil
Polimorfismos de um único nucleotídeo: SNP podem afetar a transcrição e a produção de citocinas
fenótipos alto, intermediário e baixo produtor.
Fishman et al, 1998
A freqüência dos polimorfismos de um único nucleotídeo (SNP) em genes de citocina e dos haplótipos podem diferir em populações com diferentes “backgrounds” (Cox et al. 2001; Meenagh et al. 2002; Darrin et al, 2001; Padyukov et al, 2001; Meenagh et al, 2002).
ORIGEM GENÉTICA Susceptibilidade a várias doença
ETNIA X POLIMORFISMO X SUSCEPTIBILIDADE/RESISTÊNCIA A DOENÇAS
-174 -145 -73 -26 +1
-634 -597 -572 -174
NF-B TATA
NFIL6
-158 -145
G CG C
Representação esquemática da região 5’ do gene de IL-6, identificando os dois
polimorfismos estudados e sítios de ligação para fatores de transcrição
MRE
Região de -180 a -123 é CRUCIAL para a transcrição de IL-6
induzida por vírus, segundos mensageiros e citocinas como
IL-1 e TNF-
Adaptado de Terry et al, 2000
G C
G A
A freqüência de –174G/C IL-6 é altamente heterogêneo entre diferentes populações (Fishman et al. 1998; Cox et al. 2001; Hoffman et al. 2002), mas a variante –634G/C IL-6 foi estudada apenas em amostras asiáticas (Nishimura et al. 2002; Kitamura et al. 2002; Yamada et al. 2003).
http://www.icviacilea.it/pagine/giornalino/giornale
SNP –174 (GC): artrite reumatóide juvenil (Fishman et al, 1998), mal de Alzheimer (Licastra et al, 2003), hiperandrogenismo (Villuendas et al, 2002), susceptibilidade à diabetes tipo I (Jahromi et al, 2000), desenvolvimento de doenças cardiovasculares (Jenny et al, 2002).
SNP -634 (GC): progressão da nefropatia diabética (Kitamura et al, 2002), diminuição da densidade mineral óssea (Ota et al, 2001).
Polimorfismos nos promotores de IL-6 X Pacientes infectados com HTLV-I
População do Japão
diferença na distribuição do polimorfismo no promotor de IL-6 na posição –634 entre indivíduos HTLV-I positivos, assintomáticos e com HAM/TSP (Nishimura e cols, 2002).
Pergunta:
Existe associação desses Polimorfismos com a manifestação de TSP/HAM em indivíduos infectados com HTLV-1 de Salvador, Bahia, Brazil?
G A GG
GC CC T ?
Resultado 1: 3 populacões brasileiras
293 amostras coletadas entre 1997 e 2001:
100 da população geral de Salvador (Dourado et al. 2003);
94 doadores de sangue de descendentes de Alemães de Joinville (Grimaldi et al. 2002);
99 da tribo Tiriyo, fronteira Brasil/Suriname (Shindo et al. 2002)
http://www.giemmegi.org/images/indios-1.jpg
http://www.nippobrasil.com.br/3.turismo.br/
http://www.firststudy.ch/schools/images_gross/Baiana.jpg
ETHNIC DIFFERENCES IN THE DISTRIBUTION OF INTERLEUKIN-6 POLYMORPHISMS AMONG THREE BRAZILIAN ETHNIC GROUPS.
Gadelha, S.R. 1; Alcântara, L.C.J. 1,2; Costa, G.C.S. 1; Rios, D.L. 1; Galvão-Castro, B. 1,2
1 Laboratório Avançado de Saúde Pública/Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz/ Fundação Oswaldo Cruz, Salvador, Ba;
2 Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública/ Fundação Bahiana para o Desenvolvimento das Ciências.Key words: interleukin-6, polymorphisms, Brazilian populations
Tabela 1.1 Percentagem genotípica e freqüência alélica de polimorfismos no promotor do gene de IL-6 IL-6 nas posições –634G/C e –174G/C em três populações Brasileiras.
GGN (%)
GCN (%)
GCN (%)
GN (%)
CN (%)
-634
Salvador 68 (68.0) 30 (30.0) 02 (2.0) 166 (83.0) 34 (17.0)
Tiriyó 18 (18.2) 52 (52.5) 29 (29.3) 88 (44.4) 110 (55.6)
Joinville 87 (92.6) 7 (7.4) - 181 (96.3) 07 (3.7)
-174
Salvador 71 (71.0) 25 (25.0) 04 (4.0) 167 (85.2) 29 (14.8)
Tiriyó 94 (94.9) 5 (5.1) - 193 (97.5) 5 (2.5)
Joinville 43 (45.75) 33 (35.1) 18 (19.15) 119 (63.3) 69 (36.7)
*2: 147.648, df: 2; p<0.001 (freqüência alélica)
2: 76.100, df: 2; p<0.001 (freqüência alélica).
Tabela 1.2. Freqüência dos haplótipos (combinação -634G/C e –174G/C) no promotor de IL-6 em três diferentes populações do Brasil Salvador
(n*=200)%
Tiriyó (n*=198)
%
Joinville (n*=188)
%
-634G/-174G 66.5 42.8 59.1
-634G/-174C 16.5 1.6 37.2
-634C/-174G 17.0 54.8 3.7
-634C/-174C - 0.8 -
*n= número de cromossomosSalvador X Tiriyó: teste exato de Fisher: p<0,0001Salvador X Joinvile: teste exato de Fisher: p<0,0001Tiriyó X Joinvile: teste exato de Fisher: p<0,0001
•Cox et al, 2001; # Hoffman et al, 2002; ** Hayakawa et al, 2002; ## Zhai et al, 200; & Fishman et al, 1998
Tabela 1.3. Freqüências alélicas do polimorfismo –174 IL-6G>C nos principais grupos étnicos
Africanos/
Afro-descendentes%
Asiaticos/ Ameríndios
%
Europeus/ Europeus-
descendentes %
IL-6-174
G 89.7 - 90.7*,#
(83.5) 95.5 – 100#,**,##,&
(97.5)61.7#
(63.3)
C 9.3 - 10.3*,# (16.5)
0.2 - 4.5#,**,##,&
(2.5)
38.3#
(36.7)
As frequências alélicas dos polimorfismos -634G/C p<0.001) e -174G/C (p<0.001) diferiram nas três
populações.
As frequências dos haplótipos variaram significativamente (p<0.0001) (Tabela 2).
A maior frequência do alelo C na posição –174 em descendentes alemães de Joinville é consistente com aqueles demosntrados previamente em populações de Europeus (Tabela 3).
Resultados e Discussão
Polimorfismos X Grupos étnicos
A frequência do alelo C na posição –174 em amostras de Salvador, embora um pouco maior que aquelas previamente observadas em Africanos e Afro-Americanos, está próximo daqueles descritos (Table 3). Este achado é consistente com dados históricos que mostram a importância da contribuição africana e européia em Salvador (Alcantara et al., JAIDS 2003; Alcantara et al., AIDS 2006).
A mais baixa frequência do alelo C na posição –174 foi encontrada na tribo Tiriyo. Esta frequência está na faixa observada para populações de origem asiática (Tabela 3). Estes dados são consistentes com a teoria da origem asiática dos Ameríndios, confirmando estudos anteriores em outros sistemas polimórficos (Ribeiro et al. 2003; Tokunaga et al. 2001).
Poucos estudos têm investigado o polimorfismo –634G C no promotor do gene de IL-6, e todos foram realizados em populações asiáticas.
Este é o primeiro trabalho investigando este polimorfismo nestes grupos étnicos.
Primeiro estudo verificando freqüência dos haplótipos (-634 GC e -174GC).
Resultados 2
Polimorfismos nos promotores dos genes da interleucina-6 em indivíduos infectados de
SALVADOR. Existe associação com o desenvolvimento de doença neurológica?
Manuscrito em fase final
de preparação
Tipo de estudo: Corte-transversal
População alvo: Pacientes portadores de HTLV-I de demanda espontânea ou referenciada para o Centro de HTLV da Fundação Bahiana para o Desenvolvimento das Ciências (FBDC), confirmadamente positivos.
Número de amostras analisadas:
Indivíduos assintomáticos: 84
Pacientes com HAM/TSP: 26
Sintomáticos: 23
Soronegativos: 100
Idade (Mediana)
HAM/TSPOligosintomáticos
52.5 anos51 anos
Assintomáticos 38 anos
Gênero
HAM/TSP: 26MasculinoFeminino
Assintomáticos: 84
09 (34.6%)17 (65.4%)
MasculinoFeminino
31 (36.9%)53 (63.1%)
Oligosintomáticos: 24
MasculinoFeminino
09 (39.1%)14 (60.9%)
Tabela 2.0. Frequência alélica do polimorfismos nas posições –634 e –174 do promotor de IL-6 em indivíduos infectados pelo HTLV-I atendidos no CHTLV/FIOCRUZ e indivíduos soronegativos provenientes de Salvador/ Bahia.
HTLV-1 positivoN (%)
HTLV-1 negativoN (%)
Posição –634
Alelo G 246 (89.1) 166 (83)
Alelo C 30 (10.9) 34 (17)
Posição –174
Alelo G 240 (87.0) 167 (85.2)
Alelo C 36 (13.0) 29 (14.8)p>0.05
AssintomáticoN (%)
HAM/TSPN (%)
Posição –634
Alelo G 152 (90.5) 41 (78.8)
Alelo C 16 (9.5) 11 (21.2)
Posição –174
Alelo G 145 (86.3) 49 (94.2)
Alelo C 23 (13.7) 03 (5.8)
Tabela 2.1. Frequência alélica do polimorfismos nas posições –634 e –174 do promotor de IL-6 em indivíduos infectados pelo HTLV-I assintomáticos, oligosintomáticos, com HAM/TSP, e em indivíduos soronegativos
-174GC - do alelo G e do alelo C nos indivíduos com HAM/TSP quando comparados com indivíduos oligosintomáticos (p=0.03). HAM/TSP X assintomáticos: p=0.14
-634GC - Alelo C em HAM/TSP em relação aos assintomáticos (p=0.03) e oligosintomáticos (0.01). Assint X Oligos p=0.5
Oligosintomático
N%
43 (93.5)
06 (6.5)
36 (78.3)
10 (21.7)
Tabela 2.2. Freqüência dos haplótipos (combinação -634G/C e –174G/C) no promotor de IL-6 nos indivíduos infectados pelo HTLV-1.
HAM/TSP
n(%)
OLIGOSSINTOMÁTICOS
n(%)
ASSINTOMÁTICOS
n(%)
-634GG/-174GG* 13 (50) 13 (56.5) 52 (61.9)
-634GG/-174GC 01 (3.8) 05 (21.7) 13 (15.5)
-634GG/-174CC - 02 (8.7) 03 (3.6)
-634GC*/-174GG* 10 (38.5) 02 (8.7) 13 (15.5)
-634GC*-174GC 02 (7.7) 01 (4.4) 02 (2.4)
-634GC*/-174CC - - 01 (1.1)
*genótipos relacionados a uma maior susceptibilidade a HAM/TSP
-597 G/A
Monomórfico: todas as amostras foram GG
-572 G/C
A três genótipos G/A (3.8%).
Todos os demais G/G (96.2%)
Promotor de IL-2:
20 amostras sequenciadas – fragmento de 310pb – região onde NF-B se liga
10 pacientes sintomáticos e 10 assintomáticos para o HTLV– nenhuma diferença/ nenhum polimorfismo detectado
Carga proviralhttp://www.monografias.com
http://www.tthhivclinic.com/
14 pacientes HAM/TSP
53 assintomáticos
Carga proviral (número de cópias/106cels)
HAM/TSP X Assintomáticos
núm
ero
de c
ópia
s/10
6 cel
s
Mann-Whithney: p=0.0001
Mann-Whithney: p=0.66
-634 G/C
Mediana GG: 28665 cópias/106 céls
GC: 20624 cópias/106 céls
Carga proviral X Genótipo na posição -634 do promotor de IL-6
Mann-Whithney: p=0.97
Carga proviral X Genótipo na posição -174 do promotor de IL-6
-174 G/C
Mediana GG: 22189 cópias/106 céls
GC: 20945 cópias/106 céls
núm
ero
de c
ópia
s/10
6 cel
s
núm
ero
de c
ópia
s/10
6 cel
s
Bernardo Galvão Castro Filho (Coordenador)
Sandra Rocha Gadelha (Doutorado)
Sérgio de Araújo Pereira (Doutorado)
Giselle Calazans de Souza Costa (Iniciação científica e mestrado)
Cinara Carvalho(Apoio técnico);
Simone Kashima (Colaborador)
Anne-Mieke Vandamme (Colaborador)
Ceuci Nunes (Clínica)
Rodrigo Gaspar (Administração do projeto)
Equipe do LASP/CPqGM e Centro de HTLV (FBDC/EBMSP)
FAPESB